Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Evaluation of the effect of nanoelicitors on cell growth and some biochemical properties in cell suspension culture of Galega officinalis L.

Document Type : Research Paper

Authors

1 University of Mohaghgh Ardabili

2 Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran

3 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Mohaghegh Ardabili

4 PhD student of Agricultural Biotechnology, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghgh Ardabili, Ardabil, Iran

Abstract

Galegine is one of the most important active ingredients in the Galga (Galega officinalis L.), which is used as a drug for lowering blood sugar in the treatment of type 2 diabetes. The use of nano-elicitors to increase the production of secondary metabolites in plant cell and tissue culture is a useful method to achieve high levels of compounds with medicinal worth. In this study, the effects of nano-silver (5, 10, and 20 mg/L) stimuli, iron nano oxide (50, 100, and 200 mg/L), and molybdenum nanoparticles (30, 60, and 90 mg/L) on cell growth and production of some metabolites were studied in cell suspension culture of G. officinalis. The results showed that the application of silver nanoparticles in cell suspension culture at 5 and 10 mg/L for 48 h resulted in the highest galegine content. Also, the application of 100 mg/L iron nano oxide and 60 mg/L molybdenum led to an increase in galegine content in the cell suspension culture of G. officinalis compared with the control. The highest content of total phenols and flavonoids was obtained in the treatment of cells with 100 mg/L iron nano oxide. In general, considering that some treatments used increased the content of galegine in comparison with the control, it can be suggested that applying nano-elicitors in the cell suspension culture can be used to produce more galegine of this plant.

Keywords

Main Subjects

بررسی تأثیر نانومحرک‌ها بر رشد سلولی و برخی ویژگی‌های بیوشیمیایی آن در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه دارویی شیرین‌بیان‌سا (Galega officinalis L.)

سمیرا مینایی میناباد، رسول اصغری زکریا*، ناصر زارع و مریم خضری

ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی

تاریخ دریافت: 25/6/1400            تاریخ پذیرش: 17/11/1400

چکیده

گالگین یکی از مواد مؤثره مهم در گیاه گالگا (Galega officinalis L.) است که به عنوان داروی کاهنده قند ‌‌خون در درمان دیابت نوع دو مورد استفاده قرار می‌گیرد. کاربرد نانومحرک‌ها برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت سلول و بافت گیاهی، راهکاری مفید جهت دست‌یابی به سطوح بالای ترکیبات با ارزش دارویی است. در این تحقیق تأثیر محرک‌های نانو نقره (5، 10 و mg/L 20)، نانو اکسید آهن (50، 100 و mg/L 200) و نانو ذرات مولیبدن (30، 60 و mg/L 90) بر رشد سلول‏ و تولید برخی متابولیت‌ها در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه G. officinalis مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که کاربرد نانوذرات نقره در کشت سوسپانسیون سلولی در غلظت 5 و mg/L 10 به مدت 48 ساعت منجر به بیشترین محتوی گالگین شد. همچنین کاربرد نانواکسید آهن در غلظت mg/L 100 و مولیبدن در غلظت mg/L 60 نیز در درجه بعدی منجر به افزایش محتوی گالگین در کشت سوسپانسیون سلولی  G. officinalisنسبت به شاهد شد. بیشترین محتوی فنول و فلاونوئید کل نیز در تیمار سلول‌ها با mg/L 100 نانواکسید آهن حاصل شد. در کل، با توجه به اینکه تعدادی از تیمارهای مورد استفاده منجر به افزایش محتوای گالگین در مقایسه با شاهد شدند، می‌توان گفت که اعمال نانو محرک‌ها در کشت سوسپانسیون سلولی را می‌توان برای تولید گالگین بیشتر از این گیاه استفاده کرد.

واژه‌های کلیدی: سوسپانسیون سلولی، گالگا (Galega officinalis)، گالگین، محرک‌های نانوفلزی

* نویسنده مسئول، تلفن:  09143541783  ،  پست الکترونیکی: r-asghari@uma.ac.ir

مقدمه

 

گالگا (Galega officinalis L.) یک گیاه علوفه‌ای چند‌ساله از خانواده بقولات (Fabaceae) است (31 و 32) که بومی جنوب ‌شرقی اروپا و خاورمیانه (آسیای غربی) است (47)، همچنین در چمن‌زارهای اروپای جنوبی و مزارع مرطوب در بریتانیا نیز به طور وحشی رشد می‌کند (43). گالگا گیاهی بوته‌ای با گل‌های آبی و بنفش است که تا ارتفاع 5/1متر رشد می‌کند و ساقه‌های منشعب، برگ‌های متقابل بیضوی یا نیزه‌ای و دمگل طویل دارد (15). عصاره هیدروالکلی G. officinalis حاوی فلاونوئیدها، تانن‌ها، ساپونین‌ها، گلیکوزیدها، رزین‌ها و استروئیدها است (9، 30 و 47). همچنین این گیاه لگومی دارای دو ترکیب گوانیدینی نیتروژن‌دار به نام‏های گالگین (ایزوآمین گوانیدین) و هیدروکسی گالگین است که در تمام بخش‌های آن و طی مراحل نموی از جمله گلدهی و تشکیل میوه وجود دارند. گالگین و گوانیدین مواد مؤثره G. officinalis هستند (35) که دارای خواص هیپوگلیسمی و گالاکتوژنیک هستند (14 و 31). متفورمین، فرم مصنوعی گالگین است که بر اساس مشتقات گوانیدینی جدا شده از G. officinalis تهیه شده و به عنوان داروی کاهنده قند ‌‌خون در درمان دیابت نوع 2 مورد استفاده قرار می‌گیرد (14 و 19). استفاده از G. officinalis در طب سنتی به‌عنوان مکمل در درمان بیماری دیابت قندی در دوره قرون وسطی نیز گزارش شده است (18 و 47).امروزه نیز قسمت‌های هوایی گالگا به طور گسترده‌ای به عنوان یک داروی کاربردی در برابر دیابت، تب بدخیم، التهاب، عفونت انگلی، کرم‌های انگلی و افزایش تولید شیر مادر مورد استفاده قرار می‌گیرد (31).

متابولیت‌های ثانویه با منشأ گیاهی، فعالیت‌های زیستی گوناگونی داشته و ارزش تجاری فراوانی دارند اما تولید این مواد در گیاهان در شرایط طبیعی به وسیله عوامل محیطی، اکولوژیکی و آب و هوایی محدود می‌شود (39). کشت سلولی برای تولید متابولیت‌های با ارزش در محیطی کنترل شده و مستقل از تغییرات آب و هوایی سودمند است (1). از طرفی سلول‌های کشت بافت معمولاً مقادیر زیادی از ترکیبات ثانویه را فقط در شرایط خاص انباشت می‌کنند، این بدان معنی است که به حداکثر رساندن تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه توسط سلول‌های کشت شده نیاز به دستکاری عوامل محیطی، انتخاب لاین‌های سلولی پر بازده، تغذیه با پیش ماده و استفاده از محرک‌ها دارد (2 و 36).

استفاده از محرک‌ها در حال حاضر یکی از روش‌های مؤثر برای بهبود سنتز متابولیت‏های ثانویه در گیاهان دارویی در شرایط درون‌شیشه‌ای است (10 و 51). محرک‌ها، مولکول‌هایی با منشأ زیستی و یا غیر زیستی هستند که با تحریک سیگنال‌های سلولی و بر‌همکنش مولکولی میان گیرنده‌های گیاهی در سطح غشای سلولی، بیان ژن‌های مرتبط در مسیر را تحریک می‌کنند و موجب سنتز متابولیت‌های ثانویه در گیاهان می‌شوند (56). محرک‌ها در یک غلظت دقیق می‌توانند در زمان مناسب به کشت سوسپانسیون اعمال شوند و سبب تولید میزان متابولیت بالا در مدت زمان کوتاه شوند (26 و 36). نانو ذرات از دسته محرک‌های غیر زیستی هستند که به دلیل اثرات خاص و ویژگی منحصر‌به فرد خود ورود گسترده‌ای به دنیای زیست‌شناسی و کشاورزی دارند (41). خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانو ذرات آن‌ها را قادر می‌سازد تا به طور سودمند با سیستم متابولیک گیاهی در تعامل باشند (25 و 53). این ذرات در مقیاس بین ‌100-1‌ نانومتر، سطح ویژه بسیار بزرگ و انرژی بالایی دارند و به همین دلیل واکنش‌پذیری آنها بیشتر است (33).

عوامل مختلفی مانند غلظت، مدت زمان قرارگیری در معرض محرک، سن کشت و ترکیب مواد مغذی نقش مهمی در تولید ترکیبات فعال زیستی بازی می‌کنند (45). به علاوه، پاسخ به یک محرک خاص ممکن است از گیاهی به گیاه دیگر و بین لاین‌های سلولی مختلف بسیار متفاوت باشد. بنابراین، تعیین غلظت‌های مناسب محرک‌ها برای بهینه‌سازی تولید بسیار ضروری است (6). با توجه به اهمیت گیاه گالگا، این تحقیق با هدف بررسی تأثیر نانو محرک‌های فلزی بر برخی از فاکتورهای رشدی و همچنین میزان تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت سوسپانسیون سلولی آن انجام شد.

مواد و روشها

تهیه سوسپانسیون سلولی: برای تهیه سوسپانسیون سلولی، یک گرم کالوس ترد 45 روزه (حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط جامد (MS) حاوی 3 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 1 میلی‌گرم در لیتر Kin) انتخاب و به mL 50 محیط کشت MS مایع، که در اتوکلاو با دمای 121 درجه به مدت 15 دقیقه استریل شده بودند، انتقال یافته و روی شیکر با دور 110 دور در دقیقه و C°25 قرار گرفتند (34). لازم به ذکر است که محیط کشت مایع مورد استفاده حاوی همان تنظیم‌کننده‌های رشد برای القای کالوس بود. پس از استقرار کشت سوسپانسیون، برای تعیین بهترین لاین سلولی از نظر سرعت رشد، حجم ایستایی سلول (SCV)( Settled cell volume) ، هر دو روز یک بار اندازه‌گیری و منحنی رشد آنها ثبت شد و بر این اساس، بهترین لاین سلولی انتخاب و هر دو هفته زیرکشت شد تا به حجم مورد نظر برای اعمال تیمارهای محرک برسد (34).

تحریک: برای تحریک سوسپانسیون‌های سلولی از غلظت‌های 5، 10 و mg/L 20 نانوذرات نقره (با اندازه ذرات 8-5 نانومتر)، 50، 100 و mg/L 150 نانو اکسید آهن (با اندازه ذرات زیر60 نانومتر)، و 30، 60 و mg/L 90 نانوذرات مولیبدن (با اندازه ذرات 80-13 نانومتر) استفاده شد. هر غلظت در سه تکرار اعمال و بعد از 24 و 48 ساعت سلول‌ها برداشت شدند.

اندازه‌گیری رشد سلول‌ها: به منظور ارزیابی رشد در کشت سوسپانسیون سلولی از شاخص حجم ایستایی سلول (SCV) استفاده شد به این صورت که مقدار mL 10 از محیط کشت حاوی سلول‌ها و توده‌های ریز سلولی در فالکون 15 میلی‌لیتری مدرج، به مدت 30 دقیقه در حالت سکون نگهداری شدند، در نهایت حجم سلو‌های رسوب کرده به عنوان حجم ایستایی سلول یادداشت شد (27). همچنین برای اندازه‌گیری وزن تر سلول‌ها، سوسپانسیون موجود در ارلن‌ها بعد از گذراندن از کاغذ صافی واتمن (نمره 42) و حذف محیط مایع وزن شد (24).

اندازه‌گیری پروتئین و آنزیم‌های آنتی‏اکسیدان: جهت استخراج پروتئین محلول از روش علیپور و همکاران (5) با اندکی تغییر استفاده شد، به این ترتیب که ابتدا سلول‌های برداشت شده در ازت مایع پودر شده و به 100 میلی‌گرم از پودر حاصل، بافر سدیم فسفات (7=pH) حاوی پلی‌وینیل پیرولیدین (PVP) 1% و EDTA یک میلی‌مولار اضافه شد و سپس نمونه‌ها به خوبی ورتکس شده و به مدت 20 دقیقه با دور rpm 10000 در C°4 سانتریفیوژ شدند، در نهایت فاز رویی برداشته شده و مورد استفاده قرار گرفت. میزان پروتئین محلول کل به روش برادفورد (17) اندازه‌گیری شد. جهت ترسیم منحنی استاندارد از آلبومین سرم گاوی (BSA) با ضریب تبیین بالای 98 % استفاده شد.

برای اندازه‌گیری میزان  فعالیت  آنزیم  پراکسیداز، μL 950

بافر فسفات سدیم mM 50 حاوی گایاکول به همراه  μL50 عصاره سلولی و یک μL H2O2 (30%) در کووت (Cuvette) ترکیب و مقدار عددی نمونه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر به مدت 1 دقیقه با فاصله 15 ثانیه قرائت گردید. برای محاسبه واحد آنزیمی از ضریب خاموشی معادل mM-1 cm-1  6/26 استفاده شد (5). برای اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیم پلی‏فنل اکسیداز نیز، mL 5/2 بافر فسفات mM 50 (7pH=)، Lμ 200 پیروگالول (M 02/0)، و Lμ 100 عصاره آنزیمی مخلوط و در طول موج 420 نانومتر قرائت شد. برای محاسبه واحد آنزیمی از ضریب خاموشی معادلmM-1 cm-1  7/24 استفاده شد (5).

اندازه‌گیری محتوای فنول، فلاونوئید کل و گالگین عصاره متانولی سلول‌ها: برای اندازه‌گیری میزان فنول و فلاونوئید کل و محتوای گالگین، عصاره متانولی سلول‌ها به روش Dorling و همکاران (23) با اندکی تغییر تهیه شد: سلول‌ها با ازت مایع پودر شده و به 300 میلی‌گرم از هر نمونه mL 10 متانول خالص اضافه شد. سپس نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه روی شیکر (100 دور در دقیقه، دمای °C25) و پس از آن به مدت 40 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک تحت امواج فراصوت قرار گرفتند. سپس عصاره‌های حاصل با کمک پمپ خلأ از کاغذ صافی واتمن عبور داده شده و در آون °C50 تا μL 1000 تغلیظ شد. سپس عصاره‌های به دست آمده از فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون عبور داده شدند و تا زمان استفاده در فریزر نگهداری شدند.

برای اندازه‏گیری مقدار فنول کل، μL 200 از عصاره متانولی با μL 200 معرف فولین سیکالتو رقیق (10:1) و mL 5/2 آب دوبار تقطیر مخلوط و به مدت 5 دقیقه در °C25 انکوبه شد. پس از آن mL 3 بی‏کربنات سدیم 7% اضافه و به مدت 90 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. جذب در 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر  قرائت شد و منحنی استاندارد برحسب گالیک اسید با غلظت‌های مختلف (ppm 10، 20، 40، 60، 80، 100، 150 و 200) ترسیم و میزان ترکیبات فنولی گیاه معادل گالیک اسید بر اساس منحنی استاندارد به صورت ppm اندازه‌گیری گردید (48).

برای اندازه‌گیری محتوای فلاونوئید، μL 200 عصاره متانولی با μL 600 متانول، μL 100 آلومینیوم کلرید 10 درصد (10 گرم AlCl3 در mL 100 متانول)، μL 100 پتاسیم استات یک مولار و μL 1000 آب مقطر مخلوط شد. محلول به دست آمده 30 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی قرار داده شد و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف (10، 20، 40، 60، 80، 100، 150 و 200 ppm) استاندارد کوئرستین استفاده شد (20). قابل ذکر است برای تهیه بلانک (Blank)، همه مواد مورد استفاده برای اندازه‌گیری فاکتور مورد نظر به جز عصاره نمونه ‌با هم ترکیب شدند و به جای عصاره نمونه از بافر عصاره‌گیری استفاده شد.

اندازه‌گیری میزان گالگین، با استفاده از یک ستون فاز معکوس (250 mm x 4.6 mm) در سیستم YL9100 HPLC (YoungLin Clarity, South Korea) انجام شد. در فاز متحرک KH2PO4 05/0 مولار و استونیتریل 100٪ به ترتیب به نسبت 70 به 30 استفاده شد. pH با کمک ارتو فسفریک اسید (مرک) روی 5/3 تنظیم شد. میزان جریان فاز متحرک 1 میلی‏لیتر در دقیقه و حجم تزریق μL 20 بود. برای تأیید حضور گالگین از استاندارد گالگین (Akos Consulting & Solutions GmbH, Germany AKOS 543-83-9) استفاده شد. غلظت گالگین در نمونه‌ها به روش کمی‌سازی و رسم منحنی استاندارد تعیین شد (44).

آنالیز آماری: به منظور ارزیابی اثر نانو ذرات مختلف بر فاکتورهای رشدی و صفات بیوشیمایی، تجزیه داده‌های حاصل در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و مقایسات میانگین داده­ها بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن (01/0p<) با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16.0 انجام گرفت.

نتایج

لاین سلولی با بیشترین میزان رشد، بر اساس اندازه‌گیری هر دو روز یک بار حجم ایستایی سلولی انتخاب شد (شکل 1). طبق نتایج به‌دست آمده لاین سلولی شماره 4، حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط حاوی غلظت‌های mg/L 3 2,4-D و mg/L 1 کینتین (Kin) بیشترین سرعت رشد را داشت. لاین مذکور تا زمان رسیدن به میزان مورد نیاز جهت اعمال نانو محرک هر دو هفته یک‌بار بازکشت شد (شکل 2). همچنین انتهای فاز رشدی برای این لاین روز هشتم برآورد شد و نانو محرک‌ها در روز هشتم پس از همگن‌سازی به محیط کشت سلول‌ها اعمال شدند.

وزن تر و حجم ایستایی سلولی (SCV): بین غلظت‌های مختلف نانو ذرات نقره، آهن و مولیبدن از نظر تأثیر بر وزن تر و حجم ایستایی سلول (SCV) اختلاف معنی‌داری وجود داشت، اما از نظر زمان برداشت و اثر متقابل آن با نوع محرک اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که در هر سه نانو محرک مورد استفاده، افزایش غلظت نانو محرک‌، منجر به کاهش وزن تر سلول‌ها شد، به‌طوری که با کاربرد نانومحرک‌ها در غلظت پایین، وزن تر سلول‌ها اختلاف معنی‌داری با شاهد نشان نداد اما کاربرد غلظت‌های بالاتر این نانوذرات به طور معنی‌داری موجب کاهش وزن تر سلول‌ها شد (شکل 3-الف). همچنین استفاده از نانو ذرات نقره، آهن و مولیبدن در کشت سوسپانسیون سلولی در غلظت‌های بالا منجر به کاهش معنی‌دار حجم ایستایی سلول شد. به طوری که بیشترین میزان حجم ایستایی سلول مربوط به نمونه شاهد بود که با غلظت‌ پایین نانومحرک‌ها (mg/L 5 نقره، mg/L 50 آهن و mg/L 30 مولیبدن) اختلاف معنی‏دار نداشت ولی با افزایش غلظت نانومحرک‌ها میزان حجم ایستایی سلول به طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل 3-ب). 

 

 

شکل 1- نمودار رشد لاین‌های سلولی مختلف در کشت سوسپانسیون سلولی G. officinalis. لاین سلولی 4 بیشترین سرعت رشد را داشت و انتهای فاز رشدی این لاین روز هشتم پس از بازکشت بود.

 

   

شکل 2- سوسپانسیون سلولی G. officinalis در هفته دوم (راست) و هفته پنجم (چپ) پس از استقرار

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس اثر نانو محرک‌ها بر ویژگی‏های مختلف سلول‌های G. officinalis در کشت سوسپانسیون سلولی

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

وزن تر

SCV

پروتئین کل

پراکسیداز

پلی‌فنل اکسیداز

فنول‌کل

فلاونوئید کل

گالگین

نانو محرک (A)

9

**217/0

**152/0

**003/0

**272/145

**213/167

**516/2

**646/7

**536/1

زمان برداشت (B)

1

ns003/0

ns003/0

ns0001/0

ns019/0

ns482/105

*170/0

**672/1

**178/.0

B × A

9

ns022/0

ns025/0

**001/0

**661/50

**336/167

**159/0

**365/1

** 903/0

خطا

40

019/0

016/0

0001/0

840/2

393/48

034/0

065/0

096/0

ضریب تغییرات (%)

05/16

07/13

13/9

36/12

64/23

64/11

11/11

85/5

** و ns به ترتیب تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 1% و اختلاف غیر معنی‌دار

 

شکل 3- تأثیر نانو محرک‌های مختلف بر وزن تر (الف) و حجم ایستایی سلول (ب) در سوسپانسیون سلولی گیاه G. officinalis. حروف متفاوت نشان‌دهنده وجود اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد توسط آزمون دانکن است.   

 

محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم‏های پراکسیداز و پلی‌فنل اکسیداز: طبق نتایج تجزیه واریانس، اثر سطوح مختلف نانومحرک و اثر متقابل آن با زمان برداشت از نظر محتوای پروتئین کل، فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و پلی فنل‏اکسیداز، در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار اما اثر زمان برداشت معنی‌دار نبود (جدول 1). کاربرد اغلب تیمارهای محرک مورد استفاده (غیر از mg/L 5 نقره و mg/L 90 مولیبدن) به مدت 24 ساعت، موجب افزایش سطح پروتئین کل شدند، ولی در تیمار 48 ساعته تنها غلظت‌های‌ mg/L 10 نقره و  mg/L100 نانو اکسید آهن موجب افزایش محتوای پروتئین کل در سلول‌ها نسبت به شاهد شدند و سایر غلظت‌های مورد استفاده، از این نظر اختلاف معنی‌داری با شاهد نشان ندادند. در مجموع، بیشترین مقدار پروتئین کل در تیمار 24 ساعته با غلظت mg/L 100 نانواکسید آهن با میانگین mg/g 173/0 وزن تر به دست آمد (جدول 2). در مورد فعالیت آنزیم پراکسیداز، در تیمار 24 ساعته افزایش غلظت نانوذرات نقره از mg/L 5 به 10 و mg/L 20 باعث افزایش فعالیت این آنزیم شد، در حالی که در مورد نانواکسید آهن با افزایش غلظت از 50 به mg/L 100 فعالیت این آنزیم افزایش ولی در غلظت mg/L 150 آن دوباره کاهش یافت. برای نانواکسید مولیبدن نیز فعالیت این آنزیم در غلظت mg/L 60 آن بیشتر از غلظت‌های 30 و mg/L 90 آن بود. در تیمار 48 ساعته با افزایش غلظت نانوذرات نقره از 5 به mg/L 10 فعالیت این آنزیم افزایش ولی در غلظت mg/L 20 آن دوباره کاهش یافت. در حالی که در مورد نانواکسید آهن تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های مختلف آن در تیمار 48 ساعته مشاهده نشد. در مورد نانواکسید مولیبدن نیز بین غلظت 30 و mg/L 60 آن تفاوت معنی‌داری از لحاظ فعالیت این آنزیم مشاهده نشد ولی با افزایش غلظت آن به mg/L 90 کاهش در فعالیت این آنزیم مشاهده شد به طوری که در این غلظت با شاهد تفاوت معنی‌داری نداشت. بیشترین فعالیت این آنزیم مربوط به تیمار mg/L 100 نانواکسید آهن و کمترین میزان آن مربوط به تیمار شاهد و mg/L 5 نقره هر دو با زمان تیمار 24 ساعت بود (جدول 2).

میزان فعالیت آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز در سلول‌های تیمار شده تا حدودی متفاوت بود به‌طوری که در تیمار 24 ساعته از بین محرک‌های مورد استفاده، تنها غلظت  mg/L10 نانوذرات نقره منجر به افزایش معنی‌دار میزان فعالیت این آنزیم شد. در تیمار سلول‌ها به مدت 48 ساعت، تنها تیمارهای mg/L 5 نانوذرات نقره، mg/L 50 نانواکسید آهن و mg/L 60 نانو ذرات مولیبدن موجب افزایش معنی‌دار میزان فعالیت پلی‌فنل اکسیداز شدند، و سایر تیمارها اختلاف معنی‌داری با شاهد نشان ندادند. در مجموع، بر اساس نتایج مقایسه میانگین بیشترین فعالیت آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز متعلق به تیمار 24 ساعته سلول‌ها با mg/L 10 نانونقره و تیمار 48 ساعته آنها با mg/L 50 نانواکسید آهن و mg/L 60 نانو ذرات مولیبدن بود (جدول 2).

میزان فنول و فلاونوئید کل: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات، زمان برداشت و اثر متقابل آنها بر میزان فنول و فلاونوئید کل سلول‌ها معنی‌دار بود (جدول 1). در تیمار سلول‌ها با نانو ذرات نقره، اکسید آهن و مولیبدن به مدت 24 ساعت، با افزایش غلظت نانو ذرات مذکور تا سطح متوسط محتوای فنول کل افزایش یافت اما اعمال بالاترین غلظت مورد استفاده از این نانو ذرات (یعنی mg/L 20 نانونقره، mg/L 150 نانواکسید آهن و mg/L 90 نانوذرات مولیبدن) منجر به کاهش میزان فنول کل در سلول‌ها شد، با این حال میزان فنول کل در این حالت در تمام سلول‌های تیمار شده نسبت به شاهد بیشتر بود. در تیمار سلول‌ها به مدت 48 ساعت، سطوح پایین و متوسط نانوذرات مورد استفاده موجب افزایش معنی‌دار محتوای فنول کل شد. اما، بالاترین غلظت مورد استفاده در هر سه نانو محرک موجب کاهش معنی‌دار محتوای فنول کل نسبت به غلظت‌های پایین‌تر شد و با شاهد اختلاف معنی‌داری نشان نداد. در مجموع بیشترین میزان فنول کل در سلول‌های تیمار شده مربوط به تیمار با mg/L 100 نانواکسید آهن به مدت 24 و 48 ساعت و mg/L 10 نانو ذرات نقره به مدت 48 ساعت بود. همچنین کمترین مقدار فنول کل به همراه تیمار شاهد مربوط به تیمار mg/L 90 نانوذرات مولیبدن به مدت 48 ساعت به دست آمد (جدول 2).

در تیمار 24 ساعته، با افزایش غلظت نانو محرک‌های مورد استفاده، مقدار فلاونوئید کل افزایش نشان داد. در تیمار سلول‌ها به مدت 48 ساعت، کاربرد سطوح متوسط نانو محرک (یعنی mg/L 10 نانو نقره، mg/L 100 نانواکسید آهن و mg/L 60 نانو ذرات مولیبدن) موجب افزایش محتوای فلاونوئید کل شد. هر چند تیمار با 50 و mg/L 150 نانواکسید آهن به مدت 48 ساعت نیز باعث افزایش معنی‌دار در مقدار فلاونوئید کل نسبت به شاهد شدند ولی اعمال سایر تیمارها نسبت به شاهد در این حالت معنی‌دار نبود. در مجموع، بیشترین میزان فلاونوئید کل در سلول‌های تیمار شده مربوط به تیمار mg/L 100 نانو اکسید آهن به مدت 48 ساعت با میانگین mg/g 61/5 وزن تر بود (جدول 2).

 

 

جدول 2- مقایسه میانگین تیمارهای مختلف نانومحرک از لحاظ برخی از ویژگی‌های بیوشیمیایی سلول‌ها در سوسپانسیون سلولی G. officinalis.

گالگین (mg/g)

فلاونوئید کل (mg/g)

فنول کل (mg/g)

پلی‌فنول اکسیداز

(mg/g)

پراکسیداز (mg/g)

پروتئین کل (mg/g)

زمان (ساعت)

تیمار

f325/3

l703/0

l423/0

cde919/19

i070/3

j0707/0

24

شاهد

de766/4

jk246/1

jk876/0

e04/10

gh575/7

ghi0939/0

48

ef353/4

jk286/1

fg409/1

de967/13

hi895/4

hij0805/0

24

5

نانوذرات نقره (mg/L)

a813/8

hi937/1

de825/1

a-d303/25

cde093/13

c-g1115/0

48

cde823/5

gh095/2

bc232/2

a599/36

cd616/14

b-f1173/0

24

10

ab798/7

def555/2

ab455/2

cde016/18

b671/20

b1340/0

48

b303/7

fgh125/2

fgh32/1

a-d141/25

cd256/15

b-f1160/0

24

20

cde722/5

ij517/1

hij057/1

de834/12

def463/12

fgh0974/0

48

ef311/4

ij624/1

cd112/2

a-d372/24

def217/12

bc1311/0

24

50

نانوذرات اکسیدآهن (mg/L)

cd393/6

de779/2

bc159/2

ab315/36

cd729/14

fg1030/0

48

cd968/5

c837/3

ab395/2

cde469/22

a389/26

a1732/0

24

100

cd473/6

a605/5

a659/2

de591/12

c196/16

bcd1276/0

48

de292/5

b417/4

ef571/1

cde315/16

b518/19

b1332/0

24

150

ef697/3

d003/3

ghi191/1

de21/14

cde715/13

efg1048/0

48

def568/4

kl000/1

ij001/1

abc704/28

ef286/11

efg1042/0

24

30

نانوذرات مولیبدن (mg/L)

f259/3

ij494/1

ghi209/1

b-e279/23

cde203/14

b-e1247/0

48

cd618/6

hij687/1

e797/1

cde595/19

b503/19

defg1079/0

24

60

bc862/6

de626/2

bc237/2

abc38/28

c16/16

efg1057/0

48

ef192/4

efg483/2

hij038/1

cde271/19

fg767/9

ij0747/0

24

90

f508/3

hi834/1

kl695/0

cde866/18

gh169/7

ij0778/0

48

حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد توسط آزمون دانکن است.   

 

میزان گالگین: نتایج به دست آمده از کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) نشان داد که در تیمار سلول‌ها با نانو ذرات نقره به مدت 24 ساعت، با افزایش غلطت نانونقره محتوای گالگین در سلول‌ها افزایش یافت، برعکس در تیمار 48 ساعته افزایش غلظت این نانومحرک به  mg/L 20 منجر به کاهش میزان گالگین شد. در تیمار 24 ساعته سلول‌ها با نانواکسید آهن، افزایش غلظت محرک تا سطح mg/L 100 بدون اختلاف معنی‏دار با غلظت mg/L 150 آن باعث افزایش میزان گالگین نسبت به شاهد شد. اما در تیمار 48 ساعته آن در غلظت 50 و mg/L 100 بدون اختلاف معنی‏دار با یکدیگر، مقدار گالگین نسبت به شاهد به طور معنی‌‌داری بیشتر شد. ولی با افزایش غلظت آن به mg/L 150 میزان گالگین کاهش یافت و با شاهد در این حالت تفاوت معنی‌داری نداشت (جدول 2). هم چنین غلظت mg/L 60 نانو ذرات مولیبدن، هم در تیمار 24 و هم در تیمار 48 ساعته موجب افزایش معنی‌دار میزان گالگین در سلول‌ها نسبت به شاهد شد، اما سایر تیمارهای این نانو محرک، تغییر معنی‌داری از نظر محتوای گالگین با شاهد نشان ندادند. در مجموع بیشترین میزان محتوای گالگین در تیمار 48 ساعته با غلظت 5 و mg/L 10 ذرات نقره به‌دست آمد (جدول 2).

بحث و نتیجه‌گیری

محرک­ها در واقع مواد شیمیایی یا فاکتورهای زیستی با منشأ مختلف هستند که قادر به ایجاد تغییرات فیزیولوژیکی در موجود زنده بوده (55) و از آن‌ها برای افزایش زیست توده و تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط درون شیشه‌ای استفاده می‌شود (49). با این حال، تحقیقات مختلف نتایج متفاوتی در این مورد گزارش کرده‌اند که احتمالاً به تحمل گیاه و غلظت نانو محرک اعمال شده وابسته باشد. به عنوان مثال، استفاده از نانوذرات نقره در کشت‌های سوسپانسیون سلولی Linum usitatissimum L. وزن تر سلول‌ها را در مقایسه با تیمار شاهد، چندین برابر افزایش داد (52). از طرفی، اثرات وابسته به دوز نانوذرات نقره بر رشد درون شیشه‏ای گیاه Lupinus Termis L. گزارش شده است‌، به طوری که در غلظت‏های پایین‌تر آن رشد گیاه بیشتر می‌شود ولی غلظت‌های بالاتر آن اثر بازدارنده دارند (11). نتایج حاضر نشان داد که در بیشتر موارد، افزایش غلظت نانو ذرات نقره، اکسید آهن و مولیبدن منجر به کاهش وزن تر و حجم ایستایی سلول‌ها نسبت به شاهد شد. این امر می‌تواند از سمیت و ایجاد تنش اکسیداتیو (تولید گونه‌های فعال اکسیژن ROS) ناشی از غلظت‌های بالای این نانو ذرات باشد که منجر به کاهش رشد و تکثیر سلول‌ها می‌شود.

گیاهان با دو سازوکار دفاعی آنزیمی و غیر آنزیمی ROSهای حاصل از تیمار با فلزات سنگین را از بین برده و از آسیب آنها به ترکیبات غشاء و ماکرومولکول‌های سلولی جلوگیری می‌کنند (12). در دفاع آنزیمی میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌‌اکسیدانی مانند سوپراکسید-دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز (50) و در سازوکار غیر آنزیمی محتوای متابولیت‌هایی مانند پرولین، کارتنوئیدها، ویتامین‌ها، آلکالوئیدها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها (29 و 50) در سلول دستخوش تغییر می‌شود. یون‌های فلزی نظیر آهن، مس، روی، کبالت و نیکل که جز عناصر کم مصرف هستند، در فعالیت‌های کارکردی بسیاری از پروتئین‌های مشارکت‌کننده در حفظ رشد و نمو موجودات زنده نقش دارند. با وجود این، غلظت‌های بالای آنها می‌تواند برای موجودات زنده مضر باشند (7 و 26). افزایش میزان پروتئین کل و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مورد مطالعه در شرایط اعمال نانومحرک‌ها نشان می‌دهد که سلول‌ها در کشت سوسپانسیون سلولی با جهش‌های اکسایش ناشی از تجمع گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) مواجه بوده و از طریق افزایش فعالیت این آنزیم‌ها که نقش کلیدی در پالایش ROSها دارند سعی در حذف اثرات منفی آنها می‌کند. با این حال، با افزایش بیشتر غلظت این نانوذرات سلول توانایی کافی برای مقابله با آنها را نخواهد داشت و این ممکن است از سمیت بالای این عناصر در غلظت‌های بالا و کاهش فعالیت متابولیکی سلول ناشی شود. گزارش شده است که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در حضور غلظت‌های پایین نانو ذرات افزایش یافته در حالی که غلظت‌های بالاتر نانو ذرات موجب کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در گیاهان می‌شود (46). نتایج حاصل (جدول 2) نشان داد که میزان پروتئین کل، فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و پلی‌فنول اکسیداز در سلول‌های تیمار شده با نانو محرک‌های نقره، اکسید آهن و مولیبدن بسته به غلظت و مدت زمان اعمال نانو محرک متفاوت است و به طور معمول در غلظت‌های متوسط این عناصر افزایش محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و پلی‌فنول اکسیداز مشاهده می‌شود. مشابه با نتایج ما گزارش شده است که مقدار پروتئین کل و نیز فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچه‌های زیره سبز (Cuminum cyminum L.) (8) و Lepidium draba L. (13) به دوز و مدت زمان اعمال نانو محرک وابسته است.

همچنین، در این تحقیق، نوع و غلظت نانومحرک‌های مورد استفاده منجر به تغییر معنی‌دار در میزان فنول، فلاونوئید کل شد. به طوری که کاربرد نانو اکسید آهن به ویژه در غلظت mg/L 100 منجر به بیشترین افزایش در میزان این صفات شد. تولید مداوم ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در پاسخ به مواد محرک ممکن است به عوامل مختلفی مانند سن گیاه، دوز ماده محرک و مدت زمان تیمار بستگی داشته باشد (38 و 40). این ترکیبات می‌توانند با اتصال به ذرات فلزات سنگین اثرات تنش حاصل از آنها را کاهش دهند و مقاومت سلول‌‌های گیاهی را در برابر تنش بالا ببرند (22). به نظر می‌رسد افزایش محتوای فنول‌ها و فلاونوئیدها در سلول در پاسخ به تنش حاصل از حضور نانوذرات در غلظت های متوسط می‌تواند در کاهش اثرات تنش مؤثر باشد. گزارش شده است که نقره به عنوان بازدارنده قوی اتیلن می‌تواند با مهار فعالیت اتیلن، سنتز فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها را افزایش دهد (12).

از نانوذرات فلزی می‌توان به عنوان یک محرک مؤثر برای تولید متابولیت‌های ثانویه در بیوتکنولوژی گیاهی استفاده کرد (54). کارآیی تحریک برای‌ بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه به گونه گیاهی، ترکیبات مورد نظر، نوع و غلظت محرک‌ها و زمان تیمار بستگی دارد (21). در تحقیق حاضر کاربرد نانومحرک‌های نقره، آهن و مولیبدن منجر به افزایش وابسته به دوز محتوای گالگین در سلول‌ها شد. در واقع حضور این نانوذرات در محیط کشت می‌تواند با اعمال تنش به سلول، سیگنال‌های سلولی لازم برای افزایش بیان ژن و  تحریک فعالیت آنزیم‌های مورد نیاز در مسیر بیوشیمایی تولید این متابولیت‌های ثانویه را در کشت‌های سلولی سبب شوند. افزایش متابولیت‌های پاپاورین، تبائین و کدئین در سوسپانسیون سلولی پاپاور (Papaver somniferum L.) با اعمال سه نانوذره مس، آهن و سیلسیوم (16)، و افزایش 12 برابری مقدار تجمع تانشینون‏ها با اعمال نقره در .Perovskia abrotanoides Kar گزارش شده است (3). همچنین اثر وابسته به دوز نانو ذرات اکسید آهن و روی بر میزان تولید هایپرسین و هایپرفورین در کشت سوسپانسیون سلولی گل راعی (.LHypericum perforatum ) گزارش شده است (4).

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که با کاربرد محرک در کشت سوسپانسیون سلولی G. officinalis می‌توان محتوای گالگین را در مدت زمان کوتاهی افزایش داد. بر این اساس، می‌توان از کشت وسیع سوسپانسیون سلولی این گیاه برای تولید مقدار زیاد گالگین برای اهداف تجاری استفاده کرد. این کار می‌تواند با استفاده از بیورآکتورهای مختلف انجام شود. همچنین این یافته‏ها می‌تواند برای مطالعات بیش‌تر در زمینه کشت سوسپانسیون سلولی گیاه گالگا به عنوان ابزاری برای مهندسی متابولیک گیاهی آن مورد استفاده قرار ‌گیرد.

سپاسگزاری

پژوهش حاضر، در دانشگاه محقق اردبیلی و در قالب طرح پژوهشی مربوط به پایاننامه کارشناسی ارشد به شماره 2454/51 انجام شد و اعتبار آن از طریق معاونت پژوهشی دانشگاه تأمین گردید که بدینوسیله مراتب تشکر و قدردانی به عمل می‌آید.

  1. احمدی، ج.، محمدی، ر.، گروسی، ق.، حسینی، ر. بهینه سازی کالوس‌زایی و سوسپانسیون سلولی پروانش (Catharanthus roseus) مجله بیوتکنولوژی کشاورزی 1: 18–4.
  2. سیاه منصور، ش.، اسماعیلی، ا.، نظریان فیروزآبادی، ف. تأثیر محرک‌های مختلف زیستی و غیرزیستی بر رشد ریشه مویین در گیاه دارویی خشخاش (Papaver somniferum L.) تولیدات گیاهی 41:29–42.
  3. بایسته، ب.، ابریشم‌چی، پ.، اصیلی، ج.، ذاکر، آ. 1400. تولید درون شیشه‌ای تانشینون‌ها در ریشه‌های نوپدید گیاه برازمبل Perovskia abrotanoides Kar. با استفاده از نیترات نقره و عصاره مخمر. مجله پژوهش‏های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) 34(1): 139-151.
  4. شرفی، ا. 1390. بررسی اثر نانو‏مواد آهن و روی بر تولید هایپرسین در کشت کالوس و کشت سوسپانسیون ‏سلولی گل‏ راعی (Hypericum perforatum) پایاننامه کارشناسی ارشد، دانشگاه شاهد، ایران.
  5. علیپور، س.، نصیبی، ف.، فرهمند، ه. 1393. بررسی اثر غلظت‌های متفاوت سدیم نیترو پروساید (SNP) بر صفات فیزیولوژیکی و افزایش عمر گلجایی گل شاخه بریده مریم
    .(Polianthes tuberosa)مجله پژوهش‌های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) 27 :904–.914
  6. فرجامی‌نژاد، ر.، زارع، ن.، اصغری زکریا، ر.، فرجامی‌نژاد، م. 1394. تاثیر ال-تیروزین بر تولید تبائین در کشت سوسپانسیون سلولی خشخاش ایرانی .(Papaver bracteatum) فصلنامه گیاهان دارویی 15(2): 110-119.
  7. قاسمی ب.، حسینی، ر.، دهقان‌نیری، ف. 1394. تأثیر نانو الیسیتورهای کبالت و کیتوزان بر میزان تولید آرتمیزنین و بیان دو ژن کلیدی SQS و DBR2 در گیاه .(Artemisia annua) دوفصلنامه علمی-پژوهشی مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی 4:25–39.
  8. یوسفی، ک.، ریاحی مدوار، ع.، باقی‌زاده، ا. 1394. بررسی تاثیر الیسیتورهای نقره و مس بر بیان ژن فلاون سینتاز 1 و برخی پارامترهای بیوشیمیایی در گیاهچه‌های زیره سبز
    (Cuminum cyminum)بومی ایران. مجله پژوهش‌های گیاهی(مجله زیست شناسی ایران) 28:210–223.

 

  1. Abtahi-Evari S-H, Shokoohi M, Abbasi A, et al. 2017. Protective Effect of Galega officinalis extract on streptozotocin-induced kidney damage and biochemical factor in diabetic rats. Crescent J Med Biol Sci. 4: 108–114.
  2. Akula R, Ravishankar GA. 2011. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants. Plant Signal Behav 6: 1720–1731.
  3. Al-Huqail AA, Hatata MM, Al-Huqail AA, Ibrahim MM. 2018. Preparation, characterization of silver phyto nanoparticles and their impact on growth potential of Lupinus termis seedlings. Saudi J Biol Sci 25: 313–319.
  4. Alaoui-Sossé B, Genet P, Vinit-Dunand F, et al. 2004. Effect of copper on growth in cucumber plants (Cucumis sativus) and its relationships with carbohydrate accumulation and changes in ion contents. Plant Sci. 166: 1213–1218.
  5. Aminizadeh M, Riahi mali, Mohammadi M. 2016. Nano-Metal oxides induced sulforaphane production and peroxidase activity in seedlings of Lepidium draba (Brassicaceae). Prog. Biophys. Mol. Biol. 6 (1): 75-83.
  6. Anadón A, Martínez-Larrañaga MR, Ares I, Martínez MA. 2018. Poisonous Plants of the Europe. In: Veterinary Toxicology. Elsevier, pp 891–909.
  7. Bézard M, Grancher D, Vialard J, Debarnot P. 2002. Un troupeau ovin intoxiqué par le galéga officinal. Point Vétérinaire 33: 66–67.
  8. Bondarian F, Omidi M, Torabi S. 2013. The effect of nanoelicitors on alkaloid production of Papaver somniferum in suspension cell culture. Int J Curr Res. 7 (10): 20955-20957.
  9. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254
  10. Carlson TJ, King SR. 1997. From plant to patient: an ethnomedical approach to the identification of new drugs for the treatment of NIDDM. Diabetologia 40: 614–617.
  11. Chan LK, Lim PS, Choo ML, Boey PL. 2010. Establishment of Cyperus aromaticus cell suspension cultures for the production of Juvenile hormone III. Vitr Cell Dev Biol. 46: 8–12.
  12. Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. J food drug Anal 10.
  13. Chong TM, Abdullah MA, Lai OM, et al. 2005. Effective elicitation factors in Morinda elliptica cell suspension culture. Process Biochem. 40: 3397–3405.
  14. Chung IM, Rajakumar G, Subramanian U. 2019. Impact of copper oxide nanoparticles on enhancement of bioactive compounds using cell suspension cultures of Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. Appl Sci 9:2165
  15. Dorling PR, Colegate SM, Huxtable CR. 2004. Poisonous sedges: the galegine content of Schoenus rigens at various growth stages. Poisonous plants Relat toxins 298–303
  16. Farjaminezhad R, Garoosi G. 2019. New biological trends on cell and callus growth and azadirachtin production in Azadirachta indica. 3 Biotech 9:1–17
  17. Fazal H, Abbasi BH, Ahmad N, Ali M. 2016. Elicitation of medicinally important antioxidant secondary metabolites with silver and gold nanoparticles in callus cultures of Prunella vulgaris Appl Biochem Biotechnol. 180: 1076–1092.
  18. Ghazvini RF, Heidari R. 2011. Physiology and molecular biology of stress tolerance in plants. Mashhad University Press.
  19. González-Cabrero N, Ruiz-Galea M, Alegre J, et al. 2018. Growth, morphology and maturation ability of Pinus pinea embryogenic suspension cultures. Plant Cell, Tissue Organ Cult 135:331–346.
  20. Hatami M, Naghdi Badi H, Ghorbanpour M. 2019. Nano-Elicitation of secondary pharmaceutical metabolites in plant cells: A review. Journal of Medicinal Plants, 18(71): 6-36.
  21. Hsieh T-H, Lee J, Charng Y, Chan M-T. 2002. Tomato plants ectopically expressing Arabidopsis CBF1 show enhanced resistance to water deficit stress. Plant Physiol. 130: 618–626.
  22. Kahkeshani N, Hadjiakhoondi A, Maafi N, Khanavi M. 2015. Standardization of a galactogogue herbal mixture based on its total phenol and flavonol contents and antioxidant activity. Res J Pharmacogn. 2: 35–39.
  23. Karakas FP, Turker AU, Karakas A, Mshvildadze V. 2016. Cytotoxic, anti-inflammatory and antioxidant activities of four different extracts of Galega officinalis (Goat’s rue). Trop J Pharm Res. 15: 751–757.
  24. Luka C., Omoniva B. 2012. Effect of some phytochemicals extracted from goat’s rue (Galega officinalis) on some biochemical parameters in normal and alloxan-induced diabetic rats. Nat Prod PLANT Resour. 2: 628–632.
  25. Ma X, Geiser-Lee J, Deng Y, Kolmakov A. 2010. Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and plants: phytotoxicity, uptake and accumulation. Sci Total Environ. 408: 3053–3061.
  26. Mendoza D, Cuaspud O, Arias JP, et al. 2018. Effect of salicylic acid and methyl jasmonate in the production of phenolic compounds in plant cell suspension cultures of Thevetia peruviana. Biotechnol reports 19:e00273
  27. Mooney MH, Fogarty S, Stevenson C, et al. 2008. Mechanisms underlying the metabolic actions of galegine that contribute to weight loss in mice. Br J Pharmacol. 153: 1669–1677.
  28. Mulabagal V, Tsay H-S. 2004. Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J Appl Sci Eng. 2: 29–48.
  29. Murasnige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio agsays with tohaoco tissue cultures. Physiol plant. 15: 473–497.
  30. Murthy HN, Lee E-J, Paek K-Y. 2014. Production of secondary metabolites from cell and organ cultures: strategies and approaches for biomass improvement and metabolite accumulation. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 118: 1–16.
  31. Nagella P, Murthy HN. 2011. Effects of macroelements and nitrogen source on biomass accumulation and withanolide-A production from cell suspension cultures of Withania somnifera (L.) Dunal. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 104: 119–124.
  32. Namdeo AG. 2007. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review. Pharmacogn Rev. 1: 69–79.
  33. Oberdörster G, Maynard A, Donaldson K, et al. 2005. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Part Fibre Toxicol. 2(1): 1-35.
  34. Österman J, Chizhevskaja EP, Andronov EE, et al. 2011. Galega orientalis is more diverse than Galega officinalis in Caucasus—whole‐genome AFLP analysis and phylogenetics of symbiosis‐related genes. Mol Ecol. 20:4808–4821.
  35. Pundarikakshudu K, Patel JK, Bodar MS, Deans SG. 2001. Anti-bacterial activity of Galega officinalis(Goat’s Rue). J Ethnopharmacol. 77: 111–112.
  36. Raigond P, Kaundal B, Sood A, et al. 2018. Quantification of biguanide and related compounds (anti-diabetic) in vegetables and fruits. J Food Compos Anal 74:82–88
  37. Ramezannezhad R, Aghdasi M, Fatemi M. 2019. Enhanced production of cichoric acid in cell suspension culture of Echinacea purpurea by silver nanoparticle elicitation. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 139: 261–273.
  38. Rizwan M, Ali S, Qayyum MF, et al. 2017. Effect of metal and metal oxide nanoparticles on growth and physiology of globally important food crops: a critical review. J Hazard Mater 322:2–16
  39. Shokri F, Shokoohi M, Abadi ARR, Kalarestaghi H. 2019. The ameliorative effect of Galega officinalis extract on histological damages, oxidative stress induced by torsion-detorsion in adult rats’ ovarian. Int J Womens Heal Reprod Sci. 7:119–123.
  40. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. 1999. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods Enzymol 299:152–178
  41. Soleimani T, Keyhanfar M, Piri K, Hasanloo T. 2012. Morphological evaluation of hairy roots induced in Artemisia annua and investigating elicitation effects on the hairy roots biomass production. Int J Agric Res Rev. 2:.1005–1013.
  42. Tang L, Kwon S-Y, Kim S-H, et al. 2006. Enhanced tolerance of transgenic potato plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against oxidative stress and high temperature. Plant Cell Rep. 25: 1380–1386.
  43. Thakur M, Bhattacharya S, Khosla PK, Puri S. 2019. Improving production of plant secondary metabolites through biotic and abiotic elicitation. J Appl Res Med Aromat Plants. 12: 1–12.
  44. Zahir A, Nadeem M, Ahmad W, et al. 2019. Chemogenic silver nanoparticles enhance lignans and neolignans in cell suspension cultures of Linum usitatissimum Plant Cell, Tissue Organ Cult. 136: 589–596.
  45. Zaka M, Abbasi BH, Rahman L, et al. 2016. Synthesis and characterisation of metal nanoparticles and their effects on seed germination and seedling growth in commercially important Eruca sativa. IET Nanobiotechnol. 10: 134–140.
  46. Zhang B, Zheng LP, Yi Li W, Wen Wang J. 2013. Stimulation of artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by Ag-SiO2 core-shell nanoparticles. Curr Nanosci. 9: 363–370.
  47. Zhao J, Davis LC, Verpoorte R. 2005. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Adv. 23: 283–333.
  48. Zhao J, Sakai K. 2003. Multiple signalling pathways mediate fungal elicitor‐induced β‐thujaplicin biosynthesis in Cupressus lusitanica cell cultures. J Exp Bot. 54: 647–656.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 36, Issue 3
September 2023
Pages 316-331
  • Receive Date: 16 September 2021
  • Revise Date: 11 November 2021
  • Accept Date: 06 February 2022