نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Plant growth is greatly influenced by environmental stresses including water deficit, high salinity and extreme temperatures. Therefore, the identification of genes especially those regulatory ones whose expression enables plants to adapt to or to tolerate these stresses, is essential. MYB proteins belong to a big family of transcription factors of plants and they are also active in different stages of plants’ growth and their response to stress. This study was aimed at investigating the expression pattern of TaMYB73 gene, changes in the osmotic regulators content, relative water content in leaves, protein as well as photosynthetic pigments contents of four barley cultivars native to Sistan region (Aklil, Nomar, Nimroz, Zahak) under different levels of drought stress (100% (control), 75% and 50% field capacity). This experiment was performed as a factorial in a completely randomized design with three replications. Results indicated that increasing drought stress levels led to a decrease in the amount of photosynthetic pigments, protein and relative leaf water contents. However, proline and carbohydrate concentrations, carotenoid content and the relative expression of TaMYB73 gene increased. Among the cultivars investigated in this research, the rate of changes in osmotic regulators content, photosynthetic pigments and relative water contents as well as relative expression of TaMYB73 gene in Nimroz cultivar was the highest followed by Aklil cultivar. In order to facilitate the classification of resistant cultivars in terms of stresses, drought stress in particular, through laboratory studies, it is suggested that additional tests be performed in future investigations to confirm the above results.
کلیدواژهها English
بررسی الگوی بیان نسبی ژنTaMYB73 در برخی اقام جو بومی منطقه سیستان تحت تنشخشکی
لیلا فهمیده1*، ایوب مزارعی2 و پریسا پهلوان2
1 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده تولید گیاهی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
2 ایران، زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 12/11/1400 تاریخ پذیرش: 17/02/1401
چکیده
رشد گیاهان به شدت تحت تأثیر تنشهای محیطی چون، خشکی، شوری زیاد، درجه حرارت کم یا زیاد قرار میگیرد و بر این اساس شناسایی ژنها، بهخصوص ژنهای تنظیمکننده که در انطباق یا تحمل تنش نقش دارند بسیار ضروری است. پروتئینهای خانواده MYB یکی از خانوادههای بزرگ عوامل نسخه برداری اختصاصی گیاهی است و نقشهای متنوعی را در مراحل نمو گیاهی و پاسخ به تنشها ایفا میکند. از این رو هدف از این تحقیق بررسی الگوی بیان نسبی ژن TaMYB73 و همچنین تغییرات محتوی تنظیمکنندههای اسمزی، محتوی آب نسبی برگ، میزان پروتئین و رنگیزههای فتوسنزی چهار رقم جو منطقه سیستان (نیمروز، نومار،اکلیل و زهک) تحت سطوح مختلف تنش خشکی (100 درصد ظرفیت زراعی (شاهد)، 75 درصد ظرفیت زراعی و 50 درصد ظرفیت زراعی) بود. این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. نتایج مقایسه میانگین نشان داد با افزایش سطوح تنش خشکی نسبت به سطح شاهد، میزان رنگیزههای فتوسنتزی، محتوی نسبی آب برگ و پروتئین کاهش یافت ولی بیان نسبی ژن ژنTaMYB73 ، غلظت پرولین، کربوهیدرات و میزان کاروتنوئید افـزایش یافت. در بین ارقام مورد بررسی میزان تغییرات تنظیمکنندههای اسمزی، رنگدانههای فتوسنتزی، محتوی آب نسبی برگ و بیان نسبی ژن مورد مطالعه در رقم نیمروز و سپس اکلیل، نسبت به سایر ارقام بالاتر بود. از این رو پیشنهاد میشود در مطالعات بعدی سایر آزمایشات تکمیلی نیز برای تأیید نتایج فوق انجام شود تا بتوان از طریق مطالعات آزمایشگاهی ارقام را از نظر تنشها و بهخصوص تنش خشکی در زمان کمتری دستهبندی نمود.
واژه های کلیدی: پروتئینهای Myeloblastosis، سازوکارهای اسمزی، عوامل رونویسی, واکنش زنجیرهای پلیمراز کمی
* نویسنده مسئول، تلفن: 01732251672 ، پست الکترونیکی:l.fahmideh@gau.ac.ir
مقدمه
جو (Hordeum vulgare L) یکی از مهمترین گونههای زراعی غلات است که پس از گندم، برنج و ذرت بیشترین میزان تولید را داشته و نزدیک به 30 درصد تولیدات غله جهان را به خود اختصاص داده است (20). یکی از مهمترین عوامل محدود کننده رشد و عملکـرد گیاهـان و شایعترین مورد کاهش عملکرد محصول به علت افزایش دما و کاهش آب در دسترس گیاه است (10) که هر ساله خسارتهای زیانباری بر رشد رویشی و زایشی محصولات زراعی و باغی در جهان (11) و به ویژه ایران وارد مینماید (8). از این رو گیاهان در مواجهه با کمبود رطوبت طی واکنشهای مختلف مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و متابولیکی به تنش پاسخ داده و خود را با شرایط محیطی منطبق و متحمل میسازد (9). به طوری که به محض تشخیص تغییرات درون سلولی، مسیرهای پیامرسانی (Signal Transduction) مختلفی به منظور پاسخ به تنش فیزیکی شروع شده و هر یک از آنها بیان دستهای خاص از ژنهای پاسخ دهنده به تنش را سبب میشوند (46). فرآوردههای این ژنها نه تنها بـه عنـوان محافظ سلولها در طی تنش عمل میکنند بلکه در تنظیم ژنهای درگیر در پیامرسانی پاسخ به تنش نیز نقش مهمی دارند (49). فرآورده این ژنها بر اساس نوع عملکرد آنها به دو گروه طبقه بندی میشود: گروه اول پروتئینهای مرتبط با تنش غیرزیستی مانند: چاپرونها، پروتئینهای کانالآبی، پروتئینهای اواخر دوره جنینزایی (late embryogenesis proteins)، آنزیمهای بیوسنتز اسمولیتها، آنزیمهای سمزدایی و آنزیمهای تغییردهنده لیپیدهای غشایی میباشند و گروه دوم هم عوامل پروتئینی درگیر در پیامرسانی و تنظیمکنندههای بیان ژنی مانند: پروتئینکینازها، آنزیمهای درگیر در متابولیسم فسفو لیپیدها و فاکتورهای رونویسی (TFs) را شامل میشوند (72).
فاکتور رونویسی گروهی از پروتئینها هستند که فرآیندهای سلولی را به وسیله تنظیم بیان ژنهای هدف پایین دست کنترل میکنند (61). بخش بزرگی از پروتئینهای اختصاصی گیاهی فاکتور نسخهبرداری هستند که معرف اهمیت این پروتئینها در تکامل گونههای گیاهی هستند (50). ساختار پروتئینی یک فاکتور نسخهبرداری دارای دو دامنه میباشد که شامل دامنه اتصال به DNA که مسئول اتصال به عناصر Cisاختصاصی DNAدر ناحیه راهانداز ژنهای هدف است و دامنه تنظیمی که مسئول تنظیم نسخهبرداری ژنهای هدف میباشد (42). یکی از مهمترین فاکتور رونویسی (TF) پروتئینهای Myeloblastosis هستند که یک خانواده بزرگ از عوامل رونویسی بوده و از اهمیت خاصی در تنظیم فرایندهای نموی و پاسخهای گیاه در برابر عوامل غیرزنده برخوردار هستند (58).
پروتئینهای MYB در واﻗﻊ ﻛﻼس ﻣﺘﻨﻮﻋﻲ از پروتئینﻫﺎی ﻣﺘﺼﻞﺷﻮﻧﺪه به DNA بوده که در ﺗﻨﻈﻴﻢ رونویسی ژنهای گیاهی (یوکاریوتها) دخیل هستند. از ﻣﺸﺨﺼﻪ ﻣﻬﻢ اﻳﻦ ﺧﺎﻧﻮاده، داﺷﺘﻦ ﻳﻚ داﻣﻴﻦ اﺗﺼﺎل به DNA در ناحیه N-teminal که ﺣﻔﺎﻇﺖ ﺷﺪه اﺳﺖ و ناحیه تنظیم رونویسی در C- teminal که مسئول تنظیم فعالیت پروتئین است (53). پروتئینهای MYB گیاهی به چهار گروه عمده MYB-related(Containing a single or partial R1, R2, or R3)، R2R3، R1R2R3 و 4R (Containing four R1and/or R2 domains) تقسیم میشوند (32): به طوری که MYB-R2R3 دارای دو تکرار مجاور، MYB-RIR2R3 دربردانده سه تکرار مجاور هم و یک گروه ناهمگن، MYB-4R دارای 4 تکرار و MYB-related که معمولاً (اما نه همیشه) حاوی تنها یک تکرار MYB هستند (38).
گزارشهای متعددی بر بیان ژنهای خانواده MYB طی تنش غیرزیستی به خصوص تنش خشکی انجام شده است که از جمله میتوان در گیاه آرابیدوپسیس به مطالعه Abe و همکاران (15و21) بر بیان ژن AtMYB2، Jung و همکاران (43) بر بیان ژن AtMYB44،Seo و همکاران (65) بر بیان ژن AtMYB96، در گیاه گندم به مطالعه Agarwal و همکاران (22) بر بیان ژن AtMYB15، Himi و همکاران (40) بر بیان ژن TaMYB10 و Ma و همکاران (48) بر بیان ژن TaMYB2A و در گیاه برنج هم به پژوهش Rahaie و همکاران (56) بر بیان ژن TaMYBsdu1 اشاره کرد. همچنین در پژوهشهایی دیگر که فهمیده و همکاران (12) نعیمی و همکاران (19) و تبارکی و همکاران (4) بر بیان ژن TaMYB73 در گیاه گندم انجام دادند نتایج بیانگر افزایش بیان نسبی ژن فوق طی تنش خشکی بود. در مطالعه دیگری Zhangو همکاران (74) به منظور بررسی بیان ژنهای متحمل به تنش غیرزنده، سه همولوگ A-TaMYB19 ، B-TaMYB19 و D-TaMYB19 ژن TaMYB19 را به گیاه آرابیدوپسیس منتقل و نتایج نشان داد الگوهای بیان این سه ژن در شرایط نرمال مشابه بود اما در شرایط تنش غیرزنده (سرما (دمای پایین)، خشکی (polyethylene glycol)، شوری و Exogenous ABA) و در مرحله گیاهچهای، بیان ژن TaMYB19-B گیاهان تراریخت نسبت به دو توالی همولوگ خود متفاوت بود.
مقاومت به تنش به علت پیچیده بودن اثرات متقابل بین فاکتورهای تنش و نیز تنوع پدیدههای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مؤثر بر رشد و نمو گیاه بسیار پیچیده است (59) از اینرو شناسایی مسیرهای پاسخ به تنش و همچنین مولکولهای واسطه که در انتقال و پردازش تنش در گیاهان نقش دارند، بسیار مهم و پایهای است. بنابراین جهت فهم بیشتر سازوکارهای مقاومت به تنش در گیاهان و دستیابی به منابع ژنتیکی خاص، بررسی تغییرات بیان ژنهای کلیدی خاص و شناخت آثار تنش در ارقام مختلف امری ضروری است (51). از طرفی با وجود تمام مطالعاتی که در ارتباط با سازوکار سلولی و مولکولی پاسخ به تنش خشکی انجام شده است، هنوز درک درستی از سازوکار تنظیمی تحمل به تنش خشکی و حفظ رشد گیاه تحت تنش خشکی وجود ندارد و میطلبد که در این رابطه تحقیقات کاملتری صورت پذیرد(30). از اینرو تحقیق حاضر به منظور بررسی و مقایسه اثر تنش خشکی بر بیان نسبی ژن TaMYB73 و برخی پاسخهای فیزیولوژیک مرتبط با آن در چهار رقم جو بومی منطقه سیستان انجام شد.
مواد و روشها
تهیه بذر و نمونه برداری: این تحقیق در قالب طرح فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار به صورت گلدانی اجرا شد. گلدانهای مورد استفاده از نوع پلاستیکی با قطر دهانه 23 سانتیمتری و ارتفاع 20 سانتیمتر بودند. تیمارهای آزمایشی شامل چهار رقم جو بومی منطقه سیستان (نیمروز، نومار، زهک و اکلیل) و سطوح مختلف تنش خشکی شامل: آبیاری کامل (ظرفیت زراعی)، 75 درصد ظرفیت زراعی و 50 درصد ظرفیت زراعی بود. بذرهای مورد نظر از مرکز تحقیقات کشاورزی شهرستان زابل تهیه و در 1399 در گلخانه تحقیقاتی مرکز زیست فناوری کشاورزی دانشگاه زابل و به صورت گلدانی کشت شد. در هر گلدان 10 عدد بذر کاشته شد و بعد از رسیدن بوتهها به مرحله ۴ برگی عمل تنک کردن انجام و درون هر گلدان 5 بوته یکسان نگهداری شد. پس از استقرار کامل بوتهها و 5/1 ماه بعد از کاشت، تیمارهای تنش خشکی به مدتزمان سه هفته اعمال شد (7). نمونهبرداری از همه برگهای گیاه (مخلوطی از همه برگهای گیاه) در مرحله 3 الی 4 برگی بودن گیاهچه ها و در یکزمان صورت گرفت. در ادامه سنجش بیان نسبی ژن TaMYB73، اندازهگیری میزان پرولین، کربوهیدرات، محتوی آب نسبی برگ، میزان پروتئین و رنگیزههای فتوسنزی انجام شد.
اندازهگیری میزان تنظیمکنندههای اسمزی
میزان کربوهیدرات: به منظور اندازهگیری میزان کربوهیدرات، ابتدا 2/0 گرم بافت سبز گیاه با 10 سیسی الکل اتانول 95% مخلوط شد و سپس محلول به دست آمده به مدت 1 ساعت در حمام بن ماری و در دمای 80 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد شدن، 1 سیسی از محلول را برداشته و به آن 1 سیسی فنل 5 درصد و 5 سی سی اسید سولفوریک 98% اضافه شد. در نهایت با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر 160- VU در طول موج 483 نانومتر قرائت شد (42).
میـزان پـرولین: ابتدا مقـدار 1/0 گـرم بافـت برگـی با 10 میلیلیتر سولفوسالیسـیلیک اسـید 3/3 درصد مخلوط و محلول حاصل پس از صاف کردن بـا سرعت 4000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس به دو میلیلیتر از عصاره، دو میلیلیتر معرف ناین هیدرین و دو میلیلیتر اسید گلاسیال استیک خالص اضافه گردید. پس یک ساعت قـرارگیری لولهها در بنمـاری، مقدار چهـار میلیلیتر تولوئن به هرکدام از لولهها اضافه و به مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شدند. پس از تشکیل دو بخش جداگانه، بخش بالایی رنگی (به رنگ زرد متمایل به قرمـز)، با دقت جدا و در دستگاه اسپکتروفتومتری با طولموج 520 نانومتر انـدازهگیـری شد. میزان پرولین با استفاده منحنـی اسـتاندارد و برحسب میلیگـرم بـر گـرم وزن تر محاسـبه شـد (25).
محتوای رنگیزههای فتوسنتزی برگ: با روش Prochazka و همکاران (54) محاسبه گردید:
Chlorophyll a = (19.3A663 – 0.86A646)V/100W [1]
Chlorophyll b = (19.3A646 – 3.6A663)V/100W [2]
Total Chlorophyll = Chl a + Chl b [3]
Carotenoides = ((1000*A470) - (3.27*mg chl. a) – (104*mg chl. B))/227 [4]
سنجش محتوای نسبی آب برگ (RWC): به منظور سنجش محتوای نسبی آب برگ از روش Filella و همکاران (34) استفاده شد؛ بدین منظور از هر برگ چهار دیسک برگی به قطر یک سانتی متر تهیه و سریعا وزنتر (WF) آنها اندازهگیری شدند. سپس تکههای برگ در پتریهای درب دار حاوی آب مقطر به مدت 24 ساعت شناور شد و پس از گرفتن رطوبت سطحی آنها، وزن اشباع (WT) آنهـا انـدازهگیـری شد. جهت انـدازهگیـری وزن خشـک، نمونهها به مدت 48 ساعت در آون قرار داده شدند و پس از مجاسبه وزن خشک آنها (WD)، میزان محتوای آب نسبی برگ از رابطه زیر محاسبه شد:
(معادله 1)
(%) RWC = [(WF –WD) / (WT –WD )] × 100
اندازه گیری میزان پروتئین: برای سنجش میزان پروتئین به لولههای آزمایش 50 میکرولیتر از عصاره پروتئینی و 5/2 میلیلیتر محلول برادفورد اضافه کرده و به سرعت هم زده و در نهایت جذب در طول موج 595 قرائت گردید. غلظت پروتئین بر حسب میکروگرم بر گرم بافت تازه با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه گردید (27).
ارزیابی مولکولی
استخراج RNA: RNA گیاه جو با استفاده از کیت Total RNA isolation شرکت دنازیست آسیا، مطابق دستورالعمل کیت استخراج شد. کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز یک درصد تعیین شد. تشکیل دو باند RNA ریبوزومی 28srRNA و 18srRNA روی ژل نشان دهنده کیفیت بالای RNA تخلیص شده بود. جهت از بین بردن DNA ژنومی از آنزیم DNase شرکت پیشگام استفاده شد.
طراحی آغازگرها: در این مطالعه از آغازگرهای اختصاصی TaMYB73به همراه ژن 18srRNA استفاده شد. طراحی این آغازگرها بر اساس انتهای '3 به کمک دادههای موجود در پایگاه اینترنتی National Center for Biotechnology Information ((NCBI و همچنین نرم افزارPrimer 3 صورت گرفت. مشخصات آغازگرها در جدول 1 آورده شده است:
جدول 1- توالی آغازگرهای مورد استفاده در واکنش Real Time PCR
|
Reverse Primer |
Forward Primer |
Gene |
|
5’-GGTATTGCGTGTAAGCGTCGTGCT-3’ |
5-’GGTGTTTCTAAAGTCCCCAGTTAG-3’ |
TaMYB73 |
|
5’-AGGGGTCGAAGCGGTAGAGG-3’ |
5’-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3’ |
18srRNA |
سنتز cDNA و بررسی بیان نسبی ژن TaMYB73: مراحل ساخت cDNA با استفاده از کیت Geneall شرکت پیشگام و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. پس از سنتز cDNA بیانژنها با روشReal Time PCR و با دستگاهReal Time PCR set Corbett (3000) با استفاده از کیت EvaGreen ومطابق جدول 2 برای هر نمونه در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. بدین ترتیب که cDNAهای ساخته شده با استفاده از دستگاه Real Time PCR و با شرایط تکثیر شامل: واسرشت اولیه 15دقیقه، سپس40 چرخه به صورت واسرشت سازی 15 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد، اتصال 45 ثانیه در دمای اتصال (مناسب برای جفت آغازگر مورد نظر) و طویلسازی 20 ثانیه در دمای 60- 65 درجه سانتیگراد و در نهایت طویل سازی نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 2- میزان و مواد لازم جهت انجام Real Time PCR
|
مقدار |
مواد |
|
1 µl |
cDNA |
|
4 µl |
Eva Green Master |
|
0.5 µl |
Primer Forward |
|
0.5 µl |
Primer Rivers |
|
14 µl |
PCR-grade water |
برای تمام تیمارها نسبت نرخ بیان ژن هدف (TaMYB73) در مقایسه با ژن کنترل (18srRNA) با استفاده از فرمول ct∆∆2- محاسبه شد (47) و برای هر نمونه سه تکرار برای ژن اختصاصی و سه تکرار برای ژن خانهدار 18S در نظر گرفته شد.
پس از اندازهگیری صفات مورد بررسی، دادههای حاصله بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار تجزیه واریانس و مقایسه میانگین (روش دانکن) شدند. برای این منظور از نرمافزارهای EXCELL و SAS ver 9.1 استفاده شد.
نتایج
رنگیزههای فتوسنتزی: نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که میزان رنگیزههای فتوسنتزی تحت تأثیر سطوح مختلف تنش خشکی، رقم و اثر متقابل رقم در خشکی قرار گرفتند (جدول3). نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل رقم در خشکی نشان داد که با افزایش سطوح خشکی از میزان رنگیزههای فتوسنتزی ارقام مورد بررسی کاسته شد. به طوری که در هر چهار رقم مورد بررسی، بیشترین میزان کلروفیل a، b و کل، طی شرایط شاهد و کمترین میزان این رنگیزه ها، در تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی به دست آمد. در بین ارقام مورد بررسی بیشترین میزان رنگیزههای فوق مربوط به رقم نیمروز در شرایط شاهد بود (شکل 1، 2 و 3). از طرفی با افزایش سطوح تنش خشکی بر میزان کاروتنوئید هر چهار رقم افزوده شد به طوری بیشترین مقدار کاروتنوئید با میانگین 953/0 میلیگرم بر گرم وزن تر مربوط به رقم اکلیل در خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی بود (شکل 4).
جدول 3- نتایج تجزیه واریانس اثر تنش خشکی و رقم بر برخی صفات فیزیولوژیکی 4 رقم جو
|
منابع تغیییرات |
درجه آزادی |
کلروفیل a (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
کلروفیل b (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
کلروفیل کل (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
کاروتنوئید (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
محتوی نسبی آب برگ (%) |
پروتئین (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
|
|
|
تنش خشکی |
2 |
**859/0 |
**511/0 |
**51/2 |
**113/0 |
**18/4075 |
**118/1 |
|
|
|
رقم |
3 |
**0082/0 |
**021/1 |
**054/0 |
**016/0 |
**99/322 |
**279/0 |
|
|
|
تنش خشکیÍرقم |
6 |
**009/0 |
**0041/0 |
**014/0 |
**0042/0 |
**65/26 |
**0404/0 |
|
|
|
خطا |
24 |
0004/0 |
00035/0 |
0007/0 |
00026/0 |
6/3 |
0041/0 |
|
|
|
ضریب تغییرات |
|
76/3 |
64/6 |
16/8 |
98/5 |
05/7 |
004/5 |
|
|
|
ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنیدار، اختلاف معنیدار در سطح 5 و ۱ درصد |
|
||||||||
|
|
|
||||||||
|
شکل 1- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان کلروفیل a ارقام جو |
شکل 2- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان کلروفیل b ارقام جو |
||||||||
|
|
|
||||||||
|
شکل 3- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان کلروفیل کل ارقام جو |
شکل 4- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان کاروتنوئید ارقام جو |
||||||||
محتوی آب نسبی برگ: نتایج تجزیه واریانس دادههای جدول 3 نشان داد که اثر سطوح مختلف تنش خشکی، رقم و اثر متقابل آنها بر میزان محتوی آب نسبی برگ در سطح یک درصد معنیدار بود. نتایج مقایسه میانگین اثرمتقابل رقم در خشکی نشان داد که با افزایش سطوح خشکی، میزان RWC ارقام مورد بررسی نسبت به سطح شاهد کاهش یافت، بهطوری که در شرایط شاهد رقم نیمروز بیشترین میزان RWC (21/88%) را نسبت به سایر ارقام دارا بود هرچند که اختلاف معنیداری بین رقم نیمروز و اکلیل در شرایط شاهد مشاهد نشد و از طرفی در شرایط تنش 50 درصد ظرفیت زراعی نیز رقم نیمروز بیشترین میزان RWC (55/48%) را نسبت به سایر ارقام دارا بود هرچند که اختلاف معنیداری بین رقم نیمروز و اکلیل در شرایط تنش 50 درصد هم مشاهد نشد، در مجموع بیشترین مقدار این صفت در رقم نیمروز و اکلیل در شرایط شاهد مشاهده شد (شکل 5).
میزان پروتئین: نتایج تجزیه واریانس دادههای جدول 3 نشان داد که اثر تنش خشکی، رقم و اثر متقابل رقم در خشکی بر میزان پروتئین در سطح یک درصد معنیدار بود. مقایسه میانگین اثر متقابل رقم در خشکی نشان داد که با افزایش سطح خشکی از میزان پروتئین ارقام مورد بررسی کاسته شد به طوری که بیشترین میزان پروتئین در شرایط شاهد مربوط به رقم زهک بود هرچند که اختلاف معنیداری بین این رقم و رقم اکلیل مشاهده نشد. همچنین از لحاظ میزان پروتئین در بین ارقام مورد بررسی در شرایط تنش خشکی FC 50 اختلاف معنیداری مشاهده نشد، در مجموع بیشترین مقدار این صفت در رقم زهک و اکلیل در شرایط شاهد بهدست آمد (شکل 6).
شکل 5- نتایج اثر متقابل رقم در تنش خشکی بر محتوی آب نسبی برگ ارقام جو
شکل 6- نتایج اثر متقابل رقم در تنش خشکی بر میزان پروتئین برگ ارقام جو
تنظیمکنندههای اسمزی: نتایج تجزیه واریانس دادههای جدول 4 نشان داد که میزان تنظیمکنندههای اسمزی تحت تأثیر سطوح مختلف تنش خشکی، رقم و اثر متقابل رقم در خشکی قرار گرفتند. نتایج مقایسه میانگین اثرمتقابل رقم در خشکی نشان داد که با افزایش سطوح خشکی میزان پرولین و کربوهیدرات ارقام مورد بررسی نسبت به سطح شاهد افزایش یافت، بهطوری که بیشترین میزان پرولین، در شرایط تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی در رقم نیمروز مشاهده شد هرچند که اختلاف معنیداری بین رقم نیمروز و اکلیل در این شرایط مشاهد نشد (شکل 7). همچنین بیشترین مقدار کربوهیدرات نیز در رقم نیمروز در شرایط تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی حاصل شد (شکل 8).
جدول 4- نتایج تجزیه واریانس اثر تنش خشکی و رقم بر میزان بیان نسبی ژن TaMYB73، کربوهیدرات و پرولین 4 رقم جو
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
CTΔΔ |
کربوهیدرات (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
پرولین (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
|
تنش خشکی |
2 |
**619/6 |
**164/0 |
**254/0 |
|
رقم |
3 |
**686/0 |
**039/0 |
**073/0 |
|
تنش خشکیÍرقم |
6 |
**278/0 |
**036/0 |
**004/0 |
|
خطا |
24 |
044/0 |
0003/0 |
0007/0 |
|
ضریب تغییرات |
|
66/3 |
19/7 |
17/8 |
|
ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنیدار، اختلاف معنیدار در سطح 5 و ۱ درصد |
||||
نتایج بررسیهای مولکولی: نتایج استخراج RNA در شکل 9 نشان داده شده است همچنانکه مشاهده میشود دو باند RNA ریبوزومی 18s و 28s روی ژل کیفیت بالای RNA استخراج شده را تایید میکنند.
شکل 7- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان پرولین ارقام جو
شکل 8- نتایج اثر متقایل رقم در تنش خشکی بر میزان کربوهیدرات ارقام جو
|
|
شکل 9- RNA استخراج شده دارای دو باند s 18 و s 28، شماره 1 تا 4 به ترتیب مربوط به ارقام نیمروز، نومار، زهک و اکلیل
نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثر سطوح تنش خشکی، رقم و اثر متقابل رقم در خشکی بر میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 در سطح یک درصد معنیدار بود (جدول 4). نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل رقم در خشکی نشان داد که با افزایش سطوح خشکی بر میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 ارقام مورد بررسی افزوده شد. به طوری که در هر چهار رقم مورد بررسی، بیشترین میزان بیان نسبی ژن طی شرایط تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی به دست آمد و از این نظر اختلاف آماری معنی داری بین ارقام مشاهده شد. در مجموع بیشترین میزان بیان ژن مورد بررسی مربوط به رقم نیمروز در شرایط تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی بود (شکل 10).
شکل 10- نتایج اثر متقابل رقم در تنش خشکی بر میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 ارقام جو
بحث
نتایج این تحقیق نشان داد طی تنش خشکی و با افزایش میزان تنش میزان رنگیزههای فتوسنتزی در هر چهار رقم کاهش یافت، بهطوری که کمترین میزان رنگیزههای فوق در هر چهار رقم مورد بررسی طی تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی و بیشترین میزان آنها هم طی شرایط شاهد حاصل شد. کاهش میزان رنگیزههای فتوسنتزی (کلروفیل a، b و کل) در این مطالعه با یافتههای مطالعه حسنپور لسکوکلایه و همکاران (6) در گندم، گنجی و همکاران (15) و بردهجی و همکاران (3) در گیاه جو همخوانی دارد. این محققین بیان کردند که طی تنش خشکی و با افزایش شدت خشکی میزان رنگیزههای فتوسنتزی گیاه جو و گندم کاهش مییابد. همچنین در تحقیق دیگری مولودی و همکاران (17) اثر سطوح خشکی 35، 60 و 80 درصد ظرفیت زراعی را بر میزان رنگیزههای فتوسنتزی جو بررسی و اظهار کردند که طی تنش خشکی و با افزایش شدت خشکی نسبت به سطح شاهد، میزان کلروفیل a، b و کل کاهش مییابد که با یافتههای این مطالعه همراستا میباشد.
محتـوای کلروفیل برگ شاخصی از قابلیت فتوسنتزی بافتهای گیاهی است و کاهش آن طی تنش باعث کاهش عملکرد در گیاهان میشود (71). براساس نظر Wise و Naylor(70) و Reddy و همکاران (60) تخریب غشاهای تیلاکوئید کلروپلاست و اکسیداسیون نوری کلروفیل طی تولید و افزایش میزان رادیکالهای اکسیژن ممکن است از جمله عوامل کاهش میزان کلروفیل طی تنش خشکی باشد یا این کاهش ممکن است به دلیل افزایش فعالیـت آنزیم کلروفیلاز طی تنش خشکی (6) یا افـزایش سـنتز پرولین به دلیل مشترک بودن پیش ماده کلروفیل و پرولین طی تنش خشکی باشد (16). از طرفی نتایج این مطالعه نشان داد که غلظت کاروتنوئید با افزایش سطوح تنش خشکی به طور قابل توجهی افزایش یافت به طوری که بیشترین میزان این رنگیزه طی تنش 50 درصد ظرفیت زراعی حاصل شد که با یافتههای پژوهش امام و همکاران (1) در گندم و حسینی و همکاران (7) در تریتیکاله مبنی بر اینکه با افزایش شدت تنش میزان کاروتنوئید افزایش مییابد همخوانی دارد. افزایش کاروتنوئیدها طی تنش خشکی ممکن است به دلیل نقش آنتیاکسیدانی بالای آنها باشد که سبب خنثی کردن اثر سمی گونههای اکسیژن فعال و محافظت از سیستم جمعکننده نوری دستگاه فتوسنتزی میشود و از طریق مکانیسمی که چرخه گزانتوفیل نامیده میشود، باعث مصرف اکسیژن و حفاظت از کلروفیل در مقابل فتواکسیداسیون میگردند (41).
محتوی آب نسبی برگ بهعنوان شاخصی برای نشان دادن شدت تنش و کمبود میزان آب در گیاه است (52). در این بررسی اعمال تنش خشکی سبب کاهش RWC در برگهای تمامی ارقام جو مورد مطالعه شد و کاهش میزان این صفت طی تنش خشکی با یافتههای مطالعه Soleimani و همکاران (66) در ژنوتیپهای مختلف گندم نان، گنجی و همکاران (15) و Pask و همکاران (52) در ارقام جو هم راستا میباشد. بر اساس نظرKhan و همکاران (45) کاهش محتوای رطوبت نسبی آب برگ طی تنش خشکی ممکن است ناشی از تجمع هورمون اسید آبسیزیک تولیدی در سلولهای روزنهای باشد طی تنش خشکی در ریشهها تولید و سبب بسته شدن سلولهای روزنهای شده که این امر متعاقباً سبب کاهش RWC میشود. در حالی که بر اساس نظرVenkateswarlu و Ramesh (69) احتمالا در شرایط تنش خشکی گیاهان با افـزایش مـواد اسـمزی در درون بافـتهـا و فضای بین سلولی میـزان آب در پیکـره خـود را بـه حـداقل میرساند تا آب از بافت خاک با نیروی بیشـتری وارد آنهـا شـود که این امر موجب کاهش میزان نسبی آب در شرایط تنش خشـکی میگردد با مقایسه بین چهار رقم مطالعه حاضر هم در شرایط شاهد و تنش، بیشترین میزان RWC مربوط به رقم نیمروز بود. کاهش میزان RWC در شرایط تنش در این مطالعه و اکثر مطالعات گزارش شده است (15 و 33) اما به طور معمول ژنوتیپهایی که بالاترین مقدار این صفت را در شرایط تنش خشکی داشته باشند ژنوتیپهای متحملتری خواهند بود (33 و52).
بررسی تغییرات پروتئین در طول دوره اعمال تنش خشکی نشان داد که میزان پروتئین ارقام مورد مطالعه طی تنش خشکی روندی کاهشی داشت به طوری که پس از اعمال تنش خشکی، کمترین میزان پروتئین برای تمامی ارقام، طی تنش شدید خشکی (50 درصد ظرفیت زراعی) مشاهده شد. در شرایط شاهد هم بین ارقام اختلاف معنیداری وجود داشت و بیشترین میزان پروتئین در این شرایط مربوط به رقم زهک بود و ارقام اکلیل، نومار و نیمروز در مرتبههای بعدی قرار داشتند. بررسیها نشان داده است که واکنش میزان پروتئین برگ به تنش خشکی متغیر بوده میتواند افزایشی، کاهشی یا بدون تغییر باشد (2 و 15). کاهش چشمگیر پروتئین طی شرایط تنش خشکی در مطالعات گنجی و همکاران (15) در رقمهای وحشی جو، مولودی و همکاران (17) در جو بهاره و امینی و حداد (2) در گیاه جو گزارش شده است که با یافتههای این مطالعه مبنی بر این که تنش خشکی سبب کاهش میزان پروتئین به ترتیب در هر چهار رقم جو میشود همخوانی دارند. کاهش چشمگیر پروتئین طی شرایط تنش خشکی ممکن است به دلیل افزایش فعالیت آنزیمهای تجزیهکننده پروتئین و افزایش فعالیت آنزیمهای پروتئاز (36)، کاهش سنتز پروتئین و تجمع اسیدهای آمینه آزاد از جمله پرولین (57) و کاهش زیر واحد روبیسکو و یا افزایش در اکسیداسیون پروتئین (67) باشد.
نتایج این پژوهش نشان داد که طی تنش خشکی و افزایش سطوح آن میزان پرولین در هر چهار رقم جو نسبت به شاهد روندی افزایشی نشان داد. رقم نیمروز و اکلیل در شرایط تنش 50 درصد ظرفیت زراعی بیشترین مقدار این صفت را بین ارقام مورد مطالعه نشان دادند که این نتایج با یافتههای مطالعه محققان در چهار رقم کلزا (5)، پنج رقم گندم دوروم (19) و جو (18) مبنی بر اینکه طی تنش خشکی میزان پرولین ارقام افزایش مییابد و در بین ارقام مورد بررسی آنها نیز رقم یا ارقامی که بیشترین مقدار این صفت را داشتند، ارقام متحملتری بودند همراستا میباشد. در تحقیقی بردهجی و همکاران (3) اثر سطوح خشکی را بر میزان پرولین شش رقم جو (Mastesca ،Funky ،Campagen ، Amistar ، Shangrila و رقم ایرانی یوسف) بررسی و اظهار کردند که طی تنش خشکی میزان پرولین شش رقم نسبت به سطوح شاهد افزایش مییابد که با نتایج این مطالعه نیز همخوانی دارد. همچنین در گزارشی دیگر Stroinskiو Bandurska (24) بیان کردند که محتوای پرولین برگهای گیاه جو تحت تأثیر تنش خشکی به میزان دو برابر افزایش مییابد.
پرولین یکی از مولکولهای اسموپروتکتین است که تجمع آن حتی در باکتریها، قارچها، جلبکها و گیاهان در پاسخ به تنش خشکی و شوری گزارش شده است (55) و مطالعات نشان داده است که تجمع پرولین در شرایط تنش، نقش حمایتی و حفاظتی اساسی از سلولها و بافتها داشته و سبب تحمل و مقاومت به تنشهای محیطی میگردد (64). افزایش پرولین طی تنش خشکی ممکن است ناشی از افزایش فعالیت آنزیمهای شرکت کننده در سنتز پرولین از طریق مسیر گلوتامیت شامل γ- گلوتامین کینار، گلوتامیل فسفات ردوکتاز و ∆1- پیرولین -5- کربوکسیلات رودکتاز باشد (35) یا ممکن است به علت افزایش فعالیت آنزیم پیرولین 5کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) در مسیر گلوتامات باشد که گلوتامات را به گلوتامـات سـمی آلدئیـد (GSA) احیا و سپس به پیرولین 5-کربوکسیلات(P5C) تبدیل میکند (44).
نتـایج بـه دسـت آمـده از این تحقیق نشان داد که افزایش سطوح تنش خشکی سبب افزایش کربوهیدراتهـای محلـول در ارقام مورد مطالعه شد و رقم نیمروز در شرایط تنش 50 درصد ظرفیت زراعی بیشترین مقدار این صفت را دارا بود که این نتیجه بـا نتـایج ارائه شده توسط قلیپور و عبادی (14) در ارقام گندم، گنجی و همکاران (15) در ارقام جو وحشی، مبنی بر اینکه افزایش قندهای محلول و تفاوت در میزان آن در شرایط تـنش خشکی در رقمهای مختلف متفاوت بود و ارقام متحملتر از میزان قندهای محلول بیشتری در شرایط تنش برخوردار بودند، مطابقت دارد. همچنین در تحقیقاتی ناصری و همکاران (18) و نعیمی و همکاران (19) اثر سطوح خشکی را بر تجمع قندهای محلول جو و میزان کربوهیدرات ارقام گندم دوروم بررسی و بیان کردند طی تنش خشکی میزان قندهای محلول و کربوهیدراتها تمامی ارقام مورد مطالعه طی تنش خشکی نسبت به سطوح شاهد افزایش داشت. کربوهیدراتهای محلول نیز مانند پرولین نقش مهمی در فرآینـد تنظیم اسمزی دارند (63) و تحقیقات متعددی در زمینه نقش و افزایش آنها در طی تنش خشکی در غــلات و گــراسهــای معتــدل انجام شده است که همگی بر نقش کربوهیدراتها در تنظیم اسمزی سلول دلالت دارد (15 و 58). افزایش محتوای قندهای محلول تحت تنش خشکی ممکن است به علت افزایش فعالیت آنزیم آمیلاز (73)، هیدرولیز نشاسته و کربوهیدراتهای مرکب به قندهای ساده (28) و کاهش انتقال ساکارز از برگها به سایر قسمتهای گیاه باشد (26).
نتایج این مطالعه نشاد داد که در هر دو سطح تنش خشکی میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 نسبت سطح شاهد به ترتیب افزایش 75 و66 درصدی نشان داد که با یافتههای مطالعه محققان در جو (23)، آرابیدوپسیس (39) و دو ژنوتیپ مقاوم و حساس گندم (9) همخوانی دارد. این محققین بیان کردند که طی تنش خشکی بیان ژنهای خانواده MYB-R2R3 افزایش مییابد. نتایج بررسی تغییر الگوی بیـان ژن TaMYB73 در ارقام جو مورد بررسی نشان داد که ژن انتخاب شده در پاسخ به تنش خشکی در ارقام جو دخیل بوده و تغییـر بیان داشته و سـطح بیـان آن در بین ارقام جو در شرایط تنش خشکی روندی افـزایشی نسبت به سطح شاهد داشته است به طوری بیشترین بیان نسبی در شـرایط تـنش شدید ( FC 50) مربوط به رقم نیمروز و سپس رقم اکلیل بود. در مطالعهای فهمیده و همکاران (12) اثر سطوح خشکی را بر بیان نسبی ژن TaMYB73 پنج رقم گندم نان بررسی و بیان کردند که طی تنش خشکی و با افزایش سطوح خشکی، میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 بین ارقام مورد بررسی و سطوح مختلف خشکی با هم تفاوت معنیداری داشت و رقم هیرمند، رقمی که بهترین پاسخ را نسبت به سایر صفات مورد مطالعه آنها در شرایط تنش داشت، در شدیدترین سطح تنش خشکی نیز بیشترین مقدار بیان نسبی این ژن را نشان داد، که نتایج آنها با یافتههای این مطالعه نیز همراستا میباشد. در گزارشی دیگر Alexander و همکاران (23) بیان ژن HvMYB1 را در گیاهان جو تراریخته تحت تنش خشکی بررسی و بیان کردند که گیاهانی که سطح بیان ژن HvMYB1 دارند در برابر خشکسالی مقاوم تر هستند و نسبت به گیاهان شاهد محتوی نسبی آب بالاتر، میزان هدر رفت آب و هدایت روزنهای کمتری دارند که نتایج آنها با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد. همچنین در تحقیق دیگری اثر سطوح مختلف خشکی (25، 20، 15 و 5 درصد ظرفیت زراعی) بر بیان نسبی ژن TaMYB73 در پنج ژنوتیپ گندم دوروم بررسی و نتایج آنها نشان داد که تحت تنش خشکی و با افزایش سطوح خشکی، میزان بیان ژن TaMYB73 در ارقام مورد بررسی افزایش داشت و ژنوتیپهای بهرنگ و دنا که همزمان واکنش بهتری نسبت به سایر صفات مورد بررسی داشتند، بیشترین میزان افزایش بیان نسبی این ژن را نیز دارا بودند که نتایج آنها نیز تأییدی بر نتایج مطالعه فوق میباشد (19).
فاکتورهای رونویسی به عنوان تنظیم کنندههای ژن هدف، با مشارکت در بسیاری از فرایندهای زیستی باعث سازگاری گیاه با شرایط نامساعد محیطی از جمله خشکی میشوند (28) و از طریق برهمکنش با مناطق سیس-المنت نواحی پروموتری ژنهای مرتبط با تنشهای محیطی سبب افزایش بیان این ژنها و تحمل به تنش میشوند (62). آنالیز دادههای ترانسکریپتومی در آرابیدوپسیس و بسیاری از گیاهان گویای این نکته است که تحمل یا حساسیت به تنشهای محیطی در سطح رونویسی و با برهمکنش ژنهای تنظیمی و عوامل رونویسی در شبکههای تنظیمی کنترل میشود (68). نتـایج مطالعـات قبلـی نشـان دادهانـد کـه TaMYB73در پاسـخ به تنشهای غیرزنده دخیل بوده و میـزان بیـان ایـن ژن در شرایط غرقابی، تنش خشکی و شوری افزایش مییابد (29 و 31 و 39). نتایج تحقیقات بیان داشتند ژنوتیپهایی که دارای واکنشهای مولکولی بهتری در حین مواجهه با تنش میباشند، از سازوکارهای کارآمدتری همانند تنظیم اسمزی که ناشی از تجمع مواد محلول سازگار در سیتوپلاسم سلول است برخودار هستند که نـه تنهـا بـه عنـوان اسـمولیت در تسـهیل نقل و انتقال آب و نگهداری آن در سلولها نقش دارند بلکه در حفاظت و پایدار کردن ماکرو مولکولها، اندامکها، ساختارها نظیـر غشـاءهـا، کلروپلاست و غیره در مقابل تنش نقش مهمی دارند (37). لذا واکنشهای متفاوت مشاهده شده در ارقام یا ژنوتیپهای مختلف نسبت صفات مورد بررسی در مطالعه حاضر و سایر مطالعات قبلی (4 و 12 و 13 و 19) ممکن است به دلایل ژنتیکی و یا سایر خصوصیات و عوامل موثر بر آنها بوده که باعث نشان دادن واکنش بهتر آن ارقام یا ژنوتیپها در مواجه با تنشها میگردد.
نتیجه گیری
نتایج این آزمایش نشان داد با افزایش سطوح تنش خشکی نسبت به سطح شاهد میزان بیان نسبی ژن TaMYB73 در چهار رقم جو مورد بررسی افزایش یافت. همچنین با افزایش سطوح تنش خشکی و همگام با افزایش میزان نسبی ژن TaMYB73، تجمع کاروتنوئید، پرولین و کربوهیدرات هم نسبت به شاهد افزایش بیشتری نشان داد در حالیکه میزان پروتئین، محتوی آب نسبی برگ و رنگدانههای فتوسنتزی (کلروفیل a، b و کل) نسبت به سطح شاهد کاهش چشمگیری داشت. در مجموع برای هر چهار رقم جو مورد مطالعه در شرایط تنش خشکی، افزایش نسبی بیان ژن و افزایش میزان تنظیمکنندههای اسمزی وجود داشت، اما این افزایش در رقم نیمروز بالاتر بود. در مجموع با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق در بین ژنوتیپهای مورد بررسی میزان تغییرات تنظیمکنندههای اسمزی، رنگدانههای فتوسنتزی (کلروفیل a، b و کل)، محتوی آب نسبی برگ و بیان نسبی ژن مورد مطالعه در رقم نیمروز و سپس اکلیل، نسبت به سایر ارقام بالاتر بود. لذا پیشنهاد میشود در مطالعات بعدی سایر آزمایشات تکمیلی نیز برای تأیید نتایج فوق انجام شود تا بتوان از طریق مطالعات آزمایشگاهی ارقام را از نظر تنشها و بهخصوص تنش خشکی در زمان کمتری دستهبندی نمود.
سپاسگزاری
نویسندگان این مقالـه از سرکار خانم مهندس حمیده خواجه (کارشناس آزمایشگاه کشت بافت و بخش مولکولی) جهت همکاری در انجام این پژوهش، کمال تشکر و قدردانی را دارند.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
