Document Type : Research Paper
Authors
1 tehran-koye nasr- balochestan avenue-danesh street-no. 12
2 urmia- urmia university
Abstract
Anthocyanins are a subclass of flavonoids and are responsible for red,
purple, and blue colors of many flowers, fruits and vegetables. The stability
of anthocyanin color can be improved by copigmentation. Copigments are
colourless substances which can form a coloured cluster with colourless
forms of anthocyanins. The colour changes in fruits, vegetables and flowers
may be caused by these reactions between anthocyanins and various
organic compounds present in higher plants. In this study copigmentation
of anthocyanin in red onion were investigated with four copigment: tannic
acid, coumaric acid, caffeic acid, and benzoic acid in Five levels of
copigment concentration as:0,120,240,480,960(mg/l). the dependence of
the copigmentation process on the copigment concentration and effect of sugar on the copigmentation process were examined. The copigmentation of anthocyanin resulted in increase in both
hyperchromic effect and bathochoromic shifts. In this study, tannic acid
had the biggest hyperchromic effect (0/093) and benzoic acid had the
lowest one (0/051) . Copigments had highest effect in highest
concentration. Low concentration of sacaros (10%) improved the stability
of anthocyanin-copigment complex. In this study, tannic acid was
predominant among copigments.
Keywords
اثر تیمار ساکارز بر روی پایداری کمپلکس آنتوسیانین-کوپیگمانت پیاز قرمز آذرشهر
نوشین صدقیه* و رشید جامعی
ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 5/12/91 تاریخ پذیرش: 23/12/92
چکیده
آنتوسیانینها زیرگروهی از فلاونوئیدها میباشند که در ایجاد رنگهای قرمز، بنفش و آبی در بسیاری از گلها، میوهها و سبزیجات نقش دارند. پایداری رنگ آنتوسیانینها به وسیله کوپیگمانتاسیون افزایش مییابد. کوپیگمانتها مواد بیرنگی هستند که میتوانند مجموعههای رنگی با آنتوسیانینها تشکیل دهند. تغییرات رنگ در میوهها، سبزیجات و گلها ممکن است از واکنش بین آنتوسیانینها و ترکیبات آلی مختلف موجود در گیاهان عالی ایجاد شود. در این مطالعه کوپیگمانتاسیون آنتوسیانین پیاز قرمز آذرشهر با 4 کوپیگمانت تانیک اسید، بنزوئیک اسید، کوماریک اسید و کافئیک اسید در 5 غلظت صفر، 120، 240، 480 و 960 میلیگرم در لیتر مورد بررسی قرار گرفت، همچنین اثر کوپیگمانتاسیون بر غلظت کوپیگمانت و اثر قند روی کوپیگمانتاسیون آزمایش شد. کوپیگمانتاسیون آنتوسیانین منجر به افزایش اثر هایپرکرومیک (A∆( و بت کرومیک شیفت (maxƛ∆) میشود. در این مطالعه تانیک اسید دارای بیشترین اثر هایپرکرومیک (093/0) و بنزوئیک اسید دارای پایینترین اثر هایپرکرومیک (051/0) بود. کوپیگمانتها بیشترین اثر را در بالاترین غلظت داشتند، همچنین غلظت پایین ساکارز (10%) پایداری کمپلکس آنتوسیانین – کوپیگمانت را افزایش داد. در این مطالعه، تانیک اسید در بین سایر کوپیگمانتها، کوپیگمانت غالب بود.
واژههای کلیدی: آنتوسیانین، ساکارز، کوپیگمانتاسیون، پیاز قرمز
* نویسنده مسئول، تلفن: 09125851839 ، پست الکترونیکی: nsedghieh@yahoo.com
مقدمه
آنتوسیانین ها ترکیباتی با فعالیت پاداکسایشی بسیار بالا هستند و عمدتا در میوهها و سبزیجات قرمز یافت می شوند و باعث قرمز رنگ شدن نهال ها و تغییر رنگ برگ ها در فصل پاییز میشوند. مولکول های آنتوسیانین زیر گروه بزرگی از فلاوونوئیدها می باشند که مسئول رنگ های قرمز، ارغوانی و آبی بسیاری از گل ها، میوه ها و سبزیجات بوده و نقش های مهمی در جذب حشرات برای گرده افشانی و محافظت در برابر تنش های گیاهی را بر عهده دارند (15). آنتوسیانین ها بسیار ناپایدار بوده و براحتی تخریب می شوند، پایداری آنتوسیانین ها تحت تأثیر pH، دمای نگهداری، حضور آنزیم ها، نور، اکسیژن، آسکوربیک اسید، قندها، دی اکسید گوگرد، یون های فلزی و کوپیگمان ها قرار میگیرد (17،13 و22).
آنتوسیانین ها برای درمان فشارخون بالا، اختلالات کبدی، اسهال و مشکلات ادراری مانند سنگ کلیه، عفونت های مجاری ادراری و همچنین سرماخوردگی استفاده شده است (11)، همچنین نفوذپذیری مویرگ ها را کاهش داده و خاصیت التیام دارند و باعث افزایش نیروی انقباضی قلب می شوند (11و12). آنتوسیانین ها دارای 4 ساختار متفاوت می باشند که در تعادل با هم می باشند، این 4 ساختار شامل کاتیون فلاولیوم، کربینول، چالکون و پایه کوئینوئیدال می باشد. پایداری این ساختارهای در حال تعادل متفاوت می باشد و به pH و ساختار آنتوسیانین وابسته است (22).
کوپیگمانتاسیون در طبیعت رایج و فراوان است، زمانی که یک کوپیگمانت به یک محلول اسیدی اضافه می شود باعث افزایش شدت رنگ شده که ناشی از شکل گیری ترکیبات رنگی می باشد (20و25). پدیده کوپیگمانتاسیون برای اولین بار در سال 1982 با رنگ گل ها مشاهده شد. رابینسون مشاهده کرد که آنتوسیانین های یکسان رنگ متفاوتی را در گلبرگ گل های مختلف ایجاد می کنند و آنتوسیانین های مختلف رنگ های یکسانی را در بخش های مختلف از گیاهان ایجاد می کنند (4). کوپیگمانت ها به تنهایی بی رنگ هستند اما وقتی که به محلول آنتوسیانین اضافه می شوند باعث افزایش شدت رنگ محلول می شوند. کوپیگمانت ها عبارتند از: فلاوونوئید ها و سایر پلی فنل ها، آلکالوئید ها، آمینواسید ها و ارگانیک اسیدها (2). کوپیگمانت ها یک سیستم غنی از الکترون هستند که قادر به ارتباط با یون فلاولیوم می باشند که از لحاظ الکترون فقیر می باشند، این ارتباط باعث محافظت یون فلاولیوم از حمله نوکلئوفیلیک آب می شود (4). پدیده کوپیگمانتاسیون باعث اثر هایپرکرومیک (A∆) و بت کرومیک ( ∆) میشود. اثر هایپرکرومیک یعنی افزایش شدت رنگ آنتوسیانین توسط کوپیگمانتاسیون، در حالیکه بت کرومیک یعنی حداکثر جذب طول موج در یک محدوده مرئی به سمت طول موج های بالاتر که اثر پلانگ نامیده می شود (3). ساکارز آنتوسیانین ها را از تخریب در طول ذخیره سازی محافظت می کند و از قهوه ای شدن و شکل گیری پیگمان های پلیمری بعلت ممانعت از فعل و انفعالات آنزیماتیک یا واکنش های تراکمی مختلف بوسیله ساکارز جلوگیری می کند. اثر اضافه شدن قند بر پایداری آنتوسیانین به ساختار، غلظت و نوع قند بستگی دارد (8و28).
پیاز یکی از منابع اصلی فیتومولکولهای فعال بیولوژیکی از قبیل اسیدهای فنولی، فلاونوئیده، تیو سولفونات ها و آنتوسیانین ها می باشد (13). ترکیبات فنول پیاز بهعنوان از بین برندگان قوی رادیکال آزاد و بهعنوان محافظ در برابر بیماری های قلبی و عروقی و جلوگیری از سرطان روده بزرگ در انسان شناخته شده اند (5). هدف از این مطالعه بررسی پایداری کمپلکس آنتوسیانین – کوپیگمانت پیاز قرمز آذرشهر در 5 غلظت متفاوت از چهار کوپیگمانت وسه غلظت متفاوت قند ساکارز می باشد.
مواد و روشها
در این تحقیق پیاز قرمز (Allium cepa) آذرشهر از مرکز تحقیقات بذر و نهال کرج تهیه شد. نمونه ها پس از شستشو با آب مقطر و خشک کردن در کیسه های نایلونی قرار گرفت و در فریزر 20- درجه سانتی گراد قرار داده شدند تا در زمان آزمایش از آنها استفاده شود.
300 گرم نمونه به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق گذاشته شد تا ذوب شود. سپس آنها در مخلوطکن همراه با اتانول حاوی HCl 1/0% برای 5 دقیقه مخلوط شدند. استخراج به وسیله تکان دهنده های مغناطیسی 400 دور در دقیقه در دمای اتاق و مدت زمان 3-4 ساعت انجام گردید. به محض کامل شدن استخراج عصاره از طریق کاغذ صافی واتمن 1 صاف شد و برای آنالیز در ظرف شیشه ای تیره در یخچال (4+ درجه سانتی گراد) نگهداری گردید (10). محتوای آنتوسیانین استخراج شده بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر اندازه گیری گردید. در این آزمایش از اسیدهای آلی تانیک اسید، کافئیک اسید، بنزوئیک اسید و کوماریک اسید که همه این مواد از کمپانی Merck آلمان تهیه شدند استفاده شد. واکنش های کوپیگمانتاسیون در 5 غلظت صفر، 120، 240، 480 و 960 میلی گرم برای هر اسید آلی در pH برابر5/3 انجام گردید (26).
در آزمایش اثر تیمار با ساکارز در سه غلظت متفاوت ساکارز (10, 30 و50 %) مورد بررسی قرار گرفت. این آزمایش در pH برابر 2 با بافر کلرید پتاسیم بر روی آنتوسیانین همراه با غلظت 960 میلی گرم 4 اسید آلی و بدون اسید در چهار بازه زمانی صفر، 24، 48 و72 ساعت انجام شد و در این مدت نمونه ها در تاریکی در داخل یخچال نگهداری شدند (24).
آنالیز آماری داده ها بوسیله نرم افزار SPSS انجام شد. تمامی اندازه گیری ها سه بار تکرار شد و مقادیر بصورت _+ انحراف معیار گزارش شد. برای رسم نمودارها از نرم افزار Matlab استفاده شد.
نتایج
نتایج حاصل از کوپیگمانتاسیون: طبق نتایج بدست آمده از طریق آنالیز آماری، نشان داده شد که پایداری آنتوسیانین پیاز قرمز زمانی که کوپیگمانت ها به آن افزوده شدند، افزایش یافت. در این مطالعه غلظت آنتوسیانین ثابت بود و با تغییر غلظت کوپیگمانت ها، نتایج بر اساس تغییر غلظت کوپیگمانت ها مورد ارزیابی قرار گرفت. چون غلظت آنتوسیانین ثابت است، بنابراین می توان چنین استنباط کرد که میزان تغییر بت کرومیک و اثرات هیپر کرومیک به غلظت کوپیگمانت ها بستگی دارد. در همه کمپلکس های آنتوسیانین- کوپیگمانت، با افزایش غلظت کوپیگمانت ها اثر کوپیگمانتاسیون بیشتر شده و بیشترین غلظت کوپیگمانت (mg/L 960) دارای بیشترین اثر کوپیگمانتاسیون میباشد (نمودارهای 4-1).
همچنین مشخص شد که نوع کوپیگمانت هم فاکتور مهمی می باشد که بر کوپیگمانتاسیون اثر می گذارد. نمودار 5 طیف جذبی آنتوسیانین پیاز قرمز با کوپیگمانت های مختلف و در حالت بدون کوپیگمانت را مشخص می کند. این نمودار نشان می دهد که بیشترین تغییرات بت کرومیک مربوط به کمپلکس آنتوسیانین – تانیک اسید می باشد (093/0A : ∆ و 5/7 : ∆). اما کمپلکس های دیگر اثرات کمتری را نشان دادند که مقادیر آنها عبارت است از: (04/0A : ∆ و 2: ∆( برای بنزوئیک اسید، (051/0A : ∆ و 3: ∆( برای کافئیک اسید و (064/0A :∆ و 4: ∆( برای کوماریک اسید. نتایج نشان داد که از میان چهار نوع کوپیگمانت آزمایش شده، تانیک اسید بهترین کوپیگمانت و بنزوئیک اسید ضعیف ترین کوپیگمانت می باشد که برای آنتوسیانین پیاز قرمز مناسب نمی باشد.
نمودار 1- طیف جذبی آنتوسیانین – تانیک اسید در غلظتهای متفاوت در 5/3= pH
pH=5/3 نمودار 2- طیف جذبی آنتوسیانین – کوماریک اسید در غلظتهای متفاوت در
pH= نمودار 3- طیف جذبی آنتوسیانین – کافئیک اسید در غلظتهای متفاوت در 5/3
نتایج حاصل از تیمار با قند: نتایج تیمار قند نشان داد که غلظت های مختلف ساکارز پایداری آنتوسیانین خالص را افزایش دادند و در غلظت 10 درصد قند میزان پایداری آنتوسیانین بیشتر بود. بنابراین در این غلظت بیشترین میزان آنتوسیانین وجود داشته و این غلظت از قند، غلظت مناسب برای حفظ آنتوسیانین در پیاز بود (نمودار6).
pH= نمودار 4- طیف جذبی آنتوسیانین – بنزوئیک اسید در غلظتهای متفاوت در 5/3
و بدون کوپیگمانت (960mg/L) نمودار 5- مقایسه طیف جذبی آنتوسیانین با کوپیگمانتهای مختلف
طی 72 ساعت (960 mg/L) نمودار 6- اثر ساکارز 10% بر پایداری آنتوسیانین – کوپیگمانت
طی 72 ساعت (960 mg/L) نمودار 7- اثر ساکارز 30% بر پایداری آنتوسیانین – کوپیگمانت
افزایش غلظت قند این اثر را کاهش داد. نتایج در مورد تأثیر قند بر روی کمپلکس آنتوسیانین – کوپیگمانت نشان داد که کوپیگمانت ها بطور کلی پایداری آنتوسیانین را افزایش می دهند و این اثر در غلظت 10 درصد ساکارز بیشتر بوده و در میان کوپیگمانت ها کمپلکس آنتوسیانین – تانیک اسید دارای بالاترین پایداری در غلظت 10 درصد بود. در غلظت 30 درصد ساکارز با وجود یک افزایش ناگهانی در میزان جذب در کمپلکس آنتوسیانین – کوماریک اسید اما همچنان تانیک اسید با یک شیب ملایم بالاترین میزان پایداری در این غلظت را داشت (نمودار7). در غلظت 50% هم مانند دو غلظت قبلی تانیک اسید بالاترین پایداری را دارا بود (نمودار8).
طی 72 ساعت(960mg/L ) نمودار 8- اثر ساکارز 50% بر پایداری آنتوسیانین – کوپیگمانت
بحث
افزودن اسیدهای فنولی به عصاره پیاز قرمز باعث بهبود رنگ عصاره و افزایش شدت رنگ آنتوسیانین می شود. این اضافه کردن تغییراتی را در بت کرومیک و هایپرکرومیک شیفت القا می کند که نشان دهنده کوپیگمانتاسیون آنتوسیانین در محلول بافری است. در مطالعاتی که در پیاز قرمز انجام شد، مشاهده شد که کمپلکس آنتوسیانین – تانیک اسید بیشترین اثر هایپرکرومیک و کمپلکس آنتوسیانین – بنزوئیک اسید کمترین اثر هایپرکرومیک را دارد که این نتایج توسط محققان دیگر نیز به اثبات رسیده است. بر طبق مطالعه ای که توسط مازا و برولارد در سال 1990 انجام شد غلظت کوپیگمانت، نوع آنتوسیانین، قدرت یونی و حلال بر کوپیگمانتاسیون آنتوسیانین مؤثر بودند (21). غلظت کوپیگمانت بر ثبات رنگ بیشتر اثر می گذارد و افزایش غلظت کوپیگمانت ها پایداری رنگ عصاره را شدیدا بهبود می دهند. نتیجه افزودن پنج غلظت متفاوت کوپیگمانت نشان داد که شدت کوپیگمانتاسیون به غلظت مولی وابسته میباشد که مطابق نتایج پژوهش داویس و مازا در سال 1993 میباشد (7). همچنین حیدری و همکارانش در سال 2007 پایداری آنتوسیانین ها در ترکیب با کوپیگمانت را تحت تأثیر PH ، دما و UV بررسی نمودند، آنها نیز به این نتیجه رسیدند که اثرات کوپیگمانت با غلظت آن دارای رابطه مستقیم بوده و با افزایش غلظت بیشتر می شود (26). هم غلظت کوپیگمانت و هم غلظت آنتوسیانین روی میزان کوپیگمانتاسیون مؤثر است، افزایش غلظت آنتوسیانین جذب و بت کرومیک شیفت را افزایش می دهد. افزایش در جذب به نسبت کوپیگمانت به آنتوسیانین بستگی دارد. افزایش نسبت آنتوسیانین – کوپیگمانت بزرگی هایپرکرومیک و بت کرومیک شیفت را افزایش می دهد، زیرا غلظت آنتوسیانین در محلول ثابت است و به همین دلیل غلظت کوپیگمانت تغییر می کند.
قندها به طور کلی در میوه ها وجود دارند و معمولا در طول پروسه آماده سازی مواد غذایی، به محصولات مختلف مثل عصاره میوه ها افزوده می شوند. در مواردی مشخص شده است که قندها، آنتوسیانین ها را محافظت می کنند. ساکارز، آنتوسیانین ها را در طول ذخیره سازی به صورت یخ زده، محافظت می کند و نیز از قهوه ای شدن و شکلگیری رنگدانه های پلیمری جلوگیری می کند که این امر احتمالاً ناشی از مهار واکنش های آنزیمی است (1). همچنین کاهش فعالیت آب نیز توسط قند ها می تواند مانع از تخریب آنتوسیانین ها شود (9). رولستاد و همکاران در سال 1990 نشان دادند که اثر حفاظتی قند روی پیگمانهای آنتوسیانین، ممکن است طی منجمد کردن، نسبت به ذخیره سازی بدون انجماد بهتر باشد. آنها همچنین نشان دادند که قهوه ای شدن و توسعه رنگ های پلیمری به طور معنی داری توسط اضافه کردن قند کاهش می یابد. اثر افزوده شدن قند بر پایداری آنتوسیانین به ساختار، غلظت و نوع قند وابسته است. آنها گزارش کردند زمانی که غلظت پایین است پایداری آنتوسیانین ها ی توت فرنگی افزایش مییابد که مطابق نتایج حاضر است (28). کادیر و همکاران در 1997 مکانیسم قهوه ای شدن را در میوه های ذغالاخته نشان دادند و بیان کردند که PPO ( پلی فنول اکسیداز) و آنتوسیانین نقش مهمی را در واکنش های قهوهای شدن ایفا می نمایند (18). همچنین مشخص شده است که قندها پایداری آنتوسیانین ها را کاهش می دهند (27). در مطالعاتی که توسط داراوینگاس و کین در سال 1968 انجام دادند تمام قند های آزمایش شده (ساکارز، فروکتوز، گلوکوز و گزیلوز )، همگی به یک روش تخریب آنتوسیانین را افزایش دادند (6). از محصولات تخریبی قندها میتوان به فورفورال اشاره کرد (23). واکنش های آنتوسیانین ها با محصولات تخریبی قندها، باعث شکل گیری رنگیزه های پلیمری قهوه ای رنگ می شود (19). بنابراین استفاده از قندها به تنهایی مؤثر نبوده و باید از روش انجماد برای کاهش فعالیت های آنزیمی و مهار قهوه ای شدن برای حفاظت آنتوسیانین استفاده شود. هوانگ (16) و دی انکوس (9) در سال 1956 بر این عقیده بودند که قند آنتوسیانین ها را در طول ذخیره سازی به صورت یخ زده محافظت می کند و نیز از قهوه ای شدن و شکل گیری رنگدانه های پلیمری جلوگیری می کند که این امر احتمالا ناشی از مهار واکنش های آنزیمی است. بنابراین بنظر می رسد آنچه که تأثیر قند بر روی پایداری آنتوسیانین را تعیین می کند غلظت آن است، زیرا در غلظت های پایین ساکارز اثر محافظتی و در غلظت های بالا اثر تخریبی دارد.
در نهایت با توجه به نتایج بدست آمده از پژوهش حاضر مشاهده می شود که کمپلکس آنتوسیانین – کوپیگمانت دارای پایداری بیشتری نسبت به آنتوسیانین به تنهایی است و افزودن موادی بهعنوان کوپیگمانت باعث دوام و پایداری آنتوسیانین در شرایط نامساعد می گردد و عامل منع کننده تخریب رنگیزه های آنتوسیانین می باشد. قند نیز در غلظتهای خاصی موجب پایداری آنتوسیانین شده و در غلظت های بالاتر اثر منفی دارد، بنابراین باید از غلظت های مناسب آنها استفاده شود یا روش انجماد صورت گیرد.