بررسی اثر قارچ T22 Trichoderma harizianum و باکتری Thiobacillus spp. روی برخی شاخص‌های فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و رشدی گیاه گوجه‌فرنگی، Lycopersicon esculentum تحت تنش زیستی آفت کرم میوه، Helicoverpa armigera

گوجه­فرنگی Lycopersicon esculentum Miller یکی از مهم­ترین سبزیجات در دنیا محسوب می­شود که از نظر کشت بعد از سیب زمینی مقام دوم را به خود اختصاص داده است (23). کرم میوه گوجه­فرنگی. Helicoverpa. armigera Hubner (Lepidoptera: Noctuidae)،  را می‍توان مخرب­ترین آفت گوجه فرنگی در جهان و ایران محسوب نمود. گونه­های میزبان این آفت از طیف وسیعی از تیره­های گیاهی شامل سیب­زمینی، پنبه، ذرت، نخود، سورگوم، آفتابگردان، سویا، بادام زمینی، توتون، گلرنگ و پسته می­باشند (15) و خسارت ناشی از این آفت روی گوجه فرنگی در حالت طغیانی بین 85 تا 93 درصد گزارش شده است (14). کرم میوه گوجه­فرنگی در مراحل رشدی مختلف می­تواند روی اغلب ساختار­های گیاهی شامل ساقه­ها، برگ­ها، تاج گل و میوه­ها تغذیه کند (17). لاروهای این آفت با تغذیه از اندام­های رویشی و زایشی گیاهان میزبان، سبب کاهش رشد اندام­های زایشی و در نتیجه کاهش شدید میزان تولید محصول می­شوند (9، 11، 33).

گیاهان در مقابل تنش­های غیر زیستی محیطی و نیز تنش­های زیستی از جمله پاتوژن و آفات از مکانیسم های متفاوتی برای دفاع از خود و مقاومت در برابر عامل مهاجم استفاده می­کنند (28). مقاومت به طور مستقیم با فیزیولوژی گیاه مرتبط است و در نتیجه هر عاملی که فیزیولوژی گیاه را تحت تاثیر قرار دهد، منجر به تغییراتی در فرایندهای بیوشیمیایی گیاه و در نتیجه تغییر در در مقاومت گیاه گردد (6 و 25). لذا مدیریت زراعی از جمله سطح و شیوه بهبود وضعیت تغذیه ای گیاهان احتمالا میتواند بر مقاومت نسبی گیاهان به آفات و بیماری­ها موثر باشند (3 و 31). از طرفی، عوامل متعددی بر عملکرد گیاه اثر دارند که از این میان نقش عوامل تغذیه ای بسیار مهم است و تغذیه متعادل با کودهای آلی و شیمیایی تأثیر قابل توجهی بر کیفیت و کمیت محصول دارد. این میکروارگانیسم­ها با افزایش عملکرد گیاه روی زنده مانی، رشد و نمو و تولیدمثل حشراتی که از آن­ها تغذیه می کنند تاثیر می­گذارند. در کشاورزی امروزی با توجه به اثرات منفی کودهای شیمیائی، محققان سعی دارند از میکروارگانیسم­های مفید مانند برخی قارچ­ها و باکتری­ها به منظور رفع این نقص، حذف تدریجی سموم و سایر آلاینده های خاک و کمک به حفظ سلامت گیاه استفاده نمایند (12).

در طی چند سال اخیر چندین گونه باکتریایی و قارچی شناسایی شدند که در تحریک مقاومت گیاهان نقش اساسی دارند. در واقع فعال شدن مقاومت در اثر افزایش حساسیت سلول­های گیاهی به هورمون­های گیاهی پیام­رسان می­­باشند که باعث پاسخ سریعتر و بهتر گیاه در مقابل عامل مهاجم می­گردد (5). تحقیقات اخیر در زمینه استفاده از باکتری­ها و قارچهای همزیست ریشه به عنوان کودهای زیستی نشان داده است که آنزیم­ها و مولکول­های دفاعی که در گیاهان در اثر القای مقاومت تولید می­شوند، اثرات بازدارنده متفاوتی روی رشد و نمو آفات دارند و سبب مقاومت گیاهان در برابر آفات می­شوند (7 و 32). این عوامل میکروبی خاک بر بهبود رشد گیاه و فعل و انفعالات گیاه و حشرات تأثیر می­گذارد و در نتیجه باعث افزایش ذخیره مواد غذایی گیاهان در مقابل حشرات و درنتیجه تحمل بیشتر گیاه نسبت به خسارت آن­ها می­شود. میکروب­های مفید علاوه بر افزایش جذب مواد مغذی و آب، گیاه را تحریک می­کند که باعث رشد مجدد بافت­ها پس از گیاه­خواری می شوند، در نتیجه این مسئله جبران خسارت­هایی را برای عملکرد گیاه یا زیست­توده گیاه در حضور حشرات به وجود می­آورد (14، 16، 18). علاوه بر این، میکروب­های مفید با ایجاد کارایی بیشتر فتوسنتز، گیاه را قادر می سازد تا انرژی نورانی بیشتری را به شیره نباتی تبدیل کنند ودر نتیجه گیاه بخشی از خسارت حشرات مکنده شیره نباتی را جبران می­کند (34). بنابراین، میکروب­ها می توانند به روش­های مختلف سلامتی گیاهان را بهبود بخشند که شامل افزایش جذب مواد مغذی و تولید متابولیت­های ثانویه، آنزیم­ها، ترکیبات آلی فرار و هورمون­های رشد است. همه این مواد به طور مستقیم یا غیرمستقیم باعث ایجاد مقاومت اکتسابی سیستمیک (ISR) در گیاهان در برابر حشرات گیاه­خوار می شوند.

یکی از جنس­های قارچ مفید که به جذب بیشتر مواد غذایی به ریشه گیاهان کمک می کند جنس Trichoderma  است که پتانسیل تولید اسپور فراوان را دارد و به عنوان محصول تجاری در دسترس است (38). یکی از معمول ترین گونه­های قارچ­های مفید گونه­های مختلف تریکودرما می­باشند که در اغلب خاک­های دنیا است و جدایه-های مختلف آن دارای توانایی بازدارندگی از رشد و تکثیر قارچ­های بیماری­زای گیاهی را دارند (10 و 20). به طور نمونه مواد بیوشیمایی تولید شده از جدایه­های گونه Trichoderma harizianum  به عنوان محرک رشد گیاهان در غلظت­های پائین شناخته شده است (38). مهم­ترین گونه­های گروه باسیلوس­ها باکتری­هـای جنس تیوباسیلوس می باشند. اکسیداسیون گوگرد به طور عمده توسط گونه­های شیمیوسنتزکننده تیوباسیلوس انجام می­شود (39).

با توجه به اهمیت استفاده از فراورده­های بیولوژیک در جهت بهبود کیفیت خاک زراعی و کاهش مصرف سموم و کودهای شیمیایی و همچنین اثرات اثبات شده تاثیر اینگونه مواد بیولوژیک بر تحریک و تقویت سیستم ایمنی گیاهان در مقابل عوامل بیماریزا و آفات مختلف هدف از انجام این پژوهش بررسی تاثیر جدایه T. harzianum T22 و باکتری­های جنس  Thiobacillus روی میزان رشد و عملکرد گیاه گوجه­فرنگی تحت تنش خسارت و تغذیه آفت کرم میوه گوجه­فرنگی در شرایط گلخانه­ای بود. در این راستا شاخص­های مختلف رشدی و بیوشیمیایی گیاهان تیمار شده با گیاهان شاهد مورد مقایسه قرار گرفتند.

مواد و روشها

کشت گیاه گوجه فرنگی: بذر گوجه­فرنگی، Lycopersicon esculentum، رقم فلات از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد. بذور مورد نظر در ابتدا به مدت 48 ساعت در محلول محرک جوانه­زنی به نام اکتیواتور خیسانده شدند. خاک آزمایشی از مخلوطی از کوکوپیت، پرلیت و ماسه بادی به نسبت 1:1:1 تهیه و داخل گلدان­های پلاستیکی دو لیتری انتقال داده شد. سپس خاک گلدان­ها آبیاری شد و در مرحله بعد در هر گلدان 4 بذر به فاصله معین در عمق نیم سانتی متر از سطح خاک کشت شد، پس از رشد گیاهچه­ها در هرگلدان یک گیاهچه سالم و شاداب حفظ و بقیه حذف شدند. همه گیاهان در شرایط گلخانه­ای با شرایط دمایی 5±25 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 5±50 درصد و دورة نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه پرورش داده شدند. این تحقیق در سال 1399 در گلخانه تحقیقاتی و آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته در مجاورت شهر ماهان شهرستان کرمان انجام شد.

پرورش کرم میوه گوجه­فرنگی: در اواسط فصل بهار لاروهای آفت از مزارع گوجه­فرنگی در منطقه ماهان واقع در 30 کیلومتری شهر کرمان جمع آوری شدند و با قرار دادن در ظروف پلاستیکی با درپوش توری ریز به اتاقک رشد در شرایط دمایی 251 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 655 درصد و دوره­ی روشنایی 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. این حشرات به مدت دو نسل روی برگ و میوه گیاه گوجه­فرنگی پرورش داده شدند.

پس از تفریخ تخم‌­های حشرات بالغ نسل دوم، لارو­های سن اول توسط قلم­‌موی ظریف درون ظروف پلاستیکی (قطر 5/19 و ارتفاع 5/7 سانتی­متر) برای نگهداری گروهی روی ارقام مختلف گوجه­فرنگی منتقل شدند. در قسمت درپوش ظروف پرورش لاروها به منظور تامین تهویه، سوراخ­هایی ایجاد و با توری 50 مش پوشانده شد. از لاروهای سن سوم برای انجام آزمایش اصلی و قراردادن روی میوه­های گیاهان تیمار شده و شاهد جهت تغذیه آفت استفاده شد.

طراحی آزمایش: بعد از انجام عملیات تنک، تغذیه تمام گلدان­های گیاه گوجه­فرنگی به­طور منظم تا پایان آزمایشات گلخانه­ای به فاصله هر 15 روز یک­بار با محلول کود N, P, K (برند شرکت امکس) به نسبت دو گرم در یک لیتر آب به صورت افزودن به خاک اطراف ریشه انجام شد. در این پژوهش برای تیمار قارچ از تیمار قارچ سویه
T. harzianum T22 در قالب فرم تجاری آن به نام TRIANUM-P^® ساخت شرکت کوپرت هلند به صورت اسپور استفاده شد و در آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون به نسبت پنج میلی­گرم در یک لیتر آب تهیه شد و در یخچال نگهداری شدند. بدین منظور برای تهیه سوسپانسیون قارچ، مقدار 5 گرم از اسپور تجاری در یک لیتر آب حل شد و سپس در زمان کاشت در محل کاشت بذور میزان 30 میلی­لیتر از سوسپانسیون تهیه شده استفاده شد. همچنین برای تهیه محلول باکتری از فرم تجاری آن به نام THIOFER^® به میزان پنج میلی­لیتر در یک لیتر آب سوسپانسیون تهیه شد. در تیمارهای مربوط به باکتری میزان 30 میلی­لیتر از محلول تهیه شده در محل کشت بذور استفاده شد. گیاهان شاهد نیز هیچگونه تیماری دریافت نکردند.

در مرحله رشد 6 برگی گیاه گوجه فرنگی تعداد 120 گلدان مشخص و کدگذاری شد، در این مرحله از آزمایش  گلدان­های گیاه گوجه فرنگی به سه گروه تقسیم بندی شدند، گلدان­های گیاه تیمارشده با قارچ (20 عدد با حضور آفت و  20 عدد بدون آفت) ، گلدان­های تیمار شده با باکتری (20 عددبا حضور آفت و  20 عدد بدون آفت) و گلدان­های شاهد نیز به تعداد 20 عددبا حضور آفت و 20 عدد بدون آفت بودند.

ارزیابی شاخص­های رشدی گیاه: پس از پایان دوران لاروی و تغذیه لارو حشرات و جمع­آوری آن­ها از روی بوته­های گوجه­فرنگی، سپس در همه تکرارهای تیمارهای مختلف (در مجموع 120 گیاه) ارتفاع بوته، طول و حجم ریشه (روش استوانه مدرج) اندازه­گیری شدند.  به این صورت که در حجم معینی از آب ریشه های قطع شده گیاهان شاهد و تیمار شده به صورت جداگانه و تکی قرار داده شد و سپس افزایش ایجاد شده در حجم آب استوانه به عنوان حجم ریشه در نظر گرفته شد.

اندازه­گیری شاخص­های بیوشیمیایی گیاه: بر اساس روش­های استاندارد متداول فعالیت آنزیم های اکسیداسیون شامل آنزیم کاتالاز (6)، پلی فنل اکسیداز (22)، آسکوربات پراکسیداز (26)، رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل کل و کارتنوئید (19)، میزان تجمع پراکسید هیدروژن (32)، ترکیبات فنلی کل (29) و قندهای محلول (30) در برگ همه گیاهان تیمار شده با قارچ، باکتری و شاهد و با روش اسپکتروفوتومتری اندازه­گیری شد.

تجزیه و تحلیل آماری

در این پژوهش، آزمایش­ها در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی انجام شد. تجزیه داده­های حاصل از آزمایش به وسیله نرم­افزار SPSS 22 انجام شد و میانگین تیمارها توسط آزمون چند دامنه­ای دانکن (p≤0.05) مورد مقایسه قرار گرفتند.

نتایج

ارتفاع بوته: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار های آزمایشی روی طول بوته تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و گیاهان سالم و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. همانگونه که در شکل 1 مشخص شده است میزان طول بوته در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری­های Thiobacillus spp. به طور معنی داری بیشتر از گیاهان سالم تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی در همان تیمار است. در بین گیاهان شاهد و تیمار شده با قارچ تریکودرما تفاوت معنی داری بین گیاهان سالم و آلوده به آفت تفاوت معنی­داری بین طول بوته­ها مشاهده نشد.

طول ریشه: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمارهای آزمایشی بر طول ریشه تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و گیاهان سالم و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. میزان طول ریشه در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری­های Thiobacillus spp. و قارچ تریکودرما و در گیاهان شاهد به طور معنی­داری در گیاهان سالم بیشتر از گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی در همان تیمارها بود (شکل 2). بیشترین طول ریشه در گیاهان تیمار شده با باکتری و بدون حضور آفت مشاهده شد و کمترین آن در گیاهان شاهد با حضور آفت مشاهده شد (شکل 2).

شکل 1- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان ارتفاع بوته در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

شکل 2- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان طول ریشه در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

حجم ریشه: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار های آزمایشی روی میزان حجم ریشه تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و سالم و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. همانگونه که در شکل 3 مشخص شده است میزان حجم ریشه در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری­های Thiobacillus spp. به طور معنی­داری بیشتر از گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی در این تیمار است (شکل 4). بیشترین طول ریشه در گیاهان تیمار شده با باکتری و بدون حضور آفت مشاهده شد و کمترین آن در گیاهان شاهد با حضور آفت مشاهده شد (شکل 3).

شکل 3- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر  میزان حجم ریشه در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

شکل 4- سمت راست ریشه گیاه شاهد و سمت چپ ریشه گیاه تیمار شده با باکتری Thiobacillus spp.

کلروفیل کل: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک بر میزان کلروفیل کل در گیاه تحت تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و همچنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. میزان کلروفیل کل در گیاهان سالم تیمار شده با قارچ تریکودرما و نیز باکتری تیوباسیلوس زمانی که تحت تنش تغذیه لارو حشره آفت قرار نگرفتند به طور معنی­داری بیشتر از گیاهان با تنش تغذیه آفت تیمار شده با این قارچ بود. در بین گیاهان شاهد بین گیاهان سالم و آلوده به آفت تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (شکل 5).

شکل 5- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان کلروفیل کل در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند

کارتنوئید: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک روی میزان کارتنوئید تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. مشابه نتایج در مورد کلروفیل در رابطه با میزان کارتنوئید نیز در گیاهان سالم تیمار شده با قارچ تریکودرما زمانی که تحت تنش تغذیه لارو حشره آفت قرار نگرفتند میزان تولید کارتنوئید در آن­ها به طور معنی داری بیشتر از گیاهان با تنش تغذیه آفت تیمار شده با این قارچ بود. در بین گیاهان شاهد و تیمار شده با باکتری تفاوت معنی داری بین گیاهان سالم و آلوده به آفت تفاوت معنی­داری از این نظر مشاهده نشد (شکل 6).

شکل 6- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر محتوای کارتنوئید در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

ترکیبات فنلی کل: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) بر میزان ترکیبات فنلی کل گیاه تحت تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار  بود. همانگونه که در شکل 7 مشخص شده است میزان ترکیبات فنلی کل در گیاهان سالم تحت تیمار قارچ T. harzianum T-22 به طور معنی­داری بیشتر از سایر تیمارهای آزمایشی هم در گیاهان سالم بدون آفت و هم گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی است. در بین گیاهان تیمار شده با باکتری و گیاهان شاهد تفاوت معنی­داری بین گیاهان سالم و آلوده به آفت مشاهده نشد (شکل 7).

پراکسید هیدروژن (H₂O₂): نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) بر میزان پراکسید هیدروژن در گیاه تحت تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود.

شکل 7- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان ترکیبات فنل کل در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند

همانگونه که در شکل 8 مشخص شده است میزان پراکسید هیدروژن در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری­های Thiobacillus spp. به طور معنی داری بیشتر از سایر تیمارهای آزمایشی هم در گیاهان سالم بدون آفت و هم گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی است. همچنین گیاهان تیمار شده با قارچ تریکودرما زمانی که تحت تنش تغذیه لارو حشره آفت قرار گرفتند میزان تولید پراکسید هیدروژن در آن­ها به طور معنی­داری بیشتر از گیاهان بدون آفت تیمار شده با این قارچ بود. در بین گیاهان شاهد تفاوت معنی­داری بین گیاهان سالم و آلوده به آفت تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (شکل 8).

قندهای محلول: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) بر میزان قندهای محلول در گیاه تحت تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. همانگونه که در شکل 9 مشخص شده است میزان قندهای محلول در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری­های Thiobacillus spp. و قارچ T. harzianum T22 به طور معنی داری بیشتر از سایر تیمارهای آزمایشی هم در گیاهان سالم بدون آفت و هم گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی است. بین گیاهان سالم در هر سه تیمار (قارچ، باکتری و شاهد) میزان قندهای محلول در گیاهان تحت تنش آفت به طور معنی­داری کمتر از گیاهان سالم در همان تیمار بود (شکل 9).

شکل 8- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان پراکسید هیدروژن در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

شکل 9- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان قند محلول در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند

آنزیم پلی­فنل اکسیداز: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) بر میزان آنزیم پلیپ­فنل اکسیداز در گیاه تحت تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود (شکل 10). میزان آنزیم پلی­فنل اکسیداز در گیاهان آلوده به لارو آفت تحت تیمار قارچ T.harzianum T-22 به طور معنی­داری بیشتر از سایر تیمارهای آزمایشی هم در گیاهان سالم بدون آفت و هم گیاهان تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی است. در بین گیاهان تیمار شده با باکتری و گیاهان شاهد تفاوت معنی داری بین گیاهان سالم و آلوده به آفت مشاهده نشد (شکل 10).

شکل 10- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر  میزان فعالیت آنزیم پلی­فنل اکسیداز در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

آنزیم آسکوربات پراکسیداز: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) بر میزان آنزیم آسکوربات پراکسیداز تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. میزان آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان سالم تحت تیمار باکتری به طور معنی­داری بیشتر از سایر گیاهان تیمار و شاهد بود (شکل 11).

آنزیم کاتالاز: نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که تاثیر تیمار مواد بیولوژیک (قارچ و باکتری) روی میزان آنزیم کاتالاز تیمارهای مختلف در گیاهان با تغذیه حشره و بدون آن (سالم) و هم چنین اثرات متقابل بین آن­ها در سطح پنج درصد معنی­دار بود. میزان اینآنزیم در گیاهان تحت تیمار قارچ (هر دو گیاهان سالم و تحت تنش آفت) به طور معنی­داری بیشاز سایر گیاهان (تیمار باکتری و شاهد) بود اما میزان آنزیم کاتالاز در گیاهان سالم تحت تیمار قارچ و باکتری بین گیاهان بدون آفت با گیاهان تحت تنش تغذیه لارو آفت کرم میوه گوجه­فرنگی از این لحاظ مشاهده نشد (شکل 12).

شکل 11- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر میزان فعالیت آنزیم اسکوربات پراکسیداز در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

شکل 12- اثر تیمارهای قارچ تریکودرما و باکتری­های جنس تیوباسیلوس بر  میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه گوجه فرنگی رقم فلات، میانگین­هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می­باشند از نظر آماری و بررسی آزمون دانکن (5 درصد) اختلافی ندارند.

بحث و نتیجه گیری

از نتایج ارزیابی و مقایسه گیاهان گوجه­فرنگی تیمارشده با مواد بیولوژیک شامل قارچ تریکودرما و باکتری تیوباسیلوس مشخص شد که گیاهان سالم تیمار شده با قارچ T. harzianum T22 نسبت به گیاهان شاهد که هیچگونه تیمار قارچ و باکتری برای آن­ها اعمال نشد، میزان ترکیبات فنلی کل، میزان قندهای محلول، کلروفیل کل، کارتنوئید و حجم ریشه بیشتری دارا بودند. نتایج در مورد گیاهان تیمار شده با مخلوط باکتری­های جنس Thiobacillus نیز نشان داد که میزان تولید پراکسید هیدروژن، کلروفیل کل، کارتنوئید و حجم ریشه در گیاهان تیمار شده با باکتری به طور معنی­داری بیشتر از گیاهان شاهد بود. از این نتایج اینگونه استنباط می­شود که استفاده از قارج تریکودرما و نیز باکتری­های جنس تیوباسیلوس روی رشد رویشی اندام زیرزمینی گیاه که در جذب مواد غذایی از خاک نقش دارد، تاثیر کاملا" مثبتی داشته است. همچنین کاربرد این مواد بیولوژیک روی تحریک و تقویت سیستم دفاعی گیاه در تولید برخی مواد دفاعی مهم مثل ترکیبات فنلی و پراکسید هیدروژن نقش بارزی داشته است. در راستای بررسی و مرور فعالیت­های انجام شده در این زمینه، بسیاری از محققان این باورند که به طورعمده جدایه های مختلف قارچ­های جنسTrichoderma spp.  با تولید مواد بیوشیمیایی باعث تولید تحریک رشد گیاهان می­شوند و یا باعث کاهش اثرات ممانعت از رشد برخی ترکیبات، توکسین­های زیستی و شیمیایی موجود در خاک و حتی تغییر در میزان عناصر محلول در خاک می­شوند (27 و 37).

ترشح اسیدهای آلی مانند گلوکونیک اسید، اسید سیتریک و فوماریک اسید توسط گونه های تریکودرما باعث کاهش اسیدیته خاک و در نهایت افزایش حلالیت و جذب ریزمغذی های مهم مورد نیاز برای رشد گیاه مثل آهن، منیزیم و فسفات­ها می­شود (4(. همچنین باکتری­های محرک رشد ریزوسفری از جمله تیوباسیلوس­ها با سازوکارهای مختلف مانند تسهیل جذب مواد مغذی به گیاه از طریق تثبیت نیتروژن، انحلال فسفات­های غیر آلی و قابل جذب نمودن فسفر برای گیاه، جذب ریز مغذی­هایی مانند آهن با ساخت سیدروفور و تعدیل سطح هورمونهای گیاهی مانند افزایش تولید اکسین باعث بهبود رشد و تولید اتیلن از طریق فعالیت عملکرد گیاه در شرایط تنش می­شوند. این باکتری­ها همچنین نیاز به کودهای شیمیایی را جبران و فعالیت عوامل بیماریزای گیاهی را با ترشح سیانید هیدروژن متوقف کرده یا کاهش می­دهند (11).

مطالعه­های مختلفی در زمینه بررسی تاثیر مواد بیولوژیک مختلف از جمله قارچ و باکتری استفاده شده در این تحقیق توسط نویسندگان مختلف انجام شده است. به طور نمونه در مطالعه­ای محققین نشان دادند که برخی از جدایه های T. harzianum  تنها در غلظـت یک درصد در خاک باعث افزایش رشد اندام­های هوایی و ریشه گیاه کاهو شدند (24). در پژوهش دیگری گزارش شد که تیمار بذر گیاه بامیه با قارچ   T. harzianum سبب افزایش درصد جوانه­زنی بذر و شاخص جوانه­زنی بذر شد (24). همچنین در مطالعه­ای دیگر افزایش درصد و سرعت جوانه­زنی گوجه­فرنگی تحت تأثیر قارچharzianum   T.گزارش شد (21). در پژوهشی مشابه محققین نشـان دادنـد کـه بـا اسـتفاده تلفیقی از گـوگرد و بـاکتری تیوباسـیلوس روی دو رقم سـویا میـزان عملکـرد، محتوی کلروفیل و جذب آهن و روی به طور چشـمگیری بهبـود یافـت. علاوه بر گوگرد، سولفیدها، تیوسولفات و تتراتیونات نیز به سولفات اکسیده می­شوند (8). همچنین در مطالعه­ای دیگر محققین نشان دادند که سویه­های harzianum8   T. و harzianum1103   T.در کنترل بیولوژیک بیماری­های قارچی در گیاهان استفاده نمود (1و 2).

در مقایسه شاخص­های مختلف بین گیاهان تیمار شده تحت تنش تغذیه لارو کرم میوه گوجه­فرنگی و گیاهان سالم در همان تیمارها، نتایج نشاندهنده کاهش معنی­دار میزان کلروفیل، کارتنوئید، قندهای محلول و در گیاهان تیمار شده با قارچ و همچنین کاهش معنی­دار قندهای محلول، طول و حجم ریشه گیاهان تیمار شده با باکتری تحت تنش آفت نسبت به گیاهان سالم بود. این نتایج بیانگر آن است که تغذیه آفت سبب کاهش میزان رشد رویشی و فتوسنتز گیاه شده است. علاوه بر این در نتایج این پژوهش مشخص شد که فعالیت آنزیم های اکسیداسیون دو آنزیم پلی فنل اکسیداز در تمام تیمارهای (قارچ، باکتری و شاهد) تحت تنش تغذیه و خسارت لارو کرم میوه گوجه­فرنگی به طور معنی­داری بیشتر از گیاهان سالم در همان تیمارها بود. این نشان می­دهد که گیاهان تحت تنش تغذیه لارو آفت در اثر آسیب دیدن بافت برگ گیاه و تحریک سیستم دفاعی به آن واکنش نشان داده­اند و تولید آنزیم­های مهم اکسیداسیونی از جمله آنزیم کاتالاز، پلی فنل اکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در این گیاهان نسبت به گیاهان بدون آفت به طور معنی­داری افزایش یافته است. در پاسخ به شرایط استرس زای زیستی مختلف، افزایش بیان پلی فنل اکسیداز با مقاومت گیاه بر علیه شرایط استرس زا در ارتباط است. سطح بالای فعالیت پلی فنل اکسیداز، سطح اکسیژن آزاد در دسترس را برای تولید ROS کاهش می­دهد (36). پلی فنل اکسیداز اکسید کننده فنل می­باشد و در شرایط تنش، افزایش فعالیت آن به عنوان شاخصی برای سنجش میزان مقاومت گیاهان نسبت به تنش می باشد. تنش­های زیستی باعث کاهش دسترسی گیاه به دی اکسید کربن، ممانعت از تثبیت کربن و کاهش پی در پی اکسیژن مولکولی شده که نتیجه آن افزایش بیش از حد گونه­های فعال اکسیژن و صدمه به عملکرد کلروپلاست­ها و در نهایت اختلال در فرآیند فتوسنتز می­باشد (34).  همچنین آنزیم­های اکسیدانی و ترکیبات فنلی با جمع­آوری و احیای گونه­های فعال اکسیژن از اکسیداسیون مولکول­های زیستی حیاتی سلول جلوگیری کرده و مانع بروز تنش اکسایش و یا تخفیف اثرات آن در سلول­های گیاه می­شوند (13). در این پزوهش مشخص شد که استفاده از قارچ تریکودرما سبب افزایش معنی­دار میزان آنزیم کاتالاز و قندهای محلول در گیاهان تیماری (بدون حضور آفت) نسبت به شاهد شده بود. دلیل این امر این است که گیاهان برای تعدیل میزان گونه­های فعال اکسیژن و جلوگیری از تنش اکسایش، اقدام به ساخت ترکیبات آنتی اکسیدانی اعم از آنزیمی مانند کاتالاز و غیر آنزیمی مانند ترکیبات فنلی می­کنند (13). 

از مجموع نتایج این پژوهش مشخص شد که قارچ T.harzianum T22 و باکتری­های Thiobacillus spp.  روی برخی از شاخص­های فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و رشدی گیاه گوجه­فرنگی تاثیر مثبت داشته است و علاوه­ بر گسترش سطح فتوسنتزی و حجم ریشه سبب تقویت سیستم دفاعی گیاه هم با تولید بیشتر ترکیبات دفاعی مهم از جمله فنلی کل، میزان تولید پراکسید هیدروژن، میزان قندهای محلول بیشتری دارا بودند. در تمام تیمارهای آزمایشی (قارچ، باکتری و شاهد) میزان آنزیم­های اکسیداسیون پلی فنل اکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در زمان قرار گرفتن گیاهان تیمار شده با قارچ تریکودرما و باکتری تیوباسیلوس تحت تنش تغذیه آفت کرم میوه گوجه­فرنگی مبین عکس­العمل  سیستم دفاعی گیاه در مقابل حمله گیاهخوار است. استفاده از عوامل و فراورده­های بیولوژیک موثر غیر همزیست و همزیست گیاه که کمک شایانی به جذب بیشتر و بهتر مواد غذایی از بستر کشت به گیاهان نموده و سبب رشد بهتر گیاهان می شوند و از طرفی با تحریک و تقویب بیشتر سیستم دفاعی گیاه سبب ایجاد مقاومت القایی جهت مقابله با خسارت آفات و بیماری­های گیاهی می شوند و در تقویت پایداری و حفاظت از محیط زیست دخیل هستند توصیه می شود.

سپاسگزاری

این مقاله مربوط به مطالعات انجام شده طرح بیرونی شماره 4406/99/19 فیمابین سازمان نظام مهندسی کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمان با دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته و قرارداد داخلی شماره 1972/99 /ص/7 می­باشد که در پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی به ثبت رسیده است. نویسندگان مقاله مراتب تشکرو قدردانی خود را از مسئولین سازمان نظام مهندسی کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمان و همچنین ریاست پژوهشگاه و دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته اعلام می دارند.