Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Study of the effect of drought stress on some biochemical and physiological parameters of Lippia citriodora H.B.K.

Document Type : Research Paper

Abstract

The application of medicinal plants for the treatment diseases in humans have a long history. It is estimated that more than 10% of the thousands of plant species known to have medicinal uses. Drought causes plants osmotic imbalance and inhibits plant growth and productivity. The aim of this study was to investigate the effect of drought on some biochemical and physiological trait of Lippia citriodora genus of verbeneceae family. Drought stress induced by polyethylene glycol (PEG) with different concentrations, 0%, 5%, 10%,20% and 25%. Result showed that FW (Fresh Wight) and RWC (Relative Water Contents) decreased significantly under drought stress in comparison to control. Root length not show significant changes under drought stress. At low levels of PEG Pigment content under drought stress increased significantly while reduced significantly in high level of PEG. Under drought stress, protein, proline, MDA (malondialdehyd) and hydrogen peroxide (H2O2) contents have been increased significantly. The antioxidant enzyme activity increased under drought stress when compared with control plants. Under drought stress Decreases in some parameter such as FW and RWC indicative sensitivity of this plant to stress on the other hand it responses to stress by increases in some compounds such as prolin, H2O2 and also increases in antioxidant enzyme activity.

Keywords

واکاوی اثر تنش خشکی بر برخی پارامترهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه به­لیمو H.B.K. Lippia citriodora 

عبدل محمدی1­، حسن ابراهیم‌زاده1*، جواد هادیان2 و مسعود میرمعصومی1 

1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست‌شناسی

2 تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده گیاهان دارویی

تاریخ دریافت: 16/1/92                تاریخ پذیرش: 6/11/92

چکیده

استفاده از گیاهان دارویی برای درمان بیماری­ها در انسان بیشینه طولانی دارد. تخمین زده شده که بیش از 10% از گونه های گیاهی استفاده دارویی داشته باشند. گیاهان متأثر از فاکتور های محیطی مختلفی همانند خشکی می­باشند. خشکی با برهم زدن توازون اسمزی گیاهان موجب کاهش رشد و عملکرد آنها می­شود. همچنین باعث القاء گونه های واکنشگر اکسیژن می­شود که به سلول های گیاهی آسیب می­رساند. هدف از اجرای این طرح بررسی تأثیر تنش خشکی بر پارامترهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گونه به­لیموLippia citriodora از تیره Verbenaceae است. تنش خشکی با غلظت های مختلف PEG (پلی اتیلن گلیکول) 0%، 5%، 10%، 20% و 25% القاء شد. نتایج بدست آمده نشان داد که FW (وزن تر) و RWC (محتوای نسبی آب) با افزایش تنش خشکی کاهش معنی داری را نسبت به شاهد  نشان دادند. طول ریشه تحت تنش خشکی تغییر معنی داری را ایجاد نمی­کند. محتوای رنگیزه های گیاه تحت تنش خشکی در سطوح پایین PEG افزایش معنی داری را نشان می­دهد، در حالیکه در سطوح بالای آن کاهش معنی داری ایجاد می­کند. تحت تنش خشکی محتوای پروتئین، پرولین،  MDA(مالون دی آلدهید) و آب اکسیژنه (H2O2) افزایش معنی داری را نسبت به شاهد ایجاد می­کند. به‌طوری‌که فعالیت زیمایه های پاداکساینده با افزایش تنش خشکی افزایش می­یابد. کاهش FW و RWC با تنش خشکی حساسیت گیاه را به تنش نشان می­دهد، از طرفی گیاه با افزایش ترکیباتی مانند پرولین و  H2O2  و همچنین افرایش فعالیت زیمایه های پاداکساینده به تنش خشکی پاسخ می­دهد.

واژه های کلیدی: به­لیمو، پروتئین، پرولین،  MDAو  H2O2.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02161113637، پست الکترونیکی: ebizadeh@ut.ac.ir

مقدمه

 

گونه به­لیمو با نام علمیLippia citriodora  H.B.K. از تیره شاه‌پسند (Verbenaceae)  (1و2)، درختچه ای است به ارتفاع 5/1 تا 2 متر دارای ساقه دراز، زاویه دار و منشعب، با برگ های ساده، خشن، کامل، فراهم و مجتمع به تعداد 3-4 عدد به رنگ سبز روشن. گلها کوچک و دارای جامی است که از خارج سفید و از داخل آبی مایل به بنفش است. مجموعه گل های آن ظاهر هرمی شکل در حول یک محور بلند به وجود می­آورد. کاسه گل لوله ای شکل، منتهی به 4 دندانه باریک و جام گل آن مرکب از 4 لوب پهن می­باشد. (8). این گیاه بومی امریکای جنوبی است و در کشورهایی مثل پرو، آرژانتین و شیلی گزارش شده است (2). تنش آبی یکی از تنش های متداول می­باشد که رشد و تولید مثل گیا هان را تحت تأثیر قرار می­دهد و باعث تغییرات متابولیسمی و اکسایشی در آنها می­شود (9). پروتئین هایی که در گیاهان تحت شرایط تنشی جمع می­شوند، ممکن است هنگامی که تنش بیش از حد باشد، شکلی از نیتروژن را فراهم کنند که مجددا قابل استفاده باشد و یا ممکن است نقشی را در تنظیم اسمزی بر عهده داشته باشند. در پاسخ به تنش ممکن است پروتئین ها به صورت جدید ساخته شوند یا این که به طور نهادی در غلظت های پایین وجود داشته و هنگامی که گیاهان در معرض تنش قرار می گیرند، غلظت آنها افزایش می­یابد (10). تعدادی از مشتقات مختلف اکسیژن به عنوان ROS یا AOS تعریف می شوند. H2O2 پایدارترین ROS می باشد. که واکنش پذیری نسبتا ضعیفی با بیشتر مولکول های آلی داشته و به آسانی از خلال غشاهای سلولی منتشر می شود و به محل هایی با فاصله از محل های تولید اولیه می­رسد (11). هنگامی که گیاهان در وضعیت تنش قرار می گیرند، کاهش محتوای کلروفیل باعث کاهش فعالیت فتوسنتزی می­شود (12). کاهش محتوای کلروفیل نتیجه توام کاهش سنتز مولکول های کلروفیل و افزایش تخریب آن می باشد (13). میزان حساسیت گیاه و آسیب وارد شده به غشاء با اندازه گیری محتوای مالون دی آلدهید (MDA) که حاصل قرار گرفتن اسید های چرب غیر اشباع در معرض تنش است، مشخص می­گردد. افزایش تنش با ایجاد تغییر در اسیدهای چرب غیراشباع  بر ساختار و ویژگی های غشاء سلولی اثر گذاشته، و باعث افزایش ایجاد رادیکال های آزاد و پراکسیداسیون لیپیدها و تروایی غشاء سلولی و  در نتیجه تراوش اسمولیت ها در گیاهان حساس می­شود (14). هدف این طرح بررسی میزان مقاومت به‌لیمو ( Lippia citriodora ) به تنش خشکی و همچنین واکاوی تغییرات برخی پارامترهای بیوشیمایی-فیزیولوژیکی در این گیاه تحت تنش خشکی می­باشد.

مواد و روشها

تهیه نمونه: قلمه های به­لیمو از شرکت گیاهان دارویی خرمان واقع در 26 کیلومتری شهرستان کوهدشت جمع آوری شد و  بعد به گلخانه دانشکده علوم انتقال یافت و در گلدانهایی با قطر 18 سانتیمتر و ارتفاع 28 سانتی متر کاشته شدند. نمونه ها برای رشد و حاصل شدن مقدار زیتوده (Biomass) کافی جهت شروع تنش به مدت دو ماه با محلول غذایی هوگلند آبیاری گردیدند.

تیمار تنش با PEG (6000):  تنش خشکی با محلول PEG (6000) با غلظت های %0، %5، %10، %20 و %25 اعمال شد. تیمارها به مقدار 100 میلی لیتر از محلول هوگلند حاوی (PEG)  به هر گلدان انجام شد. مدت تنش یک ماه بود و بعد از برداشت، وزن تر ریشه و برگ اندازه گیری شد و به میزان نیم گرم از  بافت تر برگ در 4 میلی لیتر بافر (Tris-HCl)  با pH=6.8 سائیده و همگن حاصل در 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ (UV-160,­ Shimadzu, Tokyo, Japan)­ شد و روشناور را جدا کرده، سپس به منظور انجام آنالیزها در فریزر 70- نگهداری شد.

اندازه گیری محتوای پروتئین: به منظور  سنجش غلظت پروتئین موجود در عصاره همگن  استخراج شده، از هر محلول روشناور  سه تکرار تهیه شد، بدین صورت که در هر لوله مقدار 1/0 میلی لیتر از عصاره را ریخته و به آن 5 میلی لیتر محلول برادفورد اضافه شد. سپس لوله ها به مدت 10 ثانیه ورتکس شد و پس از گذشت 20 تا 25 دقیقه جذب درnm  595 خوانده شد. مقدار پروتئین هر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد بر حسب میلی گرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.

اندازه گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدی:  پراکسیداسیون لیپیدی با اندازه گیری محتوای MDA تعیین می­شود (16). مقدار 2/0 گرم از بافت تر برگ را در 5 میلی لیتر از تری کلرو استیک اسید(TCA)  1/0 درصد وزنی- حجمی سائیده شد و بعد در 10000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد­. به 1 میلی لیتر از روشناور، 4 میلی لیتر از تیوباربیوتیک اسید (TBA) %5 حاوی (TCA)  20% اضافه کرده، مخلوط واکنش زائد در 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. بعد از سانتریفیوژ در 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه، جذب روشناور در 532 و 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (UV-160, Shimadzu, Tokyo, Japan) در مد Photometric خوانده شد. برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل 155 mM-1 Cm-1 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول پراکسیداسیون لیپیدها است براساس میکرومول در گرم وزن تر محاسبه گردید.

اندازه گیری محتوای پرولین: به منظور اندازه گیری محتوای پرولین، نیم گرم از بافت برگ را در 10 میلی لیتر از سولفوسالیسیلیک اسید %3 (w/v) سائیده و بعد همگن صاف گردید. به محلول بدست آمده 2 میلی لیتر اسید نین هیدرین و 2 میلی لیتر استیک اسید گلاسیال افزوده و به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد جوشانده شد. آنگاه به مخلوط واکنش  4 میلی لیتر تولوئن  افزوده و جذب در طول موج 520 نانومتر گزارش شد. محتوای پرولین بر حسب میکرومول بر گرم نمونه تر محاسبه می­شود (17).

اندازه گیری محتوای هیدروژن پراکسید (H2O2): 2/0 گرم از بافت  تر برگ درون حمام یخ در 5 میلی لیتر TCA 1/0% (W/V)  سائیده و با دور 12000 در دقیقه سانتریفیوژ شد، سپس نیم میلی لیتر از روشناور را جدا کرده و به آن نیم میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات 10 میلی مولار با pH=7  و یک میلی لیتر پتاسیم یدید یک مولار اضافه شد.

استانداردهای هیدروژن پراکسید: مقدار 134/1 گرم از پودر هیدروژن پراکسید را در محیط نیمه تاریک اتاق سرد به یک بالن حجمی اضافه نموده، آن را در 60 میلی­لیتر آب مقطر (TCA %1/0) حل کرده و حجم نهایی به 100 میلی­لیتر رسانده شد (100 میلی­مولار). برای تهیه محلولهای استاندارد صفر، 2، 4، 6، 8، 10، 20، 40، 50، 60، 80 و 100 میلی­مولار به ترتیب مقادیر صفر، 1، 2، 3، 4، 5، 10، 20، 25، 30، 40 و 50 میلی‌لیتر از شاهد را به بالن‌های حجمی در محیط سرد و نیمه تاریک اضافه نموده و حجم نهایی با آب مقطر (TCA %1/0) به 50 میلی­ لیتر رسانیده شد. محتوای پراکسید هیدروژن با منحنی استاندارد  اندازه گیری و بر حسب میکرومول بر گرم نمونه تر گزارش شد (18).

 اندازه گیری محتوای رنگیزه: به منظور اندازه گیری انواع کلروفیل (a،  bو کل) و همچنین کاروتنوئید، 2/0 گرم بافت تر برگ را در استون 90 درصد سائیده و بعد با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره یک محلول به دست آمده صاف شد و میزان جذب با استفاده از اسپکتروفوتومتر (UV- 160, ­Shimadzu, Tokyo, Japan) گزارش گردید (19).

اندازه گیری محتوای نسبی آب (RWC): RWC با استفاده از معادله زیر محاسبه شد: RWC (%) = [(FW−DW) / (TW−DW)] ×100 در این معادله FW وزن تر، DW وزن خشک و TW وزن اشباع می­باشد.  TW با قرار گرفتن نمونه ها در آب و تاریکی به مدت 24 ساعت بدست می­آید، سپس این نمونه ها در آون در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت قرار گرفت و DW اندازه گیری گردید (20).

فعالیت زیمایه SOD: فعالیت این زیمایه با قابلیت آن در بازدارندگی واکنش احیایی فتوشیمیایی نیتروبلو تترازولیوم NBT)) تعیین گردید. محلول واکنش بر اساس سنجش فعالیت زیمایه در محیط محتوای بافر فسفات mM 50 با 5/7pH=، متیونین mM 13، mM Na-EDTA 1/0، نیتروبلو تترازولیوم(NBT)  μM 75، ریبوفلاوین μM 75 و مقدار 100 میکرولیتر از عصاره می باشد. این روش بر اساس تبدیل NBT به فورمازان در حضور نور و تشکیل رنگ می باشد. در صورتی که زیمایه سوپراکسید دیسموتاز در محیط وجود داشته باشد، از انجام واکنش مذکور ممانعت کرده و تشکیل و ظهور رنگ را کاهش می دهد. پس از 16 دقیقه جذب آنها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 560 نانومتر خوانده شد (43).

 فعالیت زیمایه پراکسیداز: براساس روش Abeles در یک مخلوط واکنش حاوی 4/0 میلی لیتر H2O2 3 درصد، 2/0 میلی لیتر بنزیدین 20 میلی مولار، 4 میلی لیتر بافر استات pH= 4.8)) و 50 میکرولیتر عصاره زیمایه اندازه گیری شده است. تغییرات جذب بوسیله دستگاه اسپکتروفوتومترShimadzu  مد   kineticو طول موج 530 نانومتر خوانده شد. فعالیت پراکسیداز بر حسب واحد زیمایه ای در میلی گرم پروتئین محاسبه گردید (44).

پلی فنل اکسیداز (PPO): به این منظور مخلوطی از بافر پتاسیم فسفات 2/0 مولار با 8/6= pH 5/2 میلی لیتر و مقدار 2/0 میلی لیتر پیروگالل 02/0 مولار را با 20 میکرولیتر عصاره زیمایه­ای به یک لوله آزمایش که در دمای 40 درجه سانتی­گراد قرار داشت افزوده و بلافاصله تغییرات جذب به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu و مدل160UV- در مد کینتیک و طول موج 430 نانومتر رسم گردید. در نهایت میزان فعالیت زیمایه بر حسب واحد زیمایه­ای در میلی گرم پروتئین (Unit mg-1 protein) محاسبه گردید (49).

فعالیت آسکوربات پراکسیداز: به روش Nakano و Asada  اندازه­گیری شد. در ابتدا 850 میکرولیتر از آسکوربات پراکسیداز 5/0 میلی مولار (محلول در بافر پتاسیم فسفات 100 میلی مولار) به­همراه 150 میکرولیتر پر اکسید هیدروژن 2 میلی مولار (محلول در آب مقطر دو بار تقطیر) به یک کووت کوارتز 1 میلی لیتری اضافه شده و به عنوان شاهد در طول موج 290 نانومتر بکار رفت. سپس 20 میکرولیتر از عصاره زیمایه استخراج شده از برگ هر تکرار به مخلوط واکنش فوق اضافه شد و فعالیت آسکوربات پراکسیداز در مدت زمان 180 ثانیه و بر حسب Abs/min ترسیم شد (50). آزمایش های این پروژه براساس طرح فاکتوریل در قالب بلوک های کاملا تصادفی با 10 تکرار انجام شد. داده های حاصل از بررسیها بوسیله نرم افزار آماری SPSS  (نسخه 20) مورد تحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگین داده ها در سطح خطای 5% (5%>P)  با آزمون دانکن (DMRT)  انجام شد.

نتایج

وزن تر (FW): نتایج حاصل از بررسی اثر تنش خشکی بر وزن تر گیاه در شکل (1-a) مشاهده می­شود، به‌طوری‌که تحت تنش خشکی وزن تر گیاه کاهش معنی داری را نسبت به شاهد نشان داد.

محتوای نسبی آب (RWC): نتایج اثر تنش خشکی بر محتوای نسبی آب نشان می­دهد با افزایش سطوح PEG و به موازات آن افزایش تنش خشکی کاهش معنی داری در RWC ایجاد شد (شکل­1-b).

طول ریشه: با افزایش سطوح PEG و به موازات آن افزایش تنش خشکی تغییر معنی داری در طول ریشه ایجاد نشد (شکل­1-C).

 

شکل1- تأثیر تنش خشکی بر FW، RWC و طول ریشه

محتوای رنگیزه: در شکل 2 تأثیر تنش خشکی بر محتوای رنگیزه های گیاه نشان داده شده است. محتوای کلروفیلa ، کلروفیلb ، کلروفیل کل و کاروتنوئید در سطوح پایین PEG افزایش معنی داری را نسبت به شاهد نشان می­دهند. این در حالیست که در سطح 25 درصد PEG کاهش معنی داری در این رنگیزه ها نسبت به شاهد ایجاد شد.

محتوای پروتئین: تأثیر تنش خشکی بر محتوای پروتئین گیاه در شکل (3-a) آمده است. همانطور که مشاهده می­شود محتوای پروتئین با افزایش سطوح PEG و درنتیجه آن افزایش شدت خشکی افزایش معنی داری را نشان می­دهد.

محتوای پرولین: محتوای پرولین آزاد به عنوان یک اسمولیت سازگار تحت تنش خشکی در گیاه مورد آزمایش افزایش معنی داری را نشان می­دهد. همانطور که در شکل (3-b) مشاهده می­شود این میزان در سطح 25 درصد PEG بیشترین مقدار را دارد. پرولین در تمام سطوح خشکی افزایش معنی داری را نسبت به شاهد نشان می­دهد.

محتوای MDA: تغییر محتوای MDA به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی تحت تنش خشکی در شکل (3-c) نشان داده شده است. همانطور که در شکل مشاهده می­شود این محتوا با افزایش شدت تنش به موازات افزایش غلظت PEG اعمال شده نسبت به شاهد در تمام سطوح خشکی افزایش معنی داری را نشان می­دهد. بیشترین پراکسیداسیون لیپیدی در سطح 5 درصد PEG مشاهده می­شود.

 

 

شکل 2- تأثیر تنش خشکی بر محتوای رنگیزه‌های گیاه به­لیمو


محتوای پراکسید هیدروژن (H2O2): تأثیر تنش خشکی بر محتوای H2O2 در شکل (3-d) نشان داده شده است. همانطور که مشاهده می­شود این محتوا با افزایش غلظت PEG و در نتیجه آن افزایش تنش خشکی در تمام سطوح نسبت به شاهد افزایش معنی داری را نشان می­دهد.

زیمایه های پاداکساینده: تغییرات فعالیت زیمایه  SOD  تحت تنش خشکی در شکل (4-a) نشان داده شده است. همانطور که مشاهده می­شود با افزایش تنش خشکی میزان فعالیت این زیمایه نسبت به نمونه کنترل افزایش پیدا کرده است. بیشترین میزان فعالیت این زیمایه در تیمار 20 درصد PEG مشاهده می­شود. بین میزان فعالیت این زیمایه در تیمار 5، 10 و 25 درصد تفاوت معنی داری مشاهده نمی شود. میزان فعالیت با تنش روند افزایش نشان می­دهد، این روند از تیمار 20 به بعد روند نزولی پیدا می­کند. فعالیت زیمایه POX تحت تنش خشکی مطابق شکل (4-c) تغییر پیدا می­کند.

 

 

شکل 3- تأثیر تنش خشکی بر محتوای پروتئین، پرولین،  MDA و H2O2

 

همانطور که مشاهده می­شود با افزایش تنش خشکی فعالیت این زیمایه نسبت به شاهد در تمام سطوح خشکی افزایش پیدا کرده، به‌طوری‌که بیشترین میزان فعالیت مربوط به سطح 5 درصد PEG می­باشد. میزان فعالیت در 10 و 20 درصد خشکی با هم برابر بوده و این میزان در سطح 25 مجدد افزایش پیدا کرده است. همانطور که در شکل (4-b) مشاهده می­شود فعالیت زیمایه PPO با افزایش تنش خشکی در غلظت 20 % PEG افزایش معنی دار و در غلظت 25 % کاهش معنی داری را نسبت به شاهد نشان می­دهند، در سایر غلظتهای PEG تغییر معنی داری را نسبت به شاهد نشان نمی­دهند. نتایج حاصل از بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت زیمایه APX در شکل (4-d) آمده است. همانطور که مشاهده می­شود تحت تنش خشکی به موازات افزایش تنش میزان فعالیت این زیمایه افزایش پیدا کرده است.

بحث

وزن تر(FW): کیفیت و کمیت رشد گیاه وابسته به تقسیم سلول است. بزرگ شدن و تمایز توسط تنش کمبود آب متأثر می­شود (21). این ممکن است دلیلی­ برای رشد کاهش یافته گیاهان تحت تنش کمبود آب باشد. کاهش FW تحت شرایط خشکی ممکن است به دلیل سرکوب تقسیم سلول و رشد آن در نتیجه فشار تورژسانس پایین باشد. محققان بیان داشته اند که شوری و خشکی بالا باعث محدود شدن ترکیباتی مانند سیتوکینین ها و افزایش ترکیباتی مثل آبسیزیک اسید می­شود که بر تقسیم سلولی مؤثر می­باشند (3).

در پژوهش حاضر وزن تر گیاه در تمام سطوح خشکی نسبت به شاهد کاهش معنی داری نشان می­دهد، این نتیجه با گزارش بدست آمده  مبنی بر این که FW در گندم تحت تنش خشکی کاهش می­یابد، مطابقت دارد (19). نتایج مشابه در Abelmoschus esculentum­ گزارش شده است (23).

 

 

شکل4- تغییر فعالیت زیمایه‌های پاداکساینده تحت تنش خشکی

 


طول ریشه: زمانی که گیاه در معرض خشکی قرار می­گیرد، حتی قبل از هر گونه کاهش در تورژسانس، انعطاف پذیری دیواره سلول های در حال رشد برگ ها و ساقه ها عموما کم شده و توسعه سلول و در نتیجه رشد اندام ها کم می­شود. بنابراین به نظر می­رسد دیواره سلولی ریشه به تنش خشکی کمتر حساس بوده، به‌طوری‌که ممکن است وقتی که رشد اندام های هوایی متوقف شده باشد، رشد ریشه ادامه پیدا کند (24 و 25). در پژوهش حاضر طول ریشه با تنش خشکی  کاهش معنی داری را نسبت به شاهد نشان نداده است،  برخلاف این نتایج بدست آمده اعلام شده که وزن ریشه Phaseolus vulgaris  و P. acutifolius تحت تنش کمبود آب کاهش  یافت (26).

محتوای نسبی آب (RWC): در پژوهش اخیر با افزایش تنش خشکی محتوای نسبی آب به صورت معنی داری نسبت به شاهد کاهش پیدا کرده است. اثر خشکی روی توسعه دیواره یاخته‌ای بیشتر است، زیرا لازمه طویل شدن یاخته­ها انعطاف پذیری دیواره یاخته‌ای تحت فشار تورژسانس می­باشد و هر گونه کاهش در فشار تورژسانس که در نتیجه عدم تعادل در محتوای آب گیاه به وجود آید می­تواند منجر به کاهش رشد در شرایط تنش خشکی شود (27)، همچنین در تأیید نتایج ما ­گزارش شده که RWC تحت تنش خشکی کاهش (Festuca arundinacea ) می یابد (28).

محتوای رنگیزه: کاهش میزان کلروفیل گونه های حساس به تنش می­تواند نتیجه تخریب ساختار ظریف کلروپلاست، تغییر نسبت چربی – پروتئین رنگیزه ها و یا افزایش فعالیت کلروفیلاز باشد (29). همچنین کاش محتوای رنگیزه در اثر تنش خشکی در Guizotia abyssinica نیز گزارش شده (42) که در گیاه گندم رقم مقاوم به خشکی در مقایسه با رقم حساس به دلیل حفظ مقادیر بالایی از کلروفیل و کاروتنوئیدها، قدرت نورآمایی بهتری را در شرایط خشکی داراست که این تغییرات نوعی سازگاری در دستگاه نورآمایی می­باشد (30). در تجربه حاضر محتوای رنگیزه ها، بیشترین محتوای رنگیزه ها در سطوح 5 یا 10 درصد خشکی می­باشد.

محتوای پروتئین: در طی تنش خشکی بیان برخی ژن ها افزایش می­یابد که آنها را می­توان به ژن های وابسته به متابولیسم اولیه، تنظیم اسمزی، تغییر ساختمان، تجزیه پروتئین، رفع سمیت و پروتئین های LEA تقسیم بندی نمود (31). مطالعه حاضر نشان داد در گیاه به لیمو با افزایش تنش خشکی محتوای پروتئین زیاد شد. در رقم حساس به تنش گندم نیز افزایش محتوای پروتئین کل با اعمال تنش مشاهده شده است (32).

محتوای پرولین: مقاومت به تنش خشکی به توانایی گیاه برای ادامه حیات خود در شرایطی که پتانسیل آب بافتهای گیاهی کاهش یابد، اطلاق می شود. سازوکارهای مقاومت به خشکی اغلب از راه حفظ تورم یاخته‌ای (با تجمع نمک‌های محلول داخل یاخته‌ای) و یا با تحمل خشکی (به وسیله مقاومت پروتوپلاسمی) صورت می­گیرد. ازجمله مهمترین موادی که تجمع آنها در یاخته‌های گیاهی تحت تنش خشکی افزایش می­یابد می­توان به آمینو اسید آزاد پرولین اشاره کرد که تحت شرایط تنش، مقدار آن افزایش یافته و در حفظ پتانسیل اسمزی نقش دارد (36). در مطالعه حاضر مشخص شده که با افزایش تنش خشکی محتوای پرولین گیاه افزایش می­یابد. این نتیجه با مطالعات انجام شده بر روی گونه های Trigonella (34)، کلزا (4) و گلابی آسیایی (5) مطابقت دارد. در بررسی های انجام شده بر روی گون مشاهده شده که تیمار مانیتول و PEG باعث افزایش محتوای پرولین آزاد دانه رست های دو گونه گون گردید (6).

محتوای MDA: این مطلب شناخته شده است که پراکسیداسیون لیپید های غشایی که نتیجه اثرات رادیکال های آزاد هستند،  نشان‌دهنده آسیب تنش در سطح سلولی می­باشد. بنابراین سطح MDA حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، اغلب به عنوان یک شاخص برای آسیب اکسیداتیو به کار می رود (35). در مطالعه حاضر مشخص شده که با افزایش درصد PEG و در نتیجه تنش خشکی محتوای MDA  نسبت به شاهد افزایش پیدا می­کند. این گزارش با نتایج  بدست آمده مبنی بر اینکه افزایش تنش خشکی موجب افزایش MDA  در Citrus aurantifolia (36) و Zea maize (7) می­شود، مطابقت دارد. افزایش MDA نشان‌دهنده این است که تحت تنش خشکی ساختار غشاء آسیب دیده و لیپید های آن آزاد شده، از طرفی با وجود ترکیبات ROS که تحت تنش زیاد می­شود این لیپیدها پراکسیده شده و MDA تولید می­شود. وجود سیستم پاداکساینده توانمند باعث تقلیل ترکیبات ROS شده و به نوعی می‌تواند باعث کاهش پراکسیداسیونی لیپیدی شود.

محتوای H2O2: H2O2 به عنوان یک عامل تنظیمی نقش مهمی در فعال سازی ژن های رمزگذاری کننده زیمایه ها و پروتئین هایی بازی می­کند که در دفاع از تنش اکسیداتیو عمومی درگیر هستند (37).

افزایش میزان هیدروژن پراکسید تحت تنش های مختلف افزایش می­یابد، همچنان که مشاهده شده سطح هیدروژن پراکسید در توت با افزایش شوری ( 38)، در خیار با تنش سرما (39) و در لوبیا با تیمار باران اسیدی افزایش پیدا کرده است (40). در پژوهش حاضر تحت تنش خشکی محتوای H2O2 افزایش پیدا می­کند که این تغییر قبلا در Citrus aurantifolia و دو گونه از Salicornia  نیز گزارش شده است (36 و 41).

زیمایه‌های پاداکساینده: آنیون­های سوپراکسید به وسیله تنش شوری در سلول تولید می­شود، زیرا مهمترین تأثیر تنش شوری اختلال در وضعیت آب سلولی است که در نتیجه آن رشد کاهش می­یابد، همچنین افزایش تنفس در این شرایط سبب تولید این یون­های مخرب در میتوکندری سلول می­شود. در چنین شرایطی فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به عنوان یک زیمایه از بین برنده یون سوپر اکسید، مشابه نتایج بدست آمده افزایش می­یابد (45). فعالیت زیمایه SOD تحت تنش خشکی مطابق شکل (4-a) افزایش پیدا می­کند، همچنین مشاهده شده این روند در Mentha pulegium افزایش تنش خشکی در برگ و ریشه قبلا نیز گزارش شده است (46). در دانه رست های برنج همچنین گزارش شده که  تنش کمبود آب فعالیت تمام زیمایه های جاروب کننده اکسیژن فعال را افزایش می­دهد (47). با توجه به نقش پراکسیداز در سیستم پاداکسایشی گیاه، افزایش فعالیت آن در تنش قابل پیش بینی است. اما کاهش فعالیت این زیمایه در برخی غلظت ها می تواند به دلیل تجمع بیش از حد رادیکال های آزاد اکسیژن و رادیکال های هیدروکسیل بوده که باعث جلوگیری از فعالیت این زیمایه می شود (48). در دانه رست های برنج تحت تنش کمبود آب، افزایش فعالیت پراکسیداز که همراه با افزایش فعالیت کاتالاز است، نشان دهنده انتشار هیدروژن پراکسید از کلروپلاست ها می­باشد (47). پلی فنل اکسیدازها ازجمله اکسیداز های شناخته شده ای هستند که نقش فیزیولوژیکی آنها در گیاهان هنوز به خوبی شناخته نشده است و این زیمایه ها در زیست دیواره سلولی، مقابله با بیماری ها و شرایط تنشی فعال هستند. نتایج پژوهش حاضر در گیاه به لیمو نشان می­دهد که با افزایش تنش خشکی در نمونه هایی که تحت تنش خشکی بوده اند تا حد خاصی از خشکی فعالیت این زیمایه نسبت به شاهد افزایش پیدا می­کند و از این حد به بعد کاهش نشان می­دهد، که با نتایج بدست آمده در گیاه Mentha pulegium مطابقت دارد (46). آسکوربات پراکسیداز همانند پراکسیداز در حذف پراکسید هیدروژن دخیل می­باشد. این زیمایه سلول های گیاهی را در مقابل آسیب های اکسایشی و اکسیداسیون نوری حفاظت می­نماید. آسکوربات پراکسیداز این عمل را با واسطه آسکوربات و از طریق جاروب کردن هیدروژن پراکسید در سیتوپلاسم و کلروپلاست انجام می­دهد. این نقش آسکوربات پراکسیداز با نقش کاتالاز و پراکسیداز مشابه است (51).

گزارشهای قبلی نشان می­دهد که در دانه رست های برنج فعالیت آسکوربات پراکسیداز در پاسخ به هیدروژن پراکسید ناشی از تنش کمبود آب افزایش می­یابد (47).  Zlatevو همکاران دریافتند که تحت تنش خشکی در لوبیا که پراکسیداسیون لیپیدی کمتری داشته، فعالیت آسکوربات پراکسیدازی بالاتری نسبت به سایر ارقام نشان داده است (52). زیرا این زیمایه در روبشگری هیدروژن پراکسید دخیل است و از این‌رو در از بین بردن تنش اکسایشی مؤثر است (53). در این پژوهش مشاهده شده که فعالیت این زیمایه با تنش خشکی افزایش پیدا کرده که با مشاهدات قبلی مطابقت دارد (36).

نتیجه‌گیری: کاهش در پارامترهایی مانند وزن تر (FW) و  محتوای نسبی آب (RWC) نشان‌دهنده حساسیت این گیاه به تنش خشکی می­باشد. گیاه مورد نظر با افزایش محتوای پروتئین و پرولین به نوعی به تنش پاسخ می­دهد. افزایش محتوای MDA حساسیت گیاه را نسبت به تنش نشان می­دهد، همچنین افزایش محتوای H2O2 نشان دهنده افزایش گونه های فعال اکسیژن (ROS) در گیاه و حساسیت آن به خشکی می­باشد. گیاه به­لیمو نسبت به خشکی حساسیت نشان می­دهد، از طرفی افزایش برخی پارامترها مثلا پرولین نشان دهنده این است که گیاه سعی در تحمل تنش دارد. در سطوح پایین PEG همانطور که از روند تغییر برخی پارامترها ازجمله رنگیزه ها پیداست گیاه متحمل تر است، این تحمل تا سطوح حداکثر 20 درصد PEG مشاهده می­شود، از این سطح به بعد گیاه حساسیت بیشتری نشان می دهد.

  1. ظفریان، ولی ا...، فرهنگ اسامی گیاهان ایران. فرهنگ معاصر، 1375، صفحه 325.
  2. زرگری، علی. گیاهان دارویی. چاپ پنجم. مو سسه چاپ و انتشارات دانشگاه تهران. 1371. جلد سوم. صفحات 13-711.
  3. - اصفا، آرزو (1381). تاثیر شوری بر میزان رشد، املاح محتوای بافت و تولید آلکالوئید در درخت انار. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشکده علوم، دانشگاه تربیت مدرس.
  4. میرزایی، ملیحه، معینی، احمد، قناتی فائزه، (1392). اثر تنش خشکی بر میزان پرولین و قندهای محلول گیاهچه های کلزا (Brassica napus). مجله زیست شناسی ایران، جلد 26 (1)، صفحات 90-98. 
  5. جوادی، تیمور، ارزانی، کاظم، ابراهیم زاده، حسن، (1383). بررسی میزان کربوهیدراتهای محلول و پرولین در نه ژنوتیپ گلابس آسیایی (Pyrus serotina Rehd.) تحت تنش خشکی. مجله زیست شناسی ایران، جلد 17 (4).
  6. شاهقلی، کبری (1385). بررسی اثر شوری و خشکی بر فعالیت برخی آنزیم ها در دانه رست های دو گونه گون. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشکده زیست شناسی. دانشکده علوم. دانشگاه تهران.
  7. دولت آبادیان، آریا، مدرس ثانوی، سید علی محمد، شریفی، مظفر، (1388). اثر تنش کم آبی و محلول پاشی اسید آسکوربیک بر میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان و برخی تغییرات بیوشیمیایی در برگ ذرت دانه ای (Zea maize L.). مجله زیست شناسی ایران،  22 (3)، صفحات 407-422.
    1. Tutin, TG., 1981. Lippia In: Tutin TG. Flora Europea. Cambridge­ University Press.­ Cambridge. Vol. 13. p.123.
    2. Kalefetog˘lu, T, Ekmekc¸i Y, 2005. The effects of drought on plant and tolerance­ mechanisms (Review). GU J Sci 18(4):723–740.
    3. Ashraf, M., Hariss, P.J.C., 2004. Potential biochemical indicator of salinity tolerance in plants. Plant Science, 166: 3-16.
    4. Kuzniak, E., Urbanek, H., 2000. The involvement of hydrogen peroxide in plant responses to stresses. Acta Physiologica Plantarum. 22(2): 195-203.
    5. Jamil, M., 2007. Salinity reduced growth ps2 photochemistry and chlorophyll content in radish. Scientia Agricola. 64: 111-118.
    6. Chen, C., Tao, C, Peng, H, Ding, Y, 2007. Genetic analysis of salt stress responses in Asparagus Bean (Vigna unguiculata (L.) ssp. Sesquipedalis verdc.). Journal of Heredity. 98(7): 655-665.
    7.  Elkahoui, S, Hernandez, J.e.A, Abdelly, C, Ghrir, R., Limam, F, 2005. Effects of salt on lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities of Catharanthus roseus suspension cells. Plant Science. 168: 607-613.
    8. Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72: 248-254.
    9. Heath, R.L, Packer, L., 1968. Photoperoxidatin in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stochiometry of fatty acid peroxidation, Archives in Biochemistry and Biophysics 125: 189-198.
    10. Bates L.S, Waldren R.P, Teare, L.D, 1973. Rapid determination tolerance in cucumber plants. Pakistan Journal of Biological Science6 (1): 16-22.
    11. Velikova, V, Yordanov, I, Edreva, A, 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines. Plant Sci. 151: 59-66.
    12. Lichtenthaler, H, 1987. Chlorophylls­ and carotenoids, the pigments of the photosynthetic bio membranes. Methods Enzymol 148: 350–382
    13. Sairam, R. K, Srivastava, G. C, 2002. Changes in antioxidant activity in subcellular fractions of tolerant and susceptible wheat genotypes in response to long term salt stress. Plant Sci 162: 897–904.
    14. Kusaka, M, Lalusin, A. G, Fujimura, T., 2005. The maintenance of growth and turgor in pearl ­ millet (Pennisetum glaucum (L.) Leeke) cultivars with different root structures and osmo-regulation under drought stress. Plant Sci 168: 1–14.
    15. Rane, J, Maheshwari, M, Nagarajan, S, 2001. Effect of pre anthesis water stress on growth, ­ photosynthesis and yield of six wheat cultivars differing in drought tolerance. Indian J. Plant. ­Physiol 6: 53–60.
    16. Bhatt, R.M, Srinivasa, Roa, N.K, 2005. Influence of pod load on response of okra towater ­ stress.  Indian J. Plant Physiol 10: 54–59.  
    17. Basra, A.S, Basra, R.K, 1997. Mechanism of environmental stress resistance in plants. Harward Academic Publisher.
    18. Smith, H, 1990. Signal perception differential expression within multigene families and the molecular basis of phenotypic plasticity. Plant, Cell and Environment 13:585-595. 
    19. Ferrat, I. L, Lovat, V.J, 1999. Relation between relative­ water content, nitrogen pools, and growth of Phaseolus vulgaris and P.acutifolius during water deficit crop. Crop Science39:467-474.
    20. Farooq, MWA, Kobayashi, N., Fujita, D and Basra, SM, 2009. Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agron. Sustain Dev 29:185-212. 
    21. Jiang, Y., Huang, B, 2002. Protein alternations in tall fescue in response to drought sress and abscisic acid. Crop Science. 42: 202-207.
    22. Jacoby, B, 1994. Mechanism involved in salt tolerance by plants .In: Pessarakli M. (Ed).Handbook of plant and crop stress. Marcel Dekker Inc. New York.pp:97-123.
    23. Loggini, B, Scartazza, A, Brugnoli, E, Navari-Izzo, F. 1999. Antioxidative defense system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought. Plant Physiology 119: 1091.
    24. Ingram, J, Bartels, D, 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plant. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology47:347-403.
    25. Ashraf, M, O Leary, J.W, 1999. Changes in soluble proteins in spring wheat stressed with sodium chloride. Biol. Plant. 42: 113-117.
    26. Taiz, L, Zeiger, E, 2010. Plant Physiology, Ed Fifth. In. Sinauer Associates, USAThomashow MF (1999) Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annual Review of Plant Biology. 50: 571-599.
    27. Niknam, V, Razavi, N, Ebrahimzadeh, H, Sharifizadeh, B, 2006. Effect of NaCl on biomass, protein and proline contents, and antioxidant enzymes in seedlings and calli of two Trigonella species. BIOLOGIA PLANTARUM 50 (4): 591-596.
    28. Turkan, I, Bor, M, O¨ zdemir, F, Koca, H, 2005. Differential responses of lipid peroxidation and antioxidants in the leaves of drought-tolerant P. acutifolius Gray and drought-sensitive P. vulgaris L. subjected to polyethylene glycol mediated water stress. Plant Science. 168: 223–231.  
    29. Zafari,S., Niknam, V., 2012. Effect of phytoplasma infection on metabolite content and antioxidant enzyme activity in lime (Citrus aurantifolia). Acta Physiol Plant, 34:561–568.
    30.  Kuzniak, E, Urbanek, H, 2000. The involvement of hydrogen peroxide in plant responses to stresses. Acta Physiological Plantarum 22(2): 195-203.
    31. Harinasut, P, Poonsopa, D, Roengmongkol, K, 2003. Salinity effect on antioxidant enzymes­ in Mulberry cultivar. Science Asia 29:109-113.
    32. Lee, D.H, Lee C.B, 2000. Chilling stress-induced changes of antioxidant enzymes in the leaves of cucumber: in gel enzyme activity assays. Plant Sci 159: 75-85.
    33. Velikova, V, Yordanov, I, Edreva, A, 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines. Plant Sci., 151: 59-66.
    34. Nikna­m,­V., Torabi, S., 2011. Effects of Iso-osmotic Concentrations of NaCl and Mannitol on some Metabolic Activity in Calluses of Two Salicornia species.
    35. Ghane, S. G, Lokhande, V. H, 2012. Differential growth, physiological and biochemical responses of niger (Guizotia abyssinicaCass.) cultivars to water-deficit (drought) stress. Acta Physiol Plant 34:215–225
    36. Giannopolitilis, C.N, Ries,S.K, 1997, Superoxide dismutase.o.purification and quantitative relationship with water soluble protein in seedlings, plant physiology.59:315-318.
    37. Abeles, F.B., Biles, C.L. (1991). Characterization of peroxidase in lignifying peach fruit endocarp. Plant PHysiol. 95: 269-273.
    38. Dehghan,G, Rezazadeh,L, Habibi,G, 2011. Exogenous Ascorbate improves antioxidant defense system and induces salinity tolerance in soybean seedlings. Acta Biologica Szegediensis. 55(2):261-264.
    39. Niknam,V, Hassanpour, H, 2011. Effects of penconazole and water deficit stress on physiological and antioxidative responses in pennyroyal (Mentha pulegiumL.)
    40. Srivalli, B, Sharma, G, Khanna-Chopra, R, 2003. Antioxidative defence system in an upland rice cultivar subjected to increasing intensity of water stress followed by recovery. Physiology Plantarum 119:503-512.
    41. Demiral, T., Turkan, I., 2005. Comparative lipid peroxidation antioxidant defensesystems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance. Environmental and Experimental Botany, 53: 247-257.
    42. Raymond, J, Rakariyatham, N, Azanza, JL, 1993 Purification andsome properties of polyphenoloxidase from sunflower seeds, J Phytochem 34:927–931.
    43. Asada, K., Takahashi, M. 1987. “Production and scavenging of active oxygen in pHotosynthesis” In: Eds. Kyle DJ, Osmond CB, Amtzen DJ, PHotoinhibition. Amsterdam: Elsevier, pp. 227-287.
    44. Benavides, M. P., Marconi, P.L., Gallego, S. M., 2000, Relationship between antioxidant system and salt tolerance in Solanum tuberosum. Australian Journal of Plant PHysiology 27: 273 -278.
    45. Zlatev, Z. S., Lidon, F.C., Ramalho, J. C., 2006, Comparison of resistance to drought of three bean cultivars. Biologia Plantarum 50:389-394.
    46. Jagtap, V., Bhargava, S. 1995, Variation in the antioxidant metabolism of drought tolerant and drought susceptible varieties sorghum bicolor (L.) Moench. Exposed to high light, low Water and high temperature stress. Journal of Plant PHysiology 145: 195-197.

Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 28, Issue 3 - Serial Number 3
December 2015
Pages 617-628
  • Receive Date: 05 April 2013
  • Revise Date: 26 January 2014
  • Accept Date: 26 January 2014