Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran.
2 Department of Plant Physiology, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona, Av. Joan, XXIII, S/n, 08028, Barcelona, Spain
Abstract
Genetic engineering and elicitors are useful strategies to optimize high level production of secondary metabolites. In this study, hairy roots were produced with inoculated cotyledon explants of Hyoscyamus reticulatus L. with strain A4 of Agrobacterium rhizogenes and strain C58C1 (pRiA4-pBMI) carrying the pmt gene of Agrobacterium tumefaciens. Then, the effect of pmt gene overexpression and optimal concentration of yeast extract (250 mg l-1 after 48 h) were evaluated on morphological, biochemical characteristics and production of tropane alkaloids in hairy roots obtained from two strains. The results of the effect of different Agrobacterium strains with the optimal concentration of yeast extract showed that in hairy roots obtained from C58C1 strain, fresh weight (2.85 times) and dry weight (2.27 times), total phenol (1.74 times), flavonoid (1.76 times) and alkaloid (1.77 times) were higher than the hairy roots obtained from A4 strain. The maximum antioxidant capacity using two methods IC50 (1.62 µg ml-1) and FRAP (14.77 mmol Fe2+ g-1 FW) were observed in hairy roots obtained C58C1 strain. Also, the highest production of hyoscyamine (1.37 times) and scopolamine (1.34 times) was obtained in hairy roots from C58C1 strain. The results showed that the combination of pmt gene overexpression and the optimal concentration of yeast extract could be used as a suitable method to increase the production of phytochemicals, antioxidant capacity, activity of antioxidant enzymes and tropane alkaloids in Hyoscyamus reticulatus L. hairy roots.
Keywords
بررسی بیش بیانی ژن pmt بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشههای موئین بذرالبنج مشبک تحت تأثیر غلظت بهینه عصاره مخمر
شهلا شامه1، بهمن حسینی1* و خاویر پالازون2
2 اسپانیا، دانشگاه بارسلونا، دانشکده داروسازی، گروه فیزیولوژی گیاهی
تاریخ دریافت: 24/01/1400 تاریخ پذیرش: 06/07/1400
چکیده
مهندسی ژنتیک و محرکها از راهکارهای مفید جهت بهینه سازی تولید متابولیتهای ثانویه در سطح انبوه هستند. در این مطالعه، ریشههای موئین از تلقیح ریزنمونههای کوتیلدون گیاه بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) با سویههای A4 از Agrobacterium rhizogenes و C58C1 (pRiA4-pBMI) از Agrobacterium tumefaciens حاوی ژن pmt تولید شدند. سپس تأثیر ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلیگرم بر لیتر بعد از 48 ساعت) بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشههای موئین حاصل از دو سویه مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج بررسی تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر نشان داد که در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1، وزن تر (85/2 برابر) و خشک (27/2 برابر)، فنول (74/1 برابر)، فلاونوئید (76/1 برابر) و آلکاوئید کل (77/1 برابر) بیشتر از ریشههای موئین حاصل از سویه A4 شد. بیشترین ظرفیت آنتیاکسیدانی به دو روش IC50 (62/1 میکروگرم بر میلیلیتر) و FRAP (77/14 میلیمول آهن II بر گرم وزن تر) در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 مشاهده شد. میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 به ترتیب 45/2، 30/1، 82/1 و 18/2 برابر بیشتر از ریشههای موئین حاصل از سویه A4 به دست آمد. همچنین بیشترین میزان تولید هیوسیامین (37/1 برابر) و اسکوپولامین (34/1 برابر) در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 حاصل شد. نتایج مشخص کرد که ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر میتواند بهعنوان یک راهکار مناسب جهت افزایش تولید ترکیبات فیتوشیمیایی، ظرفیت آنتیاکسیدانی، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و تروپان آلکالوئیدها در ریشههای موئین بذرالبنج مشبک استفاده شود.
واژه های کلیدی: آلکالوئیدکل، بیش بیانی، تروپان آلکالوئیدها، عصاره مخمر، مهندسی ژنتیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 04432779558 ، پست الکترونیکی: pbhosseini@yahoo.com
مقدمه
رویکرد روز افزون مصرف داروهایی با منشأ گیاهی توسط مردم جهان، سبب افزایش تقاضا در زمینه مواد مؤثره گیاهان دارویی بهعنوان تولیدات قابل مصرف در صنایع آرایشی-بهداشتی و دارویی شده است (52). بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) یکی از گیاهان تیره بادمجانیان (Solanaceae) است که بومی مناطق خشک و نیمه خشک مصر، جنوب غرب آسیا، ایران و ترکیه است (12). تمام پیکر گیاه، حاوی آلکالوئید است که مهمترین آنها را هیوسیامین، اسکوپولامین و آتروپین تشکیل میدهند (1). از کاربردهای تروپان آلکالوئیدها در پزشکی میتوان به مواردی مانند آرام نمودن علایم بیماری پارکینسون، گشادکردن مردمک چشم و افزایش ضربان قلب، خنثیکردن سستی ماهیچههای صاف ناشی از ترکیبات فسفره آلی و کاهش ترشح عرق و اسید معده اشاره نمود (8). ارزش تجاری اسکوپولامین به دلیل عملکرد متفاوت در سیستم عصبی و فعالیت فیزیولوژیکی بالاتر نسبت به هیوسیامین بیشتر میباشد (33). در سالهای اخیر، تولید متابولیتهای ثانویه از طریق کشت بافت گیاهی بسیار مورد توجه قرار گرفته است، زیرا مواردی وجود دارد که میزان متابولیتهای موجود در کشت سلولهای گیاهی خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه کامل است و یا حتی سلولهای کشت شده، متابولیتهایی تولید میکنند که در گیاه اولیه تولید نمیشوند (54). با توجه به اهمیت و نیاز به افزایش تولید ترکیبات با ارزش در گیاهان دارویی به دلایل کاربرد در صنایع دارویی و غذایی، به نظر میرسد که روشهای زیست فنآوری مانند کشت سلول و اندام میتوانند در به ثمر رسیدن این اهداف مفید باشند (57). در حال حاضر استفاده از روشهای نوین مهندسی ژنتیک، از جمله پرکاربردترین فنونی به شمار میروند که در شناسایی مسیرهای بیوشیمیایی و ژنهای دخیل در این مسیرها، افزایش بیان ژنها، دستورزی آنها و انتقال آنها از موجودی به موجود دیگر مورد استفاده قرار میگیرند (29). مهندسی متابولیت بهعنوان راهکار نهایی برای تغییر در تولید متابولیتهای ثانویه با استفاده از دو سیستم کلی افزایش و کاهش بیان ژنهای بیوسنتز کننده است (59). به طور کلی میتوان گفت که تغییر بیان ژنهای کلیدی درگیر در تولید یک یا دستهای از متابولیتهای ثانویه در گیاهان دارویی، از مهمترین راهبردهای مورد استفاده در بالابردن تولید متابولیتها در گیاهان دارویی محسوب میشوند (9). تراریختی به واسطهی آگروباکتریوم این مزیت را داراست که با قرار دادن هر ژن خارجی مورد علاقه در یک ناقل دوگانه (Binary vector)، بتوان آن را به کلونهای ریشه موئین تراریخت انتقال داد (19). ریشه موئین نوعی بیماری گیاهی است که توسط باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز ایجاد میگردد (38). کشت ریشه موئین به علت رشد سریع، زمان دو برابرشدن کوتاه، سهولت نگهداری و توانایی سنتز گستردهای از ترکیبات شیمیایی، مزیتهای بیشتری را بهعنوان یک منبع پیوسته برای تولید متابولیتهای ثانویه ارزشمند ایجاد مینماید (19 و 13). اگرچه روشهای مختلف برای انتقال ژن وجود دارد اما استفاده از
A. tumefaciens به دلایل متعدد از جمله: بازدهی بیشتر با هزینهی کمتر، امکان انتقال قطعات بزرگ DNA و انتقال تعداد کپی DNA کم نسبت به سایر روشها ارجحیت دارد (62 و 51)
اخیراً، رویکردهای متعددی مثل استفاده از محرکهای زیستی و غیر زیستی و تحریک مسیر بیوسنتزی برای افزایش تولید متابولیتها در کشت ریشههای موئین بهکار گرفته شده است (41). محرکها با القاء سیستم دفاعی گیاه منجر به افزایش بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانویه میشوند (64). عصاره مخمر ( بهعنوان محرک زیستی)، ترکیبی از آمینو اسیدها، ویتامینها، مواد معدنی مختلف و سایر ترکیبهای تحریک کننده رشد و تولید متابولیتهای ثانویه میباشد (50). تاکنون مطالعات زیادی مبنی بر بیش بیانی ژنهای کلیدی در مسیر بیوسنتزی مختلف و استفاده از محرکها بهعنوان راهکاری مهم به منظور بهبود تولید متابولیتهای ثانویه در کشت ریشههای موئین ارائه شده است. pmt بهعنوان ژن بالادست در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئید ها نقش دارد که افزایش تعداد رونوشتهای مربوط به آن میتواند بهعنوان یکی از راهکارهای مؤثر جهت افزایش تولید تروپان آلکالوئیدها باشد (37). در تحقیقی با بررسی بیش بیانی ژن pmt به منظور افزایش تولید آلکالوئیدهای ارزشمند هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشههای موئینHyoscyamus muticus، محتوی هیوسیامین در ریشههای تراریخت شده 3-2 برابر ریشههای شاهد مشاهده گردید، اما محتوی اسکوپولامین مشابه ریشههای شاهد بود (37). در تحقیقی که توسط Kang و همکاران (26) صورت گرفت، بررسی بیش بیانی ژن h6h در کشت ریشههای موئین گیاه Scopolia parviflora نشان داد که میزان تولید اسکوپولامین 3 برابر نسبت به ریشههای شاهد افزایش یافت. در تحقیق دیگر Yang و همکاران (60)، اثر بیش بیانی ژن pmt و h6h به منظور افزایش تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشههای موئین تراریخته شده شابیزک (Atropa belladonna) مورد مطالعه قرار دادند، نتایج نشان داد که محتوی هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشههای تراریخت به ترتیب 11 و 5 برابر ریشههای غیر تراریخت افزایش یافت.
در پژوهشی تیمار ریشههای موئین خرفه
(Portulaca oleracea) با غلظت 500 میلیگرم بر لیتر عصاره مخمر به مدت 48 ساعت، سطح تجمع نورآدرنالین را نسبت به ریشههای شاهد 5 برابر افزایش داد (44). در تحقیقی که توسط رحیمی آشتیانی و همکاران (3) صورت گرفت، بررسی اثر غلظتهای مختلف عصاره مخمر در زمانهای مختلف بر کشت سوسپانسیون سلولی گیاه خار مریم (Silybum marianum) نشان داد که بیشترین میزان تولید سیلی مارین در تیمار با 6 میلیگرم بر50 میلیلیتر محیط کشت در مدت 72 ساعت حاصل شد که نسبت به شاهد 5 برابر افزایش نشان داد. تیمار عصاره مخمر در ریشههای موئین چریش (Azadirachta indica)، تولید آزادیراکتین را نسبت به شاهد 6/1 برابر بهبود بخشید (48). کاربرد عصاره مخمر در ریشههای موئین بذرالبنج مشبک (H. reticulatus) در غلظتهای مختلف و زمانهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت، بالاترین میزان تولید هیوسیامین (2 برابر) و اسکوپولامین (5/2 برابر بیشتر از شاهد) در غلظتهای 500 و 250 میلیگرم بر لیتر عصاره مخمر در مدت زمان 48 ساعت تحریک زایی به دست آمد (35). Udomusk و همکاران (55) گزارش کردند میزان تولید ایزوفلاونوئید کل در ریشههای موئین Pueraria candollei به وسیله عصاره مخمر در غلظت و زمانهای مختلف، 5/4 برابر بیشتر از ریشههای موئین شاهد بود.
گزارشات بالا نشان میدهند که بیش بیانی ژنهای کلیدی در مسیر بیوسنتزی و استفاده از محرکها از روشهای موثر بر ای بهبود تولید متابولیتهای ثانویه در کشت ریشههای موئین است. در این مطالعه برای اولین بار ترکیب بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر بر خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و تولید تروپان آلکالوئیدها در ریشههای موئین بذرالبنج مشبک مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه سویههای باکتری: در این مطالعه از Agrobacterium rhizogenesسویه A4(بهعنوان کنترل) و Agrobacterium tumefaciens سویه (pRiA4-pBMI) C58C1 حامل ژن pmt جهت تولید ریشههای موئین بذرالبنج مشبک استفاده شد (شکل 2-الف). این دو سویه به ترتیب از بانک میکروبی مؤسسه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تهران و دانشگاه بارسلونا، اسپانیا تهیه شدند (36).
کشت بذر و تهیه ریز نمونه: ابتدا بذرهای گیاه بذرالبنج مشبک (تهیه شده از شرکت پاکان بذر اصفهان) با اسید سولفوریک 10 درصد به مدت 10 دقیقه خراشیده شدند. سپس بذرها با استفاده از اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه و محلول هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد کلر فعال به مدت 10 دقیقه ضد عفونی سطحی شدند. بذور ضدعفونیشده جهت جوانهزنی و تهیه ریزنمونه در محیط کشت MS (39) فاقد تنظیم کنندههای رشد گیاهی و دارای 7 گرم بر لیتر آگار کشت گردیدند. بذرها در دمای 24 درجه سانتیگراد و شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند.
تلقیح ریز نمونه و ظهور ریشه موئین: پس از کشت شبانه، هر دو نوع سویه باکتری (A4 و C58C1) با غلظت بهینه (OD600) بین 6/0 تا 8/0 جهت تلقیح در محیط کشت مایع Luria-Bertani (LB) حاوی ریفامپیسین (50 میلیگرم بر لیتر، برای هر دو سویه باکتری) و کانامایسین (50 میلیگرم بر لیتر، برای سویه C58C1) در شرایط تاریکی بر روی شیکر انکوباتور (120 دور در دقیقه در 25 درجه سانتیگراد) کشت شدند. پس از جدا کردن ریزنمونههای کوتیلدونی (ریزنمونه) توسط اسکالپل، روش اولتراسونیکElmasonic) ،Singen ، (Germanyبا فرکانس 120 هرتز و دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه جهت تلقیح بهتر ریزنمونهها با سویههای A4 و C58C1 استفاده گردید (46). پس از 2 روز، ریزنمونهها به محیط کشت MS جامد حاوی سفوتاکسیم (200 میلیگرم بر لیتر، برای هر دو سویه) و کانامایسین (100 میلیگرم بر لیتر، برای سویه C58C1) منتقل شدند. پس ازگذشت یک هفته، برای افزایش رشد ریشههای موئین در محیط کشت جامد، هر یک از ریزنمونههای ریشهدار به صورت تکی و لاینهای مجزا به محیط کشت MS جامد عاری از هورمون و حاوی سفوتاکسیم (100 میلیگرم در لیتر، برای هر دو سویه) و کانامایسین (100 میلیگرم بر لیتر، برای سویه C58C1) منتقل گردیدند. واکشت ریزنمونهها هر 2 هفته یکبار انجام شد. از میان 10 و 54 لاین ریشه موئین القاء شده به ترتیب توسط سویههای A4 و C58C1، لاینهای 6 و 13 بعنوان لاین پر رشد جهت انجام مراحل بعدی آزمایش انتخاب شدند (شکل 2-پ).
آنالیز مولکولی ریشههای مویین از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR): جهت اثبات حضور ژن rol B در ریشههای موئین از واکنش زنجیرهای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی ژن rol B استفاده شد. DNA ژنومی ریشههای موئین حاصل از هر دو سویه به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج گردید (16). واکنش در 94 درجه و 35 چرخه (هر چرخه شامل 1 دقیقه در 94 درجه، 80 ثانیه در 60 درجه و 90 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و تکمیل بسط در 10 دقیقه در دمای 72 درجه) انجام شد. محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد و بوسیله دستگاه ژل داک عکسبرداری شد. تکثیر قطعات bp780 ژن rol B با استفاده از آغازگر رفت F: 5´- TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3´ و برگشت R: 5´- TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3´ انجام شد.
تیمار ریشههای موئین با غلظت بهینه عصاره مخمر: عصاره مخمر از شرکت لیوفیلکم Liofilchem)) تهیه شد. غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلیگرم بر لیتر) (35) جهت تیمار ریشههای موئین هر دو سویه باکتری در محیط کشت MS مایع تهیه گردید. یک گرم از ریشههای موئین هر دو سویه باکتری به داخل ارلن مایرهای 250 میلیلیتری حاوی 10 میلیلیتر محیط کشت MS مایع در 3 تکرار، منتقل و داخل شیکر انکوباتور با 120 دور در دقیقه، دمای 25 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شدند (شکل 2-ت). پس از 21 روز، محیط کشت MS مایع حاوی غلظت بهینه عصاره مخمر به ارلنها اضافه گردید. پس از گذشت 48 ساعت از زمان تیمار، ریشههای موئین به محیط کشت MS مایع فاقد عصاره مخمر انتقال یافتند. پس از گذشت یک هفته، عمل برداشت ریشههای موئین صورت گرفت و بعد از شستشو با آب مقطر و حذف رطوبت اضافی ریشهها توسط کاغذ صافی، وزن تر اندازهگیری شد. پس از خشک شدن ریشهها توسط فریز درایر (به مدت 48 ساعت) وزن خشک اندازهگیری و ثبت شدند.
عصاره گیری جهت اندازهگیری صفات فیتوشیمیایی و ظرفیت آنتی اکسیدانی: یک گرم وزن تر از ریشههای موئین سویه A4 و C58C1 داخل هاون توسط ازت مایع پودر شدند و سپس به پودرهای ریشه موئین 20 میلیلیتر متانول 80 درصد اضافه شد. در نهایت عصاره گیری با استفاده از روش اولتراسونیک در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انجام شد (58).
اندازهگیری فنول و فلاونوئید کل: اندازهگیری فنول کل با استفاده از معرف فولین سیوکالتیو (Folin-Ciocalteu) به روش Slinkard و Singleton (47) اندازهگیری شد. 180 میکرولیتر از عصاره متانولی (80 درصد) استخراج شده از ریشههای موئین با 180 میکرولیتر آب مقطر و 1200 میکرولیتر فولین 10 درصد داخل لوله ِآزمایشی تمیز ریخته و در آخر به آن 960 میکرولیتر کربنات سدیم 7 درصد مقطر اضافه گردید. سپس لولههای شیشهای به مدت 30 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شد. میزان جذب در طول موج 760 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومترDynamica (HALODB-20) قرائت شد. منحنی استاندارد بر اساس اسید گالیک، ترسیم و نتایج به بر حسب میلیگرم گالیک اسید بر گرم وزن تر گزارش شد. در مورد فلاونوئید کل، 150 میکرولیتر از عصاره متانولی (80 درصد) استخراج شده از ریشههای موئین با 150 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد به مدت 5 الی 15 دقیقه در شرایط تاریکی قرار داده شد. سپس 300 میکرولیتر محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد و 1000 میکرولیتر استات پتاسیم 1 مولار اضافه نموده و جذب مخلوط در طول موج 380 نانومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد. میزان فلاونوئید کل عصارهها بر اساس میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر گزارش شد (15).
اندازهگیری آلکالوئید کل: سنجش آلکالوئید کل با استفاده از روش Ajanal و همکاران (6) با تغییرات جزئی اندازهگیری شد. 1 گرم از ریشههای موئین خشک شده پودر شدند و با 20 میلیلیتر متانول (80 درصد) به مدت 24 ساعت عصاره گیری شد. عصاره به دست آمده توسط کاغذ صافی فیلتر شد و جهت تبخیر متانول و تغلیظ عصاره از دستگاه روتاری با دمای 45 درجه سانتیگراد در تاریکی استفاده شد. پس از آن ، عصاره غلیظ شده در 1 میلیلیتر اسید کلریدریک (2N) حل و فیلتر شد. 1 میلیلیتر از این عصاره به دکانتور منتقل و با 10 میلیلیتر کلروفرم (pH=7 توسط NaoH=0.1 N) شسته شد. درنهایت 5 میلیلیتر معرف سبز بروموکروزول (Bromocresol green)، 5 میلیلیتر بافر فسفات (pH= 4.7) و 4 میلیلیتر کلروفرم به محلول اضافه شد و به شدت تکان داده شد. جذب نمونهها در 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی استاندارد از غلظتهای آلکالوئید هیوسیامین (4/0، 6/0، 8/0، 1 و 2/1 میلیلیتر) استفاده شد. میزان آلکالوئید کل بر اساس میکروگرم بر گرم وزن خشک گزارش شد.
اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش مهار رادیکال آزاد DPPH : برای اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش DPPH، 2 میلیلیتر از محلول DPPH به غلظتهای مختلف (200، 400 و 600 پی پی ام) عصاره ریشههای موئین اضافه شد. محلول حاصل را تکان داده و در دمای آزمایشگاه به مدت 30 دقیقه نگهداری شدند. جذب نمونهها در 517 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. منحنی استاندارد بر اساس غلظتهای مختلف اسید آسکوربیک (10، 20، 30، 40 و 50 پی پی ام) رسم شد. با استفاده از فرمول زیر فعالیت آنتیاکسیدانی تعیین گردید. جهت تهیه شاهد (Blank) نیز به روش بالا عمل و فقط به جای عصاره گیاهی، 50 میکرولیتر متانول 80 درصد اضافه شد (24).
RSA= [(Abs control – Abs sample)/Abs control] ×100
:Abs control میزان جذب بلنک، :Abs sample میزان جذب نمونه
اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی از طریق قدرت احیاءکنندگی آهن FRAP)): به منظور سنجش میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی ریشههای موئین به روش FRAP، 500 میکرولیتر از عصاره ریشههای موئین و 3 میلیلیتر معرف تازهFRAP (بافر استات سدیم 300 میلیمولار با اسیدیته 6/3، فریک- تری پریدیل- اس- تریازین (2,4,6-Tris(2-Pyridyl)-s-Triazine (TPTZ)) و فریک کلرید) با هم مخلوط شدند. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (دمای 37 درجه سانتیگراد) قرار گرفت و جذب آن در طول موج 593 نانومتر و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نسبت به شاهد خوانده شد. از سولفات آهن برای رسم منحنی استاندارد استفاده گردید و نتایج دادهها بر اساس میلیمول آهن II بر گرم وزن تر بیان شد (65).
عصارهی گیاهی جهت سنجش فعالیت آنزیمها: 5/0گرم از هر نمونه تازه (ریشههای حاصل از هر دوسویه) در نیتروژن مایع پودر شدند و در 2 میلیلیتر بافر استخراج حاوی 5/0درصد تری هیدروکلراید (Tris HCL) و 05/0 درصد پلی وینیل پیرولیدون (PVP) در pH=8 حل شد. عصاره حاصل سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از جداسازی ، از مایع رویی برای اندازهگیری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان استفاده شد (49).
فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD): سنجش فعالیـت آنـزیم سوپراکسـید دیسـموتاز بـا روش Giannopolitisو Ries (18) و به کمک سنجش مهار احیای نوری (Photoreduction) نیتروبلوتترازولیوم (NBT) در طــول مــوج 560 نانومتر، انجام گرفت. برای هر نمونه ، 50 میکرولیتر عصاره به لولههای حاوی 1 میلیلیتر بافر واکنش (متشکل از 50 میلی مولار بافر فسفات (pH=7)، 13 میلی مولار ال-متیونین، 1/0 مولار EDTA، 75 میکرومولار NBT و 2 میکرومولار ریبوفلاوین) اضافه شد. پس از قرار گرفتن لولهها به مدت 15 دقیقه در معرض نور، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نمونه قرائت گردید. یـک واحد آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز، مقدار آنزیمی اسـت کـه موجب 50 درصـد ممانعـت از احیـای نوری NBT مـیگـردد.
فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): فعالیت آنزیم کاتالاز با روش Aebi (5) در 240 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. برای هر نمونه، 5 میکرولیتر عصاره (25 برابر رقیق شده) به لولههای حاوی 5/2 میلی لیتربافر فسفات (50 میلی مولار در pH=7) و 20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (3 درصد) اضافه شد. یک واحد آنزیمی کاتالاز، مقدار آنزیمی است که 1 میلیمولار H2O2 را در یک دقیقه تجزیه میکند.
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX): فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با روش Nakano و Asada (40) در 290 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. برای هر نمونه، 100 میکرولیتر عصاره به لولههای حاوی 2 میلیلیتر بافر فسفات (50 میلی مولار در pH=7، 20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (5 درصد) و 10 میکرولیتر اسید اسکوربیک (50 میکرومول) اضافه شد. فعالیت آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان اسید اسکوربیک اکسید شده در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه تعیین شد
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX): فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با روش Mac-Adam و همکاران (32) در 436 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. 100 میکرولیتر عصاره به لولههای حاوی 3 میلیلیتر بافر فسفات (1/0 مولار در pH=7)، 50 میکرولیتر گایاکول و 50 میکرولیتر پراکسید هیدروژن ( 3 درصد) اضافه شد. میزان فعالیت آنزیم بر حسب تغییرات واحد جذب در دقیقه به ازای هر گرم وزن تر محاسبه گردید.
عصاره گیری آلکالوئیدها: استخراج تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین موجود در ریشههای موئین حاصل از دو سویه باکتری به روش Kamada و همکاران (25) با اندکی تغییر انجام شد. بر اساس این روش، مقدار 5/0 گرم از ریشههای موئین خشک، پودر و کلروفرم، متانول و آمونیاک 25 درصد، به نسبتهای 15 :5 :1 به نمونههای پودر شده اضافه و به مدت 10 دقیقه با اولتراسونیک عصاره گیری شدند. پس از عبور از صافی و دو مرتبه شستشوی کاغذ صافی با 1 میلیلیتر کلروفرم، برای تبخیر فاز کلروفرمی از دستگاه تبخیر کننده دوار (روتاری اواپراتور) (Rotary evaporator) استفاده گردید. به عصارههای باقی مانده و خشک شده، 5 میلیلیتر کلروفرم و 2 میلیلیتر اسید سولفوریک 1 نرمال اضافه و کاملا هم زده شدند. در مرحله بعد مخلوط به دست آمده داخل دکانتور ریخته شد که باعث تشکیل دو فاز شد. فاز کلروفرمی (فاز پایینی) جدا و دور ریخته شد و فاز آبی حاوی آلکالوئیدها به یک بشر منتقل شد و pH آن روی یخ و به وسیله ی آمونیاک 28 درصد تا 10 تنظیم گردید محلول قلیایی داخل دکانتور اضافه شد و آلکالوئیدها یک مرتبه توسط 2 میلیلیتر و دو مرتبه توسط 1 میلیلیتر کلروفرم استخراج شدند. فاز کلروفرمی به دست آمده پس از افزودن سولفات سدیم خشک به منظور حذف آب اضافی موجود، از صافی عبور داده شده و کاغذ صافی توسط 1 تا 2 میلیلیتر کلروفرم شستشو داده شدند. در نهایت محلول صاف شده به وسیله روتاری اواپراتور در دمای 40 درجه سانتیگراد تبخیر و ماده جامد به دست آمده که آلکالوئید کل نامیده میشود در 1 میلیلیتر متانول خالص حل شد.
آنالیز تروپان آلکالوئیدها به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC): بهمنظور سنجش میزان تروپان آلکالوئیدها (هیوسیامین و اسکوپولامین) در عصاره های استخراجی از ریشههای موئین دو سویه باکتری، از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، مدل Smartline(Knauer، آلمان) با آشکارساز PDAمدل K-2800 با طول موج 215 نانومتر استفاده شد. ستون مورد استفاده C-18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) بود. سرعت جریان حلال 4/1 میلیلیتر بر دقیقه بود و فاز متحرک شامل استونیتریل و بافر استات به نسبتهای 20:80 بود. مقدار عصاره استفاده شده برای هر تزریق 20 میکرولیتر و جمع آوری و پردازش داده ها توسط نرم افزارEZChrom Elite انجام شد. میزان دو آلکالوئید هیوسیامین و اسکوپولامین بر اساس سطح زیر منحنی به دست آمده با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد.
آنالیز آماری دادهها: برای مقایسه و تحلیل دادهها از نرم
افزار SAS 9.4 و آزمون T-test جفت نشده استفاده گردید. نمودارها با استفاده از نرم افزاR رسم شدند.
نتایج
تأیید حضور ژن rol B در ریشههای موئین: نتایج آنالیز الکتروفورز ژل آگارز 1درصد محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز برای ریشههای موئین تراریخت احتمالی، حضور قطعه با اندازه حدودی bp780 مربوط به ژن rol B را در ریشههای موئین حاصل از تلقیح ریزنمونههای کوتیلدونی با سویه A4 ازAgrobacterium rhizogenes و سویه C58C1 از Agrobacterium tumefaciens تأیید نمود که هماندازه قطعه تکثیر شده در نمونه کنترل مثبت (هر دو سویه آگروباکتریوم مورد استفاده در تلقیح) بود. همچنین در DNA حاصل از ریشههای طبیعی گیاه بذرالبنج مشبک و محصول واکنش PCR بدون DNA الگو (بهعنوان کنترل منفی)، هیچ باند تکثیری مشاهده نگردید. به عبارت دیگر، حضور باند قوی در منطقه bp780 مؤید تکثیر قطعه مورد بررسی و حضور ژن rol B در ریشههای موئین بود (شکل 1).
شکل 1- الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تأیید حضور ژن rol B در ریشههای تراریخت: L: DNA مارکر (1 kb ladder Fermentas)، A4: Agrobacterium rhizogenes بهعنوان کنترل مثبت، C58C1: Agrobacterium tumefaciens بهعنوان کنترل مثبت، WT: ریشههای طبیعی بذرالبنج مشبک بهعنوان کنترل منفی، C: محصول واکنش PCR بدون DNA الگو، 1: ریشههای موئین القا شده با سویه A4،2 : ریشههای موئین القا شده با سویه C58C1
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم و غلظت بهینه عصاره مخمر بر رشد ریشههای موئین: در ریزنمونههای کوتیلدونی تلقیح شده با سویه A4 و C58C1 به ترتیب بعداز 4 و 2 هفته ریشههای موئین از محل زخم ظاهر شدند (شکل 2-ب). نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان وزن تر و خشک ریشههای موئین نشان داد که وزن تر (09/0±02/2 گرم) و خشک (01/0±18/0گرم) ریشههای موئین حاصل از سویه A4 در مقایسه با ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 (وزن تر= 03/0±76/5 گرم، وزن خشک= 00/0±41/0گرم) از لحاظ آماری به طور معنیداری در سطح احتمال یک درصد کمتر است (جدول 1).
شکل 2-الف- واکشت Agrobacterium rhizogenes سویه A4 (1) و Agrobacterium tumefaciens سویهC58C1 (2)، ب: ظهور ریشههای موئین از ریز نمونههای تلقیح یافته با آگروباکتریوم، پ: رشد ریشههای موئین در محیط کشت جامد و ت: کشت ریشههای موئین در محیط کشت مایع.
جدول 1- تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر صفات رشدی و فیتوشیمیایی ریشههای موئین بذرالبنج مشبک و آزمون T-test جفت نشده
±میانگینSE (انحراف معیار میانگین نمونه) |
|||||
نوع سویه |
وزن تر (گرم) |
وزن خشک (گرم) |
فنول کل (میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن تر) |
فلاونوئید کل میلی گرم کوئرستین بر گرم وزن تر) |
آلکالوئید کل (میکروگرم بر گرم وزن خشک) |
سویه A4 |
2.02±0.09 |
0.18±0.01 |
4.20±0.05 |
1.04±0.02 |
46.81±0.26 |
سویه C58C1 |
5.76±0.03 |
0.41±0.00 |
7.32±0.05 |
1.84±0.05 |
82.87±0.40 |
مقدار آماره t |
**-36.23 |
**-13.04 |
-42.05** |
-14.56** |
-75.26** |
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان فنول و فلاونوئید: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان فنول و فلاونوئید کل ریشههای موئین نشان داد که میانگین فنول (05/0±32/7 میلیگرم اسید گالیک بر گرم وزن تر) و فلاونوئید کل (05/0±84/1 میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر) در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بیشتر از میانگین فنول (05/0±20/4 میلیگرم اسید گالیک بر گرم وزن تر) و فلاونوئید کل (02/0±04/1 میلیگرم کوئرستین بر گرم وزن تر) ریشههای موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود. (جدول 1). طبق نتایج به دست آمده، میزان افزایش فنول و فلاونوئید کل در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بهترتیب 74/1 و 76/1 برابر نسبت به ریشههای موئین کنترل افزایش یافت.
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان آلکالوئید کل: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان آلکاوئیدکل ریشههای موئین نشان داد که میانگین آلکالوئیدکل (40/0±87/82 میکروگرم بر گرم وزن خشک: ) در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 77/1 برابر بیشتر از میانگین آلکالوئید کل (26/0±81/46 میکروگرم بر گرم وزن خشک) ریشههای موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود. (جدول 1).
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش DPPH : نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان IC50 ریشههای موئین نشان داد که میانگین IC50 (02/62±0/1 میکروگرم بر میلیلیتر) در ریشههای حاصل از سویه C58C1 کمتر از میانگین IC50 (03/12±0/2 میکروگرم بر میلیلیتر) ریشههای موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود (جدول 2). این موضوع نشان میدهد که ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با ریشههای حاصل از A4 فعالیت آنتیاکسیدانی بیشتری از خود نشان میدهد (جدول 2).
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش FRAP : نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش FRAP ریشههای موئین نشان داد که میانگین ظرفیت آنتیاکسیدانی به روش FRAP (16/77±0/14 میلیمول آهن II بر گرم وزن تر) در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بیشتر از میانگین ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP (11/71±0/11 میلیمول آهن II بر گرم وزن تر) ریشههای موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود (جدول 2).
جدول 2- تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH و FRAP ریشههای موئین بذرالبنج مشبک و آزمون T-test جفت نشده
±میانگینSE (انحراف معیار میانگین نمونه) |
||
نوع سویه |
ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش DPPH (میکروگرم بر میلیلیتر) |
ظرفیت آنتی اکسیدانی به روش FRAP (میلی مول آهن II بر گرم وزن تر ) |
سویه A4 |
2.12±0.03 |
11.71±0.11 |
سویه C58C1 |
1.62±0.02 |
14.77±0.16 |
مقدار آماره t |
**11.97 |
**-15.50 |
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی: نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز ریشههای موئین نشان داد که میانگین فعالیت آنزیمهای اکسیدانی SOD)، CAT، APX و (GPX در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بهترتیب 45/2، 30/1، 82/1 و 18/2 برابر بیشتر از میانگین آنزیمهای آنتیاکسیدانی ریشههای موئین حاصل از سویه A4 بود که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود (شکل3).
شکل 3- تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی، الف: سوپراکسید دیسموتاز، ب: کاتالاز، ت: آسکوربات پراکسیداز، پ: گایاکول پراکسیداز
تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها: کروماتوگرام مربوط به استاندارد ترکیبات هیوسیامین و اسکوپولامین و همچنین کروماتوگرامهای مربوط به عصاره ریشههای موئین دو سویه A4 و C58C1 تیمار شده با غلظت بهینه عصاره مخمر در شکل 4 آورده آمده است. نتایج مقایسه میانگین تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید هیوسیامین و اسکوپولامین ریشههای موئین نشان داد که میانگین تولید هیوسیامین (75/3±66/76 میکروگرم بر گرم وزن خشک) و اسکوپولامین (88/0±30/102 میکروگرم بر گرم وزن خشک) در ریشههای موئین حاصل از سویه A4 کمتر از میانگین تولید هیوسیامین (76/1±30/105 میکروگرم بر گرم وزن خشک) و اسکوپولامین (45/1±70/137 میکروگرم بر گرم وزن خشک) ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بود (شکل5) که این تفاوت از لحاظ آماری در سطح یک درصد معنیدار بود (شکل 5). طبق نتایج به دست آمده، میزان افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 بهترتیب 37/1 و 34/1 برابر نسبت به ریشههای موئین کنترل افزایش یافت.
بحث و نتیجه گیری
در این مطالعه، مقایسه دو سویه مختلف باکتری آگروباکتریوم (سویه A4 از A. rhizogenes و سویه C58C1 ازA. tumefaciens) بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی گرم بر لیتر) بعد از 48 ساعت بهعنوان محرک زیستی نشان داد که وزن تر و خشک ریشههای موئین حاصل از سویهC58C1 نسبت به سویه A4 بهطور مؤثری در گیاه بذرالبنج مشبک تحت تأثیر عصاره مخمر قرار گرفت. اختلاف در مورفولوژی و میزان رشد ریشههای مونین را میتوان به تنوع پلاسمیدهای وارد شده توسط سویههای مختلف باکتری نسبت داد که به چگونگی تاثیر ژنهای rol مربوط میشود. بیان این ژنها˓ سطح هورمونهای اکسین و سیتوکینین گیاه میزبان و نیز میزان حساسیت سلولهای گیاهی به سطح هورمون رشد را تغییر میدهند (53).
شکل 4-الف- کروماتوگرام پیکهای استاندارد حاصل از دستگاه HPLC تروپان آلکالوئیدها، ب: کروماتوگرام ریشههای موئین القا شده با سویه A4 و پ: کروماتوگرام ریشههای موئین القا شده با سویه C58C1
شکل 5- تأثیر سویههای مختلف آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها، الف: هیوسیامین ب: اسکوپولامین
همچنین دلیل دیگر این تفاوتها، بیان متفاوت ژنهای
T-DNA ریشههای تراریخته، تعداد کپیهای متعدد T-DNA وارد شده و اثرات محل ورود T-DNA به ژنوم گیاه میباشد (7).
در این مطالعه، مقایسه تأثیر سویههای مختلف باکتری آگروباکتریوم بهمراه غلظت بهینه عصاره مخمر (250 میلی گرم بر لیتر) بعد از 48 ساعت بهعنوان محرک زیستی نشان داد که سویه C58C1 در ریشههای موئین به طور مؤثری میزان تولید و تجمع ترکیبات فیتوشیمیایی به ویژه فنول و فلاونوئید کل، آلکالوئید کل، هیوسیامین و اسکوپولامین را نسبت به سویه A4 تحت تأثیر قرار داد. از دلایل افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در ریشههای موئین ممکن است انتقال T-DNAی باکتری آگروباکتریوم و اختلال در مسیر بیوسنتز ترکیبات با ارزش باشد (4). به طور کلی تولید انبوه و سریع متابولیتهای ثانویه در مقیاس بالا با استفاده از روشهای شیمیایی مشکل و یا غیرممکن میباشد (41). از راهبردهای متعددی برای بهبود تولید متابولیتها میتوان به کشت بافت گیاهی، استفاده از پیش سازها، کاربرد انواع محرکها و مهندسی ژنتیک اشاره کرد که راه حلی مناسب و ارزان برای تولید آسان و انبوه متابولیتهای ثانویه میباشد (59).
سه آنزیم مهم در مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها شامل هیوسیامین -6- بتا هیدروکسیلاز (H6H)، تروپینون ردوکتاز (TR-I) و پوترسین N- متیل ترانسفراز(PMT) هستند (45). بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها مانند هیوسیامین و اسکوپولامین با تشکیل یون N- متیل پیرولینیوم از آمینواسیدهای اورنیتین وآرژنین آغاز میشود. پوترسین N- متیل ترانسفراز (PMT) آنزیم دخیل در برداشت پوترسین از مخزن پلی آمین میباشد و -N متیلاسیون دی آمین را به شکل N- متیل پوترسین کاتالیز میکند. این مرحله اولین مرحله مشترک در بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها و نیکوتین میباشد و منجر به تولید یک ترکیب حدواسط دارای بارمثبت (N- متیل پیرولینیوم) میگردد. سپس مسیر تروپان آلکالوئیدها از مسیر تولید نیکوتین جدا میشود. آخرین مرحله در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها، توسط آنزیم هیوسیامین-6- بتا هیدروکسیلاز انجام میشود. در این مرحله، آنزیم هیوسیامین 6- بتا هیدروکسیلاز، هیدروکسیلاسیون هیوسیامین را به 6- بتا هیدروکسی هیوسیامین و نیز اپوکسیداسیون 6- بتا هیدروکسی هیوسیامین را به اسکوپولامین (هیوسین)، کاتالیز میکند (63). Kohnen-Johannsen و Kayser(28) نشان دادند که بیش بیانی ژنهای درگیر در فعالسازی آنزیمهای کلیدی در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها منجر به تجمع تولید این ترکیبات میشوند. علاوه بر این، استفاده از عصاره مخمر بعنوان محرک میتواند فعالیت آنزیم پوترسین متیل ترانسفراز PMT)) و به دنبال آن ظرفیت سنتز تروپان آلکالوئیدها رو به دلیل محتوی یون کلسیم (Ca) تنظیم میکند (43). در این مطالعه از یک طرف، کاربرد Agrobacterium tumefaciens سویه C58C1 بهعنوان حامل ژن pmt و از طرف دیگر تیمار با عصاره مخمر، احتمالا در میزان فعالیت آنزیمهای کلیدی مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها مانند H6H و PMT مؤثر بوده و به طور مستقیم یا غیر مستقیم، بیان ژنهایpmt و h6h را تحت تأثیر قرار داده و موجب افزایش تروپان آلکالوئیدها میشوند. گزارشات مختلف نشان میدهد میزان تجمع تروپان آلکالوئیدها با بیش بیانی ژنهایpmt و h6h در کشت ریشههای موئین شابیزک (Atropa belladonna) بهبود یافت (60 و 31). همچنین مطالعات مختلف نشان میدهند که عصاره مخمر نقش مؤثری در افزایش تولید هیوسیامین و اسکوپولامین در کشت ریشه موئین بذرالبنج مشبک
(H. reticulatus L.) (35)، اسکوپولامین در کشت ریشه موئین بنگ دانه (H. niger L.) (21)، سیلی مارین در کشت سوسپانسیون سلولی خار مریم (S. marianum) (3)، ایزوفلاونوئید کل در ریشههای موئین(P. candollei) (55) داشته است.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تیمار با غلظت بهینه عصاره مخمر منجر به افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی به دو روش DPPH و FRAP در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با سویه A4 شد. ظرفیت آنتیاکسیدانی با استفاده از روش DPPH یک روش ساده، سریع و حساس برای ارزیابی فعالیت آنتیاکسیدانها جهت مهار رادیکالهای آزاد است (27). IC50 غلظت لازم برای مهار 50 درصد رادیکالهای آزاد را نشان میدهد (24). بین مقدار IC50 و فعالیت آنتیاکسیدانی رابطهی معکوسی وجود دارد (30). در روشFRAP ترکیبات آنتیاکسیدانی با Ferric tri-pyridyl-triazine complex (Fe (III)-TPTZ) واکنش میدهند و موجب ایجاد رنگ آبی میشوند (20). افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی بالا در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 با هر دو روش DPPH و FRAP را میتوان با افزایش تجمع متابولیتهای ثانویه از جمله فنول، فلاونوئید و آلکالوئیدکل توضیح داد (23). جامی و همکاران (2) گزارش کردند با افزایش تولید ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در گیاه نوروزک (Salvia leriifolia Benth.)، فعالیت آنتی اکسیدانی نیز با هر دو روش FRAP و DPPH افزایش یافت.
نتایج آنالیز دادهها نشان داد که تیمار با غلظت بهینه عصاره مخمر منجر به افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با سویه A4 شد. در روابط گیاه-میکروب، دو سیستم دفاع آنتیاکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی وجود دارد (17). آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز از جمله مهم ترین آنزیمهای آنتیاکسیدانی هستند که مستقیماً با رادیکالهای اکساینده واکنش نمــوده و آنها را به فرآوردههای غیــر رادیـــکالی تـــبدیل مینمایند (61). سوپراکسید دیسموتاز یکی از مهمترین آنزیمهای آنتیاکسیدانی است که از اکسیده شدن غشای لیپیدها جلوگیری میکند و در تبدیل سوپراکسید (O2−•) به پراکسید هیدروژن (H2O2) نقش دارد (22). آنزیم کاتالاز در پراکسیزومها و گلیاکسیزومهای گیاهی حضور دارد و نقش تجزیهکننده H2O2 تولید شده طی تنفس نوری در پراکسیزومها یا H2O2 تولید شده طی بتا اکسیداسیون اسیدهای چرب در گلیاکسیزومها را برعهده دارد. این آنزیم برای انجام فعالیت خود به نیروی احیایی نیاز ندارد. افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز یک پاسخ سازشی برای غلبه بر آسیبهای ناشی از سطوح بالا، سمی و احیاکننده H2O2 میباشد که طی متابولیسم سلول تولید میگردد. آسکوربات پراکسیداز نقش کلیدی در پاکسازیROS و حفاظت سلولها در مقابل اثرات مخرب آنها در گیاهان عالی دارد (34). آسکوربات پراکسیداز، یک پراکسیداز اختصاصی میباشد که H2O2 را از طریق چرخه آسکوربات-گلوتاتیون با کمک اسیدآسکوربیک به آب و مونو دهیدور آسکوربات تجزیه مینماید (42). یکی دیگر از آنزیمهای اکسیدکننده ترکیبات فنولی آنزیم گایاکولپراکسیداز میباشد که نقش مهمی در افزایش دفاع آنتیاکسیدانی دارد. گایاکول پراکسیدازها گلیکوپروتئینهایی هستند که ترکیبات فنولی را مانند یک دهنده هیدروژن مصرف کرده و در فرآیندهای نمو، بیوسنتز اتیلن، لیگنینسازی، دفاع و التیام زخمها شرکت میکنند (56). در این مطالعه میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در ریشه های موئین حاصل از سویه C58C1 در مقایسه با کنترل افزایش یافته است که این افزایش ممکن است دو دلیل داشته باشد: 1- سطح بالای بیان ژن T-DNA از طریق
A. tumefaciens در مقایسه با A. rhizogenes (14) 2- تولید بیشتر ROS در این غلظت از عصاره مخمر و مقابله گیاه با این ROSها با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی باشد. نتایج تحقیق Ara و همکاران (10) نشان داد با بیش بیانی ژنهای FeSOD و MnSOD در ساقه و ریشه دو گونه مختلف خیار Cucurbita maxima) و
(Cucurbita moschata میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافت. فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشه موئین بذرالبنج مشبک(Hyoscyamus reticulatus L) بوسیله عصاره مخمر (250 میلیگرم برعصاره مخمر بعداز 24 ساعت) افزایش یافت (35). در گیاهچههای سویا (Glycine max) در اثر تیمار با غلظتهای مختلف عصاره مخمر (1/0، 2/0 و 5/0 درصد) به مدت 8 ساعت میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافته است (11).
در کل با توجه به نتایج مطالعه حاضر میتوان گفت که ترکیب بیش بیانی ژن pmt و استفاده از غلظت بهینه عصاره مخمر در مدت زمان تیمار 48 ساعت باعث افزایش رشد ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 نسبت به سویه A4 گردید. میزان تولید و تجمع ترکیبات فیتوشیمیایی از جمله فنول، فلاونوئید و آلکالوئید کل و به دنبال آن ظرفیت آنتیاکسیدانی در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 را بیشتر از ریشههای موئین سویه A4 افزایش داد. همچنین، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی شامل سوپر اکسیددیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 نسبت به سویه A4 افزایش یافت. نتایج آنالیز HPLC نیز نشان داد که تحت تأثیر بیش بیانی ژن pmt و غلظت بهینه عصاره مخمر میزان تولید و تجمع هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشههای موئین حاصل از سویه C58C1 افزایش قابل توجهی داشتند. بنابراین، ترکیب بیش بیانی و محرک میتواند بعنوان یک روش موفق آمیز جهت بهبود تولید تروپان آلکالوئیدها در شرایط درون شیشهای باشند.
سپاسگزاری
بدین وسیله نویسندگان مقاله حاضر از کارشناسان آزمایشگاههای گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه و کارشناسان بخش آنالیز دانشگاه شهید بهشتی جهت همکاری ارزشمندشان صمیمانه تشکر و امتنان را دارند. همچنین از تمام افرادی که در انجام این مطالعه ما را راهنمایی نمودند قدردانی میشود.