Document Type : Research Paper
Authors
1 Ph.D. student in plant breeding, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU)
2 Dept. Plant Breeding and Plant Biotechnology, Faculty of Crop Sciences, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU)
3 Faculty / Agricultural Science and Natural Resources University (SANRU)Dept. Plant Breeding and Plant Biotechnology, Faculty of Crop Sciences, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU)
4 Genetics and agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan- Sari Agricultural Sciences and Natural Resources university
Abstract
Castor (Ricinius communis L.) is one of the oldest medicinal plants in the world. The assessment of genetic diversity in castor beans plays a vital role in identifying superior genotypes to use in plant breeding programs. For this reason, the diversity and genetic association of 22 castor ecotypes were investigated. Out of 26 screened primers, 19 primers that produced the most polymorphic bands were used. Totally, these primers generated 188 bands, of which 180 bands (95.58 %) were polymorphic. The studied ecotypes were divided into two separate group’s using cluster analysis. The highest similarity was observed between ecotypes 4 and 5 (collected from Sari) and the lowest similarity was observed between ecotypes 1 and 14 (Sari and Babolsar).The highest Nei's genetic diversity (H) and Shannon index (I) were observed in population No. 2 including 12 ecotypes. According to the genetic structure of populations performed by Structure software, ecotypes were divided into two subpopulation clusters. The molecular analysis of variance showed that 37% of genetic variation attributed to between group's and 63% to within group's, which can be used in its breeding programs.
Keywords
Main Subjects
بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپهای کرچک (Ricinus communis L.)
با استفاده از نشانگر ISSR
سارا شریفی سلطانی1، غلامعلی رنجبر1*، سید کمال کاظمیتبار1، علی پاکدین پاریزی2 و حمید نجفی زرینی1
1 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، دانشکده علوم زراعی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی گیاهی
2 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان
تاریخ دریافت: 23/04/1400 تاریخ پذیرش: 07/09/1400
چکیده
کرچک (Ricinus communis L.) یکی از قدیمیترین گیاهان دارویی در جهان است. تعیین تنوع ژنتیکی گیاهان از جمله کرچک، نقش مهمی در شناسایی ژنوتیپهای برتر بمنظور بهرهبرداری در برنامههای اصلاح نباتات دارد، بدین منظور تنوع و ارتباط ژنتیکی 22 اکوتیپ کرچک مورد بررسی قرار گرفت. از 26 نشانگر مورد استفاده، 19 نشانگر که بیشترین تعداد نوارهای چندشکلی را تولید کردند، مورد استفاده قرار گرفت.این تعداد نشانگر در مجموع 188 نوار تولید کردند که 180 نوار چندشکل (58/95 درصد) بودند. براساس تجزیه خوشهای، اکوتیپها در دو گروه قرار گرفتند. بیشترین شباهت بین اکوتیپهای 4 و 5 (جمعآوری شده از ساری) و کمترین شباهت بین اکوتیپهای 1 و 14 (ساری و بابلسر) مشاهده گردید. بیشترین شاخص تنوع ژنتیکی نی (H) و شاخص شانون (I) در گروه 2 که شامل 12 اکوتیپ بود، مشاهده شد. در بررسی ساختار ژنتیکی جمعیتها بااستفاده از نرمافزار STRUCTURE اکوتیپها به دو خوشهی زیرجمعیتی تقسیم شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که 37 درصد از تغییرات ژنتیکی مربوط به تنوع بین اکوتیپها و 63 درصد مربوط به درون اکوتیپهای کرچک میباشد که میتوان از آن در برنامههای بهنژادی این گیاه استفاده کرد.
واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، تجزیه خوشهای، ساختار جمعیت، نشانگر ISSR.
* نویسنده مسئول، تلفن: 01133211163 ، پست الکترونیکی: ali.ranjbar@gmail.com
مقدمه
کرچک (Ricinus communis L.) متعلق به تیره فرفیون (Euphorbiaceae) است که در مناطق گرمسیری رشد میکند این تیره دارای گونه های بسیار زیادی است که اغلب آنها بومی مناطق گرمسیری از منطقه غرب آفریقا و هند میباشند (25). گیاه کرچک در ایران، بیشتر در حاشیه مزارع کشت میگردد (3) و متحمل به خشکی میباشد (47). کرچک یکی از گیاهان روغنی غیرخوراکی میباشد که بدلیل عملکرد و تولید بالا و همچنین رشد در مناطق حاشیهای و اقلیم خشک و نیمه خشک مورد توجه قرار گرفته است (8). تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی جهت توسعه منابع ژنتیکی و ایجاد واریتههای جدید کرچک بسیار مهم میباشد، در گذشته مطالعات تنوع ژنتیکی در بسیاری از گیاهان و جانوران تنها برپایه خصوصیات ریختشناسی و بیوشیمیایی استوار بوده است (10). همه واریتههای کرچک دارای عدد کروموزومی 2n=20 هستند (47). تنوع بسیار زیادی در این گیاه به جز وجود سم ریسین در تمامی صفات موفولوژیکی، با وجود یکنواخت بودن وجود دارد، تنوع موجود در کرچک نقش بسیار مهمی در تولید واریتههای مطلوب دارد. اصلاحگران برای تولید واریتههای جدید با ارزش بالای اقتصادی و مقاوم در برابر انواع تنشها از تنوع ژنتیکی بالای این گیاه استفاده مینمایند (39). شناخت تنوع ژنتیکی و مدیریت منابع ژنتیکی نه تنها باعث حفاظت ذخایر ژنتیکی میشود بلکه قابلیت کاربرد آنها را در برنامههای اصلاحی فراهم میسازد (23). چندین نشانگر ژنتیکی از جمله RAPD، AFLP، SSR، ISSR برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در میان ژنوتیپها وجود دارد (21). ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان دلایل متعددی دارد، از جمله میتوان به حمایت درست و دقیق از تنوع ژنتیکی گیاهان (13)، شناسایی و حفظ و نگهداری ذخایر توارثی در بانکهای ژن (49)، برنامههای بهنژادی (22) و انتخاب صحیح والدهای برتر جهت تلاقی (42) اشاره نمود. برای ارزیابی تنوع ژنتیکی روشهای متفاوتی وجود دارد که میتوان به RAPD، AFLP، SSR، ISSR و ... اشاره نمود. نشانگرهای مولکولی ISSR (Inter simple sequence repeat) به دلیل چندشکلی و تغییرپذیری بسیار بالا، توانایی تکثیر و تکرارپذیری بالا، قیمت نسبتاً ارزان و فراونی زیاد در ژنوم گیاهان، یکی از مهمترین نشانگرهای مولکولی جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی میباشند (32). تنوع ژنتیکی در گیاه کرچک بااستفاده از نشانگرهای غالب و همبارز توسط محققین مختلف مورد بررسی قرار گرفته است (33 و 44). نشانگرهای متعددی مانند بین ریزماهوارهای (ISSR) (17)، پلیمورفیسم طولی قطعات تکثیر شده (AFLP) (31)، توالیهای تکراری ساده (SSR) (36). ریفهای تظاهریافته برچسبدار- توالیهای تکراری ساده (EST-SSR) (18 و 46) و چندشکلی ریزماهواره تکثیرشونده تصادفی (RAMP) در ارزیابی تنوع ژنتیکی گیاه کرچک مورد استفاده قرار گرفت (12). در پژوهشی که بر روی تنوع ژنتیکی 54 اکوتیپ گیاه کرچک که از کشورهای مختلف (چین، هند، فرانسه و اردن) جمع آوری شده بود با استفاده از نشانگرهای ISSR و RAPD صورت گرفت نتایج پژوهش بیانگر موثر بودن این نشانگرها در تمایز جمعیتهای مورد مطالعه است (20). با ارزیابی تنوع ژنتیکی 82 ژنوتیپ کرچک در مکزیک با استفاده از نشانگرهای SSR و AFLP تنوع ژنتیکی بالایی در ژرمپلاسمهای مورد مطالعه گزارش شد (29). در مطالعهای دیگر که برای بررسی تنوع ژنتیکی 41 ژنوتیپ کرچک متعلق به 35 کشور مختلف با استفاده از نشانگرهای SSR و AFLP انجام شد، تنوع ژنتیکی پایین و همچنین عدم مطابقت بین الگوی گروهبندی براساس دادههای مولکولی با الگوی توزیع جغرافیایی ژنوتیپها گزارش شد که میتواند در نتیجه اصلاح ژنوتیپها، اهلیسازی یا تکثیر طولانیمدت تعداد کمی ژنوتیپ و یا استفاده از ژنوتیپهایی باشد که تنوع موجود در آنها نماینده تنوع درون گونه نیست، باشد (6). در مطالعهای که بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 22 ژنوتیپ کرچک در گجرات هندوستان بااستفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR انجام گرفت، تنوع ژنتیکی وسیعی در میان ژنوتیپهای مورد مطالعه گزارش گردید (9). مطالعات متعدد دیگر (50، 7 و15) نیز سطح بالایی از چندشکلی را در بین ژنوتیپهای مختلف کرچک نشان دادهاند. پژوهشی که بمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی 9 ژنوتیپ کرچک با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD در دامغان به اجرا در آمد نشان داد که نشانگر رپید میتواند تودههای کرچک را به گروههای مختلف تقسیم کند و همچنین میتوان بااستفاده ازمیزان درصد تشابه ژنتیکی بین اکوتیپهای کرچک، اکوتیپهای با فاصله ژنتیکی بیشتر را بمنظور تولید بذرهای هیبرید با هتروزیس مناسب به کار برد (2). جهت شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با ژنهای کنترلکننده 26 صفت مورفولوژیک در 12 اکوتیپ کرچک در دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه از 16 نشانگر ISSR استفاده و نتایج نشان دهنده سطح تقریباً بالایی از چندشکلی (85/68) در بین اکوتیپهای مختلف کرچک بود (1). از آنجایی که کشور ایران یکی از مهمترین مراکز تنوع و پراکنش گیاه کرچک میباشد و همچنین ارزیابی تنوع ژنتیکی جهت استفاده از آن در برنامههای اصلاحی کرچک یک ضرورت محسوب میشود بنابراین هدف از این پژوهش بررسی مقایسهای تنوع ژنتیکی بین اکوتیپهای جمعآوری شده از نقاط مختلف کرچک بااستفاده از نشانگرهای ISSR میباشد.
مواد و روشها
مواد گیاهی: بذور نمونههای گیاهی مورد استفاده در این پژوهش شامل 18 اکوتیپ جمع آوری شده از شهرهای مختلف ایران، 3 اکوتیپ موتانت (موتاسیون فیزیکی و شمیایی) و 1 اکوتیپ از کشور عراق است (جدول-1).
جدول 1- نام و محل جمع آوری نمونه های مورد بررسی |
|||||||
شماره اکوتیپ |
منطقه |
طول جغرافیایی |
عرض جغرافیایی |
شماره اکوتیپ |
منطقه |
طول جغرافیایی |
عرض جغرافیایی |
1 |
ساری (جاده جویبار) |
¢28 °47 |
¢30 °33 |
12 |
ساری-فیروزکنده |
¢07 °53 |
¢60 °36 |
2 |
ساری (جاده نکا) |
¢15 °53 |
¢32 °36 |
13 |
بابلسر (بهنمیر) |
¢70 °53 |
¢56 °36 |
3 |
ساری (سورک) |
¢08 °53 |
¢24 °36 |
14 |
بابل (بیجی کلا) |
¢18 °52 |
¢19 °36 |
4 |
ساری (کردخیل) |
¢53 °52 |
¢17 °36 |
15 |
نجف آباد (اصفهان) |
¢32 °51 |
¢61 °32 |
5 |
ساری(دانشگاه علوم کشاورزی ساری) |
¢09 °53 |
¢58 °36 |
16 |
زابل |
¢47 °61 |
¢03 °31 |
6 |
ساری (کیاده) |
¢26 °53 |
¢10 °36 |
17 |
عراق-کربلا |
¢03 °44 |
¢22 °33 |
7 |
ساری(خزر) |
¢04 °53 |
¢06 °36 |
18 |
خرم آباد |
¢29 °48 |
¢42 °33 |
8 |
ساری (صاحبی) |
¢21 °53 |
¢17 °36 |
19 |
بردسیر |
¢57 °56 |
¢91 °29 |
9 |
اصفهان (شهرضا) |
51 °32¢ |
¢17 °32 |
20 |
فیروزکنده-التراسوند |
- |
- |
10 |
ساری (آکند) |
07 °53 |
63 °36 |
21 |
فیروزکنده-EMS 25 |
- |
- |
11 |
ساری (ماهفروزمحله) |
09 °53 |
27 °36 |
22 |
فیروزکنده-EMS 50 |
- |
- |
در مطالعه حاضر، بذرها در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری کشت گردید و در مرحله سه برگی، نمونههای برگی از برگهای تازه و جوان جمعآوری شد. استخراج DNA بااستفاده از روش CTAB (Murry and Thompson, 1984.) با اندکی تغییرات انجام گردید. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده بااستفاده از روش اسپکتروفتومتری (Spectrophotometry) بهوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر مدل (SHIMADZU UV-1800) ساخت ژاپن و برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده از ژل آگارز 8/0 درصد انجام شد. در این تحقیق از تعداد 26 آغازگر مخصوص واکنش ISSR که در پژوهشهایی که برروی گیاه کرچک که توسط (1، 15، 16) انجام شده بود و همچنین تعدادی از این آغازگرهادر آزمایشگاه ژنومیکس پژوهشکده ژنتیک و فناوری طبرستان موجود بود، استفاده شد (جدول 2). کلیه آغازگرهای مورد استفاده از شرکت آرین ژن گستر تهیه شدند.
واکنش تکثیر DNA ژنومی در حجم 12 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، پرایمر 10 میکرومول، Master Mix (6 میکرولیتر)، H2O (25/3 میکرولیتر) انجام گرفت. برای انجام واکنشها از بافر Master Mix شرکت سیناکلون استفاده گردید. برای واکنش PCR برنامه دمایی به صورت، واسرشته سازی اولیه (به مدت 2:30 دقیقه در دمای ˚C94) و 35 سیکل (40 ثانیه در دمای ˚C94، 1 دقیقه در دمای ˚C60- 50 بسته به دمای آغازگر، 1:20 دقیقه در دمای ˚C72) و مرحله بسط نهایی (7 دقیقه در دمای ˚C72) تنظیم گردید و پس از پایان آزمایش، نمونهﻫﺎ در دمای ˚C4 نگهداری شدند.
جدول 2- نام و ترادف آغازگرهای مورد استفاده در واکنش PCR. |
|||||
ترادف |
نام آغازگر |
شماره |
ترادف |
نام آغازگر |
شماره |
5´ AGAGAGAGAGAGAGAGG 3´ |
ISSR-10 |
10 |
5´GAGAGAGAGAGAGAGAGAA 3´ |
ISSR-1 |
1 |
5´ GAGAGAGAGAGAGAGAC3´ |
ISSR-11 |
11 |
5´ GAGAGAGAGAGAGAGAGAC3´ |
ISSR-2 |
2 |
5´ ACACACACACACACACG3´ |
ISSR-13 |
12 |
5´ GAGAGAGAGAGAGAGAGAT3´ |
ISSR-3 |
3 |
5´ TGTGTGTGTGTGTGTGA 3´ |
ISSR-16 |
13 |
5´ GTGTGTGTGTGTGTGTGTA 3´ |
ISSR-4 |
4 |
5´ ACACACACACACACACC3´ |
ISSR-17 |
14 |
5´ GTGTGTGTGTGTGTGTGTC 3´ |
ISSR-5 |
5 |
5´ ATCATCATCATCATCATCT 3´ |
ISSR-18 |
15 |
5´GTGTGTGTGTGTGTGTGTT 3´ |
ISSR-6 |
6 |
5´ ATCATCATCATCATCATCC 3´ |
ISSR-19 |
16 |
5´ GAGAGAGAGAGAGAGAC3´ |
ISSR-7 |
7 |
5´ GTGTGTGTGTGTGTGTGTAC 3´ |
ISSR-21 |
17 |
5´ CTCTCTCTCTCTCTCTG 3´ |
ISSR-8 |
8 |
5´ CCCGGATCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT 3´ |
ISSR-24 |
18 |
5´ AGAGAGAGAGAGAGAGC3´ |
ISSR-9 |
9 |
5´ HBHAGAGAGAGAGAGAG3´ |
ISSR-36 |
23 |
5´ GATGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT3´ |
ISSR-29 |
19 |
5´ BHBGAGAGAGAGAGAGAGA 3´ |
ISSR-37 |
24 |
5´ GATCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCT3´ |
ISSR-30 |
20 |
5´ VHVGTGTGTGTGTGTGT 3´ |
ISSR-39 |
25 |
5´ GATCGAGGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGG 3´ |
ISSR-32 |
21 |
5´ GGGTCGGGTCGGGTC3´ |
ISSR-43 |
26 |
5´ GATCTTGGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG3´ |
ISSR-35 |
22 |
امتیازدهی باندها بر اساس حضور (1) یا عدم حضور (0) صورت گرفت و سپس ماتریس دادهها تشکیل شد. در ابتدا ماتریس شباهت بین نمونهها با استفاده از ضرایب تشابه Jaccard (1908) تهیه و امتیازدهی باندها با استفاده از نرمافزار Total lab gel analysis انجام شد (11) و برای محاسبه ماتریس تشابه و آزمون مانتل از نرمافزار NTSYS ver2.02 استفاده گردید (34). تجزیه به مولفههای اصلی با استفاده از نرمافزار Gen Alex ver2.02 (28) و محاسبه میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) براساس رابطه (1) انجام شد که در آن fi فراوانی قطعات تکثیر شده و n تعداد لوکوسهای محاسبه شده میباشد (35). برای تمامی آغازگرها شاخص نشانگر (MI) طبق رابطه (2) بدست آمد. که در آن PIC، میانگین اطلاعات چندشکل و EMR نسبت چندگانه موثر است (30). برای هر آغازگر شاخص قدرت تفکیک (Resolving Power) طبق رابطه (3) و میزان Ib نیز از رابطه (4) بدست آمد، که Pi درصد فراوانی یک آلل از هر باند است (27).
MI= EMR×PIC (2)
RP= ∑ (3)
Ib= 1-(2|0.5-Pi|) (4)
همچنین تنوع درون جمعیتها (شاخص تنوع ژنتیکی نی (H) و شاخص شانون (I) و آللهای موثر (Ne)، و آللهای مشاهده شده (N) ) با استفاده از نرمافزار Popgene (48)، همچنین ساختار ژنتیکی جمعیتها بااستفاده از نرمافزار Structure محاسبه شد.
نتایج
در این پژوهش از مجموع 26 نشانگر ISSR مورد تعداد تنها 19 آغازگر الگوی باندی مشخص و چندشکل تولید نمودند. در مجموع 188 مکان توسط 19 نشانگر ISSR تکثیر شد که از این تعداد 180 مکان چندشکل بودند. شکل 1 باندهای تشکیل شده بااستفاده از آغازگر ISSR-2 را بهعنوان نمونه نشان میدهد. میانگین کل چندشکلی 74/95 درصد برآورد گردید. اندازه باندها بین 300 تا 2000 جفت باز (bp) متغیر بود. برای هر آغازگر تعداد باندهای امتیازدهی از 6 تا 19 باند متغیر بود. از بین آغازگرهای مورد استفاده، بیشترین تعداد باندهای چندشکلی بهترتیب متعلق به آغازگرهای 1SSR-9 و ISSR-19 با تعداد باند 18 و 19، کمترین تعداد باند چندشکلی نیز آغازگر ISSR-1 با تعداد 6 باند اختصاص یافت. بهطور متوسط هر آغازگر 89/9 باند تولید نمود. میانگین تعداد باندهای چندشکلی برای هر آغازگر 47/9 برآورد شد. در این مطالعه به دلیل استفاده از 22 اکوتیپ از مناطق مختلف، مشاهده چندشکلی بالا دور از انتظار نبود. درصد چندشکلی برای هرآغازگر 42/71 درصد برای آغازگر ISSR-2 تا 100 درصد برای آغازگرهای ISSR1-3-8-13-15 و غیره متغیر بود و مقدار متوسط آن58/95درصد بود که تنوع ژنتیکی بالای ژنوتیپها را توجیه میکند (جدول 3).
در این مطالعه، بیشترین و کمترین میزان PIC بترتیب برابر با 43/ و 18/0مربوط به آغازگرهای ISSR-43 و ISSR-2 بود. بالا بودن میزان PIC در بعضی از آغازگرهای مورد استفاده نشاندهنده کارایی بالای این آغازگرها و تمایز اکوتیپهای مورد مطالعه در این تحقیق میباشد که نشاندهنده سودمندی این آغازگرها برای بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپهای کرچک میباشد (جدول 3).
برای تعیین کارایی آغازگرها در بروز چندشکلی، شاخص نشانگری (MI) و نسبت چندگانه موثر (EMR) محاسبه شد. آغازگر ISSR-36 با EMR=19 بیشترین میزان و آغازگر ISSR-2 با EMR=3.75 کمترین میزان را به خود اختصاص دادند (جدول 2). میزان MI بین 64/0 و 46/6 متغیر بود. آغازگرهای ISSR-36 و9 ISSR- بهترتیب بیشترین شاخص نشانگری (MI) را داشتند که کارایی بالای این آغازگرها را در بروز چندشکلی نشان میدهد.
براساس نتایج بدست آمده ضریب تشابه جاکارد براساس روش خوشهبندی UPGMA دارای بالاترین ضریب همبستگی کوفنتیک (92/0( بود که نشاندهنده برازش خوب و همبستگی بالا بین ماتریسهای تشابه و دندروگرام نهایی براساس ضریب جاکارد میباشد (جدول 4).
بیشترین شباهت ژنتیکی (77/0) بین اکوتیپهای 4 و 5 و کمترین شباهت ژنتیکی (24/0) بین اکوتیپهای 1 و 14 مشاهده شد (جدول 5). نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که 37 درصد از تغییرات مربوط به بین جمعیتها و 63 درصد مربوط به درون جمعیتها بود (جدول 6).
شکل 1- الگوی تکثیر DNA ژنومی توسط آغازگر ISSR-2
جدول 3- تعداد کل باندها، تعداد باندهای چندشکل، تعداد باندهای مونومورف، درصد چندشکلی، محتوای اطلاعات چندشکلی، نسبت چندگانه موثر، شاخص نشانگر و شاخص قدرت تفکیک برای هر آغازگر |
||||||||||||
شاخص قدرت تفکیک (RP) |
شاخص نشانگر (MI) |
نسبت چندگانه موثر (EMR) |
محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) |
درصد چند شکلی (Pol) |
تعداد باندهای مونومورف |
تعداد باند چندشکل |
تعداد کل باندها |
نام آغازگر |
||||
81/7 |
32/1 |
6 |
22/0 |
100 |
0 |
6 |
6 |
ISSR-1 |
||||
72/7 |
64/0 |
57/3 |
18/0 |
42/71 |
2 |
5 |
7 |
ISSR-2 |
||||
81/6 |
73/2 |
7 |
39/0 |
100 |
0 |
7 |
7 |
ISSR-3 |
||||
54/6 |
8/2 |
7 |
40/0 |
100 |
0 |
7 |
7 |
ISSR-8 |
||||
90/15 |
45/5 |
05/16 |
34/0 |
44/94 |
1 |
17 |
18 |
ISSR-9 |
||||
13 |
51/2 |
30/9 |
27/0 |
61/84 |
2 |
11 |
13 |
ISSR-11 |
||||
81/8 |
76/4 |
14 |
34/0 |
100 |
0 |
14 |
14 |
ISSR-13 |
||||
81/8 |
76/4 |
14 |
34/0 |
100 |
0 |
14 |
14 |
ISSR-15 |
||||
45/4 |
33/1 |
14/5 |
26/0 |
71/85 |
1 |
6 |
7 |
ISSR-17 |
||||
10 |
08/3 |
11 |
28/0 |
100 |
0 |
11 |
11 |
ISSR-19 |
||||
63/10 |
38/1 |
4/6 |
30/0 |
80 |
2 |
8 |
10 |
ISSR-24 |
||||
63/7 |
1/4 |
10 |
41/0 |
100 |
0 |
10 |
10 |
ISSR-29 |
||||
90/9 |
72/2 |
8 |
34/0 |
100 |
0 |
8 |
8 |
ISSR-30 |
||||
90/7 |
2/4 |
12 |
35/0 |
100 |
0 |
12 |
12 |
ISSR-32 |
||||
81/14 |
46/6 |
19 |
34/0 |
100 |
0 |
19 |
19 |
ISSR-36 |
||||
54/12 |
4/4 |
11 |
40/0 |
100 |
0 |
11 |
11 |
ISSR-37 |
||||
63/11 |
07/5 |
13 |
39/0 |
100 |
0 |
13 |
13 |
ISSR-39 |
||||
90/8 |
38/2 |
7 |
34/0 |
100 |
0 |
7 |
7 |
ISSR-41 |
||||
09/9 |
44/3 |
8 |
43/0 |
100 |
0 |
8 |
8 |
ISSR-43 |
||||
جدول 4- همبستگی بین ضرایب تشابه بدست آمده با روشهای مختلف براساس نشانگرهای مولکولی ISSR |
|
|||||||||||
الگوریتم اتصال کامل |
الگوریتم اتصال ساده |
الگوریتم UPGMA |
|
|
||||||||
91/0 |
91/0 |
92/0 |
ضریب تشابه جاکارد |
|
||||||||
89/0 |
89/0 |
90/0 |
ضریب تشابه دایس |
|
||||||||
88/0 |
90/0 |
91/0 |
ضریب تشابه تطابق ساده |
|
||||||||
جدول 6- آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) دادههای حاصل از نشانگر مولکولی ISSR مربوط به 22 اکوتیپ کرچک |
||||
درصد تنوع |
انحراف معیار |
میانگین مربعها |
درجه آزادی |
منابع تنوع |
37% |
14/14 |
121 |
2 |
بین جمعیتی |
63% |
07/24 |
07/24 |
19 |
درون جمعیتی |
100% |
22/38 |
07/145 |
21 |
کل |
بهمنظور تایید و صحت گروهبندی از تجزیه ساختار ژنتیکی براساس روش بیزین با استفاده از نرمافزارStructure استفاده شد، بدست آوردن K بهینه بااستفاده از روش k∆ نشان داد که مقدار عددی این پارامتر برای K=2 حداکثر بود بنابراین میتوان گفت دو زیر جمعیت احتمالی در تودههای مورد مطالعه شناسایی شده است که در آن هر زیرجمعیت با یک رنگ خاص نشان داده شده است (محور عمودی بیانگر درصد عضویت افراد و محور افقی بیانگر اکوتیپهای مورد بررسی میباشد) (شکل2).
شکل 2- نتایج گراف شده از آنالیز Structure جهت تعیین خویشاوندی اکوتیپهای مورد بررسی براساس نشانگر ISSR
تجزیه خوشهای اکوتیّپهای مورد مطالعه با مقایسه روشهای مختلف، بهدلیل بالاتر بودن ضریب همبستگی کوفنتیک (92/0)، با روش UPGMA و ضریب تشابه جاکارد انجام شد. خط برش براساس تجزیه Structure محاسبه گردید. بنابراین اکوتیپها به سه گروه تقسیم شدند (شکل3).
گروه اول شامل اکوتیپ های 1-2-3-4-5-6-7-8-9 و در گروه دوم فقط اکوتیپ شماره 10 گروه سوم شامل اکوتیپ های 11- 12-13-14-15-16-17-18-19-20-21-22 می باشند.
شکل 3- گروهبندی اکوتیپهای گیاه کرچک مورد بررسی براساس روش خوشهبندی UPGMA و ماتریس تشابه جاکارد
تجزیه به مختصات اصلی نیز بهعنوان روشی مکمل برای تجزیه خوشهای جهت تعیین روابط ژنتیکی بین ارقام و نیز گروهبندی آنها، استفاده شد. نتایج بدست آمده نسبتاً با نتایج تجزیهی خوشهای منطبق بود. و اکوتیپهایی که در تجزیه خوشهای در یک گروه بودند در نمودارهای پراکنش بهصورت سهبعدی نیز در کنار هم قرار گرفتند (شکل4).
شکل 4- گروهبندی اکوتیپهای مختلف کرچک مورد مطالعه براساس تجزیه به مختصات اصلی با استفاده از نرمافزار GenAlex.
بررسی ساختار ژنتیکی جمعیتها براساس دادههای ISSR و بااستفاده از روش ANOVA و همکاران (2005) نشان داده که بیشترین میزان k∆ در مقابل تغییرات K و K=2 بهدست آمد که نشان میدهد که جمعیتها در دوگروه (زیرجمعیت) قرار دارند. نسبت عضویت جمعیتهای جغرافیایی درهریک از دو گروه بین 99/0-003/0 متغیراست. (جدول 7).
جدول 7- نسبت عضویت اکوتیپها در دو زیرجمعیت کرچک مورد مطالعه
2 |
1 |
اکوتیپها |
933/0 |
067/0 |
1 |
906/0 |
094/0 |
2 |
99/0 |
004/0 |
3 |
99/0 |
004/0 |
4 |
99/0 |
005/0 |
5 |
99/0 |
007/0 |
6 |
99/0 |
003/0 |
7 |
99/0 |
004/0 |
8 |
98/0 |
012/0 |
9 |
81/0 |
187/0 |
10 |
34/0 |
65/0 |
11 |
042/0 |
95/0 |
12 |
002/0 |
99/0 |
13 |
005/0 |
99/0 |
14 |
003/0 |
99/0 |
15 |
014/0 |
98/0 |
16 |
006/0 |
99/0 |
17 |
004/0 |
99/0 |
18 |
007/0 |
99/0 |
19 |
08/0 |
92/0 |
20 |
04/0 |
95/0 |
21 |
168/0 |
83/0 |
22 |
برای روشنتر شدن ارتباط ژنتیکی بین جمعیتها به بررسی تنوع و ساختار جمعیتها پرداخته شد. شاخصهای تنوع جمعیتی Shannon و Nei (1973)، درصد چندشکلی جمعیتها، میانگین تعداد اللهای مشاهده شده، (Na)، نسبت تعداد اللهای موثر (Ne) به آللهای مشاهده شده (Ne/Na)، بااستفاده از نرم افزار Popgen ver 32 محاسبه شد (جدول 8).
جدول 8- پارامترهای اندازهگیری شده در رابطه با تنوع ژنتیکی براساس نشانگرهای ISSR در جمعیتهای کرچک |
|||||||
جمعیت |
تعداد نمونه |
%PL |
Fst |
Na |
Ne |
I |
Ne/Na |
Pop1 |
10 |
61/65 |
289/0 |
43/1 |
39/1 |
34/0 |
97/0 |
Pop2 |
12 |
95/80 |
413/0 |
70/1 |
45/1 |
40/0 |
85/0 |
بحث و نتیجهگیری
در پژوهش حاضر بااستفاده از نشانگر ISSR تنوع بین و درون جمعیتی برخی اکوتیپهای کرچک (Ricinus communis) ارزیابی گردید. این نشانگر نتایج چندشکلی قابل توجهی (58/95 درصد) را در الگوی باندی نشان داد. از میان آغازگرهای مورد بررسی آغازگر ISSR-36 با 19 باند دارای بیشترین میزان چندشکلی بود، که نتایج حاضر با پژوهش بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر ISSR بر روی گیاه کرچک از نظر میزان چندشکلی همخوانی داشت (45). همچنین در مطالعهای که از 9 آغازگر ISSR برای بررسی تنوع ژنتیکی در کرچک استفاده شد، در مجموع 83 باند با وضوح بالا و 53/74% چندشکلی مشاهده شد (20). در مطالعهای که بر روی 18 اکوتیپ پنیرک با استفاده از 15 نشانگر ISSR انجام شد میانگین درصد چند شکلی بالایی برابر با 12/98 گزارش گردید (4).
از آنجایی که شاخص قدرت تفکیک (RP) هم از تعداد افراد دارای باند و هم از تعداد آلل تاثیر میپذیرد بهترین شاخص برای آغازگر مناسب میباشد (19). میزان RP در آغازگر ISSR-9 با 9/15 بیشترین مقدار را داشت و نشان میدهد که این آغازگر نسبت به دیگر آغازگرها قدرت تفکیک بهتری دارد. بیشترین میزان (EMR) برای آغازگر ISSR-36 (24) و کمترین میزان برای آغازگر ISSR-2 (57/3) بود. بالا بودن میزان شاخص نشانگر (MI) نشاندهنده تولید تعداد بیشتری باند چندشکل و فراهم کردن اطلاعات بیشتری از ژنوم میباشد (41). بالاترین میزان شاخص نشانگر (64/6) در آغازگر ISSR-36 مشاهده گردید که نشاندهده کارایی خوب این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها میباشد. در بررسی میزان تنوع ژنتیکی 27 ژنوتیپ کرچک در کشور برزیل میزان MI بین 72/1 تا 07/5 و میزان RP بین 63/1 تا 55/9 متغیر بود (43). بیشترین مقدار اطلاعات چندشکلی در این پژوهش مربوط به آغازگر ISSR-43 به میزان 43/0 میباشد. طی مطالعهای که برروی کرچک با استفاده از نشانگرهای SSR انجام مقادیرPIC بین 4/0-26/0 را گزارش شد (38). در حالیکه که در تحقیقی دیگر که بر روی همین گیاه با استفاده از پرایمرهای SSR انجام شد مقادیر بالای PIC (81/0) و همچنین صددرصد چندشکلی نیز مشاهده شد (31). خوشهبندی حاصل از دندروگرام نشان میدهد اکوتیپهای 1تا 9 در یک خوشه و اکوتیپ 10 در خوشهای جداگانه و اکوتیپهای 11-22 در خوشه سوم قرار گرفتند، همچنین آنالیز کلاستربندی براساس K=2 بااستفاده از نرمافزار Structure تعداد زیرجمعیتها در اکوتیپهای مختلف کرچک دادههای ISSR اکوتیپها را به دو زیرجمعیت تقسیم نمود. برای تایید و بررسی دقیقتر ارتباط بین و درون جمعیتها از تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) استفاده گردید که نتایج آن تا حدودی با نتایج تجزیه خوشهای براساس روش UPGMA مطابقت داشت که شاید یکی از دلایل تفاوت در این گروهبندیها اینست که دندروگرام در تجزیه خوشهای براساس 100 درصد واریانس میباشد در حالیکه در تجزیه به مختصات اصلی تقریبا از 60 درصد واریانس کل استفاده شد بنابراین اختلافاتی در دو روش وجود داشت، انتظار بر این بود که اکوتیپهای جمعآوری شده از استان مازندران در یک خوشه قرار بگیرند در حالیکه که طبق خوشهبندی صورت گرفته اکوتیپهای بابل و بابلسر و فیروزکنده در خوشه دوم قرار گرفتند، در واقع میتوان گفت که نمونههایی که از لحاظ جغرافیایی نزدیک هم هستند الزاما از لحاظ ژنتیکی تشابه بیشتری ندارند. در پژوهشی دیگری که بر روی کرچک انجام شد، هیچ گونه شواهدی از تأثیر منشا جغرافیایی بر الگوی خوشهبندی و توزیع تصادفی ژنوتیپها مشاهده نشد و بنابراین پیشنهاد گردید که عوامل دیگری نظیر انتخاب طبیعی، مصنوعی و رانش ژنتیکی را به عنوان فاکتورهای کمک کننده به تنوع مشاهده شده بین ژنوتیپها در نظر بگیریم (37).ارزیابی تنوع ژنتیکی کرچک از 48 کشور دنیا که در مرکز تحقیقات گریفین، جورجیا تهیه شده بود بااستفاده از پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی (SNP) تنوع ژنتیکی بالایی بین جمعیتهای کرچک مشاهده شد اما همبستگی بین منشا جغرافیایی و تنوع ژنتیکی وجود نداشت (12). نتایج بررسی تنوع ژنتیکی در گیاه کرچک جمعآوری شده از 5 قاره (35 کشور) بااستفاده از نشانگرهای AFLP و SSR بیانگر تاثیر منشا جغرافیایی برروی تنوع ژنتیکی نبود در واقع تنوع ژنتیکی در ژرمپلاسم 35 کشور بسیار کم بود (14). برای محاسبه تفرق ژنتیکی از شاخص Fst استفاده و میانگین آن برای هرکدام از زیرجمعیتها با نرمافزار Structure محاسبه گردید. که سطح نسبتاً بالایی از تفرق ژنتیکی را در این گیاه را نشان داد. نتایج حاکی از تمایز ژنتیکی قابل ملاحظه بین اکوتیپها است که این امر با توجه به نحوه تولیدمثل این گیاه (دگرگشنی) طبیعی است. اگر نسبت تعداد آللهای موثر به مشاهده شده بالا باشد به این معنی است که جمعیت مورد نظر به نسبت جمعیتها از توزیع یکنواختتری برخوردار است که باتوجه به نتایج جمعیت اول که در برگیرنده 10 اکوتیپ میباشد بیشترین (97/0) یکنواختی را دارا است که بیانگر این است که نسبت آللهایی که فراوانی برابر دارند به کل آللهای جمعیت دیگر بیشتر میباشد. نتایج تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که از میزان کل واریانس مشاهده شده، 37 درصد به تنوع بین جمعیتها و 63 درصد به تنوع درون جمعیتها مربوط است. در پژوهشی مشابه که بر روی گیاه کرچک بر اساس آنالیز AMOVA انجام شد، نشان دادند که تنوع ژنتیکی درون جمعیت بیشتر از بین جمعیتها است (16). در پژوهشی که بر روی گیاه فلفل با استفاده از نشانگر ISSR انجام شد تنوع ژنتیکی درون گروهها (74 درصد) بیشتر از تنوع بین گروهها (26) گزارش شد (5). برای برآورد تنوع ژنتیکی در گیاهان عالی زمانیکه که از نشانگر غالب برای مطالعات ژنتیک جمعیتها استفاده میشود، هنوز هم از دو شاخص ژنی نی و شانون که براساس فراوانی آللها میباشد، استفاده میشود (40). متوسط شاخص شانون 27/0 و متوسط فاصله ژنتیکی نی 193/0 برآود شد. در بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپها در نیجریه شاخص شانون (43/1) و شاخص تنوع ژنی نی (72/0) گزارش شد که بیانگر وجود تنوع در بین ژنوتیپها بود (37). با وجود عدم بالا بودن ضریب تشابه، عدم شباهت اقلیمی و فاصله جغرافیایی بالا، برخی اکوتیپها در کنار هم قرار گرفتهاند. بررسی تنوع ژنتیکی میتواند در مدیریت ژرم پلاسم کرچک مفید باشد باتوجه به نتایج این پژوهش ارزیابی تنوع ژنتیکی امکان شناسایی اکوتیپهای مطلوب بمنظور بهرهگیری از این گیاه را فراهم نماید. همچنین نشانگر ISSR توانایی تفکیک اکوتیپهای مختلف کرچک را دارد. بنابراین میتوان از آن بهعنوان یک ابزار مناسب جهت برنامه های اصلاحی آینده استفاده نمود. از آنجایی که برروی گیاه کرچک کارهای اصلاحی اندکی صورت گرفته توصیه میشود اکوتیپهای بیشتری از مناطق با اقلیمهای متفاوتتری جمعآوری و همچنین از تعداد بیشتری آغازگر استفاده شود تا شناخت بیشتری نسبت به این گیاه روغنی دارویی بدست آید.
سپاسگزاری
بدینوسیله نگارندگان از دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری و پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری طبرستان که در تامین منابع مالی اجرای این پژوهش همکاری نمودند، قدردانی مینمایند.