بهینهﺳﺎزی القاء، شرایط کشت و آنالیز فیتوشیمیایی رﻳﺸﻪهای ﻣﻮیین در ﮔیاه دارویی استبرق (Calotropis procera)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
اسماعیل داردان 1
مراد جعفری 2
1 دانشجوی دکتری،‌ گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه
2 استاد گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشگاه ارومیه
چکیده
استبرق (Calotropis procera) از تیره خرزهره، یک گیاه صنعتی و دارویی مهم است. این گیاه منبعی از متابولیت‌های ثانویه متعدد با خواص دارویی مختلف از جمله فعالیت‌های ضد میکروبی و ضدسرطانی می‌باشد. ریشه‌های مویین القاشده توسط Agrobacterium rhizogenes پتانسیل فوق‌العاده‌ای برای تولید متابولیت‌های دارویی مهم فراهم می‌کند. در مطالعه حاضر، اثرات ﺳﻮﯾﻪ‌های A. rhizogenes (A4، A7، A13، K599، ATCC 11325، ATCC 15834)، مدت زمان تلقیح (15 و 30 دقیقه)، نوع ریزنمونه (لپه، محور زیرلپه، نوساقه، ﺑﺮگ) و سن ریزنمونه (14، 18، 24، 32 و 42 ﺭﻭﺯ) بر تولید ریشه مویین در استبرق مورد بررسی قرار گرفت. همچنین اثر محیط‌های مختلف‌ کشت (MS، B5، SH و WPM) بر میزان تجمع زیست‌توده در بهترین لاین‌های ریشه مویین مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل، القاء ریشه‌ی مویین فقط در سویه‌هایATCC 15834 و K599 و ریزنمونه‌های برگ و نوساقه موفقیت‌آمیز بود. حداکثر میزان القاء ریشه‌های مویین (۵۰ %) در ریزنمونه‌های برگی با سن 18 روز در مدت زمان تلقیح 30 دقیقه‌ای با سوبه K599 حاصل شد. بین لاین‌های ریشه مویین از نظر رشد و تولید زیست توده تفاوت معنی‌داری وجود داشت. بیشترین میزان تولید زیست‌توده تر (تقریبا ۱۳ گرم در ۵۰ میلی‌لیتر محیط کشت) در لاین‌های ریشه مویین کشت شده در محیط کشت MS به دست آمد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی، محتوای فنل کل و فلاونوئید کل در لاین‌های ریشه‌ مویین منتخب با تولید زیست‌توده بالا (K5L4 و A15L7) در مقایسه با ریشه‌های غیرتراریخته بیشتر بود. آنالیزGC-MS نشان داد محتوای فیتوشیمایی ریشه‌های مویین استبرق تقریبا ۲ الی ۹ برابر بیشتر از ریشه‌های طبیعی بود.
کلیدواژه‌ها
استبرق
Agrobacterium rhizogenes
ریشه‌های‌ مویین
متابولیت‌های ثانویه
آنالیز GC-MS
موضوعات

عنوان مقاله English

Optimization of induction, culture conditions and phytochemical analysis of hairy roots in the medicinal plant giant milkweed (Calotropis procera)

نویسندگان English

Esmail Dardan 1
Morad Jafari 2
1 Dep. of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran
2 Dep. of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Urmia University, Urmia, I.R. of Iran
چکیده English

Calotropis procera (Aiton), belonging to the family Asclepiadaceae, is an important industrial and medicinal plant. It is a source of numerous secondary metabolites with pharmacological properties such as anticancer and antimicrobial activities. Hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes offer tremendous potential for the production of pharmaceutically important metabolites. In this study, the effects of A. rhizogenes strains (A4, A7, A13, ATCC 15834, ATCC 11325, K599), infection time (15 and 30 min), explant type (cotyledon, hypocotyl, shoot, leaf) and explant age (14, 18, 24, 32, 42 old days) on hairy root production in C. procera were investigated. The effect of different culture media (WPM, SH, B5, MS) on biomass accumulation of the best-grown hairy root lines were also evaluated. Based on the results, hairy root induction was successful only in ATCC 15834 and K599 strains and leaf and shoot explants. Maximum hairy root induction (50%) was obtained using the K599 strain in an infection time of 30 min in 18-day-old leaf explants. There was a significant difference between the hairy root lines in terms of growth and biomass production. The highest amount of fresh root biomass (about 13 g/50 ml culture medium) was obtained in the hairy root lines cultured on MS medium. Antioxidant activity, total phenolic, and total flavonoid contents were higher in selected high-biomass-producing hairy root lines (A15L7 and K5L4) compared to non-transformed roots. The GC-MS analysis showed that the phytochemical content of C. procera hairy roots was about 2 to 9-fold higher than in wild-type roots.

کلیدواژه‌ها English

Calotropis procera
Agrobacterium rhizogenes
Hairy roots
Secondary metabolites
GC-MS analysis

ﺑﻬﻴﻨﻪﺳﺎﺯﻱ القاء، شرایط کشت و آنالیز فیتوشیمیایی ریشه‌های مویین در ﮔﻴﺎﻩ دارویی استبرق (Calotropis procera)

اسماعیل داردان و مراد جعفری*

ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

تاریخ دریافت: ۱۲/۰۹/۱۴۰۱          تاریخ پذیرش: ۲۱/۰۸/۱۴۰۲

چکیده

استبرق (Calotropis procera) از تیره خرزهره، یک گیاه صنعتی و دارویی مهم است. این گیاه منبعی از متابولیت‌های ثانویه متعدد با خواص دارویی مختلف از جمله فعالیت‌های ضد میکروبی و ضدسرطانی می‌باشد. ریشه‌های مویین القاشده توسط Agrobacterium rhizogenes پتانسیل فوق‌العاده‌ای برای تولید متابولیت‌های دارویی مهم فراهم می‌کند. در مطالعه حاضر، اثرات ﺳﻮﯾﻪ‌های A. rhizogenes (A4، A7، A13، K599، ATCC 11325، ATCC 15834)، مدت زمان تلقیح (15 و 30 دقیقه)، نوع ریزنمونه (لپه، محور زیرلپه، نوساقه، ﺑﺮگ) و سن ریزنمونه (14، 18، 24، 32 و 42 ﺭﻭﺯ) بر تولید ریشه مویین در استبرق مورد بررسی قرار گرفت. همچنین اثر محیط‌های مختلف‌ کشت (MS، B5، SH و WPM) بر میزان تجمع زیست‌توده در بهترین لاین‌های ریشه مویین مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل، القاء ریشه­ی مویین فقط در سویه‌هایATCC 15834  و K599 و ریزنمونه‌های برگ و نوساقه موفقیت‌آمیز بود. حداکثر میزان القاء ریشه­های مویین (۵۰ %) در ریزنمونه­های برگی با سن 18 روز در مدت زمان تلقیح 30 دقیقه‌ای با سوبه K599 حاصل شد. بین لاین‌های ریشه مویین از نظر رشد و تولید زیست توده تفاوت معنی‌داری وجود داشت. بیشترین میزان تولید زیست‌توده تر (تقریبا ۱۳ گرم در ۵۰ میلی‌لیتر محیط کشت) در لاین‌های ریشه مویین کشت شده در محیط کشت MS بدست آمد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی، محتوای فنل کل و فلاونوئید کل در لاین‌های ریشه‌ مویین منتخب با تولید زیست‌توده بالا (K5L4 و A15L7) در مقایسه با ریشه‌های غیرتراریخته بیشتر بود. آنالیزGC-MS  نشان داد محتوای فیتوشیمایی ریشه‌های مویین استبرق تقریبا ۲ الی ۹ برابر بیشتر از ریشه‌های طبیعی بود.

واژه های کلیدی: استبرق، Agrobacterium rhizogenes، ریشه‌های‌ مویین، متابولیت‌های ثانویه، آنالیز GC-MS

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی:m.jafari@urmia.ac.ir

مقدمه

 

استبرق با نام علمیCalotropis procera (Aiton)  درﺧﺘﭽﻪای داﺋﻤﯽ و ﭼﻨﺪ‌ﺳﺎﻟﻪ از خانواده Apocynacea است (شکل ۱) که ﺩﺭ ﻧﻮاﺣﯽ ﮔﺮم ﺑﯿﺎﺑﺎﻧﯽ ﺟﻨﻮب ﻏﺮﺑﯽ آﺳﯿﺎ و ﻧﺎﺣﯿﻪ ﻣﺪﯾﺘﺮاﻧﻪ ﺗﺎ ﺳﻮاﺣﻞ آﻓﺮﯾﻘﺎ ﺍﻧﺘﺸﺎﺭ ﺩﺍﺭﺩ (۷ و ۴۵). اﺳﺘﺒﺮق ﺍﺯ ﮔﻮﻧﻪ‌ﻫﺎﻱ ﮔﻴﺎﻫﻲ ﺍﺭﺯﺷﻤﻨﺪ ﺩﺭ ﻋﺮﺻﻪ ﻃﺒﻴﻌﻲ، صنعتی و دارویی می‌باشد. این گیاه به شرایط نامساعد محیطی مانند خشکی، شوری و گرما مقاوم است و در اﺣﯿﺎی زمین‌های ﻣﻨﺎﻃﻖ ﺧﺸﮏ و ﺑﯿﺎﺑﺎﻧﯽ ﻧﻘﺶ ﻣﻬﻤﯽ دارد (۶۷). از الیاف ساقه‌ استبرق، با توجه به توخالی بودن و چگالی کم، ﺑﺮای ﺳﺎﺧﺖ ﮐﺎﻣﭙﻮزﯾﺖﻫﺎی سبک وزن استفاده می­شود (2۸).

 قسمت‌های مختلف استبرق به عنوان دارو به طور سنتی برای درمان بیماری‌های مختلفی مانند صرع، زردی، سرما‌خوردگی و سرفه، اسهال، درمان زخم و عفونت‌های پوستی و قارچی مورد استفاده قرار می‌گیرد (۶۷ و ۴۵). مطالعات فارماکولوژی نشان داد اﺳﺘﺒﺮق دارای فعالیت ضد درد (1۵)، ضد تشنج (4۷)، ضد التهاب (۸)، ضد قارچ (2۷)، ضد باکتری (۳۴) و فعالیت حشره‌کشی (۷) قابل توجهی است. اﺧﯿﺮاً، گزارش شده است ترکیبات فعال استبرق اﺛﺮات سمّیت سلولی ﺑﺎﻻﯾﯽ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺳﻠﻮل‌ﻫﺎی ﺳﺮﻃﺎﻧﯽ دارد (1۲، ۲۳ و ۵۳). طیف وسیعی از ترکیبات زیستی از ﺟﻤﻠﻪ فنل، فلاونوئیدها، ترپنوئیدها، گلیکوزید‌های قلبی، آلکالوئیدها، رزین‌ها، آنتوسیانین‌ و ترکیبات استرولی در اﻳﻦ ﮔﻴﺎه ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﺷﺪه است (2۷ و ۶۷).

تولید متابولیت‌های ثانویه از طریق روش‌های رایج از قبیل جمع‌آوری از طبیعت و کشت در زمین‌های زراعی به دلایل متعددی شامل سرعت و مقدار بسیار پایین تولید، تاثیرپذیری تولید از شرایط نامساعد محیطی، آلودگی های عوامل بیماریزا و عدم صرفه اقتصادی مناسب نمی‌باشد. از طرفی گیاﻫﺎﻥ ﺩﺍﺭﻭﻳﻲ ﺯﻳﺴﺘﮕﺎﻩ ﻃﺒﻴﻌﻲ ﻣﺤﺪﻭﺩﻱ ﺩﺍﺷﺘﻪ ﻭ ﺟﻤﻊﺁﻭﺭﻱ گیاهان دارویی از طبیعت، آنها ﺭﺍ ﺩﺭ ﻣﻌﺮﺽ ﺧﻄﺮ ﺍﻧﻘﺮﺍﺽ ﻗﺮﺍﺭ ﺩﺍﺩﻩ ﺍﺳﺖ (2۳). از طرف دیگر،  متابولیت­های ثانویه­ای که در گیاهان ساخته می­شوند، ممکن است محدود به جنس یا گونه خاصی باشند و یا اغلب در مرحله رشدی خاصی تولید گردند (۶۵). لذا برای تولید سریع و انبوه متابولیت‌های ثانویه، استفاده از روش‌های زیست‌فناورانه ضروری به نظر می‌رسد. کشت ریشه‌های مویین در دو دهه اخیر مسیر جدیدی برای تولید بهبود یافته متابولیت‌های ثانویه فراهم کرده است (1۶ و ۳۶). ریشه­های مویین در شرایط کشت بدون تنظیم‌کننده­ی رشد گیاهی، پایدار بوده و تولید بالایی دارد. رشد سریع، کمتر بودن مدت زمان دو برابر شدن تولید زیست توده، نداشتن زمین‌گرایی، سهولت نگهداری و توانایی سنتز ترکیبات شیمیایی گوناگون از جمله مزایایی ریشه­های مویین بوده که آنها را به منبعی مهم و دایمی برای تولید متابولیت‌های ثانویه تبدیل نموده است (۲۱، ۳۶، ۴۰ و ۵۶).

 تولید ریشه‌های مویین در جنس Calotropis برای اولین بار در گونه C. gigantea مطالعه و گزارش شده است. Sun و همکاران (۵۸) در ریشه‌های مویین این گیاه تولید ترکیبات کاردنولیدی تحت تاثیر محرک‌های کیتوسان، متیل‌جاسمونات و عصاره مخمر را مطالعه کردند. ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﻫﻤﻴﺖ داروﻳﻲ استبرق، اﺳﺘﻔﺎده از روش‌ﻫﺎی زیست‌فناورانه ﺑﺮای ﺗﻮﻟﯿﺪ متابولیت­های دارویی آن ﺿﺮوری ﺑﻪ ﻧﻈﺮ ﻣﻲرﺳﺪ. بر اساس منابع علمی قابل دسترس، تاکنون مطالعات زیست‌فناورانه‌ای در زمینه تراریخت‌سازی ژنتیکی و القا و تولید ریشه مویین با در نظر گرفتن فاکتور‌های موثر در گونه procera C. گزارش نشده است. ﻟﺬﺍ ﺩﺭ ﺍﻳﻦ ﺗﺤﻘﻴﻖ برای اولین بار بهینه­ﺳﺎزی اﻟﻘﺎء رﯾﺸﻪ‌ ﻣﻮﯾﯿﻦ در ﮔﯿﺎه استبرق و ﻣﻘﺎﯾﺴﻪ ﻣﺤﺘﻮای ترکیبات اسانس لاین­های گزینش شده رﯾﺸﻪ ﻣﻮیین در مقایسه با ریشه طبیعی (ریشه غیرتراریخته) مورد ﺑﺮﺭﺳﻲ قرار گرفت.

شکل ۱- درختچه استبرق (الف)، گل‌ها (ب)، کپسول‌های بذر (پ) و بذرها با تارهای ابریشمی (ت). خط مقیاس (الف): ۵۰ میلی‌متر، خط مقیاس (ب و پ): ۱۰ میلی‌متر، خط مقیاس (ت): ۵ میلی‌متر. محل عکس‌برداری: استان هرمزگان، شهرستان پارسیان.

مواد و روشها

مواد گیاهی و کشت گیاه : بذرهای استبرق از مراتع طبیعی شهرستان پارسیان، استان هرمزگان با مختصات جغرافیایی بین ʹ۲۲ °۵۳ طول شرقی و ʹ۷ °۲۷ عرض شمالی و ارتفاع 54 متری از سطح دریا جمع‌آوری گردید. بمنظور ﺗﻮﻟﯿﺪ ﮔﯿﺎهچهﻫﺎی درون‌ شیشه‌ای، بذر‌ها با اﺗﺎﻧﻮل 70 % و ﻣﺤﻠﻮل ﻫﯿﭙﻮﮐﻠﺮﯾﺖ ﺳﺪﯾﻢ 5 %، به ترتیب به مدت 3 و 10 دقیقه ضد عفونی و پس از چند بار شستشو با آب مقطر استریل، در محیط کشت MS (۳۸) کشت و در اتاق رشد با دمای °C 24 و شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شد.

آﻣﺎدهﺳﺎزی ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮی و تلقیح: جهت اﻟﻘﺎء ریشه ﻣﻮﯾﯿﻦ از شش ﺳﻮیه باکتریA. rhizogenes  ﺷﺎﻣﻞ A4، A7، A13، ATCC 11325، ATCC 15834 و K599 استفاده شد. برای تهیه سوسپانسیون باکتری، ابتدا یک تک کلنی از باکتری‌های مذکور در ﻣﺤﯿﻂ کشت  LBﻣﺎﯾﻊ، حاوی50 میلی‌گرم بر لیتر آنتی‌بیوتیک ریفامپیسین کشت گردید و ﺑﻪ ﻣﺪت 48 ﺳﺎﻋﺖ در دﻣﺎی 24 درجه سانتی‌گراد روی ﺷﯿﮑﺮ انکوباتور (شرکت نور صنعت آزما فردوس، ایران) ﺑﺎ ﺗﻜﺎﻧﺶ 180 دور در دقیقه (rpm) ﻗﺮار گرفت. سپس، سوسپانسیون با سرعت rpm 3600 به مدت 10 دقیقه به وسیله سانتریفوژ، رسوب و در mL 10 محیط کشت MS مایع حاوی 100 میکرومولار استوسرینگون حل شد و به مدت 4 ساعت روی شیکر انکوباتور با سرعت rpm 100 در دمای 24 درجه سانتی گراد قرار گرفت.

ﺟﻬﺖ ﺗﻠﻘﯿﺢ ریز نمونه‌های لپه، محور زیرلپه، ساقه و ﺑﺮگ، ﮔﯿﺎهچهﻫﺎی با سنین 14، 18، 24، 32 و 42 روز، ﺗﻮﺳﻂ ﺳﻮزن آﻏﺸﺘﻪ ﺑﻪ ﺑﺎﻛﺘﺮی زﺧﻤﻲ ﺷﺪﻧﺪ و سپس در ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن ﺑﺎﻛﺘﺮی ﺩﺭ دو ﻣﺪﺕ ﺯﻣﺎﻥ 15 ﻭ 30 ﺩﻗﻴﻘﻪ ﻏﻮﻃﻪﻭﺭ ﺷﺪﻧﺪ. ریز‌نمونه‌های تلقیح شده روی کاغذ صافی قرار گرفتند تا باکتری‌های اضافی حذف و برای عمل هم‌کشتی روی محیط کشت MS جامد کشت و در محلی تاریک به مدت 72 ساعت نگهداری شدند. در ادامه ریزنمونه­ها در محیط کشت ½MS مایع حاوی 500 میلی‌گرم بر لیتر آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم به مدت 2 ساعت در شیکر انکوباتور با تکانش rpm 80 و دمای 24 درجه سانتی‌گراد شستشو داده شدند. پس از شستشو، ریزنمونه‌ها در محیط کشت MS جامد حاوی 500 میلی‌گرم بر لیتر آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم کشت و در اتاقک رشد در شرایط تاریکی قرار گرفتند. واکشت ریزنمونه‌ها هر دو هفته یک‌بار انجام و در هر واکشت غلظت سفوتاکسیم به میزان نصف کاهش یافت تا در نهایت از محیط کشت حذف گردید. ﺭﻳﺸﻪﻫﺎﻱ ﺍﻟﻘا‌ﺷﺪﻩ ﺍﺯ ﺭﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ ﺟﺪﺍ ﻭ ﺑﺮﺍﻱ ﺭﺷﺪ ﺑﻴﺸﺘﺮ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ MS ﺟﺎﻣﺪ ﻛﺸﺖ ﻭ ﺩﺭ ﺍﺗﺎﻗﻚ ﺭﺷﺪ ﺑﺎ ﺩﻣﺎﻱ 24 درجه سانتی‌گراد و ﺩﺭ ﺗﺎﺭﻳﻜﻲ ﻧﮕﻬﺪﺍﺭﻱ شدند.

ﺗﺎﯾﯿﺪ ﻣﻮﻟﮑﻮﻟﯽ رﯾﺸﻪﻫﺎی ﻣﻮﯾﯿﻦ: استخراج ‌DNAی ژنومی از ریشه‌ها به روش CTAB (2۹) انجام شد. جهت تأیید ماهیت تراریختگی ریشه­ها از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای تکثیر همزمان بخش‌هایی از ژﻥ‌های rolA و‌ rolB (به صورت Duplex PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (Forward: 5′-CAGTTTCGCATCTTGACAG-3′/Reverse: 5′-GTTCTCGCGAGAAGTGCA-3′) استفاده شد. بمنظور اطمینان از عدم آلودگی میان بافتی با باکتری تلقیح‌شده،‌ تکثیر ژنvirD2  با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (Forward: 5′-CCTGACCCAAACATCTCGGCTGCCCA -3′/Reverse: 5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′) انجام گردید. واکنش PCR شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه واسرشت‌سازی در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و 20 ثانیه، چرخه بسط در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه و در انتها تکمیل چرخه بسط در دمای 72 درجه سانتی‌گراد در مدت زمان 7 دقیقه انجام شد.

بررﺳﯽ ﻣﯿﺰان رﺷﺪ ﻻﻳﻦهای رﯾﺸﻪ ﻣﻮﯾﯿﻦ: جهت مشخص نمودن لاﻳﻦ‌های پررشد، ﻗﻄﻌﺎتی ﺣﺎﻭﻱ ﻣﺮﻳﺴﺘﻢ ﺭأﺳﻲ ربشه از لاین‌های مختلف ریشه مویین PCR+ در ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ MS ﻣﺎﻳﻊ کشت و بر روی شیکر انکوباتور (شرکت نور صنعت آزما، ایران) با دور rpm 100 با دمای 24 درجه سانتی‌گراد و شرایط تاریکی قرار گرفتند و در نهایت ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺗﺠﻤﻊ زیست‌توده ﺗﺮ ﺭﻳﺸﻪﻫﺎ در طی دوره رشد ۳۵ روزه اندازه‌گیری شد.

ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺭﺷﺪ ﻻﻳﻦﻫﺎﻱ ﺭﻳﺸﻪ ﻣﻮﻳﻴﻦ ﺍﻧﺘﺨﺎﺑﻲ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖﻫﺎﻱ ﻣﺨﺘﻠﻒ: ﺑﺮ ﺍﺳﺎﺱ ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺣﺎﺻﻞ ﺍﺯ ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺭﺷﺪ ﻻﻳﻦﻫﺎ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ MS، ﺩﻭ ﻻﻳﻦ K5L4 ﻭ A15L7  که ﺍﺯ ﻧﻈﺮ ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺭﺷﺪ ﺩﺭ ﺑﻴﻦ ﻻﻳﻦﻫﺎﻱ حاصل از تلقیح سویهK599  و ATCC 155834 ﻣﺘﻤﺎﻳﺰ ﺑﻮﺩﻧﺪ، انتخاب و ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺭﺷﺪ آنها در ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖﻫﺎﻱ ½ MS،MS ، B5 (۲۰)،SH  (4۸) و WPM (۳۱) ﻣﻮﺭﺩ ﺑﺮﺭﺳﻲ ﻗﺮﺍﺭ ﮔﺮﻓﺖ. ﻭﺯﻥ ﺗﺮ ﺭﻳﺸﻪﻫﺎ ﻫﺮ پنج روز یک‌ بار ﻭ ﻃﻲ پنج ﻫﻔﺘﻪ ﻣﺘﻮﺍﻟﻲ ﺍﻧﺪﺍﺯﻩ‌ﮔﻴﺮﻱ ﻭ منحنی رشد ریشه‌ها رسم گردید.

اندازه­گیری فنول کل: محتوای فنل کل با استفاده از ﻣﻌﺮف Folin-Ciocalteau اندازه‌گیری شد (۵۴). به 100 میکرولیتر ﻋﺼﺎره متانولی، 750 میکرولیتر معرف فولین 10% افزوده شد و پس از 10 دقیقه نگهداری در دمای اتاق، 750 میکرولیتر کربنات سدیم 10 % اضافه گردید و پس از 2 ساعت میزان جذب نوری نمونه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر قرائت گردید. از ﻏﻠﻈﺖ­ﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ ﮔﺎﻟﯿﮏ اﺳﯿﺪ برای رﺳﻢ ﻣﻨﺤﻨﯽ اﺳﺘﺎﻧﺪارد اﺳﺘﻔﺎده شد و در ﻧﻬﺎﻳﺖ ﻣﺤﺘﻮای ﻓﻨل کل ﺑﺮﺣﺴﺐ هم‌ارز گالیک اسید (میلی­گرم گالیک اسید بر گرم وزن ﺧﺸﻚ) ﮔﺰارش ﺷﺪ.

اﻧﺪازهﮔﻴﺮی ﻣﺤﺘﻮای ﻓﻼوﻧﻮﺋﻴﺪ ﻛﻞ: ﻣﺤﺘﻮای ﻓﻼوﻧﻮﺋﯿﺪ کل ریشه‌های مویین ﺑﺮ اﺳﺎس روش رﻧﮓ‌ﺳﻨﺠﯽ آﻟﻮﻣﯿﻨﯿﻮم ﮐﻠﺮاﯾﺪ اﻧﺠﺎم ﺷﺪ (۱۴). به 5/0 میلی‌لیتر ﻋﺼﺎره ﻣﺘﺎﻧﻮﻟﻲ، به ترتیب 150 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 %، 300 میکرولیتر کلرید آلومینیوم 10 %، 1 میلی‌لیتر استات پتاسیم 1 مولار اضافه شد و در نهایت حجم نهایی با آب مقطر به 5 میلی‌لیتر رسانده شد. ﺑﺮای ﺗﻬﻴﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﺑﻪ ﺟﺎی ﻋﺼﺎره ﻣﺘﺎﻧﻮﻟﻲ، ﺗﻨﻬﺎ از ﻣﺘﺎﻧﻮل ﺧﺎﻟﺺ اﺳﺘﻔﺎده ﮔﺮدﻳﺪ. میزان جذب نوری ﻣﺨﻠﻮط 30 دقیقه ﺑﻌﺪ از ﻧﮕﻬﺪاری در دﻣﺎی اﺗﺎق، در ﻃﻮل ﻣﻮج 415 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ ﺗﻮﺳﻂ دستگاه اسپکتروفتومتر مدل  UV/Vis 2100(شرکت Unico، آمریکا) خوانده شد و ﻣﻴﺰان ﻓﻼوﻧﻮﺋﻴﺪ ﻛﻞ ﺑﺮﺣﺴﺐ هم‌ارز کوئرستین (میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن خشک) ﺗﻌﻴﻴﻦ ﺷﺪ.

اندازه­گیری فعالیت آنتی­اکسیدانی: فعالیت آنتی‌اکسیدانی به روش خنثی کنندگی رادیکال آزاد (DPPH) انجام شد (۱۲). به این منظور، 4 میلی‌لیتر از اﺳﺘﻮک DPPH (004/0 گرم  DPPHدر 100 میلی‌لیتر ﻣﺘﺎﻧﻮل) به 100 میکرولیتر ﻋﺼﺎره متانولی ریشه اضافه و پس از 30 دقیقه نگهداری در دمای اتاق، میزان جذب نوری آن با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 517 نانومتر قرائت گردید و با استفاده از فرمول زیر فعالیت آنتی‌اکسیدانی تعیین شد. جهت تهیه شاهد (بلانک) آنتی‌اکسیدان به جای عصاره ریشه، متانول 80 % اضافه شد.

100 × [Ab-As)/Ab)] = (%) فعالیت رادیکال­های آزاد

Ab: جذب بلانک

As: جذب نمونه

آنالیز کروماتوگرافی گازی-طیف‌سنجی جرمی (GC-MS): جهت تولید اسانس، 25 گرم پودر خشک شده ریشه­های مویین و همچنین ریشه طبیعی ﺑﻪ روش ﺗﻘﻄﻴﺮ ﺑﺎ آب ﺑﺎ استفاده از دﺳﺘﮕﺎه ﻛﻠﻮﻧﺠﺮ (شرکت کیمیا طب گستر،‌ ایران) طبق روش فارماکوپه بریتانیا (۱۰) به شکل جداگانه استفاده شد. ﺗﻔﻜﻴﻚ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت اﺳﺎﻧﺲ با استفاده از کروماتوگرافی گازی Agilent (Agilent Technologies A7890، آمریکا) متصل به طیف‌سنج جرمی Agilent 5975C بر روی یک ستون مویرگی HP-5MS با طول 30 متر و قطر داخلی 25/0 میلی­متر و ضخامت 25/0 میکرومتر انجام گرفت. ﺑﺮﻧﺎﻣﻪ ﺣﺮارﺗﯽ ﺳﺘﻮن در دﻣﺎی اﺑﺘﺪاﯾﯽ 80 درجه سانتی‌گراد و مدت زمان توقف 3 دقیقه شروع و ﺑﺎ ﺳﺮﻋﺖ 5 درجه سانتی‌گراد در ﻫﺮ دﻗﯿﻘﻪ اﻓﺰاﯾﺶ ﯾﺎﻓﺖ ﺗﺎ ﺑﻪ دﻣﺎی 260 درجه سانتی‌گراد رﺳﯿﺪ. از ﮔﺎز ﻫﻠﯿﻢ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﮔﺎز ﺣﺎﻣﻞ ﺑﺎ ﺳﺮﻋﺖ ﺟﺮﯾﺎن 1 ﻣﯿﻠﯽ­ﻟﯿﺘﺮ ﺑﺮ دﻗﯿﻘﻪ و اﻧﺮژی ﯾﻮﻧﯿﺰاﺳﯿﻮن 70 اﻟﮑﺘﺮون وﻟﺖ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. دمای دریچه تزریق 250 درجه سانتی‌گراد و در مد split با نسبت ۵۰۰ : ۱ و محدودة جرمی 40 تا m/z 500 استفاده شد. ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺗﺸﻜﻴﻞ دﻫﻨﺪه اﺳﺎﻧﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﺷﺎﺧﺺﻫﺎی ﺑﺎزداری و ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﻃﻴﻒ ﺟﺮﻣﻲ ﻫﺮ ﻳﻚ از اﺟﺰای اﺳﺎﻧﺲ ﺑﺎ ﻃﻴﻒ ﺟﺮﻣﻲ ﻣﻮﺟﻮد در ﻛﺘﺎﺑﺨﺎﻧﻪﻫﺎی دستگاه (NIST08) انجام شد.

تجزیه آماری: آزمایش ﺗﺎﺛﻴﺮ سویه­های باکتری، ﻣﺪﺕ ﺯﻣﺎﻥ ﺗﻠﻘﻴﺢ، ﺳﻦ و نوع ﺭﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪ­ی گیاهی بر میزان اﻟﻘﺎء ریشه ﻣﻮﯾﯿﻦ ﺑﻪ ﺻﻮرت آزﻣﺎﯾﺶ ﻓﺎﮐﺘﻮرﯾﻞ در ﻗﺎﻟﺐ ﻃﺮح ﮐﺎﻣﻼً ﺗﺼﺎدﻓﯽ ﺑﺎ سه ﺗﮑﺮار اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. ﺗﺎﺛﻴﺮ ﻧﻮﻉ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ ﺑﺮ ﺭﺷﺪ ﺭﻳﺸﻪﻫﺎﻱ ﻣﻮﻳﻴﻦ و ﺁﺯﻣﺎیش‌های ﻣﺮﺑﻮﻁ ﺑﻪ میزان ترکیبات فنل و فلاونوئیدی و فعالیت آنتی­اکسیدانی ﺩﺭ ﻗﺎﻟﺐ ﻃﺮﺡ ﻛﺎﻣﻼ ﺗﺼﺎﺩﻓﻲ ﺩﺭ سه ﺗﻜﺮﺍﺭ ﺍﻧﺠﺎﻡ ﮔﺮﺩﻳﺪ و همه آزمایش‌ها سه بار تکرار شدند. آنالیز داده‌ها توسط نرم افزار SAS 9.4 و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام گرفت.

نتایج

ﺗﺄﺛﯿﺮ عوامل مختلف بر ﻣﯿﺰان اﻟﻘﺎء رﯾﺸﻪ ﻣﻮیین: نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول ۱) نشان داد بین عوامل مختلف یعنی سویه باکتریA. rhizogenes ، ریزنمونه، سن ریزنمونه و مدت زمان تلقیح و همچنین اثرات متقابل بین آنها از نظر اثر بر القاء و تولید ریشه مویین در گیاه استبرق اختلاف آماری معنی‌دار وجود دارد. لازم به ذکر است با توجه به اینکه با استفاده از ﺳﻮﯾﻪهای A4، A7، A13 و ATCC 11325 در ﻫﯿﭻ ﯾﮏ از رﯾﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ با وجود ﮔﺬﺷﺖ دو ﻣﺎه رﯾﺸﻪ ﻣﻮیین القاء ﻧﺸﺪ، این سویه‌ها از آنالیزهای آماری حذف شدند. ولی ﺳﻮﻳﻪ‌هایK599  و ATCC 15834 قادر به القاء رﯾﺸﻪ ﻣﻮﯾﯿﻦ بودند (شکل ۲-الف) و ﺑﯿﻦ این ﺳﻮﯾﻪﻫﺎ از ﻧﻈﺮ میزان اﻟﻘﺎء رﯾﺸﻪ ﺗﻔﺎوت ﻣﻌﻨﯽداری (۰۱/۰ ≤ P) وﺟﻮد داﺷﺖ. ﺑﻴﻦ ﺯﻣﺎﻥﻫﺎﻱ ﺗﻠﻘﻴﺢ نیز ﺍﺯ ﻧﻈﺮ القاء ﺭﻳﺸﻪ ﻣﻮﻳﻴﻦ ﺍﺧﺘﻼﻑ ﻣﻌﻨﻲﺩﺍﺭ ﺁﻣﺎﺭﻱ (۰۱/۰ ≤ P) مشاهده شد. در ریزنمونه­های تلقیح ‌شده با سویه ATCC 15834 در مدت زمان تلقیح 15 دقیقه‌ای ریشه مویین القاء نشد، در حالیکه با استفاده از سویهK599  در هر دو زمان تلقیح (15 و 30 دقیقه‌) ﺭﻳﺸﻪ‌های ﻣﻮﻳﻴﻦ القا شدند، ﺑﺎ این‌حال بیشترین ﻣﻴﺰﺍﻥ القاء ریشه ﺩﺭ مدت ﺯﻣﺎﻥ ﺗﻠﻘﻴﺢ 30 ﺩﻗﻴﻘﻪﺍﻱ حاصل شد (شکل ۲-الف). نوع ریزنمونه نیز در القاء ریشه مویین استبرق موثر بود و بین رﯾﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ از ﻧﻈﺮ میزان القاء ریشه مویین اﺧﺘﻼف آﻣﺎری ﻣﻌﻨﯽدار (۰۱/۰ ≤ P) وجود داﺷﺖ. در رﯾﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎی لپه و محور زیرلپه ﻫﯿﭻ رﯾﺸﻪ‌ای اﻟﻘﺎء ﻧﺸﺪ ولی در ریزنمونه‌های برگ و نوساقه ربشه‌های متعددی القا شدند (شکل‌های ۲-ب و ۳-ب، پ)، که ﺑﯿﺸﺘﺮﯾﻦ تعداد رﯾﺸﻪ اﻟﻘﺎ‌ شده در ﺑﺮگ ﻣﺸﺎﻫﺪه ﺷﺪ. تولید ریشه مویین در استبرق به ﺳﻦ ﺭﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ نیز وابسته بود، که بیشترین درصد القاء ریشه مویین ﺩﺭ ﺭﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎﻱ ﺑﺎ ﺳﻦ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻱ 14 ﺗﺎ 18 ﺭﻭﺯ ظاهر شد. با افزایش سن ﺭﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ به 24 ﺭﻭﺯ درصد القاء ریشه مویین کاسته شد و در ریزنمونه‌های با سن 42 روز القاء ریشه مویین مشاهده نگردید (شکل ۲-پ). شکل ۳ فرآینده کلی تولید ریشه مویین توسط A. rhizogenes در گیاه استبرق و استقرار آنها در محیط کشت مایع را نشان می‌دهد.

ﺗﺄﻳﻴﺪ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﻣﺎﻫﻴﺖ ﺗﺮارﻳﺨﺘﻲ رﻳﺸﻪﻫﺎی ﻣﻮﻳﻴﻦ: ﺟﻬﺖ تعیین وضعیت ﺗﺮارﯾﺨﺘﯽ ریشه‌های مویین تولید شده از آنالیز Duplex PCR ﺑﺮای ﺗﮑﺜﯿﺮ همزمان بخشی از ژن‌های rolA و rolB (در ناحیه T-DNA) اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ و نوار مورد انتظار (bp ۱۲۰۰~) در ریشه­های مویین تکثیر گردید که نشان دهنده تلفیق این ژن‌ها در ژنوم گیاه است (شکل ۴-الف). همچنین عدم تکثیر ژن virD2، که در خارج ازT-DNA  قرار دارد و در فرآیند ترانسفورماسیون توسط باکتری به ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﮔﯿﺎﻫﯽ انتقال نمی‌یابد،‌ دلیلی بر عدم هر گونه آلودگی باکتریایی در فضاهای بین سلولی و اطمینان از تراریخته بودن ریشه­های مویین بود (شکل ۴-ب). به این ترتیب ماهیت تراریختگی ریشه‌های مویین تولید شده تایید شد.

ﺗﺄﺛﻴﺮ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖﻫﺎﻱ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺑﺮ رشد لاین‌های ریشه مویین: برای تعیین اثر محیط کشت بر رشد ریشه‌های مویین، آنها در محیط‌های مختلف مایع (MS، ½ MS، B5، SH، WPM) کشت شد و سینتتیک رشد ریشه‌ها (شکل ۵-الف) در یک دوره ۴۰ روزه پیگیری شد. پس از فاز ﺗﺄﺧﯿﺮی (lag phase) ۵ روز، ریشه‌ها شروع به رشد نمایی کرده و ﻓﺎز نمایی (exp. phase) تقریبا تا روز ‌۳۰ام ادامه داشت و وزن تر به طور نمایی و در نهایت به صورت خطی افزایش نشان داد. ﺑﻌﺪ از روز ۳۵ام میزان رشد رﯾﺸﻪﻫﺎ کم شد تا اینکه وارد ﻓاز سکون (stationary phase) گردید (شکل ۵-ب). نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول ۲) نشان داد بین محیط‌های کشت از نظر تاثیر بر میزان رشد ریشه‌های مویین استبرق اختلاف آماری معنی‌دار (۰۱/۰P≤) وجود دارد و ﻧﻮﻉ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ بر میزان تجمع وزن ﺗﺮ ﺭﻳﺸﻪﻫﺎﻱ ﻣﻮﻳﻴﻦ استبرق ﺗﺎﺛﻴﺮ ﻣﻌﻨﻲﺩﺍﺭﻱ دﺍﺭﺩ. محیط­ کشت­ MS در مقایسه با سایر محیط‌های کشت­ تاثیر قابل توجهی بر رشد ریشه­های مویین داشت (شکل ۵-ب). ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻭﺯﻥ ﺗﺮ (17/17 گرم) ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ MS و ﻛﻤﺘﺮﻳﻦ ﻭﺯﻥ ﺗﺮ (5 گرم) در ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ WPM بدست آمد.  به این ترتیب اثر ﻣﺤﻴﻂﻫﺎﻱ ﻛﺸﺖ ﺑﺮ ﻣﻴﺰﺍﻥ ﺭﺷﺪ و تولید زیست‌توده ریشه‌های مویین استبرق ﺑﻪ ﺻﻮﺭﺕ B5 ≤ ½ MS < SH < MS  < WPM ﺭﺗﺒﻪﺑﻨﺪﻱ ﺷﺪﻧﺪ.

 

 

جدول ۱- تجزیه واریانس تاثیر سویه باکتری، ریزنمونه، سن ریزنمونه و مدت زمان تلقیح بر اﻟﻘﺎء ریشه مویین در گیاه استبرق.

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

سویه باکتری

۱

⁎⁎۰۴/۵۸۷۲

ریزنمونه

۱

⁎⁎۰۱/۲۰۹

سن ریزنمونه

۳

⁎⁎۶۹/۹۵۵

مدت زمان تلقیح

۱

⁎⁎۰۸/۴۱۹۰

سویه باکتری × ریزنمونه

۱

⁎⁎۷۸/۲۲۳

سویه باکتری × سن ریزنمونه

۳

⁎⁎۸۴/۹۳۹

سویه باکتری × مدت زمان تلقیح

۱

⁎⁎۱۳/۶۶۹

ریزنمونه × سن ریزنمونه

۳

⁎⁎۵۳/۲۴۷

ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۱

⁎⁎۷۵/۴۰

سن ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۳

⁎⁎۱۸/۱۸۰

سویه باکتری × ریزنمونه × سن ریزنمونه

۳

⁎⁎۴۹/۵۰

سویه باکتری × ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۱

⁎⁎۶۴/۱۳۶

سویه باکتری × سن ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۳

⁎⁎۸۹/۱۹

ریزنمونه × سن ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۳

⁎۳۷/۸

سویه باکتری × ریزنمونه × سن ریزنمونه × مدت زمان تلقیح

۳

⁎۰۲/۷

خطا

۶۴

۳۹/۲

ضریب تغییرات (٪)

-

۱۶/۸

⁎، ⁎⁎و  nsبه ترتیب معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد، ۱درصد و عدم وجود تفاوت معنی‌دار.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل ۲- تاثیر عوامل مختلف بر القاء ریشه مویین در گیاه استبرق. الف) تاثیر سویه باکتری و مدت زمان تلقیح، ب) تاثیر ریزنمونه، پ) تاثیر سویه باکتری، مدت زمان تلقیح (دقیقه)، نوع و سن ریزنمونه (روز). داده‌ها بیانگر میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش مستقل سه تکراری است. حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی‌دار (۰۱/۰P ≤ ) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

 

 

مقایسه ﻻﻳﻦﻫﺎﻱ ﺭﻳﺸﻪ ﻣﻮﻳﻴﻦ از نظر تولید زیست‌توده: نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول ۳) نشان داد بین لاین‌های ریشه مویین استبرق از نظر تاثیر میزان رشد و تولید زیست توده اختلاف آماری معنی‌دار (۰۱/۰P ≤ ) وجود دارد. به شکل کلی، لاین‌های حاصل از ترانسفورم با ﺳﻮﯾﻪ K599 از رشد خوبی برخوردار بودند و وزن تر ﺑﯿﺸﺘﺮی ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ لاین­های حاصل از ترانسفورم با ﺳﻮﯾﻪ ATCC 15834 داﺷﺘﻨﺪ (شکل ۳-ح، خ و د و شکل ۶). ﺑﯿﺸﺘﺮﯾﻦ ﻣﯿﺰان وزن تر رﯾﺸﻪ ﻣﻮﯾﯿﻦ، تقریبا 13 گرم در ۵۰ میلی‌لیتر محیط کشت مربوط به ﻻﯾﻦهای K5L4، K5L6 وK5L7  بود که از ﺗﺮانسفورم ﺑﺎ ﺳﻮﯾﻪ K599 حاصل شدند، در ﺣﺎلیکه بیشترین میزان وزن تر در ریشه‌های مویین حاصل از ترانسفورم با ﺳﻮﯾﻪ ATCC 15834، ۶ ﮔﺮم در ۵۰ میلی‌لیتر محیط کشت برآورد شد که مربوط به لاین‌های A15L1، A15L3، A15L7 و A15L9 بود (شکل ۶).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ﺷﮑﻞ ۳- فرآیند تولید ریشه مویین تراریخته توسط A. rhizogenes در گیاه استبرق. الف) گیاهچه‌های درون‌ شیشه‌ای به عنوان منبع ریزنمونه، ب) رﯾﺸﻪ­های ﻣﻮیین القا شده از ریزنمونه برگ، پ) رﯾﺸﻪ­های ﻣﻮیین القا شده از ریزنمونه نوساقه، ت) لاین ریشه مویین A15L7 حاصل از ترانسفورم با باکتری سویه ATCC 15834 با انشعابات فرعی کم، ث) لاین ریشه مویین  K5L4 حاصل از ترانسفورم با باکتری سویه K599، حاوی انشعابات فراوان و رشد سریع، ج) نمای نزدیک از مورفولوژی لاین ریشه مویین A15L7 در ﻣﺤﯿﻂ کشت جامد MS حاوی انشعابات فرعی کم، چ) نمای نزدیک از مورفولوژی لاین ریشه مویین K5L4 در ﻣﺤﯿﻂ کشت جامد ½ MS حاوی انشعابات فراوان، ح) لاین رﯾﺸﻪ ﻣﻮیین K599 با رشدی عالی و تولید زیست‌توده قابل توجه در محیط کشت مایع MS در طول ۳۵ روز، خ) لاین رﯾﺸﻪ مویین  A15L7 با رشدی خوب و تولید زیست‌توده مناسب در محیط کشت مایع  MS در طول ۳۵ روز، د) تولید میزان قابل توجهی زیست‌توده خشک از لاین ریشه مویین پر رشد K5L4 حاصل ترانسفروماسیون با باکتری سویه K599. خط مقیاس (الف، ح و خ): ۱۲ میلی‌متر، خط مقیاس (ب، پ، ج و چ): ۵ میلی‌متر، خط مقیاس (ت، ث و د): ۲۰ میلی‌متر.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ﺷﮑﻞ ۴- آنالیز Duplex PCR برای ژن‌های rolA و rolB (الف) و آنالیز PCR برای ژن virD2 (ب) در لاین‌های ریشه مویین تراریخته استبرق. M) نشانگر‌های ladder 1 Kb DNA  (الف) و 50 bp DNA ladder (ب)، C+): پلاسمید Ri باکتری A. rhizogenes به عنوان کنترل مثبت، C1-): ریشه طبیعی  به عنوان کنترل منفی اول، 1-6) ﺭﻳﺸﻪ­های ﻣﻮﻳﻴﻦ تراریخته، C2-) واکنش PCR بدون DNAی الگو به عنوان کنترل منفی دوم.

 

جدول ۲- تجزیه واریانس تاثیر محیط کشت بر رشد ریشه‌های مویین گیاه استبرق.

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

محیط کشت

۴

⁎⁎۸۲/۲۳   

خطا

۱۰

۱۷/۰

ضریب تغییرات (٪)

-

۰۴/۳

⁎⁎ معنی‌دار در سطح احتمال ۱ درصد.

 

جدول ۳- تجزیه واریانس مقایسه رشد لاین‌های ریشه مویین گیاه استبرق.

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

لاین ریشه مویین

۲۰

⁎⁎۹۴/۳۶   

خطا

۴۲

۲۳/۰

ضریب تغییرات (٪)

-

۱۲/۶

⁎⁎ معنی‌دار در سطح احتمال ۱ درصد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 5- ﺍﺛﺮ ﻣﺤﻴﻂﻫﺎﻱ ﻛﺸﺖ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺑﺮ رشد و تولید زیست‌توده در لاین‌های ریشه مویین استبرق. الف) سینتیک رشد، ب) اثر محیط‌ کشت بر رشد و تولید زیست‌توده در ریشه‌های مویین. داده‌ها بیانگر میانگین سه آزمایش مستقل سه تکراری است. حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی‌دار (۰۱/ ≤ P ) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

شکل ۶- مقایسه رشد ﻻﻳﻦﻫﺎﻱ ریشه مویین تراریخته بر اساس تولید زیست‌توده تر در یک دوره رشد 35 روز در محیط کشت MS. K5L1-K5L10: لاین­های حاصل از ترانسفورم با باکتری A. rhizogenes سویه K599،A15L1-A15L10 : لاین­های حاصل از ترانسفورم با باکتری سویه ATCC 15834، control: ﺭﻳﺸﻪ غیرتراریخته. داده‌ها بیانگر میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش مستقل سه تکراری است. حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی‌دار (۰۱/۰P ≤ ) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

 

ارزیابی محتوای فنل و فلاونوئید کل: نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول ۴) نشان داد بین لاین‌های ریشه مویین تولید شده و ریشه طبیعی استبرق (شاهد) از نظر محتوای ﻓﻨﻠﻲ و فلاونوئیدی تفاوت ﻣﻌﻨﻲداری (۰۱/۰ ≤ P) وﺟﻮد دارد. ﻣحتوای فلاونوئید کل در ریشه­های مویینA15L7  و  K5L4 به ترتیب ۸۵/۱ و ۰۸/۲ برابر بیشتر از ربشه­های طبیعی بود (شکل ۷-الف). از نظر محتوای فنل کل نیز ریشه­های مویین برتر بودند، به طوری که میزان فنل کل لاین‌های A15L7 و K5L4 تقریبا ۷۳/۱ و ۱۷/۲ برابر ریشه طبیعی بود (شکل ۷-ب).

ظرفیت آنتی­اکسیدانی: فعالیت آنتی‌اکسیدانی بر اساس مهار رادیکال آزاد مبتنی بر اهدای اﺗﻢ ﻫﻴﺪروژن بر ﻣﻴﺰان ﺑﻲ‌رﻧﮓ ﻛﺮدن ﻣﺤﻠﻮل DPPH، اندازه­گیری شد. نتایج تجزیه واریانس (جدول ۴) نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (۰۱/۰ ≤ P) بین ریشه‌های مویین و ریشه طبیعی از نظر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بود. لاین‌های ریشه‌ مویین K5L4 و A15L7 به ترتیب ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ۳۷ % و ۹۶/۳۲ % نشان دادند که تقریبا دو برابر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ریشه‌های طبیعی (23/1۸%) بود (شکل ۷-پ).

تجزیه و تحلیل ترکیبات اسانس: آنالیز GC-MS برای اسانس دو لاین ریشه‌ مویین گزینش‌شده حاصل از دو نوع سویه باکتری در مقایسه با ریشه طبیعی گیاه انجام گرفت که کروماتوگرام آنالیز در شکل ۸ نشان داده شده است و ترکیبات مهم قابل شناسایی به صورت خلاصه در جدول ۵ آمده است. نتایج آنالیز GC-MS نشان داد که ریشه­های مویین استبرق قادر به تولید ترکیبات مختلفی بودند که بعضی از این ترکیبات در ریشه غیرتراریخته وجود نداشت. از مجموع 72 ترکیب شناسایی شده، 49 و 48 ترکیب، به ترتیب، در اسانس لاین‌های ریشه مویین K5L4 و A15L7 شناخته شد (جدول ۵ خلاصه‌ای از مهمترین آنها را نشان می‌دهد). آلکان­ها با 97/19 % و 62/17 % بیشترین گروه ترکیبات اسانس A5L4 و A1L8 بودند. اسیدهای کربوکسیلیک دومین قسمت اصلی اسانس A5L4 وA15L7 ، به ترتیب، با مقادیر 58/15 % و 5/16 % بود. از ترکیبات مهمی که در ریشه‌های مویین در مقایسه با ریشه طبیعی به مقدار زیاد تولید شده‌اند، می‌توان به 2-pentylfuran (۶ الی ۹ برابر)، 4′-hydroxyacetophenone (۲ الی ۶ برابر)، methyl salicylate (۲ الی ۳ برابر)، tetradecanal (۲/۱ الی ۵ برابر)، Linalool (~ ۲ برابر) و caryophyllene oxide (۵/۱ الی ۵/۶ برابر) اشاره نمود که کاربرد‌های متنوع مهمی از جمله کاربردهای دارویی و صنعتی دارند. بین دو لاین ریشه مویین تفاوت‌های کمی در محتوای ترکیبات شیمیایی وجود داشت (جدول ۵). ترکیباتی مانند  nonenal،2, 6-dimethyldecalin ، 3-methyldecane وcis-1-ethyl-2-methylcyclopentane  در ریشه‌های مویین وجود داشت، ولی در ریشه­های طبیعی شناسایی نشد. همچنین، ترکیب 2-ethyl-1-hexanol تنها ماده‌ای بود که فقط در لاین ریشه مویین A15L7 شناسایی شد اما در لاین K5L4 و همچنین ریشه طبیعی وجود نداشت.

 

 

جدول ۴- تجزیه واریانس مقایسه لاین‌های ریشه مویین با ریشه طبیعی گیاه استبرق از نظر محتوای فلاونوئید کل، فنل کل و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی.

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

فلاونوئید کل

فنل کل

ظرفیت آنتی‌اکسیدانی

نمونه ریشه

۲

⁎⁎ ۸۳/۷      

⁎⁎ ۰۵/۷۶   

⁎⁎۹۹/۲۸۱   

خطا

۶

۰۵۳/۰  

۱۵/۰

۲۷/۰

ضریب تغییرات (٪)

-

۰۴/۵

۷۳/۲

۷۸/۱

⁎⁎ معنی‌دار در سطح احتمال ۱ درصد.

 

 

 

 
 

الف
 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل ۷- محتوای فلاونوئید کل (الف)، فنل کل (ب) و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی (پ) در لاین­های ریشه مویین در مقایسه با ریشه طبیعی استبرق. داده‌ها بیانگر میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش مستقل سه تکراری است. حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی‌دار (۰۱/۰P ≤ ) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

 

بحث و نتیجه گیری

القاء ریشه‌ی مویین بر پایه آلوده‌سازی گیاه با باکتری A. rhizogenes می‌باشد که در طول مراحل آلوده­سازی بخشی از DNAی پلاسمید Ri، تحت عنوان T-DNA به سلول‌های گیاهی منتقل می‌شود و در نتیجه بیان ژن‌های این بخش در سلول گیاه باعث القاء ریشه‌های مویین می‌شود (۲۱ و ۳۶). عوامل مختلفی در افزایش القاء ریشه­ی مویین موثر هستند که یکی از مهم­­ترین آنها نوع سویه باکتری است (۱، ۲، ۶ و ۵۹). نتایج این مطالعه نشان داد ﺗﻮاﻧﺎﯾﯽ ﺳﻮﯾﻪﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ در ترانسفورماسیون ﺳﻠﻮل ﮔﯿﺎه استبرق ﻣﺘﻔﺎوت است، به طوری‌ که از ﺑﯿﻦ ﺳﻮﯾﻪﻫﺎی استفاده شده، تنها سوﯾﻪ‌هایK599  و ATCC 15834 قادر به القاء ریشه مویین بودند (شکل 2-الف ). اﯾﻦ ﺗﻔﺎوت ﺑﻪ قدرت و شدت قابلیت بیماریزایی سویه بستگی دارد که این خصوصیت توسط ژنوم و نوع ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ‌هایRi  موجود در ﺳﻮﯾﻪﻫﺎی ﺑﺎﮐﺘﺮی A. rhizogenes تعیین می‌شود (۴۱ و ۵۹). بر اساس نتایج حاصل قابلیت ترانسفورم سویه K599 بالاتر از سویه ATCC 15834 بود (شکل 2-الف و ب). سویه K599 یکی از سویه‌های با قابلیت بیماریزایی بالا در بین سویه‌های مختلف A. rhizogenes می‌باشد (۶۴). توالی‌هایی به نام‌ توالی‌های محرک انتقال DNA (DNA simulator sequences)، که در بین سویه‌های مختلف با تکرارهای متعددی روی پلاسیمد Ri حضور دارند، کارآیی ترانسفورماسیون توسط سویه باکتری را تقویت می‌کنند (۳۷). وجود تفاوت در القاء ریشه مویین در سویه­های مختلف در مطالعات دیگر نیز به اثبات رسیده است (۵ و ۴۹). از دلایل دیگر تفاوت در پتانسیل القاء ریشه­ مویین، تعداد رونوشت T-DNA وارد شده (۱۷ و ۲۵) و محل تلفیق آن در ژنوم گیاهی است که میزان القاء ریشه مویین را تحت تأثیر قرار می­‌دهد (1۹ و ۶۲).

 

 

 

جدول ۵- ترکیبات فرار تولید شده در لاین­های ریشه مویین K5L4 وA15L7  در مقایسه با ریشه طبیعی استبرق.

ردیف

زمان بازداری

ترکیب

Peak Area (%)

(دقیقه)

 

K5L4

A15L7

ریشه طبیعی

۱

170/5

cis -1-ethyl-2-methylcyclopentane

57/1

34/1

-

 

۲

328/5

3-ethyl-2-methylheptane

88/0

55/0

88/0

 

۳

768/5

benzaldehyde

22/2

98/1

05/2

 

۴

228/6

cis-1,4-dimethylcyclohexane

76/0

70/0

55/0

 

۵

355/6

2-pentylfuran

۴۰/6

۱۶/۹

۰۳/1

 

۶

996/6

4-methyldecane

۴۸/1

75/1

۸2/0

 

۷

125/7

2-ethyl-1-hexanol

-

76/0

-

 

۸

531/7

benzeneacetaldehyde

78/0

74/0

12/1

 

۹

815/7

trans 2-dodecenal

00/1

91/0

87/0

 

۱۰

072/8

3-methyldecane

۹7/0

94/0

-

 

1۱

390/8

4-methylbenzaldehyde

62/1

34/1

77/0

 

1۲

758/8

linalool

۵6/3

76/3

99/1

 

1۳

860/8

nonanal

90/0

86/0

۰۳/3

 

1۴

334/9

1-ethyl-2-propylcyclohexane

62/1

57/0

-

 

1۵

640/9

cis-di-tert-butylethylene

67/0

69/0

60/0

 

1۶

809/9

cyclohexanecarboxylic acid

89/0

90/0

56/0

 

1۷

009/10

3,4-hexadien-1-ol

08/1

90/0

-

 

۱۸

148/10

nonenal

۵۲/۱

34/1

-

 

۱۹

272/10

4′-hydroxyacetophenone

۳۵/۹

۷۳/۲۳

95/3

 

2۰

588/10

ethyl-2,3-dimethylcyclohexane

72/0

78/0

87/0

 

2۱

022/11

methyl salicylate

۳6/۱۰

۵۰/۱۱

99/3

 

2۲

138/11

dodecane

48/1

92/0

55/0

 

2۳

256/11

2,6-dimethyldecalin

53/1

04/1

-

 

2۴

405/11

2,3-dimethyldecahydronaphthalene

55/1

49/1

43/1

 

2۵

555/11

β-cyclocitral

87/0

09/1

54/0

 

۲۶

75012

cinnamaldehyde

01/1

35/2

99/1

 

۲۷

171/13

thymol

۴۶/1

52/1

32/1

 

۲۸

820/19

caryophyllene oxide

59/3

84/0

54/0

 

۲۹

705/20

α-eudesmol

51/1

96/1

55/0

 

۳۰

780/20

2-isopropylphenol

15/1

61/0

-

 

۳۱

768/21

tetradecanal

۰۹/۱۰

۲۹/۲

۹۱/۱

 

۳۲

990/22

benzylbenzoate

36/1

09/1

76/0

 

۳۳

508/26

dibutyl phthalate

16/1

59/0

31/

 

۳۴

335/30

tricosane

۲۶/2

45/1

۴7/0

 
               

شکل ۸- کروماتوگرام آنالیز GC-MS اسانس لاین‌های ریشه مویین استبرق. الف) ﻻﻳﻦ A5L4، ب) ﻻﻳﻦ A15L7، پ) ریشه طبیعی.

 

ﻧﻮع و ﺳﻦ رﯾﺰ‌ﻧﻤﻮﻧﻪ ﮔﯿﺎﻫﯽ نیز ﺑﺮ میزان القاء رﯾﺸﻪ ﻣﻮﯾﯿﻦ ﺗﺎﺛﯿﺮ دارد، که این حساسیت می­تواند به علت وضعیت فیزیولوژیکی بافت­ها باشد (۳۵). تفاوت در ﺗﻘﺴﯿﻢ ﺳﻠﻮﻟﯽ و ﺳﻨﺘﺰ DNA، ﺳﺎﺧﺘﺎر دﯾﻮارة ﺳﻠﻮﻟﯽ و وﺿﻌﯿﺖ ﻓﯿﺰﯾﻮﻟﻮژﯾﮑﯽ بافت­های گیاهی ﻣﻤﮑﻦ اﺳﺖ علت تفاوت ﺗﻮاﻧﺎﯾﯽ القاء ریشه ﻣﻮﯾﯿﻦ ﺑﺎﺷﺪ (۳۹ و ۴۴). بنابراین بسته به نوع گیاه و بافت گیاهی فراوانی ترانسفورماسیون متفاوت است. به عنوان مثال، پتانسیل بالای القاء ریشه­مویین در ریزنمونه­های محور زیرلپه درPsoralea corylifolia  (۵)، برگ در Artemisia vulgaris (۵۷) و نوساقه درFicus carica  (۶) گزارش شده است. نتایج مطالعه حاضر نشان داد ریزنمونه‌های برگ و نوساقه برای القاء ریشه مویین در گیاه استبرق بسیار مستعد هستند. همچنین نتایج نشان داد القاء ریشه مویین ﺑﺎ اﻓﺰاﯾﺶ ﺳﻦ رﯾﺰﻧﻤﻮﻧﻪ، ﮐﺎﻫﺶ ﻣﯽﯾﺎﺑﺪ. ویژگی­های فیزیولوژیکی سلول­ها در سنین مختلف تغییر می­یابد، که تأثیر قابل توجهی در پاسخ به میزان آلودگی باکتریایی دارد (1۸). ثابت شده است که ریزنمونه‌های جوان‌تر معمولا توان تکثیر بالاتری داشته، از این رو دارای شرایط مناسب‌تر جهت تراریختگی می­باشند (۵۰). ارتباط درجات مختلف القاء ریشه مویین با سن ریزنمونه­ها طی مطالعات قبلی گزارش شده است (۴۱، ۵۹ و ۶۱). ﺑﻪ ﻋﻨﻮان مثال، در مطالعه Pirian و همکاران (۴۴) بالاترین میزان القاء ریشه مویین در گیاه Portulaca oleracea در ریزنمونه‌های برگی با سن 14 روز بدست آمد. بنابراین با توجه به اثرات متقابل گیاه-پاتوژن، ﺑﺪﯾﻬﯽ اﺳﺖ ﮐﻪ ﻧﻪ ﺗﻤﺎﻣﯽ ﺳﻮﯾﻪﻫﺎی آﮔﺮوﺑﺎﮐﺘﺮﯾﻮم ﻗﺎﺑﻠﯿﺖ ﺑﯿﻤﺎری­زایی داشته و نه هر نوع ریزنمونه‌ای قابلیت القاء ریشه مویین را دارد.

ﺑﯿﻦ ﻻﯾﻦﻫﺎی رﯾﺸﻪ ﻣﻮﯾﯿﻦ استبرق از ﻧﻈﺮ ﻣﯿﺰان رﺷﺪ و ﻣﻮرﻓﻮﻟﻮژی ﺗﻨﻮع ﻣﺸﺎﻫﺪه ﮔﺮدﯾﺪ که متأثر از نوع سویه باکتری مورد استفاده در ترانسفورم بود. ریشهﻫﺎی مویین حاصل از ترانسفورم با سویه K599 ﻣﻮرﻓﻮﻟﻮژی بسیار ﭘﺮاﻧﺸﻌﺎب‌ و رﺷﺪ ﺳﺮﯾﻊتری داشتند. ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت ﻓﻨﻮﺗﯿﭗ رﺷﺪی ﻣﺨﺘﻠﻒ لاین‌های رﯾﺸﻪ‌های ﻣﻮﯾﯿﻦ ﻧﺎﺷﯽ از ﺗﻔﺎوت در ﺗﻌﺪاد روﻧﻮﺷﺖ و ﻣﺤﻞ تلفیق ژنﻫﺎیrol  در درون ژﻧﻮم ﮔﯿﺎﻫﯽ اﺳﺖ (1۶ و 1۷). مطابق با نتایج تحقیق حاضر، Amani و همکاران (۶) نیز تنوع رشدی متفاوتی بین لاین‌های مختلف ریشه مویین F. carica مشاهده کردند و بر مبنای سرعت رشد و میزان تولید زیست‌توده، لاین(های) برتر را انتخاب کردند. رشد ریشه‌های مویین همچنین وابسته به غلظت و برهم‌کنش مواد غذایی موجود در محیط کشت می­باشد و ﺗﻐﯿﯿﺮ ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻣﻮاد ﻣﻐﺬی ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ می‌تواند نرخ رشد ریشه­های مویین را تغییر دهد (۲، ۳۵ و ۵۶). بنابراین تعیین محیط کشت مناسب نیز یکی از اهداف مهم جهت بهینه‌سازی رشد و تولید زیست‌توده مناسب می­باشد. در مطالعه حاضر از بین پنج نوع محیط کشت مورد بررسی، MS مناسب‌ترین محیط برای رشد و تولید زیست‌توده بیشتر در کشت ریشه‌های مویین استبرق تعیین شد.

ترکیبات ﻓﻨﻠﯽ و فلاونوئیدها از جمله متابولیت‌های مهم گیاهی ﻫﺴﺘﻨﺪ ﮐﻪ با بسیاری از فعالیت‌ها زیستی از جمله فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی ارتباط دارند (۴۳). بر اساس نتایج تحقیق حاضر، ترکیبات فنلی و فلاونوئید‌ی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی ریشه‌های مویین نسبت به ریشه‌ طبیعی بالاتر بود. این اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ در ارﺗﺒﺎط ﺑﺎ ﻣﺴﻴﺮ علامت‌رسانی H2O2  باشد ﻛﻪ منجر به ﺗﺤﺮﻳﻚ ﺑﺮﺧﻲ از ژنﻫﺎی ﻣﺮتبط ﺑا مکانسیم دﻓﺎع در ﺑﺮاﺑﺮ ﻋﻮاﻣﻞ ﺧﺎرﺟﻲ، از جمله انتقالT-DNA  در گیاه مورد ترانسفورم، می‌شود که نتیجه با بیوستنر برخی ترکیبات فنلی و فلاوونوییدی همراه می‌باشد (۵). مشابه با نتایج این مطالعه، محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی کل و فعالیت آنتی‌اکسیدانی ریشه‌های مویین Genista tinctoria (۳۳) و Momordica charantia (۶۰) نسبت به ریشه طبیعی بالاتر بودند.

نتایج آنالیز GC-MS  ترکیبات اسانس نشان داد بین اسانس ریشه­های مویین با ریشه طبیعی تفاوت‌های قابل توجهی وجود دارد و ریشه­های مویین استبرق پتانسیل خوبی برای تولید و مطالعه متابولیت­های ثانویه دارد. مشابه با مطالعه حاضر،Abdelkader  و Lockwood (۳) تفاوت در محتوای شیمیایی اسانس ریشه­های طبیعی و ربشه‌های مویین گیاه Anethum graveolens را گزارش کردند. خصوصیات ژنتیکی، سیستم رشدی ریشه­های مویین و شرایط کنترل شده کشت درون‌ شیشه‌ای باعث می‌شود ریشه­های مویین پتانسیل بالایی در میزان و نوع تولید متابولیت‌های ثانویه تولیدی در مقایسه با گیاه کامل نشان دهند. گیاهانی که توان بالای تولید ترکیبات دی­ترپنی (فیتول) را در قلمرو گیاهی داشته باشند، معمولا کم هستند (۵۴). در تحقیق حاضر بررسی ترکیبات اسانس ریشه­­های مویین استبرق نشان داد میزان تولید فیتول در هر دو لاین K5L4 و A15L7 بالا بوده و جز ترکیبات اصلی ربشه‌های مویین می­باشد. اثرات ضدمیکروبی فیتول در مطالعات متعددی به اثبات رسیده است (۲۴). از دیگر ترکیبات قابل توجه در ریشه‌های مویین، tetradecanal است که میزان آن در لاین ریشه‌ مویین K5L4 تا ۵ برابر ریشه غیرترایخته بود. این متابولیت از ترکیبات اصلی آروماتیک در گونه­های Calotropis  است که داری خواص ضدمیکروبی می‌باشد (۵۲ و ۶۶). ترکیب tetradecanal در صنایع آرایشی در ساخت کلد کرم‌ها (۲۲) و همچنین به عنوان سوبسترای طبیعی در واکنش نورتابی باکتریایی مانند باکتری Vibrio fischeri نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد که از نظر زیست‌فناوری در ساخت بیوسنسورهای میکروبی ارزش ویژه‌ای دارد (۳۰). معمولا محتوای ترکیبات شیمیایی ریشه‌های مویین بیشتر و متنوع‌تر از سایر بخش‌های گیاه در حالت طبیعی گزارش شده است (۳۷، ۴۱، ۵۷ و ۶۵). در تحقیق حاضر نیز مقدار اکثر متابولیت‌های ثانویه ریشه‌های مویین استبرق بیشتر و مقدار بعضی از ترکیبات خیلی بالاتر (۲ الی ۹ برابر) از ریشه طبیعی برآرود شد.

ﻧﺨﺴﺘﯿﻦ ﮔﺎم در ﮐﺸﺖ رﯾﺸﻪﻫﺎی ﻣﻮﯾﯿﻦ ﯾﺎﻓﺘﻦ ﻣﻨﺎﺳﺐﺗﺮﯾﻦ ﺳﻮﯾﮥ ﺑﺎﮐﺘﺮی و ﺑﻬﺘﺮﯾﻦ رﯾﺰﻧﻤﻮنه ﮔﯿﺎﻫﯽ ﺟﻬﺖ القاء ریشه­ی ﻣﻮﯾﯿﻦ اﺳﺖ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻣﻄﺎلعه ﺣﺎﺿﺮ ﻋﻼوه ﺑﺮ ﺗﻌﯿﯿﻦ بهترین سویه باکتری (K599) و ﻣﻨﺎﺳﺐﺗﺮﯾﻦ رﯾﺰﻧﻤﻮﻧﻪ از نظر نوع و سن (برگ با سن ۱۸ روز)، اﻓﺰاﯾﺶ چند برابری ﻣﯿﺰان متابولیت‌های ثانویه و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در رﯾﺸﻪﻫﺎی مویین ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ریشه­های طبیعی استبرق را اثبات نمود. همچنین در این تحقیق محیط کشت مناسب (MS) جهت حداکثر رﺷﺪ ریشه‌های مویین و تولید بالای زیست‌توده معرفی شد که ﺑﺮای ﺑﻬﯿﻨﻪﺳﺎزیﻫﺎی ﺑﻌﺪی جهت ﺑﻬﺒﻮد ﻣﯿﺰان ﺗﻮﻟﯿﺪ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﯿﺖﻫﺎیﺛﺎﻧﻮﯾﻪ در استبرق ﻣﯽﺗﻮاند ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﻗﺮار گیرد. آنالیز ترکیب شیمیایی ریشه‌های مویین نشان‌دهندة پتانسیل بالای این ریشه‌ها برای تولید متابولیت‌های ثانویه دارویی در گیاه استبرق می­باشد. لذا در مطالعات بعدی می‌توان با استفاده از روش‌های زیست‌فناورانه مانند مهندسی متابولیت، مسیر‌های بیوسنتز و تیمار با عوامل محرک مختلف برای تولید بهیودیافته متابولیت‌های مهم داوریی و صنعتی این گیاه در ریشه مویین را مورد بررسی قرار داد.

سپاسگزاری

نویسندگان مراتب سپاسگزاری خود را از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه ارومیه به خاطر حمایت‌های مالی و از گروه پژوهشی شیمی تجزیه جهاد دانشگاهی واحد استان آذربایجانغربی به خاطر همکاری در آنالیز‌های فیتوشیمی اعلام می‌دارند.

۱- زارع، ن.، مدنی، و.، جمالی گله‌شیخان، ا. و اصغری زکریا ر. (۱۴۰۱). عوامل مؤثر بر کارایی اگروباکتریوم رایزوژنز در القای ریشه‌های مویین تراریخت و ارزیابی تولید والرنیک اسید در ریشه‌مویین گیاه دارویی سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis L.). مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست شناسی ایران)، ۳۵ (۱): ۶۹-۸۳.
۲- سهرابی‌نژاد، ز.، مرعشی، ح.، و مشتاقی، ن. (۱۳۹۷). بهینه‌سازی کشت ریشه‌های مویین گیاه دارویی همیشه بهار (Calendula officinalis L.) به منظور تولید ترکیب دارویی اولئانولیک اسید. مجله پژوهش‌های گیاهی (زیست شناسی ایران)، ۳۱ (۳): ۶۴۰-۶۵۴.
 
3-     Abdelkader, M.S.A., and Lockwood, G.B. (2016). Essential oils from the plant, hairy root cultures and shoot cultures of Egyptian Anethum graveolens (dill). Journal of Essential Oil Research 28(2): 104-112.
4-     Abhyankar, G., Reddy, V.D., Giri, C.C., Rao, K.V., Lakshmi, V.V. S., Prabhakar, S., and Bhattacharya, P.S. (2005). Amplified fragment length polymorphism and metabolomic profiles of hairy roots of Psoralea corylifolia L. Phytochemistry 66(20): 2441-2457.
5-     Alderete, L.G., Ibáñez, S.G., Agostini, E., and Medina, M.I. (2012). Phytoremediation of phenol at pilot scale by tobacco hairy roots. International Journal of Environmental Sciences 3(1): 398-407.
6-     Amani, S., Mohebodini, M., Khademvatan, S., and Jafari, M. (2020). Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Ficus carica L. for the efficient production of secondary metabolites. Journal of the Science of Food and Agriculture 100 (5): 2185-2197.
7-     Anjum, S.I., Hussain, S., Attaullah, M., Ullah Khan, H., Khattak, B., and Fouad, H. (2016). Evaluation of the larvicidal potential of Calotropis procera plant extract against Culex pipiens. International Journal of Mosquito Research 3(6): 1-5.
8-     Arya, S., and Kumar, V.L. (2005). Anti-inflammatory efficacy of extracts of latex of Calotropis procera against different mediators of inflammation. Mediators of Inflammation 31 (4): 228-232.
9-     Batello, C., Marzot, M., Touré, A.H., and Kenmore, P.E. (2004). The future is an ancient lake: traditional knowledge, biodiversity and genetic resources for food and agriculture in Lake Chad Basin ecosystems. Rom, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
10-  British Pharmacopoeia. (1988). Published on the recommendation of the Medicine Commission. Volume 2, London: Her Majesty’s Stationery Office; p. A138.
11-  Chandrawat, P., and R.A. Sharma. (2015). An overview on giant milkweed (Calotropis procera (Aiton)). Journal of Plant Sciences 3(1): 19-24.
12-  Burits, M., and Bucar, F. (2000). Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil. Phytotherapy Research 14: 323-328.
13-  Cerella, C., Muller F., Gaigneaux, A., Radogna, F., Viry, E., Chateauvieux, S., M. Dicato1. and Diederich, M. (2015). Early downregulation of Mcl-1 regulates apoptosis triggered by cardiac glycoside UNBS1450. Cell Death and Disease 6: 1782-1795.
14-  Chang, C.C., Yang, M.H., Wen, H.M., and Chern, J.C. (2002). Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis 10: 178-182.
15-  Dewan, S., Sangraula, H., and Kumar, V.L. (2000). Preliminary studies on the analgesic activity of latex of Calotropis procera. Journal of Ethnopharmacology 73: 307-311.
16-  Dhakulkar, S., Bhargava, S., Ganapathi, T.R., and Bapat, V.A. (2005). Induction of hairy roots in Gmelina arborea Roxb. using Agrobacterium rhizogenes. Founder’s Day Special Issue 261: 100-106.
17-  Doran, P.M. (2002). Properties and applications of hairy root cultures. Plant Biotechnology and Transgenic Plants (Eds. K. M. okasman-caldenty and W. H. Barz). Mercel Dekker Inc., New York, USA, 4: 143-162.
18-  Dupré, P., Lacoux, J., Neutelings, G., Mattar‐Laurain, D., Fliniaux, M.A., David, A., and Jacquin‐Dubreuil, A. (2000). Genetic transformation of Ginkgo biloba by Agrobacterium tumefaciens. Physiologia Plantarum 108(4): 413-419.  
19-  Furze, J.M., Hamill, J.D., Parr, A.J., Robins, R.J., and Rhodes, M.J.C. (1987). Variations in morphology and nicotine alkaloid accumulation in protoplast-derived hairy root cultures of Nicotiana rustica. Journal of Plant Physiology 131(3-4): 237-246.
20-  Gamborg, O. L., Miller, R. A., and Ojima, K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research Journal 50(1): 151-158.
21-  Gantait, S., and Mukherjee, E. (2021). Hairy root culture technology: applications, constraints and
prospect. Applied Microbiology and Biotechnology 105: 35-53.
22-  Hsieh, S.C., Wang, J.H., Lai, Y.C., Su, C.Y., and Lee, K.T. (2018). Production of 1-Dodecanol, 1-Tetradecanol, and 1,12-Dodecanediol through whole-cell biotransformation in Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology 84(4): e01806-17.
23-  Ibrahim, S.R., Mohamed, G.A., Shaala, L.A., Moreno, L., Banuls, Y., Kiss, R., and Youssef, D.T.A. (2014). Proceraside A, a new cardiac glycoside from the root barks of Calotropis procera with in vitro anticancer effects. Natural Product Research 28(17): 1322-1327.
24-  Islam, M.T., Ali, E.S., Uddin, S.J., Shaw, S., Islam, M.A., Ahmed, M.I., et al. (2018). Phytol: A review of biomedical activities. Food and Chemical Toxicology 121:82-94.
25-  Jafari, M., Norouzi, P., Malboobi, M.A., Ghareyazie, B., Valizadeh, M., Mohammadi, S.A., and Mousavi, M. (2009). Enhanced resistance to a lepidopteran pest in transgenic sugar beet plants expressing synthetic cry1Ab gene. Euphytica 165(2): 333-344.
26-  Jha, S., Badypadhyay, M., Chaudhuri, K.N., Ghosh, S., and Ghosh, B. (2005). Biotechnological approaches for the production of forskolin, withanolides, colchicine and tylophorine. Plant Genetic Resources 3(2): 15-101.
27-  Kareem, S.O., Akpan, I., and Ojo, O.P. (2008). Antimicrobial activities of Calotropis procera on selected pathogenic microorganisms. African Journal of Biomedical Research 11: 105-110.
28-  Khairnar, A.K., Bhamare, S.R. and Bhamare, H.P. (2012). Calotropis procera: An ethnopharmacological update. Advance Research in Pharmaceuticals and Biologicals 2(2):142-56.
29-  Khan, S., Irfan, Q., Kamaluddin, A., and Abdin, M. (2007). Protocol for isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable for RAPD and restriction digestion. African Journal of Biotechnology 6: 175-178.
30-  Lee, J., Müller, F., Visser, A.J.W.G. (2019). The Sensitized bioluminescence mechanism of bacterial luciferase. Photochemistry and Photobiology 95(3): 679-704.
31-  Lloyd, G.B., and McCown, B.H. (1980). Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. In Proceedings of the International Plant Propagator’s Society 30: 421-427.
32-  Lourenco, P.M.L., Figueiredo, A.C., Barroso, J.G., Pedro, L.G., Oliveira, M.M., Deans, S.G., and Scheffer, J.J.C. (1999). Essential oils from hairy root cultures and from plant roots of Achillea millefolium. Phytochemistry 51(5): 637-642.
33-  Luczkiewicz, M., and Kokotkiewicz, A. (2005). Genista tinctoria hairy root cultures for selective production of isoliquiritigenin. Zeitschrift für Naturforschung C 60(11-12): 867-875.
34-  Mainasara, M.M., Aliero, B.L., Aliero, A.A., and Dahiru, S.S. (2011). Phytochemical and antibacterial properties of Calotropis procera (Ait.) R. Br. (Sodom Apple) fruit and bark extracts. International Journal of Modern Botany 1(1): 8-11.
35-  Mehrotra, S., Kumar Kukreja, A., Singh Khanuja, S.P., and Nath Mishra, B. (2008). Genetic transformation studies and scale up of hairy root culture of Glycyrrhiza glabra in bioreactor. Electronic Journal of Biotechnology 11(2): 69-75.
36-  Melina, A., Laura, T.A., Oller, W., Paola, S.G., and Agostin, E. (2012). Hairy roots, their multiple applications and recent patents. Recent Patents on Biotechnology 6: 115-133.
37-  Moriguchi, K., Maeda, Y., Satou, M., Hardayani, N.S., Kataoka, M., Tanaka, N., Yoshida, K. (2001). The complete nucleotide sequence of a plant root-inducing (Ri) plasmid indicates its chimeric structure and evolutionary relationship between tumor-inducing (Ti) and symbiotic (Sym) plasmids in Rhizobiaceae. Journal of Molecular Biology 307:771–784.
38-  Murashige, T., and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15, 473–497.
39-  Murthy, H.N., Dijkstra, C., Anthony, P., White, D.A., Davey, M.R., Power, J.B., and Paek, K.Y. (2008). Establishment of Withania somnifera hairy root cultures for the production of withanolide A. Journal of Integrative Plant Biology 50(8): 975-981.
40-  Ono, N.N. and Tian, L. (2011). The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science 180(3): 439-446.
41-  Ooi, C.T., Syahida, A., Stanslas, J., and Maziah, M. (2013). Efficiency of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy roots induction in Solanum mammosum. World Journal of Microbiology and Biotechnology 29(3): 421-430.
42-  Pawar, P.K., and Maheshwari, V.L. (2003) Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family. Indian Journal of Biotechnology 3: 414-417.
43-  Pilaisangsuree, V., Somboon, T., Tonglairoum, P., Keawracha, P., Wongsa, T., Kongbangkerd, A., and Limmongkon, A. (2018). Enhancement of stilbene compounds and anti-inflammatory activity of methyl jasmonate and cyclodextrin elicited peanut hairy root culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (1): 165-179.
44-  Pirian, K., Piri, K. and Ghiyasvand, T. (2012). Hairy roots induction from Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to noradrenaline’s production. International Research Journal of Applied and Basic Sciences 3: 642-649.
45-  Rahimi, M. (2015). Pharmacognostical aspects and pharmacological activities of Calotropis procera. Bulletin of Environment., Pharmacology and Life Sciences 4(2): 156-162.
46-  Ranjan, N., Kumar, S., Singh S.K. and Kumari, C. (2017). Biological morphology and ethano pharmacological importance of Calotropis Species- A Review. International Journal of Current Microbiology and Applied Science 6(4): 1640-1648.
47-  Saleh, I., Abd-ElGawad, A., El Gendy, A.E.N., Abd El Aty, A., Mohamed, T., Kassem, H., and Hegazy, M.E.F. (2020). Phytotoxic and antimicrobial activities of Teucrium polium and Thymus decussatus essential oils extracted using hydrodistillation and microwave-assisted techniques. Plants 9(6): 716-728.
48-  Schenk, R.U., and Hildebrandt, A.C. (1972). Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany 50(1): 199-204.
49-  Shahnawaz, M. (Ed.). (2021). Biotechnological Approaches to Enhance Plant Secondary Metabolites: Recent Trends and Future Prospects (1st ed.). CRC Press. https://doi.org/10.1201/9781003034957
50-  Shilpha, J., Jayashre, M., largia, M.J.V. and Ramesh, M. (2016). Direct shoot organogenesis and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Solanum trilobatum L. Turkish Journal of Biology 40(4): 866-877.
51-  Shkryl, Y.N., Veremeichik, G.N., Bulgakov, V.P., Tchernoded, G.K., Mischenko, N.P., Fedoreyev, S.A. and Zhuravlev, Y.N. (2008). Individual and combined effects of the rolA, B, and C genes on anthraquinone production in Rubia cordifolia transformed calli. Biotechnology and Bioengineering 100(1): 118-125.  
52-  Singh, M., and Javed, K. (2013). Chemical characterization and antimicrobial activity of Calotropis gigantea Linn. flower essential oil collected from northern plain of India. International Journal of Advanced Biotechnology and Research 4: 533-541.
53-  Slingerland, M., Cerella, C., Guchelaar H.J., Diederich, M., and Gelderblom, H. (2013). Cardiac glycosides in cancer therapy from preclinical investigations towards clinical trials. Investigational New Drugs 31: 1087–1094.
54-  Slinkard, K., and Singleton, V.L. (1977). Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture 28(1): 49-55.
55-  Soares, P.M., Lima, S.R., Matos, S.G., Andrade, M.M. and Vasconcelos, S.M. (2005). Antinociceptive activity of Calotropis procera latex in mice. Journal of Ethnopharmacology 99(1):125-9.
56-  Srivastava, S. and Srivastava, A.K. (2007). Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology 27(1): 29-43.
57-  Sujatha, G., Zdravković-Korać, S., Ćalić, D., Flamini, G., and Kumari, B.R. (2013). High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Artemisia vulgaris: hairy root production and essential oil analysis. Industrial Crops and Products 44: 643-652.
58-  Sun, J., Xiao, J., Wang, X., Yuan, X. and Zhao, B. (2012). Improved cardenolide production in Calotropis gigantea hairy roots using mechanical wounding and elicitation. Biotechnology Letters 34(3): 563-569.
59-  Tao, J., and Li, L. (2006). Genetic transformation of Torenia fournieri L. mediated by Agrobacterium rhizogenes. South African Journal of Botany 72(2): 211-216.
60-  Thiruvengadam, M., Praveen, N., John, K.M., Yang, Y.S., Kim, S.H., and Chung, I.M. (2014). Establishment of Momordica charantia hairy root cultures for the production of phenolic compounds and determination of their biological activities. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 118(3): 545-557.
61-  Thwe, A., Valan Arasu, M., Li, X., Park, C.H., Kim, S.J., Al-Dhabi, N.A., and Park, S.U. (2016). Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology 7: 318.
62-  Tiwari, R.K., Trivedi, M., Guang, Z.C., Guo, G.Q., and Zheng, G.C. (2007). Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Reports 26(2): 199-210.
63-  Torkamani, M.R.D., Abbaspour, N., Jafari, M., and Samadi, A. (2014). Elicitation of valerenic acid in the hairy root cultures of Valeriana officinalis L (Valerianaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research 13(6): 943-949.
64-  Veena, V. and Taylor, C.G. (2007). Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 43, 383-403.
65-  Verpoorte, R., Contin, A., and Memelink, J. (2002). Biotechnology for the production of plant secondary metabolites. Phytochemistry Reviews 1(1): 13-25.
66-  Wahba, H.E., and Khalid, K.A. (2018). Comparative study on essential oil composition in various organs of Sodom apple (Calotropis procera) grown wild in Egypt. Asian Journal of Plant Sciences 17(2): 85-90.
67- Yogi, B., Sujeet Kumar, G., and Ashutosh, M. (2016). Calotropis procera (Madar): A medicinal plant of various therapeutic uses-A Review. Bulletin of Environment, Pharmacology and Life Sciences 5(7): 81-74.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 38، شماره 2
تابستان 1404
صفحه 212-222

  • تاریخ دریافت 12 آذر 1401
  • تاریخ بازنگری 10 آبان 1402
  • تاریخ پذیرش 21 آبان 1402