Document Type : Research Paper
Authors
1 Assistant professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran
2 Associate professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran
3 Research expert, Fars agricultural and natural resources research center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO),Shiraz, I.R. of Iran
Abstract
In this study, antimicrobial effects of two accession of Thymus fedtschenkoi originated from Semnan and Zanjan against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Bacillus subtilis were investigated. The essential oil was extracted by Clevenger apparatus and compounds identified by GC and GC-MS instruments. Disc diffusion and microdilution methods were used to determine antimicrobial activity. The experiment was done on factorial design based on complete randomized design. The effect of microorganism type (as first factor) and essential oil concentration and antibiotics (as second factor) and their interaction was evaluated. According to the results, essential oil yield was %0.73 and %0.95 in Zanjan and %0.83 and %0.86 in Semnan accession in two successive years. The main chemical compounds of Zanjan accession was p-cymene, linalool, thymol and carvacrol and Semnan accession was p-cymene, thymol and carvacrol. Statistical analysis showed that the effect of microorganism type, essential oil concentration and their interaction on inhibition zone was significant at 1% level. In Semnan accession, the highest diameter of inhibition zone was observed in C. albicans and in dilution of one fifth of essential oil. C. albicans and B. subtilis had the most sensivity to Zanjan accession and C. albicans to Semnan accession. The observed difference in antimicrobial effects can be related to difference in chemical composition and their activity.
Keywords
Main Subjects
بررسی اثرات ضدمیکروبی و ترکیبهای شیمیایی اسانس جمعیتهای
Thymus fedtschenkoi Ronniger در دو استان سمنان و زنجان
فاطمه عسکری1*، ابراهیم شریفی عاشورآبادی1، مریم تیموری1 و عاطفه بهمنزادگان2
1 ایران، تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور،
2 ایران، شیراز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مرکز تحقیقات منابع طبیعی استان فارس
تاریخ دریافت: 22/06/1399 تاریخ پذیرش: 07/09/1400
چکیده
در این مطالعه اثرات ضدمیکروبی دو اکسشن از گونه Thymus fedtschenkoi از استانهای زنجان و سمنان بر ضد باکتریهای Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis و قارچ Candida albicans بررسی شد. استخراج اسانس با دستگاه کلونجر و شناسایی ترکیبها با استفاده از دستگاههای GC و GC-MS صورت گرفت. برای بررسی اثرات ضدمیکروبی از روش انتشار از دیسک و روش رقتسازی در لوله استفاده شد. آزمایش اثرات ضدمیکروبی اسانس در قالب طرح فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با دو عامل میکروارگانیسم (عامل اول) و رقت اسانس (عامل دوم) انجام شد. براساس نتایج، بازده اسانس در دو سال برداشت در اکسشن زنجان (95/0 و 73/0 درصد) و اکسشن سمنان (83/0و 86/0 درصد) بود. ترکیبهای عمده در اکسشن زنجان شامل پارا-سیمن، لینالول، تیمول و کارواکرول و در اکسشن سمنان پارا-سیمن، تیمول و کارواکرول بود. نتایج آنالیز واریانس و مقایسه میانگین دادههای ضدمیکروبی نشان داد که اثر نوع میکروارگانیسم و رقت اسانس و اثر متقابل این دو عامل بر میانگین قطر هاله عدم رشد در سطح 1% معنیدار بود. در اکسشن سمنان بیشترین قطر هاله ممانعت از رشد در گونه C. albicans و در رقت یک پنجم اسانس مشاهده شد. میکروارگانیسمهای C. albicans و B. subtilis به اکسشن زنجان و C. albicans به اسانس اکسشن سمنان حساسیت بیشتری از خود نشان دادند. تفاوت در حساسیت میکروارگانیسمها میتواند ناشی از تفاوت در ترکیبهای تشکیل دهنده اسانس و اثرات ضدمیکروبی اجزای تشکیل دهنده آن باشد.
واژه های کلیدی: آویشن، اسانس، زنجان، سمنان، ضدمیکروبی
* نویسنده مسئول، تلفن: 5-44580282، پست الکترونیکی: fasgari@rifr-ac.ir
مقدمه
بروز مقاومتهای دارویی علیه آنتیبیوتیکها و گسترش جهانی این مشکل که درمان برخی از عفونتها را با مشکلات جدی مواجه میکند باعث شده است که محققان بدنبال یافتن ترکیبهای جدید با اثرات ضدمیکروبی قوی برای مقابله با این مشکل باشند. گیاهان دارویی از جمله منابعی هستند که برای تولید ترکیبات ضدمیکروبی جدید میتوانند مورد استفاده قرارگیرند (24). ترکیبهای طبیعی جدا شده از گونه های مختلف جنس تیموس از جمله اسانسها خواص ضد میکروبی، ضد قارچی و ضد ویروسی دارند (25).
آویشن یا Thymus یکی از جنسهای خانواده نعنا است. در حدود 215 گونه از این جنس شناسایی شده است که 18 گونه آن در ایران رویش دارد (19،11). آویشنها گیاهانی چند ساله به فرم بوتهای و کپهای هستند. ساقه آنها چهار گوش است و سطح ساقه و برگ پوشیده از کرکهای محافظتی میباشد. کرکهای غدهای که محل انباشتگی اسانس هستند در سطح گل، برگ و گاهی ساقه مشاهده میشوند. گونههای آویشن در مناطق مدیترانه گسترش یافتهاند. گونه Thymus fedtschenkoi در ترکیه، قفقاز و ایران میروید و یکی از گونههای بومی آویشن در ایران است. این گونه در مناطق کوهستانی خزری و ایرانی تورانی در ارتفاع 250 تا 3750 متری در استانهای مازندران، گیلان، گلستان، آذربایجان، تهران، قزوین و کردستان رویش دارد (11). ترکیبهای عمده اسانس این گونه شامل تیمول و کارواکرول (3،6،10) است و گاهی اوقات لینالول (16، 21) و ترپینیل استات (17) نیز به عنوان ترکیب غالب گزارش شده است. از گونههای آویشن به ویژه گونه Th. fedtschenkoi برای درمان سرماخوردگی و عفونتهای دستگاه تنفسی و نیز به عنوان طعم دهنده و نگهدارنده مواد غذایی استفاده میشود.
محتوای اسانس گیاهان دارویی و فعالیت زیستی آنها براساس روشهای مختلف کشت، خاستگاه، مرحله رویشی و فصل رویش تغییر میکند (5). فعالیت ضدمیکروبی گونههای مختلف آویشن در تحقیقات متعدد مطالعه شده است و به نظر میرسد تیمول مسئول ویژگیهای ضدمیکروبی اسانس آویشن باشد. در مطالعه مقایسهای ترکیبهای شیمیایی و فعالیت آنتیاکسیدانی و ضدمیکروبی انواع خودرو (وحشی) و کاشته شده گونه Th. fedtschenoi از آذربایجانشرقی مطالعه شد. ترکیبهای عمده نمونه خودرو شامل تیمول (21 تا 49 %)، پاراسیمن (20 تا 15 %)، کارواکرول (10 تا20 %) و ترکیبهای اصلی در نمونه کشت شده شامل تیمول (33/62 %) و کارواکرول (12/7 %) بود. شاخص MIC برای نمونه خودرو بین g/mlµ128-2 و نمونه کشت شده g/mlµ16-2 بود (12). در مطالعه دیگری خواص ضدمیکروبی اسانس و عصاره گونه Th. daenesis بر ضد Candida albicans، Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Klebsiella pneumonia تائید شده است (7). در تحقیقی اثرات ضدمیکروبی و ترکیب شیمیایی اسانس گونه آویشن دنایی مطالعه شد. ترکیبهای عمده شامل تیمول (8/29 %)، کارواکرول (6/13 %)، پاراسیمن (3/11 %)، بورنئول (8/6 %)، 1، 8-سینئول (89/5 %) بود. فعالیت ضدمیکروبی اسانس بر ضد باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی و سه قارچ با استفاده از روش انتشار از دیسک مطالعه شد. نتایج این مطالعه نشان داد که باکتری S. aureus حساسترین باکتری به اسانس است و اسانس این گونه فعالیت ضدقارچی بر ضد همه قارچهای مورد آزمون نشان داده است (23). در تحقیق دیگری فعالیت ضدمیکروبی گونه
Th. fedtschenkoi با استفاده از آزمونهای MBC و MIC تائید شده است (4). اثرات ضدمیکروبی Th. kotschyanus بر ضد K. pneumonia تائید شده است. تاثیر اسانس بر
S. aureus و Staphylococous epidermidis یکسان ولی کمتر ازK. pneumonia گزارش شد (14). اثرات ضدباکتریایی اسانس گیاه Th. trautvetteri ، روی 7 باکتری نشان داد که اثر بازدارنده اسانس بر رشد باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت بسیار خوب بوده است. حساسترین باکتری S aureus با MIC برابر µg/ml 125 بود (22). در مطالعهی دیگر ترکیبهای شیمایی در مراحل مختلف رویشی و اثرات ضد میکروبی اسانس
Th. caramanicus بر ضد باکتریهای مختلف مطالعه شد. بر اساس نتایج این مطالعه، کارواکرول، پارا-سیمن، گاما-ترپینن، تیمول و بورنئول ترکیبهای غالب اسانس در این گونه بودند و اسانس این گونه اثرات ضد میکروبی را در مراحل مختلف رشد نشان داد. همچنین حساسترین باکتری به اسانس این گونه Bacillus subtilis و مقاومترین باکتری Pseudomonas aeruginosa بود (20). علاوه بر گونه های آویشن سایر گونه های جنس نعنا شامل گونه های مختلف مرزه، اسطوخودوس و رزماری دارای فعالیت ضد باکتری و ضد قارچ هستند (1 و 2)
هدف از این مطالعه تعیین اثرات ضدمیکروبی اسانس
Th. fedtschenkoi دو اکسشن زنجان و سمنان، بر ضد باکتریهای Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis و قارچ Candida albicans، تعیین مقادیر MIC و MBC و مقایسه اثر اسانس با آنتیبیوتیکهای Ceftizoxime و Ciprofloxacin بود.
مواد و روشها
روش بررسی یافته ها
کشت گیاهان: بذر دو اکسشن از گونه Th. fedtschenkoi از رویشگاههای طبیعی آن در استانهای سمنان و زنجان جمعآوری شد و در مزرعه گیاهان دارویی باغ گیاهشناسی ملی ایران کشت گردید. نمونههای هرباریومی توسط سرکار خانم دکتر جمزاد شناسایی و در هرباریوم بخش گیاهشناسی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور نگهداری شد.
استخراج اسانس و شناسایی ترکیبها: از سرشاخه های گلدار در مرحله گلدهی کامل، به روش تفطیرباآب اسانس گیری شد. درصد و نوع ترکیبهای موجود در اسانس با استفاده از گاز کروماتوگرافی (GC) و گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) شناسایی شدند (18)
بررسی اثر ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک (Disk diffusion method): باکتریهای Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa وBacilus subtilis و قارچ Candida albicans در محیط کشت تریپتوکیسسوی آگار (ساخت شرکت مرک) به مدت 18 ساعت کشت شدند. غلظت معینی از باکتریها معادل استاندارد شماره 1 مکفارلند (7) در محیط کشت تریپتوکیس سوی برات تهیه گردید. ml 500 از سوسپانسیون میکروبی به محیط کشت تریپتوکیس سوی آگار منتقل و با سواپ استریل به شکل یکنواخت بر روی سطح پخش شدند اسانسهای هر کدام از نمونهها، با استفاده از دیمتیل سولفوکساید (DMSO) که فاقد اثر ضدمیکروبی است به نسبتهای یکپنجم، یکبیستوپنجم و یکپنجاهم رقیق شده و 30 میکرولیتر از محلول رقیق شده اسانس بر روی دیسکهای کاغذی 6 میلیمتری قرارداده شد. دیسکهای آغشته به مقادیر مشخص از اسانس بر روی محیط کشت قرار داده شد و سپس پلیتها در دمای مناسب (37) بمدت 24 تا 48 ساعت گرمخانهگذاری شدند. از دو آنتیبیوتیک سیپروفلوکساسین (mg 5) و سفتیزوکسیم (mg30) برای مقایسه اثر ضدمیکروبی اسانسها استفاده شد هاله ممانعت از رشد بر حسب میلیمتراندازهگیری شده و با مقادیر آنتیبیوتیکهای استاندارد (شکلهای 1 و2) مقایسه گردید (8).
شکل 1 – هاله های ممانعت از رشد ایجاد شده توسط اسانس Thymus fedchenkoi از استان زنجان با روش انتشار از دیسک
شکل 2 – هاله های ممانعت از رشد ایجاد شده توسط اسانس Thymus Fedchenkoi از استان سمنان با روش انتشار از دیسک
تعیین حداقل غلظت بازدارنده (MIC) (Minimum inhibitory concentration) و حداقل غلظت کشنده (MBC) (Minimum bactericidal concentration): از روش رقت لولهای (Serial dilution method)، برای تعیین مقادیرMIC و MBC استفاده شد. به این منظور، رقتهای متوالی از هر کدام از نمونههای اسانس، بین 75/3 تا g/mlμ 600 تهیه و به هر کدام 100 میکرولیتر از کشت 18 ساعته میکروارگانیسمها با غلظت معادل استاندارد 1 مک فارلند ( cfu/ml8 10×3) اضافه شد. میکروپلیتها در37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند و پس از گذشت 24 ساعت، کمترین غلظتی از اسانس که فاقد رشد میکروبی است (فاقد کدورت) بعنوان MIC تعیین شد. برای تعیین MBC، 5 میکرولیتر از هر کدام از چاهکهای میکروپلیت برداشت شده و به محیط کشت فاقد اسانس منتقل و در 37 درجه سانتیگراد بمدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند و غلظتی که مانع از رشد میکروارگانیسم شدند بعنوان MBC تعیین گردید.
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: اطلاعات بدست آمده توسط نرم افزارهای SAS و MSTAT-C مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگین نیز توسط آزمون چند
دامنهای دانکن انجام شد.
نتایج
بازده و ترکیبهای شیمیایی عمده اسانس: در اکسشن زنجان بازده اسانس Th. fedtschenkoi در سال اول 95/0درصد و در سال دوم 73/0 درصد بود. ترکیبهای عمده شامل پاراسیمن (4/6 % و 24/12 %)، لینالول (04/14 % و74/14%)، تیمول (33/8% 63/13 %) و کارواکرول (67/30 % و 18/19 %) بهترتیب در سال اول و دوم بود (جدول 1).
در اکسشن سمنان بازده اسانس Th. fedtschenkoi در سال اول 83/0 درصد و در سال دوم 86/0 بود. در اکسشن سمنان ترکیبهای غالب شامل پاراسیمن (88/10% و 51/16%)، تیمول (41/66% و 16/58 %) و کارواکرول (75/2 % و 97/1 %) بهترتیب در سال اول و دوم بود (جدول 1).
اثرات ضدمیکروبی: تجزیه واریانس اثرات ضدمیکروبی اسانسTh. fedtschenkoi اکسشن استان زنجان نشان داد که نوع میکروارگانیسم، مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیک و رقتهای مختلف اسانس) و اثر متقابل آنها بر قطر هاله عدم رشد در سطح یک درصد معنیدار بود (جدول2).
جدول 1- درصد اسانس و ترکیبهای شیمیایی عمده اکسشنهای استانهای زنجان و سمنان گونه Thymus fedtschenkoi کاشته شده در باغ گیاهشناسی ملی ایران
ردیف |
ترکیب شیمیایی |
ایندکس بازداری (RI) |
استان زنجان |
استان سمنان |
||||
|
|
|
سال اول |
سال دوم |
سال اول |
سال دوم |
||
1 |
p-cymene |
1028 |
4/6 |
24/12 |
88/10 |
51/16 |
||
2 |
1,8-cineole |
1035 |
95/3 |
68/3 |
13/3 |
09/5 |
||
3 |
γ-terpinene |
1065 |
73/2 |
12/2 |
98/1 |
59/2 |
||
4 |
linalool |
1100 |
04/14 |
74/14 |
05/0 |
05/0 |
||
5 |
borneol |
1167 |
t |
t |
t |
t |
||
6 |
α –terpineol |
1190 |
t |
t |
t |
t |
||
7 |
geraniol |
1257 |
t |
t |
t |
t |
||
8 |
thymol |
1293 |
33/8 |
63/13 |
41/66 |
16/58 |
||
9 |
carvacrol |
1300 |
67/30 |
18/19 |
75/2 |
97/1 |
||
10 |
α -terpinyl acetate |
1353 |
t |
t |
t |
t |
||
11 |
geranyl acetate |
1386 |
t |
t |
t |
t |
||
جدول2- نتایج آنالیز واریانس اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیکها و رقتهای مختلف اسانسTh. fedtschenkoi) اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات قطر هاله عدم رشد |
میکروارگانیسم |
4 |
488/206** |
مواد ممانعت کننده رشد |
5 |
733/2690** |
اثر متقابل میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد |
20 |
662/49** |
خطا |
90 |
550/1 |
کل |
119 |
367/15412 |
مقایسه میانگینها نشان داد، بیشترین قطر هاله عدم رشد اسانس اکسشن استان زنجان مر بوط به قارچ C. albicans به مقدار 29/19 میلیمتر بود. قطر هاله عدم رشد اسانس با رقتهای یکپنجم، یکبیستوپنجم و یکپنجاهم به ترتیب 75/18، 00/12 و 70/10 میلیمتر با یکدیگر و با آنتیبیوتیکهای سفتیزوکسیم (75/25 میلیمتر) و سیپروفلوکساسین (50/32 میلیمتر) اختلاف معنیدار داشتند (جدولهای 3 و 4).
نتایج آزمون MIC اکسشن زنجان نشان داد که E. coli، B. subtilis و C. albicans با MIC معادل μg/ml75/23 حساسترین و P. aeruginosa با MIC بیش از μg/ml380 مقاومترین باکتری بود. مقادیر MBC و MIC مشابه و برای C. albicans و P. aeruginosa بهترتیب μg/ml75/23 و بیش ازμg/ml 380 تعیین شد (جدول5).
تجزیه واریانس بررسی اثرات ضد میکروبی اسانس
Th. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان نشان داد که همانند اکسشن زنجان، نوع میکروارگانیسم، مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیکها و رقتهای مختلف اسانس) و اثر متقابل آنها بر قطر هاله عدم رشد در سطح یک درصد معنیدار بود (جدول 6).
جدول 3- مقایسه میانگینهای اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیکها و رقتهای مختلف اسانس Th. fedchenkoi اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن
تیمار |
قطر هاله عدم رشد (میلیمتر) |
میکروارگانیسم |
|
E. coli |
b 58/16 |
S. aureus |
b 67/16 |
P. aeruginosa |
c 83/11 |
C. albicans |
a29 /19 |
B. subtilis |
71/18 a |
مواد ممانعت کننده رشد |
|
رقت یکپنجم |
c 75/18 |
رقت یکبیستوپنجم |
d 00/12 |
رقت یکپنجاهم |
e 70/10 |
Ceftizoxime Ciprofloxacin |
b 75/25 a 50/32 |
جدول 4- مقایسه میانگینهای اثر متقابل نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعتکننده رشد (آنتی بیوتیک و رقتهای مختلف اسانسTh. fedchenkoi اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن
میکروارگانیسم × مواد ممانعتکننده رشد |
قطر هاله عدم رشد (میلی متر) |
E. coli´ |
g 17 |
E. coli ´ |
hi 75/12 |
E. coli ´ |
ij 75/10 |
E. coli ´ Ceftizoxime |
de75/26 |
E. coli ´ Ciprofloxacin |
b 25/32 |
S. aureus ´ |
f 50/19 |
S. aureus ´ |
hij 50/11 |
S. aureus ´ |
ij 75/10 |
S. aureus ´ Ceftizoxime |
c 50/29 |
S. aureus ´ ciprofloxacin |
cd 75/28 |
P. aeruginosa ´ |
j 75/9 |
P. aeruginosa ´ |
j 50/9 |
P. aeruginosa ´ |
j 9 |
P. aeruginosa ´ Ceftizoxime |
hij 50/11 |
P. aeruginosa ´ Ciprofloxacin |
bc 25/31 |
C. albicans ´ |
e 25/26 |
C. albicans ´ |
hi 50/12 |
C. albicans ´ |
hij 50/11 |
C. albicans ´ Ceftizoxime |
bc 75/30 |
C. albicans ´ Ciprofloxacin |
a 75/34 |
B. subtilis ´ |
f 25/21 |
B. subtilis ´ |
h 75/13 |
B. subtilis ´ |
hij 50/11 |
B. subtilis ´ Ceftizoxime |
bc 25/30 |
B. subtilis ´ Ciprofloxacin |
a 50/35 |
جدول 5- حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و کشنده (MBC) اسانس Th. fedtschenkoi اکسشن استان زنجان
نام میکروارگانیسم |
|
||||
B. subtilis |
C. albicans |
P. aeruginosa |
S. aureus |
E. coli |
نام آزمون |
75/23 |
75/23 |
380 ≤ |
5/47 |
75/23 |
MIC (μg/ml) |
5/47 |
75/23 |
380 ≤ |
5/47 |
75/23 |
MBC (μg/ml) |
جدول 6- نتایج آنالیز واریانس اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیکها) و رقتهای مختلف اسانسTh. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات قطر هاله عدم رشد |
میکروارگانیسم |
4 |
083/1513 ** |
مواد ممانعت کننده رشد |
5 |
793/3531** |
اثر متقابل میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد |
20 |
368/274** |
خطا |
90 |
139/6 |
کل |
119 |
967/8205 |
**: اختلاف معنیدار در سطح احتمال یک درصد C.V.=6.04%
مقایسه میانگینها نشان داد که بیشترین قطر هاله عدم رشد در اکسشن استان سمنان درC. albicans به مقدار 3/32 میلیمتر بود. قطر هاله عدم رشد اسانس با رقتهای یکپنجم، یکبیستوپنجم و یکپنجاهم به ترتیب 7/37، 6/24 و 8/13 میلیمتر با یکدیگر و با آنتیبیوتیکهای سفتیزوکسیم (1/25 میلیمتر) و سیپروفلوکساسین (3/30 میلیمتر) اختلاف معنیدار داشتند (جدولهای 7 و 8).
جدول 7- مقایسه میانگینهای اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتیبیوتیکها و رقتهای مختلف اسانس Th. fedchenkoi) اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن
تیمار |
قطر هاله عدم رشد (mm) |
|
|
E. coli |
c21/19 |
S. aureus |
c71/20 |
P. aeruginosa |
d13/11 |
C. albicans |
a33/32 |
B. subtilis |
b21/26 |
L |
|
رقت یکپنجم اسانس |
a70/37 |
رقت یکبیستوپنجم اسانس |
c60/24 |
رقت یکپنجاهم اسانس |
d 80/13 |
Ceftizoxime Ciprofloxacin |
c10/25 b30/30 |
حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنیدار میباشد |
جدول 8 - مقایسه میانگینهای اثر متقابل نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعتکننده رشد (آنتیبیوتیکها و رقتهای مختلف اسانسTh. fedchenkoi اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن
میکروارگانیسم × مواد ممانعتکننده رشد |
قطر هاله عدم رشد (میلیمتر) |
E. coli ´ |
fghi28 |
E. coli ´ |
jk 25/22 |
E. coli ´ |
mno 75/12 |
E. coli ´ Ceftizoxime |
hij25 |
E. coli ´ Ciprofloxacin |
fghij 25/27 |
S. aureus ´ |
defg 32 |
S. aureus ´ |
ij 24 |
S. aureus ´ |
lmn 25/14 |
S. aureus ´ Ceftizoxime |
efgh 25/29 |
S. aureus ´ Ciprofloxacin |
hij 75/24 |
P. aeruginosa ´ |
no 75/9 |
P. aeruginosa ´ |
o 9 |
P. aeruginosa ´ |
o 9 |
P. aeruginosa ´ Ceftizoxime |
no 10 |
P. aeruginosa ´ Ciprofloxacin |
fghi 29 |
C. albicans ´ |
a 67 |
C. albicans ´ |
cd 75/36 |
C. albicans ´ |
l 75/17 |
C. albicans ´ Ceftizoxime |
cde 25/34 |
C. albicans ´ Ciprofloxacin |
c 25/38 |
B. subtilis´ |
b 75/51 |
B. subtilis´ |
efg 31 |
B. subtilis´ |
lm 25/15 |
B. subtilis´ Ceftizoxime |
ghij 27 |
B. subtilis ´ Ciprofloxacin |
def 25/32 |
حروف مشابه در هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی دار می باشد |
نتایج آزمون MIC اکسشن استان سمنان نشان داد که
S. aureus با MIC معادل μg/ml34/17 حساسترین و
C. albicans و E. coli با MIC بیش از g/ml 5/277 مقاوم ترین بودند. مقادیر MBC برایS. aureus معادل μg/ml69/34 و برای C. albicans و E. coli بیش از μg/ml555 ارزیابی شد (جدول 9).
جدول 9- حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و کشنده (MBC) اسانس Th. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان
میکرو ارگانیسم |
|
||||
B. subtilis |
C. albicans |
P. aeruginosa |
S. aureus |
E. coli |
نام آزمون |
75/138 |
5/277 |
38/69 |
34/17 |
5/277 |
MIC (μg/ml) |
5/277 |
0/555 |
38/69 |
69/34 |
0/555 |
MBC (μg/ml) |
بحث و نتیجه گیری
با توجه به افزایش مصرف گیاهان دارویی در سرتاسر دنیا و نیز بالا رفتن مقاومت میکروارگانیسمها به آنتیبیوتیکها، یافتن داروهای جدید یک نیاز و از اولویت های مهم برای مقابله با عفونتهای میکروبی است. با توجه به اثرات ضد میکروبی گیاهان دارویی از جمله آویشن، در این مطالعه ترکیبات تشکیل دهنده اسانس Th. fedtschenkoi اکسشنهای استانهای سمنان و زنجان و اثرات ضدمیکروبی آنها مطالعه شد.
در اغلب مطالعات انجام شده تیمول و کارواکرول به عنوان ترکیبات عمده اسانس در Th. fedtschenkoiمعرفی شدهاند که با نتایج این مطالعه در اکسشن سمنان مطابقت دارد (3،6، 10). اگر چه در برخی دیگر از مطالعات ترکیبهای دیگری همچون ترپینیل استات و لینالول به تنهایی و یا همراه با ترکیبات فنلی مانند تیمول و کارواکرول بهعنوان ترکیبهای عمده در اکسشنهای دیگر این گونه شناسایی شده است (17). در این مطالعه نیز لینالول بهعنوان یکی از ترکیبهای عمده در اکسشن زنجان شناسایی شده است. تفاوتهای مشاهده شده در ترکیبات عمده تشکیل دهنده اسانس میتواند ناشی از تنوع ژنتیکی درتفاوت اقلیمهای اولیه رویشگاههای مبداء آنها باشدکه بر خواص و کاربرد آنها موثر میباشد (15، 26).
بر اساس روش انتشار از دیسک بالاترین هاله عدم رشد در اکسشن زنجان در باکتریهای C. albicans و B. subtilis و در اکسشن سمنان در C. albicans مشاهده شد. حساسیت بالای C. albicans به اسانس گونههای دیگر آویشن نیز قبلاَ گزارش شده است (9). بر اساس مقادیر MIC و MBC، حساسترین باکتری به اسانس اکسشن زنجان باکتریهای C. albicans و B. subtilis و E. coli است در حالی که به اسانس اکسشن استان سمنان S. areus بیشترین حساسیت را نشان داده است. در مطالعات قبلی نیز باکتری S. aureus به عنوان حساسترین باکتری به اسانس گونه آویشن دنائی و trautvetteri Th. گزارش شده است (22). استافیلوکوکوس آرئوس به عنوان یک باکتری همزیست و نیز بیماریزا عمل میکند. در شرایط بیماریزایی S. areus میتواند انواع متفاوتی از عفونتهای سطحی پوستی تا انواع سیستماتیک را ایجاد کند. درمان عفونتهای حاصله از این باکتری به دلیل مقاومت آن به انواع آنتیبیوتیکها با مشکلات جدی همراه است و حساسیت بالای آن به اسانس این گونه از آویشن با منشاء استان سمنان میتواند در درمان عفونتهای آن امیدوار کننده باشد. تفاوتهای مشاهده شده در حساسیت میکروارگانیسمهای مورد بررسی می تواند ناشی از تفاوت در ترکیبات تشکیل دهنده و نیز درصد آنها باشد که باعث میشود میکروارگانیسم خاصی حساسیت بیشتر و یا کمتری داشته باشد که البته برای اثبات این امر نیاز به مطالعات بیشتر ، استخراج ترکیبات اصلی و بررسی اثر ضد میکروبی آنها به صورت مجزا وجود دارد. بهعلاوه در حساسیت میکروارگانیسمها بین دو روش انتشار از دیسک و رقت های متوالی تفاوت مشاهده میشود. این تفاوتها می تواند ناشی از تفاوت در قدرت انتشار اسانسها از دیسک و نیز نحوه رشد باکتریهادر محیط جامد باشد که بشکل بیوفیلم است. این شکل از رشد میتواند مانع دسترسی اسانس به آنها و عملکرد ضدمیکروبی آن شود در حالی که در محیط کشتهای مایع سلولها در محیط منتشر بوده و به شکل یکدست در معرض اسانس و یا آنتیبیوتیک قرار دارند (13).
در مجموع میتوان گفت که اسانسهای بررسی شده دارای خواص ضد میکروبی متفاوت بر میکروارگانیسمهای مختلف هستند که میتواند راهی برای تولید مواد ضد میکروبی جدید باشد.
سپاسگزاری
نگارندگان از مسئولان محترم مؤسسه و رییس بخش تحقیقات گیاهان دارویی بهدلیل امکاناتی که جهت اجرای این طرح در اختیارشان قرار دادند، صمیمانه قدردانی و سپاسگزاری می نمایند. از همکاران آزمایشگاه شیمی گیاهی بهویژه آقای دکتر میرزا به دلیل تهیه طیف های GC/MS و سرکار خانم مهندس فکری بهدلیل تهیه طیفهای GC و از خانم دکتر جمزاد بهدلیل شناسایی گونه و نمونههای گیاهی بینهایت قدردانی می شود. در پایان لازم است از کلیه همکارانی که ما را در اجرای این تحقیق یاری کردند، تشکر و سپاسگزاری نماییم.
3-Abousaber, M., Hadjakhoondi, A., Shafiee, A. 2002. Composition of the essential oil of Thymus pubescens Boiss. Et Kotschy ex Celak and Thymus fedtschenkoi Ronniger from Iran. Journal of Essential oil Research. 14(3): 154-155.
4-Aminkhani, A., Sharifi, R., Ranjbar, E., Chalabian, F., Katouzian, F. 2019. Antimicrobial activities and chemical constituents of essential oil extracted from stem, leaf, and flower of Thymus fedtschenkoi from Khoy, Iran. J Food Process preserv. 43(10): e14149. http: //doi.org/10jfpp.14149.
5-Askari, F., Teimouri, M. 2019. Antimicrobial activity of essential oil of Thymus fedtschenkoi R. collected from Semnan province. 8th congress on medicinal plants, Iran. 24-25 April: 271.
6-Baser, KHC., Demirci, B., Kirimer, N., Satil, F., Tumen, G. 2002. The essential oil of Thymus migricus and T. fedtschenkoi var. Handellii from Turkey. Flavour and Fragrance Journal. 17(1): 41-45.
7-Bauer, AW., Kirby, WM., Sherris, JC., Turck, M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 45: 49 (European )
8-Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eighteenth informational supplement, vol. 28, no. 1. CLSI, Wayne, PA.
9-Ghasemi Pirbalouti, A., Emami Bistghani, Z., Malekpoor, F. 2015. An overview on genus Thymus. Journal of Herbal Drugs. 6(2): 93-100.
10-Ghelichnia, H., 2018. Essential oil composition of Thymus fedtschenkoi Ronniger at different growing altitudes in Mazandaran, Iran. Cercetari Agronomica in Moldova. 2 (174): 75-83.
11-Jamzad, Z. 2009. Thymus and Satureja Species of Iran. Research Institute of forest and rangelands. Tehran, Iran. 171p
12-Kazemi, A., Elmib, F., Moradic, A. 2019. Chemical composition and biological activities of essential oils and methanolic extracts obtained from wild and cultivated types of Thymus fedtschenkoi from East Azarbayjan, Iran. Advanced Herbal Medicine. 5(1):1-13.
13-Khalili, H., Soltani, R., Negahban, S., Abdollahi, A., Gholami, K. 2012. Reliability of disk diffusion test results for the antimicrobial susceptibility testing of nosocomial gram-positive microorganisms: is e-test method better? Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 11(2): 559–563.
14-Khayami, M., Noujavan Asghari, M., Rasouli, B. 2002. Antibacterial effects of essential oils of Stachys and Thymus of sumach and wild maunt atlas pistacia in vitro. Pajouhesh-Va-Sazandegi. 15(1): 36-39.
15-Matrotti, M., Dellacecca, V., Piccaglia, R., Glovanelli, E. 1993. Agronomic and chemical evaluation of three varieties of Foeniculum vulgar Mill. Acta horticulture. 331:63-69.
16-Mericli, F. 2004. Volatile oils of Thymus kotschyanus var. glabrescens and Thymus fedtschenkoi var. handelii. Journal of Natural products. 49(5): 942.
17-Mirza, M., Ahmadi, L. 2000. Efficacy of DB-5 and DB-1 columns in Identifying Thymus fedschenkoi ronniger essential oil compounds. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic plants. 6(1): 128-139.
18-Mirza, M. 2012. Extraction, qualitative and quantitative analyses of the essential oil of different Thymus species (National Botanic Garden of Iran). Research Institute of Forest and Rangelands. Tehran, Iran.
19- Mozaffarian, V. 2006. A dictionary of Iranian Plant Names. Farhang Moaser publisher. Tehran, Iran. 596p.
20-Nejad Ebrahimi, S., Hadian, J., Mirjalili, MH., Sonboli, A., Yousefzadi, M. 2008. Essential oil composition and antibacterial activity of Thymus caramanicus at different phenological stages. Food Chemistry. 110 (4): 927-931
21-Rustaiee, AR., Mirahmadi, SF., Sefidkon, F., Tabatabaei, MF., Omidbaigi, R. 2011. Essential oil content and composition of Thymus fedtschenkoi Ronniger at different phonological stages. Journal of essential oil bearing plant. 14(5): 625-629.
22-Shahnazi, S., Khalighi sigaroudi, F., Ajani, Y., Yazdani, D., Ahvazi, M., Taghizad Farid, R. 2007. Study on chemical composition and antibacterial activity of thyme essential oil of Thymus trautvetteri Klokov & Dest.-Shost. Journal of Medicinal Plants. 6(23): 80-88.
23-Teimouri, M. 2012. Antimicrobial activity and essential oil composition of Thymus daenensis Celak from Iran. Journal of Medicinal Plants Research. (4): 631-635.
24-Teimouri, M., Askari, F. 2019. Comparison of Antimicrobial activities of Essential oil of Thymus vulgaris from two Iranian localities (Gazvin and central provinces), 8th congress on medicinal plants. Iran, 24-25 April: 114.
25-Tohidi, B., Rahimmalek, M., Trindade, H. 2019. Review on essential oil, extracts composition, molecular and phytochemical properties of Thymus species in Iran. Industrial Crops and Products. 134: 89-99.
26-Zarezadeh, A., Mirza, M., Sharifi Ashurabady, E., Mirhosseini, A., Arabzadeh, M.R. 2013. Survey on quality and quantity of essential oil different accessions of Thymus pubescens in province Yazd. Eco-phytochemical Journal of Medical Plants. 1(3): 35-43.