Document Type : Research Paper
Authors
1 Bu-Ali Sina University - Hamedan
2 Department of Horticultural Sciences - College of Agriculture - Bu-Ali Sina University - Hamedan - Iran
3 Department of Agronomy and plants breeding - College of Agriculture - Bu-Ali Sina University - Hamedan - Iran
Abstract
To determine some bioactive compounds of Amaranthus blitoides in different phenological stages, an experiment was conducted in a randomized complete block design with three treatments and three replications. Three phenological stages, including eight-leaf, flowering and seed production stages, were considered three treatment of experiment, some phytochemical traits and phenolic acids, including quercetin, rutin, chlorogenic acid and caffeic acid, were measured. The highest total chlorophyll content (2.05 mg g-1) was observed at the seed production stage, while the lowest total chlorophyll content (0.94 mg g-1) was observed at the eight-leaf stage. The highest content of chlorophyll a and b was observed in the seed production stage, whereas the lowest amount of chlorophyll a and b was observed in the eight-leaf stage. The highest content of carotenoids was observed at the seed production stage. At different phenological stages, the evaluated traits had significant differences. The highest amount of total phenolic compounds, total flavonoids, total tannins, and antioxidant capacity were observed in the flowering stage. HPLC analysis of extracts showed that quercetin and rutin production increased during growth until the flowering stage and then decreased. Also, the biosynthesis of two phenolic acids, including chlorogenic acid and caffeic acid, was high at the eight-leaf stage and reduced after this phenological stage. In general, the highest amount of bioactive compounds and phenolic acids quercetin and rutin of this plant was observed in the flowering stage and the highest amount of plant pigments was observed in the seed production stage.
Keywords
Main Subjects
محمد سیاری*، مریم حمیدی، علی عزیزی و گودرز احمدوند
ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
تاریخ دریافت: 04/03/1400 تاریخ پذیرش: 07/09/1400
چکیده
جهت تعیین برخی مواد موثره گیاه تاجخروس گسترده (Amaranthus blitoides) در مراحل مختلف فنولوژیکی، آزمایشی در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تیمار و 3 تکرار انجام گرفت. سه مرحله رشد گیاه شامل مرحله 8 برگی، مرحله گلدهی و مرحله بذردهی به عنوان سه تیمار آزمایش در نظر گرفته شد. سپس صفات فیتوشیمیایی و محتوی اسیدهای فنولیک کوئرستین، روتین، اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک در این گیاه اندازه گیری شد. بیشترین محتوای کلروفیل کل (05/2 میلیگرم بر گرم) در مرحله بذردهی و کمترین آن (94/0 میلیگرم در گرم) در مرحله 8 برگی مشاهده شد. بیشترین محتوای کلروفیل a و b در مرحله بذردهی و کمترین آن در مرحله هشت برگی مشاهده شد. بالاترین مقدار کارتنوئید، در مرحله فنولوژیکی بذردهی مشاهده شد. میزان متابولیتهای ثانویه این گیاه در مراحل مختلف فنولوژیکی اختلاف معنیداری نشان داد، بیشترین مقدار فنل کل، فلاونوئید کل، تانن کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی در مرحله گلدهی مشاهده شد. آنالیز HPLC عصاره اندام هوایی گیاه نشان داد که این گیاه دارای مقداری کوئرستین و روتین میباشد که با افزایش سن گیاه تا مرحلهی گلدهی مقدار روتین و کوئرستین افزایش و پس از آن مقدار این دو ترکیب کاهش یافت. همچنین عصاره گیاه دارای دو اسید فنلیک شامل کلروژنیک اسید و کافئیک اسید بود که در مرحلهی 8 برگی بالاترین میزان را داشتند و در مراحل بعدی رشد کاهش یافتند. در مجموع بیشترین میزان ترکیبات زیست فعال و اسیدهای فنولیک کوئرستین و روتین این گیاه در مرحله گلدهی و بیشترین میزان رنگیزههای گیاهی در مرحله بذردهی مشاهده شد.
واژههای کلیدی: تانن کل، ترکیبات فنلی، ظرفیت آنتیاکسیدانی، فلاونوئید کل
* نویسنده مسئول، تلفن: 08134425400، پست الکترونیکی: m.sayyari@basu.ac.ir
مقدمه
در کشور ما به رغم پیشینه طولانی در مصرف گیاهان دارویی و گذشته درخشان خود در دانش گیاهان دارویی و همچنین تنوع فراوان گونههای دارویی، هنوز آنطور که شایسته است گامهای اساسی در زمینه جمعآوری، کشت انبوه و شناسایی ترکیبات شیمیایی گیاهان دارویی برداشته نشده است. علاوه بر این بسیاری از گیاهان دارویی منحصربهفرد موجود در کشور حتی وارد مراحل اهلیسازی نشده و یا با برداشت بیرویه و غیراصولی از منابع طبیعی، زمینه انقراض و نابودی آنها فراهم شده است (1, 13). بنابراین شایسته است که با شناخت و مطالعه روند تولید گیاهان دارویی و توسعه تحقیقات در زمینه اهلیسازی گیاهان دارویی که هنوز وارد چرخه تولید زراعی نشدهاند، زمینه برای تامین نیاز صنایع داروسازی و افزایش سطح درآمد تولیدکنندگان و بهرهبرداران گیاهان دارویی فراهم گردد (28).
اهلـی کـردن و کشت گیاهان دارویی و معطر نهتنها وسیلهای برای تأمین نیازهـای روزافزون ترکیبـات دارویـی حـال و آینـده مـیباشـد بلکـه وسیلهای جهت کاهش فشار بـر جوامـع گیـاهان وحـشی نیـز محسوب میشود (13). تودههای وحشی یک گونه، از نظر مورفولوژی، تیپ رشدی و تیپ شیمیایی ناهمگن هستند. علاوه بر این برای استفاده در صنایع غذایی و دارویی، ارقام همگن با درصد بالای ماده موثره و عملکرد بالای اندام دارویی مورد نیاز میباشد (28). بنابراین برای استفاده اصولی و صنعتی از این گیاهان لازم است که هویت و ماهیت آنان از جنبههای مختلف شیمیایی و تولیدی بررسی شود.
از مهمترین گیاهانی که اخیراً مورد توجه قرار گرفته، گونههای مختلف گیاه تاجخروس (Amaranthus spp.) است این گیاهان با شرایط محیطی مختلفی سازگار بوده و جز گیاهان چهار کربنه محسوب میشود (3، 5، 9). خصوصیاتی مانند مقاومت محیطی سودمند و مصرف موثر آب منجر به فعالیتهای اخیر در تولید این گیاهان به عنوان یک منبع دانهای، سبزی یا دارویی شده است (2، 4، 22). گیاه تاجخروس گسترده با نام علمی Amaranthus blitoides به عنوان یک گیاه کم توقع و یک منبع ارزان از پروتئینها، ویتامینها و مواد معدنی است و به عنوان یک محصول آیندهدار با عملکرد فوقالعاده و کیفیت تغذیهای خوب میتواند پاسخگوی تقاضای امروزی بشر باشد (3، 5, 24). گیاهان خانواده تاج خروس به دلیل دارا بودن فنولها، آلکالوئیدها، ساپونینها، ترپنوئیدها مورد کشت و کار قرار میگیرند و در صنایع داروسازی مورد استفاده قرار میگیرند (14، 27).
در گیاهان داروئی که استخراج متابولیت های ثانویه به عنوان ماده داروئی مد نظر است عوامل مختلفی روی بیوسنتز این ترکیبات اثر میگذارند که یکی از مهمترین عوامل، مراحل فنولوژیک گیاه میباشد. هر ماده داروئی در مرحله خاصی از رشد گیاه به حداکثر میزان خود میرسد و جهت استحصال حداکثر میزان ماده موثره گیاهی در واحد سطح، بهدست آوردن مناسبترین مرحله رشدی گیاه لازم است (7، 11). با توجه بهاینکه تاجخروس گسترده گیاهی چند منظوره بوده و از نظر متابولیتهای ثانویه مورد توجه قرار گرفته است هدف از این تحقیق بررسی اثر مراحل فنولوژیکی بر میزان برخی از مواد موثره موجود در این گیاه بوده است.
مواد و روشها
بذر گیاه تاجخروس گسترده از روی بوتههای مادری جمعآوری شد. منطقه جمع آوری بذور محوطه اطراف دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا با طول جغرافیایی 33 درجه و 95 دقیقه تا 35 درجه و 48 دقیقهی عرض شمالی و 47 درجه و 34 دقیقه تا 49 درجه 36 دقیقهی طول شرقی بود. در اﺑﺘﺪا از ﺑﻴﻦ ﺑﺬور ﺑﻮﺟﺎری ﺷﺪه (ﺑﺬرﻫﺎ از ﻣﻮاد ﺧﺎرﺟﻲ، ﺑﺬرﻫﺎی ﻧﺮﺳﻴﺪه، ﭘﻮک و ﺷﻜﺴﺘﻪ ﺟﺪا ﺷﺪﻧﺪ)، ﺑﺬرﻫﺎﻳﻲ ﺑﺎ اﻧﺪازه ﻳﻜﺴﺎن، ﻳﻜﻨﻮاﺧﺖ و بدون شکستگی انتخاب و با استفاده از هیپوکلریت سدیم تجاری یک درصد ضدعفونی و سپس با آب مقطر سه بار شستشو داده شدند. بذرها در قالب یک طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار با فواصل 10 سانتیمتری در کرتهایی به ابعاد 2×1 به عمق 5 سانتیمتر در اسفند ماه سال 1398 کاشته شدند. آزمایش در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با اعمال 3 تیمار صورت گرفت که هرکدام از مراحل فنولوژیکی 8 برگی، ابتدای گلدهی و رسیدگی فیزیولوژیکی گیاه (رسیدن بذور در روی گیاه) یک تیمار در نظر گرفته شد. وارد شدن 75 درصد گیاهان موجود در کرتهای مشخصشده به یک مرحله فنولوژیکی، معیار ثبت تاریخ مراحل فنولوژیکی در نظر گرفته شد. اولین برداشت در مرحله هشت برگی، دومین برداشت در مرحله گلدهی گیاه و سومین برداشت در زمان بذردهی صورت گرفت.
در هریک از مراحل فنولوژیکی گیاه، برگهای سالم و تازه در هر کرت بهصورت جداگانه انتخاب، جمعآوری و جهت اندازهگیری ویژگیهای بیوشیمیایی ذیل (فنل کل، فلاونوئید، تانن، ظرفیت آنتیاکسیدانی، اسیدهای فنولیک روتین و کوئرستین) به فریزر 80- درجه سانتیگراد منتقل شدند. بخشی از برگهای تازه نیز برای اندازهگیری صفات کلروفیل و کاروتنوئید مورد استفاده قرار گرفت.
صفات اندازه گیری شده: صفات اندازهگیری شده شامل میزان کلروفیلa و b در برگ، میزان فنل کل، میزان فلاونوئید کل و میزان تانن کل اندام هوایی، ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره برگ، محتوای کوئرستین، روتین، اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در عصاره برگ بود.
برای سنجش غلظت کلروفیل ابتدا محتوای کلروفیل از نمونه برگ تازه استخراج و سپس جذب نمونههای حاوی رنگیزه در طول موجهای 664 و 645 نانومتر به ترتیب برای کلروفیل a، b و همچنین 470 نانومتر برای کاروتنوئید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (شیمادزو مدل UV-1280) اندازهگیری و در نهایت با استفاده از رابطههای زیر، میزان کلروفیل a، b، کل و کاروتنوئید بر حسب میلیگرم در گرم وزن تازه محاسبه گردید (29).
فرمول (1) |
Chl a = (12.25 × A664) - (2.55 × A645) |
فرمول (2) |
Chl b = (20.31 × A645) - (4.91 × A664) |
فرمول (3) |
Chl T = (17.76 × A645)- (7.34 × A664) |
فرمول (4) |
کاروتنوئید= (1000 × A470 -1.82 × Cha- 85.02 × Chb) / 198 |
برای سنجش میزان فنل کل، فلاونوئید و تانن کل ابتدا از نمونهها عصاره گیری انجام شد (8). بدین منظور 5/0 گرم نمونه تازه برگ گیاه به همراه 5 میلیلیتر متانول 85% در هاون سائیده شد سپس به مدت 60 دقیقه در شیکر 120 دور در دقیقه گذاشته شد. پس از آن به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس فاز رویی جدا شده و برای فاز زیرین همان مراحل قبلی تکرار شد و به فاز رویی مرحله قبل اضافه شد و بهعنوان عصاره مورد استفاده قرار گرفت. در ادامه برای سنجش میزان فنل کل از معرف فولین-سیکالتو (Folin-Ciocalteu) استفاده شد. بدین منظور به 300 میکرولیتر از عصاره گیاهی، 1500 میکرولیتر معرف فولین - سیکالتو رقیقشده با نسبت یک به ده اضافه گردید و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. سپس به آن 1200 میکرولیتر سدیم کربنات 5/7 درصد اضافه شد و به مدت 90 دقیقه روی شیکر در دمای اتاق و شرایط تاریکی قرار داده شد، در نهایت جذب محلول در طولموج 765 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. با استفاده از منحنی استاندارد اسیدگالیک و در نظر گرفتن نسبت رقیق شدن، مجموع فنل بهصورت میلیگرم اسیدگالیک در گرم وزن عصاره بیان شد (6).
برای اندازهگیری غلظت فلاونوئید کل اندام هوایی، 275/0 میلیلیتر از عصاره برگ با 825 میکرولیتر آب مقطر به حجم 1/1 میلیلیتر رسانده شد سپس 3/0 میلیلیتر نیتریت سدیم 5 درصد به محلول اضافه گردید پس از سپری شدن مدت زمان 5 دقیقه 6/0 میلیلیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد به محلول اضافه شد و بعد از 6 دقیقه 2 میلیلیتر سدیم هیدروکسید (سود) 1 مولار به همراه یک میلیلیتر آب مقطر به محلول اضافه گردید. شدت جذب محلول در طولموج 510 نانومتر با اسپکتروفتومتر قرائت شد. از آب مقطر به عنوان بانک استفاده شد. برای محاسبه غلظت فلاونوئید کل با استفاده از روتین منحنی استاندارد رسم گردید و غلظت فلاونوئید کل در برگ بر حسب میلیگرم روتین (کوئرستین 3- روتینوزید) در گرم وزن تر بیان شد (20).
بهمنظور اندازهگیری تانن کل نیز 250 میکرولیتر از عصاره متانولی با 1375 میکرولیتر آب مقطر مخلوط گردید، سپس 125 میکرولیتر فولین-سیکالتو به آن اضافه شد. پس از 3 دقیقه، 250 میکرولیتر از محلول سدیم کربنات به همراه 8 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه شد. پس از انجام شیکر به مدت 60 دقیقه، جذب نمونهها در طول موج 725 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت و برای محاسبه غلظت تانن کل با استفاده از اسید تانیک منحنی استاندارد رسم شد و در نهایت غلظت تانن کل در برگ بر حسب میلیگرم تانیک اسید در 100 گرم وزن تر بیان گردید (31).
برای سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی، ابتدا محلول دی فیل پیکریل هیدرازیل ((DPPH با غلظت 5./. میلیمولار تهیه گردید. این محلول برای اندازهگیری درصد بازدارندگی به شکل روزانه تهیه گردید. در مرحله بعد 500 میکرولیتر عصاره گیاهی برداشته و به آن 500 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد و با 10000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 75 میکرولیتر از این محلول برداشته و به آن 2925 میکرولیتر محلول DPPH اضافه گردید. جذب نمونهها در دقیقه صفر با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 515 نانومتر قرائت شد. سپس نمونهها به مدت 30 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد و دوباره میزان جذب آنها اندازهگیری شد. درصد بازدارندگی با استفاده از فرمول 5 محاسبه گردید (18): فرمول (5)
A515 = ((A515T0- A515T30) / A515T0) × 100
A515T0 مقدار جذب در دقیقه صفر،
A515T30 = مقدار جذب در دقیقه 30
برای تعیین غلظت اسیدهای فنولیک گیاه تاج خروس گسترده با استفاده از دستگاه HPLC ابتدا استخراج آنها صورت گرفت. بدین منظور مقدار 100 میلیگرم از نمونه برگی به همراه 1 میلیلیتر متانول 85 درصد (با درجه HPLC) داخل لوله فالکون 15 میلیلیتری ریخته شد، سپس 30 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک با دمای 30 درجه سانتیگراد قرار داده شد و سپس به مدت 10 دقیقه با دور 3500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی برداشته و درون تیوپ جدید ریخته شد. برای اطمینان از شفاف بودن عصاره، دوبار سانتریفیوژ صورت گرفت. قسمت فوقانی محلول پس از گذشتن از فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرومتر به میکروتیوپ منتقل شد. سپس عصاره با متانول 80 درصد، 10 برابر رقیق شد و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
برای سنجش میزان کوئرستین، روتین، اسید کلروژنیک و اسید کافئیک از دستگاه HPLC ساخت شرکت کنوور آلمان مجهز به پمپ مدل اسمارت لاین 2050، ستون C18 به طول 150 میلیمتر و قطر داخلی 6/4 میلیمتر استفاده گردید. دتکتور از نوع UV-Detector بود که روی طول موج330 نانومتر تنظیم گردید. استونیتریل (95%) و ارتوفسفریک (1%) به عنوان فاز متحرک دستگاه مورد استفاده قرار گرفتند. میزان حجم هر تزریق نمونه 20 میکرولیتر و سرعت جریان فاز متحرک 1 میلیلیتر در دقیقه بود. پس از تزریق استاندارد، نمونهها تزریق شدند و با مقایسه گروماتوگرام نمونهها و بر اساس زمان بازداری پیکهای خروجی و مطابقت پیکهای استاندارد، مقدار و نوع ماده خروجی از ستون شناسایی، تعیین و میزان اسیدهای فنولیک پس از محاسبات لازم بر اساس میلیگرم بر گرم وزن تر نمونه مشخص گردید (19).
تجزیه و تحلیل دادههای آماری: تجزیه آماری دادههای حاصل از اندازهگیری صفات مختلف، با نرمافزار SAS نسخه 4/9 و مقایسه میانگینها با آزمون چنددامنهای دانکن در سطح احتمال 5% انجام پذیرفت و نمودارها با نرمافزار Excell 2013 رسم گردیدند.
نتایج و بحث
میزان رنگیزههای گیاهی در مراحل مختلف فنولوژیکی: اثر مراحل فنولوژیکی (مرحله 8 برگی، مرحله گلدهی و مرحله بذردهی) بر میزان کلروفیل a، کلروفیلb، کلروفیل کل و کارتنوئید کل در سطح 1 درصد معنی دار شد (جدول 1). بیشترین محتوای کلروفیل کل در مرحله فنولوژیکی بذردهی به مقدار 05/2 میلیگرم در گرم وزن تازه بهدست آمد در حالی که کمترین محتوای کلروفیل کل به مقدار 94/0 میلیگرم بر گرم وزن تر در مرحله هشت برگی مشاهده شد. بیشترین محتوای کلروفیل a و b در مرحله بذردهی به ترتیب به مقدار 58/1 و 44/0 میلیگرم بر گرم وزن تر و کمترین مقدار کلروفیل a و b در مرحله هشت برگی به ترتیب با مقدار 77/0 و 15/0 میلیگرم بر گرم وزن تر مشاهده شد که کمترین مقدار کلروفیل b اختلاف معنیداری با مرحله گلدهی نداشت (جدول 2). بالاترین مقدار کارتنوئید کل معادل 63/0 میلیگرم در گرم وزن تر در مرحله فنولوژیکی بذردهی مشاهده شد و کمترین مقدار در مرحله هشت برگی با مقدار 39/0 میلیگرم بر گرم مشاهده شد که اختلاف معنیداری با تیمار مرحله گلدهی نداشت (جدول 2).
تاثیر مراحل فنولوژیکی بر صفات فیتوشیمیایی: تاثیر مرحله فنولوژیکی بر مقدار فنل کل، فلاونوئید کل، ظرفیت آنتیاکسیدانی و تانن کل در سطح 1 درصد معنیدار شد (جدول 3). بیشترین محتوای فنل کل در مرحله گلدهی به مقدار 22/602 میلیگرم در 100 گرم وزن تر مشاهده شد که اختلاف معنیداری با مرحله بذردهی و 8 برگی داشت وکمترین محتوی فنل کل در مرحله 8برگی با مقدار 22/345 میلیگرم در 100 گرم وزن تر مشاهده شد که اختلاف معنیداری با تیمار مرحله بذردهی نداشت (جدول 4).
بیشترین محتوای فلاونوئید کل در مرحله گلدهی به مقدار 72/392 میلیگرم بر 100 گرم وزن تر مشاهده شد که اختلاف معنیداری با مرحله گلدهی و 8 برگی داشت و کمترین محتوای فلاونوئید کل در مرحله8 برگی با مقدار 32/83 میلیگرم بر 100 گرم وزن تر مشاهده شد و اختلاف معنیداری با مرحله گلدهی نداشت (جدول 4).
جدول 1- تجزیه واریانس اثر مراحل مختلف فنولوژیکی (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده بر میزان کلروفیل کل، کلروفیلa، کلروفیلb و کارتنوئید کل
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات(MS) |
|||
کلروفیل کل |
کلروفیل a |
کلروفیل b |
کارتنوئید |
||
بلوک |
2 |
ns01/0 |
ns005/0 |
ns004/0 |
ns006/0 |
مرحله فنولوژیکی |
2 |
**98/0 |
**53/0 |
**06/0 |
**04/0 |
خطای آزمایشی |
4 |
009/0 |
006/0 |
008/0 |
001/0 |
ضریب تغییر (درصد) |
- |
91/6 |
18/7 |
79/16 |
62/6 |
**نشاندهنده معنیدار بودن در سطح 1 درصد و nsبیانگر عدم معنیداری میباشد.
جدول 2- مقایسه میانگین اثر مراحل فنولوژیکی (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده بر میزان کلروفیل کل، کلروفیل a، کلروفیلb و کارتنوئید کل
کارتنوئید (میلی گرم بر گرم وزن تر |
کلروفیل b (میلیگرم بر گرم وزن تر) |
کلروفیل a (میلی گرم بر گرم وزن تر) |
کلروفیل کل (میلی گرم بر گرم وزن تر) |
مرحله فنولوژیک |
39/0b |
15/0b |
77/0c |
94/0c |
8 برگی |
44/0b |
24/0b |
98/0b |
23/1b |
گلدهی |
63/0a |
44/0a |
58/1a |
05/2a |
بذردهی |
حروف مشابه در هر ستون نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن میباشد.
بالاترین مقدار تانن کل در مرحله گلدهی (62/192 میلیگرم بر 100 گرم وزن تر) بهدست آمد که اختلاف معنیداری با سایر مراحل فنولوژیکی داشت و کمترین مقدار تانن کل در مرحله 8 برگی (09/120 میلیگرم بر 100 گرم وزن تر) مشاهده شد که اختلاف معنیداری با مرحله گلدهی و بذردهی داشت (جدول 4).
بیشترین ظرفیت آنتیاکسیدانی با مقدار 69/43 درصد بازدارندگی در مرحله گلدهی و کمترین ظرفیت آنتیاکسیدانی در مرحله 8 برگی با مقدار 944/2 درصد مشاهده شد. تمامی تیمارها با یکدیگر اختلاف معنیداری نشان دادند (جدول 4).
جدول 3- تجزیه واریانس اثر مراحل فنولوژیکی (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده بر میزان فنل کل، فلاونوئید کل، تانن کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی
منابع تغییر درجه آزادی |
میانگین مربعات (MS) |
||||
فنل کل |
فلاونوئید کل |
تانن کل |
ظرفیت آنتیاکسیدانی |
||
بلوک |
2 |
ns72/2008 |
ns84/504 |
ns46/67 |
ns03/19 |
مرحله فنولوژیکی |
2 |
**96/50823 |
**84/84043 |
**84/4691 |
**33/1276 |
خطای آزمایشی |
4 |
14/2708 |
19/733 |
47/190 |
58/3 |
ضریب تغییر |
- |
26/11 |
38/13 |
56/8 |
52/7 |
**نشاندهنده معنیدار بودن در سطح 1 درصد و nsبیانگر عدم معنیداری میباشد.
جدول 4- مقایسه میانگین اثر مراحل فنولوژیکی (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده بر میزان فنل کل، فلاونوئید کل، تانن کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی
تانن کل (میلیگرم بر 100 گرم وزن تر) |
فلاونوئید کل (میلیگرم بر 100 گرم وزن تر |
فنل کل (میلی گرم بر 100گرم وزن تر) |
مرحله فنولوژیک |
|
86/28c |
09/120c |
32/83b |
22/345b |
8 برگی |
69/43a |
62/199a |
72/392a |
22/602a |
گلدهی |
94/2b |
11/164b |
98/129b |
87/437b |
بذردهی |
حروف مشابه در هر ستون نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن میباشد.
اثر مراحل فنولوژیکی بر مقدار اسیدهای فنولیک روتین، کوئرستین، اسیدکافئیک و اسیدکلروژنیک: تاثیر مراحل فنولوژیکی بر مقدار اسیدهای فنولیک از جمله روتین، کوئرستین، اسیدکلروژنیک و اسیدکافئیک در گیاه تاجخروس گسترده معنی دار بود (جدول 5). با توجه به نتایج بدست آمده بیشترین مقدار روتین و کوئرستین در مرحله گلدهی به ترتیب به مقدار 16/2 و 87/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک برگ و کمترین مقدار در مرحله 8 برگی به ترتیب به مقدار 52/1 و 01/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک برگ مشاهده شد. یعنی با افزایش سن گیاه تا مرحله گلدهی مقدار این دو ترکیب افزایش و سپس کاهش یافته است. همچنین بیشترین مقدار اسیدکلروژنیک واسیدکافئیک در مرحله 8 برگی به ترتیب با مقدار 13/6 و 35/7 میلیگرم بر گرم وزن خشک برگ و کمترین مقدار در مرحله بذردهی بهترتیب با مقدار 44/2 و 79/2 میلیگرم بر گرم وزن خشک برگ مشاهده شد که تفاوت معنیداری با مرحله گلدهی مشاهده نشد. با افزایش سن گیاه مقدار این دو ترکیب به طور معنیداری کاهش یافته است (شکل 1).
جدول 5- تجزیه واریانس اثر مراحل فنولوژیکی (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده بر میزان برخی اسیدهای فنولیک
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|||
مقدار روتین |
مقدار کوئرستین |
مقدار اسیدکلروژنیک |
مقدار اسیدکافئیک |
||
بلوک |
2 |
ns16/0 |
ns0001/0 |
ns006/0 |
ns20/0 |
مرحله فنولوژیکی |
2 |
**38/0 |
**70/0 |
**15/11 |
**13/23 |
خطای آزمایشی |
4 |
019/0 |
0006/0 |
007/0 |
10/0 |
ضریب تغییرات |
- |
95/7 |
98/3 |
16/2 |
96/7 |
**نشاندهنده معنیدار بودن در سطح 1 درصد و nsبیانگر عدم معنیداری میباشد.
شکل 1- میزان اسیدهای فنولیک روتین، کوئرستین، اسیدکلروژنیک و اسیدکافئیک در مراحل مختلف رشد (مرحله هشت برگی، مرحله گل دهی و مرحله بذردهی) گیاه تاجخروس گسترده.
حروف مشابه در هر ستون و در هر اسید فنولیک نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن میباشد.
بحث
در این تحقیق بالاترین میزان کلروفیل کل، کلروفیل a، کلروفیل b و نیز کارتنوئید در مرحله بذردهی گیاه مشاهده شد (جدول 2). ﻣﺘﻨﺎﺳﺐ ﺑﺎ ﺳﻦ و ﻣﻮﻗﻌﻴﺖ ﺑﺮگ روی ﺷﺎﺧﻪ، ﺳﻄﺢ ﺑﺮگ ﺑﻪ ﺗﺪرﻳﺞ اﻓﺰاﻳﺶ ﻳﺎﻓﺘﻪ و ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ آن تغییرات ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﺑﺮای ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻛﻠﺮوﭘﻼﺳتﻫﺎی ﻛﺎﻣﻼً ﻧﻤﻮ ﻳﺎﻓﺘﻪ اﻧﺠﺎم ﻣﻲﺷﻮد. گزارش شده است که رﻧﮕﺪاﻧﻪﻫﺎی ﮔﻴﺎﻫﻲ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﻛﻠﺮوﻓﻴﻞﻫﺎ و ﻛﺎروﺗﻨﻮﺋﻴﺪﻫﺎ از ﻧﺸﺎﻧﮕﺮﻫﺎی ﻓﻴﺰﻳﻮﻟﻮژﻳﻜﻲ اﻓﺰاﻳﺶ ﺳﻦ ﺑﺮگها ﺑﻮده و ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ ﻧ ﻤﻮ ﺑﺮگ و ﻛﻠﺮوﭘﻼﺳﺖها، ﺗﻮﻟﻴﺪ آنﻫﺎ ﻧﻴﺰ بهﻣﻨﻈﻮر ﺗﺄﻣﻴﻦ اﻧﺮژی ﻣﻮرد ﻧﻴﺎز اﻓﺰاﻳﺶ مییابد (10). افزایش کلروفیل کل برگ از مرحله جوانی تا بلوغ در گیاهان آفتابگردان و کاسیا (Cassia alata) نیز مشاهده شده است (15, 26). در گیاه گراویلا (Annona muricate L.) نیز با افزایش سن گیاه مقدار کلروفیل و کارتنوئید افزایش یافته (23) که نتایج این آزمایش نیز با آن مطابقت دارد. اما در گیاه تاجخروس سه رنگ با افزایش سن گیاه غلظت کلروفیل کاهش یافته که نتایج این تحقیق با گزارش آنها مغایرت دارد (17).
در این پژوهش بیشترین مقدار فنل کل، فلاونوئید کل، ظرفیت آنتیاکسیدانی و تانن کل در مرحله گلدهی مشاهده گردید (جدول 4). علت افزایش تجمع ترکیبات فنولیک در مرحله گلدهی را میتوان مرتبط به سلولها و بافتهایی مثل مزوفیل، اپیدرم و ضخامت کوتیکول، کلروپلاست، کرک و یا تغییرات مهم فیزیولوژیکی و یا ساختاری طی مراحل نموی دانست. همچنین این افزایش را میتوان به همزمانی این مرحله با دمای معتدل هوا در اواسط بهار مرتبط دانست و با نزدیکی به تابستان و افزایش دمای هوا و رسیدن گیاه به بلوغ کامل میزان این ترکیبات مجدداً کاهش مییابد. اثر مراحل فنولوژیکی بر مقدار فنل کل، فلاونوئید کل و فعالیت آنتیاکسیدانی در گیاه گل راعی بررسی و گزارش شده است که در مرحله گلدهی مقدار این ترکیبات به حداکثر میرسد و پس از گلدهی سیر نزولی دارد (32). در برگهای گیاه رزماری نیز بیشترین مقدار ترکیبات فنلی، فلاونوئید کل و تانن در مرحله بذردهی و بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی در مرحله گلدهی مشاهده شد (33).
در تحقیقی در گیاه بومادران (Achillea gypsicola) دریافتند که ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و فعالیت آنتی اکسیدانی در مراحل مختلف رشد متفاوت است و بیشترین مقدار فنل کل در مرحله گلدهی و بیشترین مقدار فلاونوئید کل و فعالیت آنتیاکسیدانی در مرحله بذردهی اتفاق میافتد (7). مقدار فنل کل و فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه ترشک (Rumex crispus L.) در مرحله گلدهی بیشتر از مرحله بذردهی گزارش شده (12) و در گیاه سیاهدانه هم مقدار فنل کل، فلاونوئید کل و تانن کل در مرحله بذردهی گیاه بیشترین مقدار را داشته است (34). در گزارشی نیز آمده است که بیشترین مقدار فنل کل و فلاونوئید کل در مرحله گلدهی گیاه لعل کوهستان (Oliveria decumbens Vent.) تولید می گردد (34).
در تمام مراحل رشد گیاهان، یک سیستم دفاع آنتیاکسیدانی فعال میباشد که عمل این آنتیاکسیدانها متفاوت است و به طور گسترده با چندین فاکتور مثل مراحل بلوغ، شرایط آب و هوایی، بخشهای مورد استفاده از گیاه، شرایط برداشت و ذخیرهسازی تغییر میکند (21). رسیدگی گیاهان دارویی با تغییرات مهم بیوشیمیایی اتفاق میافتد. اغلب میزان فنل کل با نمو و رسیدن کامل گیاه به طور پیوسته کاهش مییابد که این موضوع با نتایج این بررسی مطابقت داشت و میزان فنل کل بعد از مرحله گلدهی روند نزولی نشان داد.
بیشترین مقدار روتین و کوئرستین در مرحله گلدهی و بیشترین میزان اسیدکلروژنیک واسیدکافئیک در مرحله 8 برگی یافت شد. با توجه به نتایج این پژوهش گونه تاجخروس گسترده را نمیتوان به عنوان یک منبع غنی از کوئرستین به حساب آورد. منابع غنی کوئرستین در تعدادی از میوهها، سبزیها و گیاهان داروئی مشخص شده است (30). در تحقیقی مقدار روتین و کوئرستین 4 گونه تاجخروس را مورد سنجش قرار گرفته و گزارش شده که بیشترین مقدار روتین و کوئرستین در مرحله گلدهی تولید می گردد (16) که نتایج آزمایش ما نیز با این گزارش مطابقت دارد. در گیاه بادیان رومی (Pimpinella anisum L.) بیشترین مقدار روتین و کوئرستین در مرحله گلدهی مشاهده شده است (25). در پژوهشی ترکیبات فنولیک گیاه مرزنجوش (Origanum majorana L.) در مراحل مختلف فنولوژیکی بررسی شده و گزارش شده که بیشترین مقدار کوئرستین در مرحله گلدهی و بیشترین مقدار روتین، اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در مرحله رویشی پدیدار می گردد (25).
در تحقیقی مقدار روتین گیاه تاجخروس (حدود 3%) مانند مقدار روتین در برگهای گیاه جعفری (Petroselinum crispum) گزارش شده است و لذا میتوان از این گیاه به عنوان سبزی در تغذیه انسان استفاده کرد. این گیاه منبع غنی از اسیدکافئیک و اسیدکلروژنیک در مراحل ابتدای رویشی میباشد و با افزایش سن گیاه بیوسنتز این دو ترکیب به شدت کاهش مییابد.
مراحل فنولوژیکی بر میزان متابولیتهای ثانویه گیاه تاج خروس موثر میباشد و بیشترین مقدار فنل کل، فلاونوئید کل، تانن کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی در مرحله گلدهی تولید میگردد. این گیاه دارای اسیدهای فنولیک از جمله کوئرستین، روتین، اسیدکلروژنیک و اسیدکافئیک میباشد. بیشترین مقدار روتین و کوئرستین در مرحله گلدهی یافت شد و در مرحله بذردهی مقدار آنها کاهش یافت اما بیشترین مقدار اسیدکلروژنیک و اسیدکافئیک در مرحله 8 برگی مشاهده شد و سپس در مراحل بعدی کاهش پیدا کرد. در مجموع می توان گفت که بیشترین میزان ترکیبات زیست فعال از جمله فنل کل، تانن کل، فلاونوئید کل و اسیدهای فنولیک کوئرستین و روتین این گیاه در مرحله گلدهی و بیشترین میزان رنگیزههای گیاهی از جمله کلروفیل و کارتنوئید در مرحله بذردهی بیوسنتز می گردد.
سپاسگزاری
اعتبار مالی لازم این تحقیق توسط حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه بوعلی سینا تأمین شده است. لذا نویسندگان مقاله مراتب قدردانی خود را از مساعدت های مذکور اعلام می دارند.