نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 فارغ التحصیل کارشناسی ارشد دانشگاه گرگان
2 استادیار دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
چکیده
جهت انجام هرگونه کار اصلاحی بر روی بذر، تعیین میزان قابلیت حیات آن از طریق انجام آزمون-های جوانهزنی دارای اهمیت فراوانی است. آزمونهای بیوشیمیایی به صورت کلی روشهای سریع-تری برای ارزیابی زنده بودن نمونههای بذری و به طور اختصاصی برای ارزیابی بذرهای غیرقابل جوانهزنی که به نظر میرسد خواب باشند، از طریق سنجش بافتهای ضعیف یا مرده ارائه میکنند. آزمون تترازولیوم از معمولترین آزمونهای یاد شده است. تحقیق حاضر با هدف بهینهسازی شرایط آزمون تترازولیوم شامل غلظت محلول، دما و مدت زمان نگهداری بذور در محلول برای گونه راش شرقی انجام پذیرفت. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملأ تصادفی با 3 تکرار، انجام گرفت. نتایج نشان داد فاکتورهای مورد بررسی باعث ایجاد تغییرات معناداری در درصد رنگپذیری بذور میشوند. برای تعیین بهترین شرایط آزمون تترازولیوم نتایج این آزمون با نتایج حاصل از آزمون کشت جنین (در محیط کشتMS) مقایسه شد. تیمار خیساندن بذور به مدت 18 ساعت و دمای 30 درجه سانتیگراد در محلول 5/0 درصد تترازولیوم با بیشترین شباهت به نتایج آزمون کشت جنین، تیمار مناسب جهت آزمون جوانهزنی با استفاده از محلول تترازولیوم انتخاب شد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Standardization if the tetrazolium test in East Beech
نویسندگان [English]
1
2 Assistant Prof., Gorgan university of Agricultural Sciences and Natutal Resources
چکیده [English]
To perform any breeding work on seed, determination of its life ability amount via germination test is very important. In general, biotechnical tests present rapid methods for evaluating viability of seed samples and specificalty to assess non-germinable seeds which seems to be dormant through the measurement of weak or dead tissue. Tetrazolium test is the most common of these tests. This study aims to optimize Tetrazolium test conditions including concentration, temperature and storage time on seeds in Fagus orientalis. Factorial experiment was conducted in completely randomized design in three replications. the results of this experiment was compared with the obtained results from embryo culture test (in MS medium) for evaluating the best condition of tetrazolium. Soaking treatment of seeds for 18 h at 30°C in a solution of 0/5% Tetrazolium test results with the greatest similarity to embryos cultured was selected as suitable treatment for germination test using tetrazolium protocol in Fagus orientalis.
کلیدواژهها [English]
بهینه سازی دستورالعمل بکارگیری تترازولیوم در راش شرقی
شادی میرزاوندیانی* و وحیده پیام نور
گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم جنگل، گروه جنگلشناسی
تاریخ دریافت: 26/8/92 تاریخ پذیرش: 15/11/93
چکیده
برای انجام هرگونه کار اصلاحی بر روی بذر، تعیین میزان قابلیت حیات آن از طریق انجام آزمونهای جوانهزنی دارای اهمیت فراوانی است. آزمونهای بیوشیمیایی به صورت کلی روشهای سریعتری برای ارزیابی زنده بودن نمونههای بذری و به طور اختصاصی برای ارزیابی بذرهای غیرقابل جوانهزنی که به نظر میرسد خواب باشند، از طریق سنجش بافتهای ضعیف یا مرده ارائه میکنند. آزمون تترازولیوم از معمولترین آزمونهای یادشده است. تحقیق حاضر با هدف بهینهسازی شرایط آزمون تترازولیوم شامل غلظت محلول، دما و مدت زمان نگهداری بذور در محلول برای گونه راش شرقی انجام شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. نتایج نشان داد فاکتورهای مورد بررسی باعث ایجاد تغییرات معناداری در درصد رنگپذیری بذور میشوند. برای تعیین بهترین شرایط آزمون تترازولیوم نتایج این آزمون با نتایج حاصل از آزمون کشت جنین (در محیط کشتMS) مقایسه شد. تیمار خیس کردن بذور به مدت 18 ساعت و دمای 30 درجه سانتیگراد در محلول 5/0 درصد تترازولیوم با بیشترین شباهت به نتایج آزمون کشت جنین، تیمار مناسب برای آزمون جوانهزنی با استفاده از محلول تترازولیوم انتخاب شد.
واژههای کلیدی: تترازولیوم، راش شرقی، زندهمانی
* نویسنده مسئول، تلفن: 09379115157، پست الکترونیکی: sh.mirzavandian89@yahoo.com
مقدمه
نخستین قدم برای انجام هر گونه کار اصلاحی و همچنین شناسایی خصوصیات بذور ارزیابی قوه نامیه میباشد که از طریق انجام آزمونهای جوانهزنی انجام میشود (1). قوه نامیه، درصد یا سهمی از بذور زنده در مقدار معینی نمونه میباشد (23) و نشان دهنده درجه زنده بودن بذر، فعالیت متابولیکی و دارا بودن آنزیمهایی است که بتوانند واکنشهای متابولیکی لازم برای جوانهزنی و رشد گیاهچه را آنالیز نمایند (1). اطلاعات حاصل از این آزمایشها در زمینههای مختلفی میتواند مورد استفاده قرار گیرد. روشهای مختلفی برای تخمین قوه نامیه وجود دارد که میتوان به آزمون جوانهزنی، آزمونهای بیوشیمیایی، روش X-REY و آزمون کشت جنین اشاره نمود. در این میان آزمونهای بیوشیمیایی روشهای سریعتری برای ارزیابی زنده بودن نمونهها و به طور اختصاصی ارزیابی بذرهای غیرقابل جوانهزنی که به نظر میرسد خواب باشند، از طریق سنجش بافتهای ضعیف یا مرده ارائه میکنند (3). آزمون تترازولیوم که از معمولترین آزمونهای یادشده است و به صورت گسترده برای تشخیص قوه نامیه بذرها استفاده میشود، بر اساس واکنش تری فنیل تترازولیوم کلراید با هیدروژن حاصل از فعالیت آنزیم دهیدروژناز در بافتهای زنده به کار گرفته میشود؛ این واکنش سبب میشود تا رنگیزهای نامحلول در آب به نام فرمازان در سلولهای زنده تشکیل و آنها را از بیرنگی به رنگ قرمز درآورد اما سلولهای غیرزنده به صورت بیرنگ باقی میمانند (7، 15). ISTA (2003) الگوهایی از رنگپذیری جنین را برای تعدادی از بذور جنگلی منتشر کرده است. به صورت پراکنده مطالعاتی نیز در مورد گونههایی که در لیست فوق قرار ندارند توسط محققان مختلف انجام شده و در ژورنالهای مرجع مربوط به ایستا معرفی شده است که میتوان به چند مورد اشاره کرد؛ به طور مثال،Kak et al., (2008) اعلام کردند که تغییر میزان غلظت، دما و زمانهای مختلف باعث بوجود آمدن میزان رنگپذیری متفاوتی در بذور گونه Jatropa curcas میشود، در این تحقیق شرایط اپتیمم برای آزمون خیس کردن بذور، در غلظت 1/0 درصد محلول تترازولیوم به مدت 6 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد و یا خیس کردن در غلظت 25/0 درصد به مدت 4 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد معرفی شد. مشابه همین نتایج را Gupta et al,. (2010) برای گونه Baliospermum muntanum به دست آوردند، بیشترین رنگپذیری در غلظت 025/0% با دمای آزمایش 35 درجه سانتیگراد و زمان خیس کردن در محلول به مدت 17 ساعت مشاهده شد و کمترین میزان رنگپذیری نیز در غلظت 05/0، دمای 20 درجه و زمان 4 ساعت اتفاق افتاد. راش شرقی Fagus orientalis متعلق به خانواده Fagaceae، از درختان پهن برگ با ارزش است (4). تجدید نسل آن از طریق بذر انجام میشود. بذر راش فاقد اندوسپرم با خواب نسبتاً طولانی مربوط به پوسته است که تاکنون موجب مشکلاتی در بازده جوانهزنی شده است (28، 24، 5). مطالعات هیستوشیمی (27) و تکنیکهای عملی (9) حضور فنول در پوسته بذر این گونه و نقش آن در جلوگیری از جوانهزنی را نشان میدهند (11). پوسته و تستا میتوانند به وسیله مکانیسمهای مختلفی از قبیل مصرف اکسیژن و جلوگیری از تبادل گازها (26، 12)، جذب آب (26، 19)، نفوذ نور، خروج مهارکنندههای رشد از جنین (26، 10) و ممانعت از رشد آن مانع جوانهزنی شوند (26، 22). راش شرقی در چرخه توالی و تکامل جنگلهای شمال کشور نقش بسیار مهمی دارد، به عنوان یکی از گونههای اصلی کلیماکس در دامنههای ارتفاعی 2000-700 متر از سطح دریا به حساب میآید و عمدهترین مساحت این جنگلها را تشکیل میدهد، به طوری که در حدود 30% حجم و 24% تعداد در هکتار را به خود اختصاص داده است (6). به علت نقش مهمی که در ترکیب و ساختار اکوسیستم های جنگلهای خزری بازی میکند تحقیقات زیادی انجام شده و در نتیجه بدست آوردن شرایط اپتیمم برای ارزیابی سریع قوهنامیه بذور آن در آزماشگاه اهمیت فراوان دارد. ISTA شرایط اپتیمم آزمون تترازولیوم را برای جنس راش، 18 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1 درصد در دمای 30 درجه سانتیگراد معرفی کرده است. این تحقیق با هدف ارائه طرحی برای ارزیابی قوه نامیه بذور راش شرقی با استفاده از آزمون تترازولیوم و با توجه به عدم وجود پروتکل مربوطه برای این گونه در لیست ISTA (2003)، شکل گرفته است. از آنجایی که بر اساس تحقیقات انجام شده میزان خواب بذر و در نتیجه تیمار مناسب جهت شکست آن در مبدأ و در سالهای مختلف بذردهی، متفاوت است (20، 13، 9) و در مورد بذور با مبدأ این آزمایش تحقیقی انجام نشده و همچنین خواب راش شرقی مربوط به پوسته آن بوده، در نتیجه جهت حصول اطمینان، از آزمون کشت جنین برای مقایسه با نتایج آزمون تترازولیوم استفاده گردید.
مواد و روشها
بذور مورد مطالعه از درختان راش در منطقه شصتکلاته گرگان واقع در عرض جغرافیایی 36 درجه و 41 دقیقه تا 36 درجه و 45 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 54 درجه و 20 دقیقه شرقی در سال 1390 جمعآوری و ب عدبه آزمایشگاه منتقل شدند. از توده بذر نمونههایی انتخاب و با مخلوط کردن آنها یک نمونه معرف تهیه شد (16). برای تهیه محلول بافر 71/14 گرم K2Po4 را در 1620 و 91/22 گرم Na2HPo4 را در 2430 میلیلیتر آب مقطر حل و بعد با هم مخلوط شد (7 =PH). در مرحله بعد برای تهیه محلول 5/0، 1 و 5/1 درصد تترازولیوم به ترتیب به میزان 75/6، 5/13 و 25/20 گرم نمک تترازولیوم کلراید هریک را جداگانه در 1350 میلیلیتر از محلول بافر ریخته و حل شد. پریکارپ بذور (پوسته بذور) به وسیله اسکالپل و پنس جدا و بلافاصله در آب مقطر با دمای 20 درجه سانتیگراد معلق شدند. پس از گذشت 18 ساعت تستا جدا و در محلول تترازولیوم با 7 = PH معلق شدند (15). آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار (هر تکرار شامل 50 عدد بذر) انجام شد. غلظتهای مختلف محلول تترازولیوم، مدت زمان معلق ماندن در محلول (15، 18 و 24 ساعت) و دمای قرارگیری محلول حاوی بذور (25، 30 و 35 درجه سانتیگراد) مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از گذشت مدت زمان معین بذور از محلول خارج و با آب مقطر شستشو و مورد بررسی قرار گرفتند. پس از بررسی به طور کلی 4 الگوی رنگپذیری در بذور مورد مطالعه شناسایی شد (شکل 1):
برای ارزیابی میزان زندهمانی، دسته اول و دوم به عنوان بذور زنده و دو دسته دیگر به عنوان بذور غیر زنده در نظر گرفته شدند (18، 14).
الف ب
ج د
شکل 1- الگوی رنگپذیری در بذور Fagus orientalis. الف) رنگپذیری کامل و یکنواخت بذور، ب) رنگپذیری محور جنینی و قسمت بیشتر لپهها، ج) رنگپذیری قسمتهایی از لپهها (محور جنینی رنگ نگرفته و دارای بافتهای مرده هستند)، د) عدم رنگپذیری
در آزمون کشت جنین که برای تعیین قوه نامیه بذور استفاده می شود، جنین بذرها خارج و کشت داده شده و میزان جوانهزنی محاسبه میشود. برای انجام آزمون محیط کشت MS فاقد هورمونهای رشد گیاهی و دارای 3 درصد ساکارز آماده و PH محیط برابر 7/5 تنظیم گردید (5). به منظور سترون سازی، محیط کشتها به مدت 20 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد اتوکلاو شدند. بذور طی یک روش 4 مرحلهای (1- قرار دادن بذرها به مدت 10 دقیقه در اتانول 70 درصد، 2- شستشو با آبمقطر سترون 5 بار هر بار به مدت 5 دقیقه، 3- استفاده از هیپوکلریت سدیم 25 درصد به مدت 20 دقیقه، 4- شستشو با آبمقطر سترون 5 بار هر بار به مدت 5 دقیقه) سترون شدند. لایه اندوکارپ بذور و بعد تستا حذف و در ژرمیناتور با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و شدت نور 5000-4500 لوکس و با دمای 25 درجه سانتیگراد کشت گردیدند. این آزمون به صورت کاملاً تصادفی با 3 تکرار (هر تکرار شامل 50 عدد بذر) انجام شد. تجزیه و تحلیل دادهها با کمک نرم افزار Spss 16.0 انجام و میزان تأثیر هریک از شرایط ذکر شده آزمون به تنهایی و اثر متقابل آنها بر درصد رنگپذیری تعیین گردید. برای تعیین بهترین شرایط آزمون، تیماری که میزان رنگپذیری نزدیکتری با مقدار به دست آمده از آزمون کشت جنین داشت با استفاده از آزمون دانکن انتخاب شد.
نتایج
بر اساس نتایج بدست آمده از تجزیه واریانس دادههای رنگپذیری بذور مشخص شد. اثرات اصلی و متقابل تیمارهای اعمال شده اختلاف معناداری در سطح 99% داشته ولی اثر سه جانبه تیمارها، تأثیر معناداری بر میزان رنگپذیری بذور نداشته است (جدول 1).
جدول1-نتایج تجزیه واریانس حاصل از اثرات اصلی و متقابل شرایط آزمون تترازولیوم
مقدار معناداری |
مقدار F |
میانگین مربعات
|
درجه آزادی |
مجموع مربعات |
منابع تغییرات |
**000/0 |
83/39 |
86/3736 |
2 |
72/7473 |
غلظت |
**000/0 |
72/67 |
22/6354 |
2 |
45/12708 |
دما |
**000/0 |
2/13 |
40/1238 |
2 |
82/2476 |
زمان |
**000/0 |
25/9 |
00/868 |
4 |
03/3472 |
غلظت×دما |
**000/0 |
2/6 |
70/581 |
4 |
81/2326 |
غلظت×زمان |
**000/0 |
6/12 |
62/1181 |
4 |
50/4726 |
دما×زمان |
ns68/0 |
71/0 |
82/66 |
8 |
55/534 |
غلطت×دما×زمان |
|
|
83/93 |
54 |
70/5066 |
خطای آزمایشی |
|
|
|
81 |
02/38785 |
کل |
Ns و **: به ترتیب بیانگر عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد و وجود اختلاف معنیدار در سطح 1 درصد میباشند.
مقایسات میانگین فاکتورهای مختلف این آزمون نشان داد مقادیر بالای این فاکتورها باعث ایجاد رنگپذیری بیشتری در بذور شدند. در این مقایسات غلظتهای 1 و 5/1% با ایجاد بیشترین رنگپذیری در بذور به طور مشترک در یک دسته (a) قرار گرفتند و دارای تفاوت معناداری در میزان رنگپذیری نسبت به غلظت 5/0% (b) بودند. مقایسات میانگین فاکتور دما مشخص کرد که بین هر سه گروه در سطح احتمال 99 درصد اختلافات معناداری وجود دارد. دمای 35 درجه سانتیگراد با بیشترین میزان رنگپذیری در دسته اول (a) و دمای 25 درجه سانتیگراد با کمترین میزان رنگپذیری در دسته سوم (c) قرار گرفتند. غلظت و دماهای بالاتر علاوه بر افزایش میزان رنگپذیری باعث ایجاد رنگ تیرهتری در بذور نیز شدند. زمانهای 18 و 24 ساعت نیز با بیشترین میزان رنگپذیری به طور مشترک در یک گروه (a) و زمان 15 ساعت با کمترین میزان رنگپذیری در گروه دیگری (b) قرار گرفتند (شکل 2).
شکل 2- تأثیر غلظتهای مختلف محلول تترازولیوم، مدت زمان معلق ماندن بذور در محلول و دمای محلول بر میزان رنگپذیری
نتایج، حاکی از تفاوت قابل توجه در میزان رنگپذیری بذور تحت تیمارهای مختلف آزمون بود (جدول 2). بیشترین میزان رنگپذیری در تیمار 15 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1% در دمای 35 درجه سانتیگراد، به میزان 77/97% و پس از آن در تیمارهای 24 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 5/1% در دمای 30 درجه سانتیگراد، 18 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1% در دمای 35 درجه سانتیگراد و 24 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1% در دمای 35 درجه سانتیگراد با رنگپذیری برای هر 3 تیمار به میزان 55/95% دیده شد. کمترین میزان رنگپذیری نیز در تیمار 15 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 5/0% در دمای 25 درجه سانتیگراد به میزان 55/15% و پس از آن در تیمار 15 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1% در دمای 25 درجه سانتیگراد به میزان 55/35% مشاهده شد.
جدول 2- تأثیر شرایط آزمون (مدت زمان معلق ماندن، غلظت و دمای محلول تترازولیوم) بر میزان رنگپذیری بذورFagus orientalis L. و مقایسه با نتایج کشت جنین
زمان |
غلظت تترازولیوم |
25 درجه سانتیگراد |
30 درجه سانتیگراد |
35 درجه سانتیگراد |
|
15 ساعت |
5/0 |
i55/15 |
ij33/53 |
abc33/93 |
|
1 |
k55/35 |
hi77/57 |
a77/97 |
||
5/1 |
ghi60 |
abcdef44/84 |
abcd89/88 |
||
18 ساعت |
5/0 |
hi78/57 |
efghi89/68 |
bcdefg77/77 |
|
1 |
abcdef99/79 |
abcd89/88 |
ab55/95 |
||
5/1 |
defgh33/73 |
abcdef22/82 |
cdefgh55/75 |
||
24 ساعت |
5/0 |
jk77/37 |
ij33/53 |
bcdefg77/77 |
|
1 |
fghi66/66 |
abcdef22/82 |
ab55/95 |
||
5/1 |
abcde66/86 |
ab55/95 |
abcde67/86 |
||
کشت جنین |
efgh92/68 |
|
|||
10 تا 12 روز پس از کشت جنین در محیط کشت MS، لپه اکثر جنینها متورم شده و به رنگ سبز درآمدند و همزمان شروع به بازشدن کردند، ریشهچه و محور زیر لپه از بین آنها نمایان شدند. با اینکه اکثر نمونهها دچار آلودگی شدند اما گیاهچهها کاملا مشهود و دارای برگچه شدند (شکل 3).
شکل 3- گیاهچههای حاصل از کشت جنین در محیط کشت MS
در این بین تعدادی از بذور به علت عدم توانایی در جوانهزنی به رنگ قهوهای درآمده و پوسیده شدند. در آخر جوانهزنی بذور 92/68% تعیین شد.
بحث
آزمونهای تعیین و تشخیص بنیه بذر اهمیت ویژهای در اجرای آزمایشهای مختلف مرتبط با بذر دارند. با وجودی که هیچ آزمونی به طور جامع نتوانسته جایگزین آزمایش استاندارد جوانهزنی بذر شود (2) ولی آزمون های دیگری که به مدت زمان کمتری برای اجرا نیاز دارند طراحی شده و به وفور استفاده میشوند. آزمون تترازولیوم یکی از سریعترین روشها در این خصوص بوده و بیشتر زمانی که جوانهزدن با کاهش جوانهزنی به علت رکود بذر است مورد استفاده قرار میگیرد. بهینه سازی شرایط این آزمون در به دست آوردن نتایج دقیقتر اهمیت دارد. شرایط دور از حد اپتیمم آزمون باعث ایجاد خطا در درک میزان رنگپذیری میشوند؛ در رنگپذیریهای بسیار تیره امکان اشتباه در درک تفاوت بین بخشهای زنده بذور از بخشهای آسیب دیده مکانیکی وجود دارد، رنگپذیری خیلی روشن هم ممکن است منجر به اشتباه در مورد درک تفاوت بین بعضی از بذور زنده و غیر زنده شود (20). از طرفی قیمت بالای نمک تترازولیوم لزوم استفاده از آن را به میزان حداقل مورد نیاز کاملا توجیه میکند. برای بهینه سازی شرایط آزمون سه عامل دما، غلظت و مدت زمان قرارگیری بذور در محلول، مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد رنگپذیری بذور تحت تأثیر عوامل فوق، متفاوت و در مقادیر بالا بیشتر میشود که با نتایج Kak et al,. (2009) و Gupta et al,. (2010) مطابقت دارد. ایستا (2003) شرایط اپتیمم آزمون تترازولیوم را برای خانواده راش، 18 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 1 درصد در دمای 30 درجه سانتیگراد معرفی کرده است، شرایط ذکر شده به صورت کلی بوده و هر دو جنس بلوط و راش را که در کشورمان وجود دارند دربر میگیرد. بهتر است میزان اپتیمم این پارامترها برای گونههای مختلف بخصوص بومی کشور که در لیست ایستا نیامدهاند مشخص و با اطمینان بیشتری به کار گرفته شوند. طبق نتایج حاصل میزان قوهنامیه حاصل از کشت جنین بذرو راش شرقی 89/68% تشخیص داده شد. از تیمارهای مورد بررسی تیمار 18 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 5/0%، در دمای 30 درجه سانتیگراد (با میزان رنگپذیری 89/68%) بیشترین شباهت را به نتایج مربوط به کشت جنین داشته، از اینرو مناسبترین تیمار برای انجام آزمون قوه نامیه بذر این گونه تشخیص داده شد. با وجود اینکه حداکثر رنگپذیری در تیمارهای با غلظتهای بالای تترازولیوم و همچنین دمای آزمایش بالاتر حاصل شدهاند، بنابراین نمیتوانند به عنوان بهترین معرفی شوند، زیرا توجه به حداکثر رنگپذیری به تنهایی و بدون مقایسه با سایر آزمونهای تعیین قوه نامیه نمیتواند معیار مناسبی برای انتخاب باشد. به این ترتیب برای انجام آزمون قوهنامیه بذور راش شرقی 18 ساعت خیس کردن در محلول تترازولیوم 5/0%، در دمای 30 درجه سانتیگراد توصیه میگردد. امید است نتایج این تحقیق بتواند برای اصلاحگرانی که برای انجام تحقیقات خود نیاز به آزمایشهای جوانهزنی در مورد گونه راش شرقی را دارند، مؤثر واقع شود.