مطالعه تاثیرتنش خشکی القا شده با پلی‌اتیلن گلیکول بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی درگیاه چاودارSereale cereal L.)) تیمار شده با24 اپی‌براسنیواستروئید

مطالعه تأثیر تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول بر فعالیت آنتی­اکسیدانی در گیاه چاودار Secale cereale L.)) تیمار شده با 24-اپی­براسینواستروئید

سپیده حاتمی¹، سید یحیی صالحی لیسار^1*، فاطمه رحمانی²، لطیفه پوراکبر² و بتول صمدانی³

¹ ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه علوم گیاهی

² ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

³ ایران، تهران ، سازمان تحقیقات کشاورزی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 04/08/1400          تاریخ پذیرش: 10/01/1401

چکیده

چاودار با نام علمی Secale cereale L.، گیاهی از خانواده گندمیان (Poaceae)، بومی کشورهای آسیای مرکزی، سوریه و ایران است. تنش خشکی یکی از مهم­ترین عوامل محدود کننده رشد و تولید محصول در سراسر دنیا به شمار می­آید. براسینواستروئیدها از طریق اثرگذاری بر فرآیندهایی مانند فتوسنتز، فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانی، انباشت اسمولیت­ها، متابولیسم نیتروژن گیاهان در شرایط طبیعی و تحت تنش، در تنظیم رشد نقش دارند. در این پژوهش، تأثیر هورمون 24-اپی­براسینولید (با غلظت ^8-10 مولار) بر پاسخ آنتی­اکسیدانی یک رقم و دو جمعیت گیاه چاودار (رقم لونکورد تهیه شده از موسسه اصلاح و تولید نهال و بذر، جمعیت بذر استفاده شده توسط کشاورزان و جمعیت بذر جمع­آوری شده از مزارع به عنوان علف هرز) در یک طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار تحت تنش خشکی 6، 12 و 18% القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (PEG 6000) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از آن بود که بروز علائم فیزیولوژیک تنش خشکی بعد از اعمال 24-اپی­براسینولید تغییرات معنی­داری را در مقایسه با شاهد در هر سه نمونه مورد مطالعه نشان داد. در هر سه نمونه مورد مطالعه در اندام­های هوایی فعالیت آنزیم­های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز افزایش و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز کاهش نشان داد. در مجموع می توان گفت که کاربرد 24-اپی­براسینولید توانسته است تأثیر مثبت بر فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه چاودار داشته باشد و از طریق کاهش شدت تنش اکسیداتیو اثرات تنش خشکی را کاهش دهد و هم­چنین با افزایش مقادیر اسمولیت­ها و افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی موجب جاروب رادیکال­های آزاد گردد.

واژه های کلیدی: 24- اپی­براسینولید، آنزیم­های آنتی­اکسیدانت، تنش خشکی، چاودار.

* نویسنده مسئول، تلفن:  3272 900 0914،  پست الکترونیکی:  y_salehi@tabrizu.ac.ir

مقدمه

امنیت غذایی یک مسئله بسیار مهم برای توسعه پایدار جوامع است. در حال حاضر، کمبود آب شیرین مورد نیاز کشاورزی مشکلات جدی برای تولید محصولاتی با کیفیت غذایی مناسب ایجاد کرده است. علاوه بر این، با توجه به افزایش سریع جمعیت، تخمین زده می­شود که تا سال 2050 جمعیت جهان به 6/9 میلیارد نفر برسد، که فشار زیادی را برای تأمین نیازهای غذایی برای مردم جهان تحمیل خواهد کرد (44). بیش از 50% از اراضی بخش کشاورزی جهان در مناطق خشک واقع شده است و تغییرات اقلیمی ناگهانی و شدید در مقیاس جهانی به­طور قابل توجهی الگوی بارندگی را تغییر داده است که منجر به کمبـود آب شده و بر رشـد و بهره­وری محصولات زراعی

تأثیر منفی گذاشته است (27 و 33).

خشکی با اثر بر روی الگوهای بیان ژنی و با فعال­سازی ژن­های درگیر در پاسخ به آن، و هم­چنین تأثیر در مورفولوژی، آناتومی و فرآیندهای بیوشیمیایی گیاهان باعث ایجاد تغییرات اساسی در متابولیسم سلول­ها و تولید متابولیت­های ثانویه می­شود و در نهایت بر روی رشد و نمو آن­ها تأثیر می­گذارد (5). مطالعات نشان داده است که تنش خشکی در گیاهان منجر به تجمع گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن (ROS) می­شود. این گونه­های فعال اکسیژنی با لیپیدها، پروتئین­ها، رنگیزه­ها و اسیدهای نوکلئیک واکنش می­دهند و با پراکسیداسیون لیپیدها منجر به آسیب غشایی و در نتیجه نشت الکترولیت­ها می­شوند (35). در گیاهان سازوکار­های دفاعی برای محافظت یا به حداقل رساندن آسیب­های ناشی از گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن تکامل یافته است تا تعادل بین تولید و تجزیه آن­ها جهت حفظ تعادل ردوکس سلولی را فراهم سازد (26). سیستم آنتی­اکسیدانی، آسیب اکسیداتیو را در گیاهان تحت شرایط تنش کاهش می­دهد و مقاومت به تنش را که اغلب با یک سیستم آنتی­اکسیدانی منظم مرتبط است، افزایش می­دهد. فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، پراکسیداز (POD) و کاتالاز (CAT) به ­عنوان یک شاخص کلیدی در سازوکار دفاع آنتی­اکسیدانی عمل می­کنند (26). علائم خشکی در گیاهان بر اساس گونه گیاهی، مرحله رشدی، شرایط رشدی و سایر فاکتورهای محیطی بسیار متفاوت است. شدت خشکی، طول دوره خشکی، شرایط فیزیکوشیمیایی خاک و میزان مقاومت گیاه از سایر فاکتورهایی هستند که علائم خشکی در گیاهان را تحت تأثیر قرار می­دهند. به­طور کلی، از علائم خشکی می­توان به کاهش تورژسانس برگ، افتادگی، پژمردگی، اتیوله شدن، زرد شدن و ریزش زودهنگام برگ اشاره کرد (34).

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نقش مهمی در تنظیم رشد و نمو گیاهان دارند و به­طور فعالی با راه­اندازی آبشارهای ترارسانی علامت در مواجهه با تنش­های زیستی و غیرزیستی شرکت می­کنند (21). تصور بر این است که براسینواستروئیدها (BR) از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی هستند که می­توانند اثرات ناشی از تنش خشکی در گیاهان را کاهش دهند (28 و 42). این ترکیبات از طریق مشارکت فعال خود در فرآیندهایی مانند فتوسنتز، فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانی، انباشت اسمولیت­ها، متابولیسم نیتروژن و روابط آب-گیاه در شرایط طبیعی و تحت تنش در تنظیم رشد نقش دارند. گزارش شده است که گیاهان دارای نقص در بیوسنتز براسینواستروئید، ناهنجاری­هایی در فنوتیپ­های رشدی و مسیرهای اساسی تنظیم­کننده این فرآیندها را نشان می­دهند (12). براسینواستروئیدها با فعال کردن سیستم دفاعی از طریق افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز و گلوتاتیون­ ردوکتاز از گیاهان در برابر تنش­های غیرزیستی محافظت می­کنند (37). استفاده برون­زا از این ترکیبات با کاهش شدت تنش اکسیداتیو، تأثیر بر محتوای پروتئین، تجمع اسمولیت­های سازگار و حفظ محتوای نسبی آب، تحمل گیاه به خشکی را افزایش می­دهند (39). 24-اپی­براسینولید (24-EBR)، نوعی براسینواستروئید است که در تنش­های مختلف محیطی در گیاهان نقش دارد. استفاده از 24-اپی­براسینولید در گیاهان موجب افزایش رشد، محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی، راندمان فتوسنتز و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی می­شود (36  و 37). در مطالعه­ای که بر روی گیاه گوجه­فرنگی انجام گرفت مشخص گردید که مصرف برون­زای 24-اپی­براسینولید از طریق تنظیم سیستم آنتی­اکسیدانی و متابولیسم اسمولیت­ها اثرات مخرب ناشی از تنش­های شوری (4) و خشکی (8) را کاهش داد. در مطالعه­ا­ی دیگر، اعمال خارجی 24-اپی­براسینولید، به­طور قابل توجهی سبب بهبود فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانی و تجمع اسمولیت­ها در ارقام ذرت تحت تأثیر تنش خشکی گردید (40). 24-EBR در ترکیب با اسپرمین با کاهش تولید رادیکال­های سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که منعکس­کننده پراکسیداسیون لیپید پایین و پایداری بالاتر غشا می­باشد، سازوکار­های دفاعی اکسیداتیو را تنظیم می­کند (40). گزارش گردیده است که استفاده از 24-EBR در گیاهان ذرت تحت تنش خشکی، سبب افزایش فعالیت آنزیم­های بیوسنتتیک و پلی­آمین­ها و کاهش فعالیت آنزیم­های کاتابولیزه می­شود و در نتیجه سبب افزایش تحمل به تنش خشکی می­شود (41). محققان گزارش کرده­اند که ژنوتیپ­های جو دارای نقص در سنتز براسینواستروئیدها، مقاومت کم­تری به تنش خشکی را دارا هستند و تجمع کاستاسترون و اپی­براسینواستروئیدها به علت تشدید خشکسالی باعث تعدیل تنش خشکی  در گیاه می­شود (16).

تحقیقات در مورد اثرات اپی­براسینواستروئیدها تحت تنش خشکی در گیاهان به­ویژه غلات، نیاز به توجه بیش­تری دارد. مطالعات چندی در مورد تأثیر 24-EBR بر فرآیندهای رشدی در گیاهان تحت تنش خشکی انجام گرفته است، با این­حال، اطلاعات کمی در مورد مکانیسم ارائه تحمل تنش خشکی ناشی از  24-EBRدر چاودار وجود دارد. بنابراین، این مطالعه با هدف ارزیابی نقش بالقوه 24-EBR بر صفات فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و پاسخ­های آنتی­اکسیدانی چاودار تحت تنش خشکی انجام شد.

مواد و روشها

کشت گیاه و اعمال تیمار: این آزمایش در یک طرح کاملاً تصادفی با پایه فاکتوریل در سه تکرار و در هر تکرار با 24 تیمار انجام گرفت. سه نمونه بذر گیاه چاودار (توده تولید شده در موسسه اصلاح بذر و نهال سازمان تحقیقات کشاورزی ایران (رقم لانکورد)، جمعیت بذر تولیدی زارعین، جمعیت  جمع­آوری شده از مزارع به عنوان علف هرز) در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. قبل از کشت، بذرهای گیاه چاودار با استفاده از اتانول 70% به مدت 2 دقیقه و سدیم هیپوکلریت 5% به مدت 5 دقیقه استریل شدند و در نهایت با آب مقطر برای چندین بار شستشو داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت نگهداری در آب مقطر استریل، به منظور اعمال تیمار هورمون 24- اپی براسینولید (^8-10 مولار)، بذور استریل شده در آب مقطر (گروه کنترل) یا محلول 24-اپی­براسینولید (^8-10 مولار) در دمای اتاق به مدت 24 ساعت در تاریکی قرار داده شدند (5). سپس در هر گروه تیمار، بذور بر روی دو ورقه کاغذ صافی (کنترل و تیمار 24-اپی­براسینولید) مرطوب شده با آب مقطر و یا غلظت­های متفاوت پلی­اتیلن گلیکول (PEG6000) (0، 6%، 12% و 18%) انتقال داده شدند و برای جوانه­زنی به مدت سه روز در دمای 2± 27 درجه سانتی­گراد و در شرایط تاریکی قرارگرفتند (29). پس از گذشت سه روز، بذرهای جوانه­زده به بطری­های شیشه­ای انتقال داده شدند. برای هر تیمار 3 بطری درنظر گرفته شد و در هر بطری 20 بذر جوانه­زده قرار گرفت. بطری­ها به مدت 7 روز به اتاقک کشت با شدت نور µmol m^-2 s^-1350، دمای 2±27 درجه­سانتی­گراد و رطوبت 70% منتقل شدند. بعد از 7 روز دانه­رست­های 10 روزه برداشت شده و تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- درجه­سانتی گراد نگهداری شدند.

سنجش رنگیزه‌های فتوسنتزی: سنجش محتوای رنگیزه‏های فتوسنتزی (کلروفیلa ، b و کاروتنوئید‏ها) بر اساس روش Lichtenthaler انجام شد (26). مقدار 1/0 گرم بافت تر برگ گیاهان در 5 میلی‏لیتر استون 80% همگن شدند و در ظرف‌های شیشه‌ای درب‌دار به مدت یک هفته در یخچال و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. سپس میزان جذب نوری نمونه‏ها پس از صاف کردن با کاغذ صافی، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Analytic Jena, Specol 1500, Germany) در طول موج‏های 662، 645 و 470 نانومتر اندازه‏گیری شد و با استفاده از رابطه‌های زیر، محتوای کلروفیل a، کلروفیلb و کاروتنوئید بر حسب میلی­گرم بر گرم بافت تر برگ محاسبه گردید:

Chl. a (mg/g FW) = 12.7 (OD₆₆₃) - 2.69 (OD₆₄₅) × V/1000× W

Chl. b (mg/g FW) = 12.9 (OD₆₅₄) - 4.68 (OD₆₆₃) × V/1000 × W

Carotenoids (mg/g FW) = OD₄₈₀ + (0.114×OD₆₆₃) - (0.638×OD₆₄₅)

سنجش محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂): محتوای پراکسید هیدروژن، مطابق روش Harinasut اندازه‌گیری گردید (19). یک گرم از بافت تر در تری‌کلرو‌استیک اسید 1/0% (TCA, Merck, Germany)، همگن شد و به مدت 15 دقیقه در g 10000 سانتریفوژ گردید. بلافاصله 5/0 میلی‌لیتر از محلول شناور بالایی با 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار (7=pH) و یک میلی‌لیتر یدور پتاسیم یک مولار مخلوط شدند و در دمای 25 درجه­سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. سپس جذب نوری نمونه­ها در طول موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری گردید. غلظت پراکسید هیدروژن نمونه­ها بر اساس منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت­های مختلف پراکسید هیدروژن محاسبه و به ‌صورت میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید.

سنجش محتوای مالون‌ دی ‌آلدئید (MDA): سنجش محتوای مالون دی آلدئید با استفاده از روشBoominathan  وDoran  انجام گردید (9). با استفاده از محلول 1/0% (w/v) تری‌کلرواستیک اسید (TCA) نمونه­های گیاهی همگن شدند و به مدت پنج دقیقه در g 10000 سانتریفوژ گردیدند. سپس محلول روشناور، با محلول 20% TCA حاوی 5/0% تیوباربیتوریک اسید به نسبت 1 به 4، در لوله آزمایش با هم مخلوط شدند و به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس نمونه­ها به سرعت در داخل یخ سرد شدند و به مدت 15 دقیقه در g 10000 سانتریفوژ گردیدند. میزان جذب مخلوط به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر  UV-VISدر دو طول موج 532 و 600 نانومتر اندازه­گیری شد (جذب در طول موج دوم غیرخالص است که باید از جذب در طول موج اول کم شود و در محاسبه مقدار مالون دی آلدئید ضریب خاموشی mM ^-1 cm ^-1 156 نیز لحاظ گردید). نمونه­ها برحسب میکرومول بر گرم وزن ‏تر اندام محاسبه گردیدند. هم‌زمان با عصاره گیاهی، محلول­های استاندارد در محدوده صفر تا 100 نانومول از 3، 1، 1، 3 تترا‌ اتوکسی ‌پروپان تهیه شدند. 3، 1، 1، 3 تترا اتوکسی پروپان و با کد t9889 از کمپانی سیگما آلدریچ هست و فرمول شیمیایی آن به صورت زیر است.

2CHCH2CH(OC2H5)2(C2H5O)

برای تهیه در حد نانو یک محلول مادر با غلظت میکرو تهیه و سپس از طریق رقیق­سازی غلظت­های نانو 0، 20، 40، 60، 80 و 100 تهیه گردید.

اندازه­گیری نشت الکترولیت­ها (EL): برای اندازه­گیری نشت الکترولیت­ها از روش Osman وRady استفاده شد (32). دو نمونه 2 گرمی از برگ هر تیمار برداشته و به لوله آزمایش محتوای 10 میلی­لیتر آب مقطر منتقل گردید. لوله­ها به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری شده و هدایت الکتریکی آن­ها توسط دستگاه سنجش هدایت الکتریکی (HANNA مدل  HI8819 ساخت کشور پرتغال) اندازه گرفته شد (EC₁). سپس لوله­ها به مدت 15 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه­سانتی­گراد منتقل شدند. بعد از سرد شدن لوله­ها هدایت الکتریکی دوباره اندازه گرفته شد (EC₂). نشت الکترولیت­ نمونه­ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

EL (%) = (EC₁/EC₂) ×100

سنجش محتوای پرولین آزاد: محتوای پرولین آزاد با استفاده از معرف نین­هیدرین به روش Bates و همکاران اندازه­گیری شد (7). برای این منظور یک گرم بافت تر برگ با استفاده از 3 میلی­لیتر محلول سولفوسالیسیلیک اسید 3% سابیده شد و به مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفوژ گردید. سپس به 2 میلی­لیتر محلول ­رویی 2 میلی­لیتر معرف نین­هیدرین (برای تهیه معرف نین­هیدرین 25/1 گرم نین­هیدرین در 30 میلی­لیتر اسید استیک و 20 میلی­لیتر اسید فسفریک 6 مولار حل گردید) و 2 میلی­لیتر اسید استیک­ گلاسیال اضافه شد و به مدت 1 ساعت در حمام آب­ گرم 100 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. سپس لوله­ها به داخل حمام یخ منتقل شدند. بعد از سرد شدن به هر لوله 4 میلی­لیتر تولوئن اضافه گردید و 20 ثانیه خوب تکان داده شدند. در هر لوله آزمایش دو فاز تشکیل شد. از فاز صورتی رنگ بالایی جهت سنجش محتوای پرولین آزاد با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر استفاده شد و محتوای پرولین بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید.

سنجش قندهای محلول: اندازه­گیری قند­های محلول با استفاده از روش  Kochertانجام گرفت (24). بدین­ منظور، 5/0 گرم بافت تر گیاه در 3 میلی­لیتر آب مقطر سابیده شد و سپس با کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف گردید. بر روی 2 میلی‌لیتر محلول صاف شده، 5 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ و 1 میلی‌لیتر فنل 5% اضافه گردید و بعد از گذشت 20 دقیقه جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری گردید. محتوای قندهای محلول نمونه‏ها با استفاده از منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت­های مختلف گلوگز (0 تا 100 میلی­گرم در لیتر)، (0-20-40-60-80-100) محاسبه گردید.

اندازه­گیری پروتئین­های محلول کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت

تهیه عصاره گیاهی: یک گرم بافت تر گیاهی در 3 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم با غلظت50 میلی‌مولار و 7=pH همگن گردید و به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و درg  10000 سانتریفوژ شد. از محلول شناور رویی برای سنجش پروتئین­های محلول کل به روش برادفورد (10) و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت شامل کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات ‌پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز استفاده گردید.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: فعالیت این آنزیم بر اساس برآورد میزان اکسیداسیون آسکوربیک اسید با اندازه گیری کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر مورد اندازه­گیری قرار گرفت (9). 300 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (7=pH، 50 میلی‌مولار)، 200 میکرولیتر EDTA (2/0 میلی‌مولار)، 200 میکرولیتر آسکوربیک اسید (5/0 میلی‌مولار)، 200 میکرولیتر آلبومین سرم گاوی (50 میلی‌مولار) و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی با هم مخلوط شدند. واکنش آنزیمی با افزودن 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (1/0 میلی‌مولار) شروع شد و تغییرات جذب به مدت سه دقیقه در طول موج 290 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت گردید. در نهایت فعالیت ویژه آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی آسکوربیک اسید (mM^-1cm^-1 8/2) محاسبه و به صورت واحد بر میلی­گرم پروتئین (Unit/mg protein) بیان گردید. یک واحد فعالیت آنزیمی، مقدار آنزیم لازم برای احیاء یک میکرولیتر آسکوربیک اسید در دقیقه در نظر گرفته شد.

فعالیت آنزیم پراکسیداز: فعالیت این آنزیم بر اساس روشChance  و Maehly و با اندازه‌گیری میزان تبدیل گایاکول به تتراگایاکول در مدت زمان سه دقیقه انجام گرفت (11). مخلوط واکنش (1 میلی­لیتر) شامل 350 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار با 7=pH، 300 میکرولیتر گایاکول 4 میلی‌مولار و 300 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 5 میلی‌مولار بود. واکنش با افزودن 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد آغاز شد و جذب نمونه­ها به مدت سه دقیقه در طول موج 470 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد. در نهایت فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی تتراگایاکول ( mM^-1 cm^-15/25) محاسبه شد و به صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (Unit/mg protein) بیان گردید. یک واحد فعالیت آنزیمی، مقدار آنزیم لازم جهت اکسیداسیون یک میکرومولار گایاکول به تتراگایاکول در نظر گرفته شد.

فعالیت سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسید‌‌ دیسموتاز بر اساس روش Winterbourn با کمی تغییر انجام گرفت (44). در این روش آنیون سوپراکسید (O₂^-) به‌ وسیله فتولیز ریبوفلاوین تولید می‌شود وNBT  (نیتروبلوتترا‌زولیوم) را به ترکیب ارغوانی دیفرمازون احیاء می­کند. فعالیت آنزیم بر اساس اندازه­گیری میزان ممانعت از احیاء نوری NBT توسط عصاره آنزیمی انجام گرفت. مخلوط واکنش (3 میلی‌لیتر) شامل 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 100 میکرولیتر NBT 5/1 میلی‌مولار، 200 میکرولیتر EDTA 1/0 مولار حاوی سدیم‌ سیانید 3/0 میلی‌مولار و 2650 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 60 میلی‌مولار با 8/7=pH بود. این محلول به مدت 8-5 دقیقه در زیر نور لامپ (40 وات) در دمای اتاق قرار داده شد. سپس 50 میکرولیتر ریبوفلاوین (12/0 میلی‌مولار) به محلول افزوده شد و دوباره در زیر لامپ به مدت 12 دقیقه قرار گرفت. سپس جذب نوری نمونه­ها در طول موج 560 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت گردید. مخلوط واکنش شاهد فاقد عصاره آنزیمی بود. فعالیت ویژه آنزیم به‌ صورت واحد بر میلی‌گرم پروتئین (Unit/mg protein) بیان گردید. یک واحد فعالیت آنزیمی، مقداری از آنزیم است که موجب ممانعت 50 درصدی از احیاء نوری NBT می‏شود.

فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس اندازه­گیری میزان کاهش جذب نوری پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر، مطابق روشChance  و Maehly اندازه­گیری گردید (11). به این منظور 500 میکرولیتر عصاره آنزیمی به 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم (7=pH، 50 میلی‌مولار) و 1 میلی‏لیتر پراکسید هیدروژن (10 میلی‌مولار) افزوده شد و تغییرات جذب نوری به مدت سه دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت گردید. در نهایت فعالیت ویژه آنزیم بر اساس ضریب خاموشی پراکسید هیدروژن (mM ^-1 cm^-1 40) محاسبه و به ‌صورت واحـد بر میلی‌گرم پروتئین (Unit/mg protein)

بیان گردید.

تجزیه و تحلیل آماری: آنالیز داده‏های به‌ دست ‌آمده با استفاده از نرم‌افزار SPSS (نسخه 16) و آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0 صورت گرفت و نمودارهای مربوط به میانگین پارامترهای سنجیده شده، با استفاده از نرم‌افزار Microsoft excel 2019 ترسیم گردیدند.

نتایج

محتوای کلروفیل a و b: نتایج آزمایش حاکی از آن بود که تنش­های ایجاد شده توسط غلظت­های مختلف 6، 12 و 18% پلی­اتیلن گلیکول به­ طور جدی بر فاکتورهای مورد آزمایش اثر ممانعت­کنندگی نشان دادند و در مقابل تیمار با 24-اپی­براسینولید به­صورت چشمگیری کاهش این اثرات ممانعت­کنندگی را در بر داشت. در شرایط طبیعی و بدون استفاده از اثرات تنش­زای پلی­اتیلن گلیکول نیز  تیمار با 24-اپی­براسینولید باعث افزایش فاکتورهای مورد مطالعه شد. همان­طور که در شکل 1 مشاهده می­شود، تنش خشکی محتوای کلروفیل a را در تمامی نمونه­ها کاهش داد و تیمار با 24-اپی­براسینولید باعث افزایش تولید آن در تیمارهای تحت تنش شد. محتوای کلروفیل  aدر تیمار کنترل بدون اعمال تنش خشکی با استفاده از 24-اپی­براسینولید به بالاترین میزان خود در آزمایش رسید. بیش­­ترین و کم­ترین محتوای کلروفیل a به­ ترتیب در رقم لانکورد و تیمار 24-اپی­براسینولید (mg/g FW 32/5) کنترل و توده جمع­آوری شده از مزارع در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% (mg/g FW 03/2) مشاهده شد. خشکی در هر سه نمونه بذر موجب کاهش معنی­دار محتوای کلروفیل a شد که بیش­­ترین کاهش در بین سه نمونه، در جمعیت بذر جمع­آوری شده از مزارع به میزان 22/39% به ­دست آمد. استفاده از 24-اپی­براسینولید محتوای کلروفیل a را در مقایسه با شاهد در هر سه نمونه افزایش داد و بالاترین افزایش در توده جمع­آوری شده از مزارع (mg/g FW 19/54) مشاهده شد (شکل -a1). استفاده از 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تنش خشکی در هر سه نمونه مورد مطالعه، محتوای کلروفیل a را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی به­صورت معنی­داری افزایش داد. حداکثر و حداقل افزایش بین سه نمونه به ­ترتیب در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید و جمعیت بذرجمع­آوری شده از مزارع (59/67%) و در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید و جمعیت بذر تولیدی زارعین (71/8%) به ­دست آمد (شکل a-1).

تنش خشکی موجب کاهش محتوای کلروفیل b در تمامی نمونه­های بذری گردید و تیمار با 24-اپی­براسینولید باعث افزایش تولید آن در تیمارهای تحت تنش شد. بیش­ترین و کم­ترین محتوای کلروفیل b به ترتیب در رقم لانکورد در تیمار با 24-اپی­براسینولید (mg/g FW 66/2) کنترل (بدون تنش خشکی) و جمعیت جمع­آوری شده از مزارع در تیمار بدون 24-اپی­براسینولید و پلی­اتیلن گلیکول 18% (mg/g FW 75/0) مشاهده شد.

شکل 1- محتوای کلروفیل a (a)، کلروفیلb (b) و کاروتنوئید کل (c) در دانه­رست­های 10 روزه سه نمونه گیاه چاودار (رقم لانکورد، جمعیت جمع­آوری شده از مزارع و جمعیت بذر تولیدی زارعین) تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (PEG) (0، 6، 12 و 18%) و اعمال 24-اپی­براسینولید (24-EBR). اعداد میانگین 3 تکرار ±SE می­باشند و حروف مختلف بر روی ستون­ها نشانگر تفاوت معنی­دار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن می­باشد ((p<0.05.

خشکی در هر سه نمونه موجب کاهش معنی­دار محتوای کلروفیل b شد، به طوری­که بیش­ترین کاهش در بین سه نمونه، در توده جمع­آوری شده از مزارع به میزان 39/56% مشاهده شد. اعمال 24-اپی­براسینولید محتوای کلروفیل b را در مقایسه با شاهد در هر سه نمونه بذر افزایش داد و بالاترین افزایش در مقایسه با شاهد در بذر جمع­آوری شده از مزارع ( mg/g FW31/51) حاصل گردید (شکل b-1).

محتوای کاروتنوئید: تنش خشکی بر محتوای کاروتنوئید در سه نمونه بذری تأثیر منفی داشت و با افزایش شدت تنش میزان کاهش کاروتنوئیدها در هر سه نمونه افزایش نشان داد. مصرف 24-اپی­براسینولید این تأثیر منفی را جبران کرده و باعث افزایش میزان کاروتنوئیدها در هر سه نمونه بذری و همه شدت­های تنش خشکی شد. بیش­ترین محتوای کاروتنوئیدها در تیمار 24-اپی­براسینولید و رقم لانکورد ( mg/g FW92/0) و کم­ترین آن در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18%، رقم لانکورد و جمعیت بذر تولیدی زارعین ( mg/g FW36/0) و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید بود. محتوای کارتنوئیدها در هر سه نمونه با افزایش درصد پلی­اتیلن گلیکول کاهش یافت و بیش­ترین کاهش در بین سه نمونه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18%، رقم لانکورد و توده زارعین به میزان 36% مشاهده شد. اعمال 24-اپی­براسینولید در هر سه نمونه منجر به افزایش محتوای کاروتنوئیدها شد و بیش­ترین افزایش در توده تولیدی زارعین (50%) به دست آمد (شکل c-1).

محتوای مالون دی آلدئید (MDA) و پراکسید هیدروژن (H₂O₂): بیش­ترین محتوای MDA در ریشه و اندام­های هوایی سه نمونه چاودار در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و رقم لانکورد به ­ترتیب به میزان nmol/g FW 271 و 465 مشاهده شد. کم­ترین محتوای MDA نیز در ریشه و اندام­های هوایی در تیمار 24-اپی­براسینولید و رقم لانکورد به ­ترتیب به ­میزان  nmol/g FW95 و 141 به ­دست آمد (شکل b-2 و a-2). محتوای MDA در هر سه رقم با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت و حداکثر افزایش در ریشه بین سه رقم مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و توده بذر تولیدی زارعین (135%) و در اندام­های هوایی در رقم لانکورد (78/168%) در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) مشاهده شد. مصرف 24-اپی­براسینولید در هر سه نمونه بذر منجر به کاهش محتوای MDA در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) شد که بیش­ترین کاهش در ریشه و اندام­های هوایی در رقم لانکورد (5/18%) به ­دست آمد (شکل b-2 و a-2).

استفاده از ترکیب 24-اپی­براسینولید، در گیاهان تحت تیمار خشکی، در هر سه رقم محتوای MDA ریشه را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی کاهش داد (90/15 تا 73/28%). بیش­ترین کاهش در ریشه سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید و رقم لانکورد مشاهده شد. محتوای MDA اندام­های هوایی در اثر مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی به ­میزان 25/7 تا 78/39% کاهش یافت و بالاترین کاهش در رقم لانکورد در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید مشاهده گردید (شکل b-2 و a-2).

محتوای  H₂O₂ریشه و اندام­های هوایی، در هر سه نمونه با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت و بیش­ترین افزایش بین سه نمونه در ریشه تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و نمونه بذر جمع­آوری شده از مزارع (61/3 برابر) و در اندام­های هوایی در رقم لانکورد (17/169%) در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) به دست آمد. کاربرد 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به کاهش محتوای H₂O₂ در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) گردید و بیش­­ترین کاهش در ریشه (55/23%) و اندام­های هوایی (09/25%) در رقم لانکورد به ­دست آمد (شکل d-2 و c-2). اعمال 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه بذر، محتوایH₂O₂  ریشه را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی کاهش داد (75/23 تا 35/36%). بیش­ترین کاهش  H₂O₂ریشه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید و نمونه بذر جمع­آوری از مزارع مشاهده شد. کاهش محتوای H₂O₂ اندام­های هوایی در اثر مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی به میزان 42/14 تا 89/30%  نیز مشاهده شد و بیش­ترین کاهش در اندام­های هوایی توده جمع­­آوری شده از مزارع در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید به ­دست آمد (شکل d-2 و c-2).

شکل 2- محتوای MDA ریشه (a) و اندام­های هوایی (b) و محتوای H₂O₂ ریشه (c) و اندام­های هوایی (d) در دانه­رست­های 10 روزه سه نمونه گیاه چاودار (رقم لانکورد، جمعیت بذری جمع­آوری شده از مزارع و جمعیت بذر تولیدی زارعین) تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (0، 6، 12 و 18%) و اعمال 24-اپی­براسینولید. اعداد میانگین 3 تکرار ±SE می­باشند و حروف مختلف بر روی ستون­ها نشانه تفاوت معنی­دار بین تیمارها طبق آزمون دانکن می­باشد ((p<0.05.

نشت الکترولیت­ها (EL): بیش­ترین میزان نشت الکترولیت­ها در توده بذر تولیدی زارعین در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% (32/44 %) و کم­ترین آن در تیمار24-اپی­براسینولید رقم لانکورد (31/17%) بود. درصد نشت الکترولیت­ها در هر سه نمونه با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت که بیش­ترین افزایش آن در بین سه نمونه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و توده بذر تولیدی زارعین (31/17%) در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) مشاهده شد. استفاده از 24-اپی­براسینولید در هر سه نمونه منجر به کاهش درصد نشت الکترولیت­ها شد و بیش­­ترین کاهش در رقم لانکورد (61/5%) به­ دست آمد (شکل a-3). مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه رقم چاودار، درصد نشت الکترولیت­ها را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی کاهش داد (93/3 تا 10%). بیش­ترین کاهش درصد نشت الکترولیت­ها بین سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید و توده جمع­آوری شده از مزارع مشاهده گردید (شکل a-3).

محتوای پرولین آزاد: بیش­ترین محتوای پرولین آزاد در توده جمع­آوری شده از مزارع در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید (µg/g FW01/158) و کم­ترین آن در تیمار شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) و توده بذری تولیدی زارعین (µg/g FW 90/58) بود. محتوای پرولین آزاد در هر سه رقم با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت که بیش­ترین افزایش در بین سه رقم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18%و  توده بذر تولیدی زارعین (56/172%) در مقایسه با شاهد مشاهده شد. کاربرد 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به افزایش محتوای پرولین نسبت به شاهد شد، به طوری­که بیش­ترین افزایش در توده بذر تولیدی زارعین (91/6 %) به دست آمد (شکل b-3). هم­چنین استفاده از 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه رقم چاودار، محتوای پرولین آزاد را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی افزایش داد (42/12 تا 25/40 %). بیش­ترین افزایش محتوای پرولین آزاد بین سه رقم مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید و توده بذر تولیدی زارعین مشاهده شد (شکل b-3).

محتوای قندهای محلول: محتوای قندهای محلول در هر سه نمونه بذر مورد مطالعه با اعمال تنش خشکی و  تیمار با 24-اپی­براسینولید افزایش یافت. بیش­­ترین محتوای قندهای محلول در رقم لانکورد و در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید ( mg/g FW97/52) و کم­ترین آن در گیاهان شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) و در نمونه جمع­آوری شده از مزارع ( mg/g FW01/18) حاصل شد. محتوای قندهای محلول در هر سه رقم با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت که بیش­ترین افزایش آن در بین سه رقم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18%و  توده جمع­آوری شده از مزارع (80/148%) در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) مشاهده شد. کاربرد 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به افزایش محتوای قندهای محلول نسبت به شاهد شد که بیش­ترین افزایش در توده جمع­آوری شده از مزارع (82/17 %) به دست آمد (شکل c-3). اعمال 24-اپی­براسینولید بر روی گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه رقم چاودار، محتوای قندهای محلول را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی افزایش داد (94/10 تا 14/23%). بیش­ترین افزایش محتوای قندهای محلول بین سه رقم مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید و رقم لانکورد مشاهده شد (شکل c-3).

پروتئین­های محلول کل: محتوای پروتئین­های محلول در هر سه رقم با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت و بیش­ترین افزایش در بین سه رقم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و توده جمع­آوری شده از مزارع (08/4 برابر) در مقایسه با شاهد این گروه مشاهده شد. اعمال 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به افزایش محتوای پروتئین­های محلول نسبت به شاهد شد و بیش­ترین افزایش در توده جمع­آوری شده از مزارع (81/40 %) به دست آمد (شکل d-3). بیش­ترین محتوای پروتئین محلول کل در نمونه لانکورد در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید ( mg/g FW01/8) و کم­ترین آن در گیاهان شاهد نمونه  لانکورد (mg/g FW 01/1) حاصل شد. مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه بذر چاودار، محتوای پروتئین­های محلول را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی چاودار به میزان (80/32 تا 59/60%) افزایش داد. بالاترین افزایش محتوای پروتئین­های محلول بین سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید و بذر تولیدی زارعین مشاهده شد (شکل d-3).

شکل 3- درصد نشت الکترولیت­ها (EL) (a)، محتوای پرولین آزاد (b)، محتوای قندهای محلول (c) و پروتین­های محلول کل (d) در دانه­رست­های 10 روزه سه نمونه بذر گیاه چاودار (رقم لانکورد، جمعیت جمع­آوری شده از مزارع و جمعیت بذر تولیدی زارعین) تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (0، 6، 12 و 18%) و اعمال 24-اپی­براسینولید. اعداد میانگین 3 تکرار ± SEمی­باشند و حروف مختلف بر روی ستون­ها نشانه تفاوت معنی­دار بین تیمارها طبق آزمون دانکن می­باشد ((p<0.05.

فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی

فعالیت آسکوربات پراکسیداز (APX): فعالیت آنزیم APX ریشه و اندام­های هوایی در هر سه نمونه بذر  با افزایش پلی­اتیلن گلیکول افزایش یافت و بیش­ترین افزایش  APXریشه بین سه نمونه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و رقم لانکورد (175%) و در اندام­های هوایی در نمونه بذر جمع­آوری شده (208%) در مقایسه با شاهد مشاهده شد. استفاده از 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به کاهش فعالیتAPX  در مقایسه با شاهد (بدون تنش خشکی و بدون تیمار با 24-اپی­براسینولید) در هر نمونه شد و بیش­ترین کاهش در ریشه (75/50%) و اندام­های هوایی (22/%47) در توده بذر جمع­آوری شده از مزارع در مقایسه با شاهد به ­دست آمد (شکل b-4 و a-4).

بیش­ترین فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در ریشه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18%، رقم لانکورد و بذر تولیدی زارعین (U/mg protein 99/0) و در اندام­های هوایی در بذر تولیدی زارعین در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% (U/mg protein 60/11) مشاهده شد. کم­ترین فعالیت آنزیم APX در ریشه (U/mg protein 16/0) و اندام­­های هوایی (U/mg protein 9/1) در ترکیب تیماری 24-اپی­براسینولید و نمونه بذر جمع­آوری شده از مزارع به ­دست آمد (شکل b-4 و a-4).

کاربرد 24-اپی­براسینولید به گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه چاودار فعالیت آنزیم APX ریشه را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی کاهش داد (50/26 تا 70/37%). بیش­ترین کاهش فعالیت این آنزیم در ریشه بین سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید و نمونه بذر جمع­آوری از مزارع مشاهده شد. کاهش فعالیت آنزیمAPX  اندام­های هوایی در اثر مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی هر سه نمونه مورد مطالعه به میزان 75/32  تا 28/43% مشاهده شد که بیش­ترین کاهش در اندام­های هوایی بذور جمع­آوری شده از مزارع در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید به دست آمد (شکل b-4 و a-4).

فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD): فعالیت آنزیم POD در هر سه نمونه بذر با افزایش پلی­اتیلن گلیکول در ریشه افزایش و در اندام­های هوایی کاهش یافت. به طوری­که  بیش­ترین افزایش در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و توده جمع­آوری شده از مزارع (301%) و بیش­ترین کاهش در اندام­های هوایی در رقم لانکورد (33/81%) با پلی­اتیلن گلیکول 18% در مقایسه با شاهد مشاهده گردید. اعمال 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به کاهش فعالیت POD ریشه و افزایش فعالیت آن در اندام­های هوایی در مقایسه با شاهد شد. بیش­ترین کاهش در ریشه در رقم لانکورد (25%) و بیش­ترین افزایش در اندام­های هوایی در توده بذر جمع­آوری شده از مزارع و توده بذر تولیدی زارعین (18/18%) به ­دست آمد (شکل d-4 و c-4).

بیش­ترین فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه در ترکیب تیماری پلی­اتیلن گلیکول 18% و بذر تولیدی زارعین (U/mg protein 32/2) و در اندام­های هوایی در رقم لانکورد در تیمار 24-اپی­براسینولید ( U/mg protein14) بود. کم­ترین فعالیت آنزیم POD ریشه در تیمار 24-اپی­براسینولید و بذر جمع­آوری شده از مزارع ( U/mg protein41/0) و در اندام­های هوایی در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و تمام نمونه­های مورد مطالعه ( U/mg protein2) به­ دست آمد (شکل d-4 و c-4).

اعمال 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه چاودار، فعالیت آنزیم POD ریشه را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار تنش خشکی کاهش داد (68/12 تا 66/38%). بالاترین کاهش فعالیت این آنزیم در ریشه بین سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید و بذر تولیدی زارعین مشاهده شد. فعالیت آنزیم POD اندام­های هوایی در اثر کاربرد 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه بذر مورد مطالعه به میزان 85/42 تا 150% افزایش یافت. بیش­ترین افزایش فعالیت این آنزیم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید اندام­های هوایی رقم لانکورد و بذر تولیدی زارعین به ­دست آمد (شکل d-4 و c-4).

شکل 4- فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) ریشه (a) و اندام هوایی (b) و فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) ریشه (c) و اندام هوایی (d) در دانه­رست­های 10 روزه سه نمونه گیاه چاودار (رقم لانکورد، جمعیت بذر جمع­آوری شده از مزارع و جمعیت  بذر تولیدی زارعین) تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (0، 6، 12 و 18%) و اعمال 24-اپی­براسینولید. اعداد میانگین 3 تکرار ±SE بوده و حروف مختلف بر روی ستون­ها از لحاظ آماری نشانه تفاوت معنی­دار بین تیمارها طبق آزمون دانکن می­باشد ((p<0.05.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD): فعالیت آنزیم SOD در هر سه نمونه با افزایش پلی­اتیلن گلیکول در ریشه افزایش و در اندام­های هوایی کاهش یافت و بیش­ترین افزایش ریشه در بین سه نمونه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و توده جمع­آوری شده از مزارع (174%) و بیش­ترین کاهش در اندام­های هوایی نمونه جمع­آوری شده از مزارع (55/55%) در مقایسه با گیاهان شاهد مشاهده شد. اعمال 24-اپی­براسینولید در هر سه نمونه منجر به افزایش فعالیت SOD ریشه و اندام­های هوایی در مقایسه با شاهد شد. در این راستا بیش­ترین افزایش در ریشه نمونه لانکورد (89/31%) و در اندام هوایی توده بذر تولیدی زارعین (21/51%) به ­دست آمد (شکل b-5 و a-5).

بیش­ترین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در ریشه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% + 24-اپی­براسینولید و بذر تولیدی زارعین ( U/mg protein301) و در اندام­های هوایی در گیاهان شاهد و بذر تولیدی زارعین ( U/mg protein121) به دست آمد. کم­ترین فعالیت آنزیم SOD ریشه در گیاهان شاهد توده جمع­آوری شده از مزارع ( U/mg protein66) و در اندام­های هوایی در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 18% و نمونه جمع­آوری شده از مزارع ( U/mg protein32) به ­دست آمد (شکل b-5 و a-5).

مصرف 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه نمونه چاودار، فعالیت آنزیم SOD ریشه را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی افزایش داد (89/50 تا 01/63%). بیش­ترین افزایش فعالیت این آنزیم در ریشه بین سه نمونه مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید و توده جمع­آوری شده از مزارع مشاهده شد. فعالیت آنزیمSOD  اندام­های هوایی در اثر اعمال 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی هر سه نمونه مورد مطالعه به میزان 28/34 تا 39/80% افزایش یافت که بیش­ترین افزایش فعالیت این آنزیم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید اندام­های هوایی نمونه جمع­آوری شده از مزارع به ­دست آمد (شکل b-5 و a-5).

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): بیش­ترین فعالیت آنزیم کاتالاز در ریشه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% و توده بذر تولیدی زارعین (U/mg protein 47/5) و در اندام­های هوایی در گیاهان شاهد توده جمع­آوری شده از مزارع (U/mg protein 01/15) مشاهده شد. کم­ترین فعالیت آنزیم CAT ریشه در گیاهان شاهد توده جمع­آوری شده از مزارع و در اندام­های هوایی در گیاهان شاهد توده بذر تولیدی زارعین (U/mg protein 95/3) به ­دست آمد (شکل d-5 و c-5).

فعالیت آنزیم CAT در هر سه نمونه با افزایش پلی­اتیلن گلیکول در ریشه و در اندام­های هوایی افزایش یافت که بیش­ترین افزایش فعالیت ریشه و اندام­های هوایی در بین سه رقم در توده جمع­آوری شده از مزارع (به­ترتیب 51/2 و 31/2 برابر) در مقایسه با شاهد مشاهده شد. اعمال 24-اپی­براسینولید در هر سه رقم منجر به افزایش فعالیت آنزیم CAT ریشه و اندام­های هوایی در مقایسه با شاهد شد و بیش­ترین افزایش در ریشه و اندام­های هوایی در بین سه رقم مورد مطالعه در توده بذر جمع­آوری شده از مزارع (به ترتیب 65/53 % و60/41%) به ­دست آمد (شکل d-5 و c-5).

استفاده از 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی در هر سه رقم چاودار، فعالیت آنزیم CAT ریشه در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی را به میزان 90/19 تا 49/31% افزایش داد و بالاترین فعالیت این آنزیم در ریشه بین سه رقم مورد مطالعه در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 12% + 24-اپی­براسینولید مشاهده شد. فعالیت آنزیم CAT اندام­های هوایی در اثر اعمال 24-اپی­براسینولید در گیاهان تحت تیمار خشکی هر سه نمونه مورد مطالعه به میزان 13/7 تا 78/36% افزایش یافت و حداکثر فعالیت این آنزیم در تیمار پلی­اتیلن گلیکول 6% + 24-اپی­براسینولید و در اندام هوایی جمعیت جمع­آوری شده از مزارع به ­دست آمد (شکل d-5 و c-5).

شکل 5- فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) ریشه (a) و اندام هوایی (b) و فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) ریشه (c) و اندام هوایی (d) در دانه­رست­های 10 روزه سه نمونه گیاه چاودار (رقم لانکورد، توده جمع­آوری شده از مزارع و جمعیت بذر تولیدی زارعین) تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول (0، 6، 12 و 18%) و اعمال 24-اپی­براسینولید. اعداد میانگین 3 تکرار ±SE بوده و حروف مختلف بر روی ستون­ها از لحاظ آماری نشانه تفاوت معنی­دار بین تیمارها طبق آزمون دانکن می­باشد ((p<0.05.

بحث

نتایج این مطالعه که در آن تأثیر هورمون 24-اپی­براسینولید

بر عملکرد فیزیولوژیک بذر چاودار تحت تنش حشکی بررسی شد، نشان داد که محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل a، b  و کارتنوئید کل در هر سه نمونه بذر مورد مطالعه گیاه چاودار تحت تنش خشکی در مقایسه با شاهد کاهش معنی­داری یافتند. این کاهش میزان کلروفیل تحت تنش خشکی در گیاه آنیسون نیز توسط حیدری و همکاران گزارش شده است (1). این موضوع که تنش خشکی با انباشت گونه­های فعال اکسیژن (ROS) تنش اکسیداتیو در گیاهان را القاء می­کند، کاملاً به اثبات رسیده است. رنگیزه­های کلروفیل نقشی اساسی در فتوسنتز دارند و آسیب به کلروفیل ممکن است متابولیسم کل گیاه را به خطر بیندازد (41). کاهش کلروفیل هنگامی اتفاق می­افتد که ساختار و عملکرد غشاهای تیلاکوئیدی به دلیل پراکسیداسیون ناشی از تنش اکسیداتیو مختل می­شود (18). تخریب بیش­تر کلروفیل در گیاهان تحت آسیب اکسیداتیو ناشی از انباشت ROS انتظار می­رود، زیرا ROS­ها از نظر ماهیت بسیار واکنش­پذیر هستند و باعث آسیب قابل توجه به رنگیزه­ها و سایر مولکول­های زیستی مهم می­شوند (17 و 30). با این حال، نقش اصلی کارتنوئیدها محافظت از سلول­های گیاهی است، زیرا به ­عنوان یک مولکول آنتی­اکسیدانت در جلوگیری از آسیب­های ناشی از تنش­های اکسیداتیو حاصل از ROS عمل می­کنند. هم­چنین نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از 24-اپی­براسینولید در گیاه چاودار تحت تنش خشکی منجر به افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی و شاهد گردید. نتایج مشابه قبلاً در گیاهان جو (17) و گندم (21) تحت تیمار خشکی و 24-اپی­براسینولید نشان داده شده است. در این پژوهش افزایش محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی در گیاهان تحت تیمار 24-اپی­براسینولید به دلیل کاهش شدت تنش اکسیداتیو می­باشد که با کاهش محتوای MDA، H₂O₂ و نشت الکترولیت­ها نمود پیدا کرده است.

مالون دی آلدئید محصول جانبی پراکسیداسیون لیپیدها است و به­ عنوان یک شاخص مهم جهت برآورد شدت آسیب اکسیداتیو در نظر گرفته می­شود (6). این ترکیب شاخص فیزیولوژیکی ارزشمندی برای تعیین ثبات و نفوذ­پذیری غشاء سلولی است که مقدار آن در اثر آسیب اکسیداتیو افزایش می­یابد. تنش خشکی می­تواند باعث انباشت گونه­های فعال اکسیژن در گیاهان شود (24) که به نوبه خود به ماکرومولکول­هایی مانند لیپیدها، کربوهیدرات­ها، اسیدهای نوکلئیک و پروتئین­ها آسیب می­رسانند (41). پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش غلظت مالون ­دی ­آلدئید در گیاهانی نظیر جو (22)، هیبریدهای ذرت (14) و واریته­های گندم (24) گزارش شده است. مطالعات انجام شده توسط Khan و همکاران (21) نشان داده است که تنش خشکی باعث القاء تنش اکسیداتیو در دو واریته گندم می­گردد و نفوذ­پذیری غشاء و نشت­ الکترولیت­ها را افزایش می­دهد، در حالی ­که استفاده از 24-اپی­براسینولید منجر به کاهش قابل توجهی در میزان این فاکتورها در هر دو واریته گندم تحت تنش خشکی می­شود. این نتیجه نشان­ دهنده القاء مکانیسم محافظتی توسط 24-اپی­براسینولید می­باشد که با از بین بردن ROS اضافی و بهبود ظرفیت آنتی­اکسیدانی و یا پتانسیل بیوسنتز آنتی­اکسیدان­ها باعث کاهش خسارات ناشی از تنش خشکی می­شود. گیاهان دارای یک سیستم دفاعی آنتی­اکسیدانی کارآمد متشکل از آنتی­اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی هستند که برای از بین بردن ROS استفاده می­شوند (3). تیمار 24-اپی­براسینولید با کاهش نفوذپذیری و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به حفظ یکپارچگی، ثبات و فعالیت غشاهای سلولی گیاه کمک می­کند و از این طریق مقاومت گیاه در مقابل تنش را افزایش می­دهد. نتایج مشابه در مورد اثر 24-اپی­براسینولید در کاهش میزان  MDAدر شرایط تنش خشکی در گیاه ذرت (40) نیز گزارش شده است که با نتایج این تحقیق هم­خوانی دارد.

نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی موجب انباشت اسمولیت­هایی مانند پرولین آزاد، قندها و پروتئین­ها در گیاه چاودار می­گردد و از طرف دیگر کاربرد 24-اپی­براسینولید تولید اسمولیت­ها را به­ طور معنی­داری در گیاهان هر سه نمونه مورد مطالعه چاودار تحت تیمار خشکی بهبود داد. محمدی خلیفه­لوئی و همکاران اظهار داشتند که محلول­پاشی با ترکیب 24-اپی­براسینولید سبب افزایش میزان پرولین گیاه مرزه تابستانه نسبت به شاهد گردید (2). پرولین آزاد به ­عنوان یک نشانگر تنش و یک اسمولیت محافظت­کننده در گیاهانی که تحت تنش­های غیر­زیستی هستند شناخته شده است (29). نقش پرولین آزاد و قندها در کاهش خسارات ناشی از تنش خشکی و کم­آبی با سم­زدایی از ROS از طریق خاموش کردن اکسیژن یکتایی (¹O₂) و یا واکنش با رادیکال هیدروکسیل حیاتی است و منجر به افزایش مقاومت گیاهان در مقابل تنش می­شود (15). پرولین آزاد و اسمولیت­های مختلف به ­عنوان عوامل محافظتی در تعادل آب، مواد مغذی و تثبیت ساختار غشاها نیز عمل می­کنند (20). هم­چنین محافظت­کننده­های اسمزی در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیک مانند تعادل اسمزی، انبساط برگ، فتوسنتز و بسیاری از واکنش­های بیوشیمیایی دیگر نقش حیاتی دارند (31). مشابه نتایج حاصل از این مطالعه، افزایش سطوح پرولین آزاد، قندهای محلول و پروتئین­ها در گیاهان فلفل و فستوکا پس از استفاده از 24-اپی­براسینولید نیز گزارش شده است (13 و 23).

در مطالعه حاضر، محتوای پروتئین­های محلول کل در گیاه چاودار تحت تنش خشکی افزایش یافت. کاربرد 24-اپی­براسینولید نیز باعث افزایش بیش­تر محتوای پروتئین­های محلول کل در گیاهان چاودار شد. افزایش محتوای پروتئین­ها ممکن است در اثر تغییرات نسبی در غلظت پروتئین­های آنزیمی دخیل در سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی گیاهان تحت تنش خشکی باشد. مطالعات دیگر نیز افزایش پروتئین­ها در گیاه گندم، کتان و جو تحت تنش خشکی را نشان داده­اند (12، 20 و 21).

طبق نتایج حاصل از این مطالعه فعالیت هر چهار آنزیم بررسی شده در ریشه هر سه نمونه چاودار مورد مطالعه افزایش نشان داد، در صورتی­که در اندام­های هوایی هر سه نمونه مورد مطالعه چاودار فعالیت آنزیم­های APX و CAT در گیاهان تحت تیمار خشکی افزایش و فعالیت آنزیم­های SOD و POD کاهش نشان داد. آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز اولین خط دفاعی گیاه در برابر تنش اکسیداتیو هستند، در نتیجه در هنگام تنش اکسیداتیو فعالیت این آنزیم­ها افزایش پیدا می­کند (21). گزارش شده است که همبستگی مثبتی بین تنش اکسیداتیو و افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی وجود دارد. افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در اثر تنش خشکی در هیبریدهای ذرت (14) و گندم (21) گزارش شده است. SOD در گیاهان تحت تنش، نقش حیاتی به عنوان مکانیسم دفاعی در برابر خطر تشکیل رادیکال هیدروکسیل (OH^•) از طریق تبدیل رادیکال سوپراکسید ((O^•₂⁻ به H₂O₂ در سیتوزول، کلروپلاست و میتوکندری بازی می­کند (43). H₂O₂ نیز سمی است و باید با تبدیل شدن به آب در واکنش­های بعدی از بین برود (45). در گیاهان، تعدادی از آنزیم­ها سطح  H₂O₂داخل سلولی را تنظیم می­کنند، اما آنزیم­های CAT، APX و  PODمهم­ترین آنزیم­ها در این زمینه محسوب می­شوند (27). در این بین، آنزیمCAT  سرعت تبدیل بالایی دارد و می­تواند H₂O₂ را به آب و اکسیژن کاتالیز کند. به همین ­ترتیبAPX  و POD نیز از آنزیم­های مهم آنتی­اکسیدانی هستند که هر دو باعث تجزیه H₂O₂ می­شوند. طبق نتایج حاصل به­نظر می­رسد در ریشه گیاه چاودار که اولین محل درک تنش خشکی است آنزیم­های POD و CAT و در اندام هوایی دو آنزیم APX و CAT نقش مهمی در تجزیه H₂O₂ دارند. کاتالاز عمدتاً در پراکسی­زوم­ها و میتوکندری وجود دارد که اغلب پس از قرار گرفتن در معرض خشکی و کم­آبی فعالیت آن افزایش می­یابد (38). پراکسیدازها نیز به­طور عمده در کلروپلاست، سیتوزول و دیگر اندامک­های داخل سلول تولید می­شوند و برای حفظ حالت احیا در سلول­ها مورد نیاز هستند.

نتایج نشان داد که استفاده از 24-اپی­براسینولید تحمل گیاه چاودار را در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از خشکی افزایش داد. تیمار هر سه نمونه مورد مطالعه چاودار با 24-اپی­براسینولید به­طور قابل­ توجهی در اندام هوایی فعالیت آنزیم­های SOD، POD و CAT و در ریشه­ها فعالیت SOD و CAT را در مقایسه با گیاهان تحت تیمار خشکی و شاهد افزایش داد. افزایش فعالیت برخی آنزیم­های آنتی­اکسیدانی با مصرف 24-اپی­براسینولید در هیبریدهای ذرت تحت تیمار کم­آبی نیز نشان داده شده است و ممکن است مربوط به اثر 24-اپی­براسینولید بر رونویسی و بیان ژن­های آنتی­اکسیدانی باشد که می­توانند با کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از خشکی، تجمع  H₂O₂را تا حد زیادی کاهش دهند (14).

میزان غلظت­های ROS توسط سیستم دفاعی گیاه از جمله آنزیم­های POD، CAT و SOD کنترل می­شود. POD می­تواند سطح ROS را به ­طور قابل توجهی از طریق مهار و مصرف H₂O₂ تغییر دهد. علاوه بر این، آنزیم­هایCAT  و SOD نیز می­توانند تولید رادیکال OH را مهار و یا به حداقل برسانند (25). از طرف دیگر به نظر می­رسد کاربرد 24-اپی­براسینولید توانسته است تأثیر مثبتی بر فرآیندهای فیزیولوژیکی القاء نماید و از طریق کاهش تولید H₂O₂ و نشت الکترولیت­ها تنش اکسیداتیو القاء شده توسط خشکی را کاهش دهد و هم­چنین با افزایش مقادیر اسمولیت­ها و افزایش فعالیت و یا بیان آنزیم­های آنتی­اکسیدانی موجب جاروب رادیکال­های آزاد گردد. طی مطالعات متعدد محققان نشان داده­اند که کاربرد 24-اپی­براسینولید منجر به افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و کاهش میزان مالون­ دی ­آلدئید در گیاهان می­گردد (14 و 41) که با نتایج این مطالعه هم­خوانی دارد.

نتیجه ­گیری

تنش خشکی در نمونه بذرهای مورد مطالعه چاودار از طریق تغییرات فیزیولوژیکی منجر به کاهش رنگیزه­های فتوسنتزی، افزایش محتوای MDA، H₂O₂، نشت الکترولیت­ها، پرولین آزاد، قندها و پروتئین­های محلول شد. تیمار با 24-اپی­براسینولید باعث بهبود وضعیت پارامترهای مذکور گردید و سبب کاهش غلظت H₂O₂ و نشت الکترولیت­ها و آسیب­های غشایی (به صورت کاهش غلظت MDA)، گردید. نتایج مثبت استفاده از 24-اپی­براسینولید در سه نمونه گیاه چاودار تحت تنش خشکی القاء شده با پلی­اتیلن گلیکول به علت تغییرات ایجاد شده در سیستم­های محافظت­کننده سلولی از جمله سیستم آنزیم­های آنتی­اکسیدانی بود. به نظر می­رسد که در نمونه­های مورد مطالعه چاودار در این مطالعه، همکاری بین آنزیم­های سیستم محافظتی آنتی­اکسیدان­ها در گیاه چاودار اثرات سمی و مخرب گونه­های فعال اکسیژن تولید شده تحت شرایط تنش خشکی را کاهش داده است و منجر به بهبود شرایط رشد برای گیاهان گردیده است.