Study of Antibacterial effect and chemical compounds in populations of Thymus fedtschenkoi Ronniger from Semnan and Zanjan

Document Type : Research Paper

Authors

1 Assistant professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

2 Associate professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

3 Research expert, Fars agricultural and natural resources research center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO),Shiraz, I.R. of Iran

Abstract

In this study, antimicrobial effects of two accession of Thymus fedtschenkoi originated from Semnan and Zanjan against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Bacillus subtilis were investigated. The essential oil was extracted by Clevenger apparatus and compounds identified by GC and GC-MS instruments. Disc diffusion and microdilution methods were used to determine antimicrobial activity. The experiment was done on factorial design based on complete randomized design. The effect of microorganism type (as first factor) and essential oil concentration and antibiotics (as second factor) and their interaction was evaluated. According to the results, essential oil yield was %0.73 and %0.95 in Zanjan and %0.83 and %0.86 in Semnan accession in two successive years. The main chemical compounds of Zanjan accession was p-cymene, linalool, thymol and carvacrol and Semnan accession was p-cymene, thymol and carvacrol. Statistical analysis showed that the effect of microorganism type, essential oil concentration and their interaction on inhibition zone was significant at 1% level. In Semnan accession, the highest diameter of inhibition zone was observed in C. albicans and in dilution of one fifth of essential oil. C. albicans and B. subtilis had the most sensivity to Zanjan accession and C. albicans to Semnan accession. The observed difference in antimicrobial effects can be related to difference in chemical composition and their activity.

Keywords

Main Subjects

بررسی اثرات ضدمیکروبی و ترکیب‌های شیمیایی اسانس جمعیت‌های

Thymus fedtschenkoi Ronniger در دو استان سمنان و زنجان

فاطمه عسکری1*، ابراهیم شریفی عاشورآبادی1، مریم تیموری1 و عاطفه بهمن‌زادگان2

1 ایران، تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور،

2 ایران، شیراز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مرکز تحقیقات منابع طبیعی استان فارس

تاریخ دریافت: 22/06/1399         تاریخ پذیرش: 07/09/1400

چکیده

در این مطالعه اثرات ضد‌میکروبی دو اکسشن از گونه Thymus fedtschenkoi از استان­های زنجان و سمنان  بر ضد باکتری‌های Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis  و قارچ Candida albicans بررسی شد. استخراج اسانس با دستگاه کلونجر و شناسایی ترکیب‌ها با استفاده از دستگاه‌های GC و GC-MS صورت گرفت. برای بررسی اثرات ضدمیکروبی از روش انتشار از دیسک و روش رقت‌سازی در لوله استفاده شد. آزمایش اثرات ضد­میکروبی اسانس در قالب طرح فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با دو عامل میکروارگانیسم (عامل اول) و رقت اسانس (عامل دوم) انجام شد. براساس نتایج، بازده اسانس در دو سال برداشت در اکسشن زنجان (95/0 و 73/0 درصد) و اکسشن سمنان (83/0و 86/0 درصد) بود. ترکیب‌های عمده در اکسشن زنجان شامل پارا-سیمن، لینالول، تیمول و کارواکرول و در اکسشن سمنان پارا-سیمن، تیمول و کارواکرول بود. نتایج آنالیز واریانس و مقایسه میانگین داده‌های ضدمیکروبی نشان داد که اثر نوع میکروارگانیسم و رقت اسانس و اثر متقابل این دو عامل بر میانگین قطر هاله عدم رشد در سطح 1% معنی‌دار بود. در اکسشن سمنان بیشترین قطر هاله ممانعت از رشد در گونه C. albicans و در رقت یک پنجم اسانس مشاهده شد. میکروارگانیسم­های  C. albicans و B. subtilis به اکسشن زنجان و C. albicans به اسانس اکسشن سمنان حساسیت بیشتری از خود نشان دادند. تفاوت در حساسیت  میکروارگانیسمها می­تواند ناشی از تفاوت در ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس و اثرات ضدمیکروبی اجزای تشکیل دهنده آن باشد.

واژه های کلیدی: آویشن، اسانس، زنجان، سمنان، ضد‌میکروبی

* نویسنده مسئول، تلفن: 5-44580282، پست الکترونیکی: fasgari@rifr-ac.ir

مقدمه

 

بروز مقاومت‌های دارویی علیه آنتی‌بیوتیک‌ها و گسترش جهانی این مشکل که درمان برخی از عفونت‌ها را با مشکلات جدی مواجه می‌کند باعث شده است که محققان بدنبال یافتن ترکیب‌های جدید با اثرات ضدمیکروبی قوی برای مقابله با این مشکل باشند. گیاهان دارویی از جمله منابعی هستند که برای تولید ترکیبات ضدمیکروبی جدید می‌توانند مورد استفاده قرارگیرند (24).  ترکیب­های طبیعی جدا شده از گونه های مختلف جنس تیموس از جمله اسانس­ها خواص ضد میکروبی، ضد قارچی و ضد ویروسی دارند (25)‌.

آویشن یا Thymus یکی از جنس‌های خانواده نعنا است. در حدود 215 گونه از این جنس شناسایی شده است که 18 گونه آن در ایران رویش دارد (19،11).‌ آویشن­ها گیاهانی چند ساله به فرم بوته­ای و کپه­ای هستند. ساقه آنها چهار گوش است و سطح ساقه و برگ پوشیده از کرک­های محافظتی می‌باشد. کرک‌های غده­ای که محل انباشتگی اسانس هستند در سطح گل، برگ و گاهی ساقه مشاهده می‌شوند. گونه‌های آویشن در مناطق مدیترانه گسترش یافته‌اند. گونه Thymus fedtschenkoi در ترکیه، قفقاز و ایران می‌روید و یکی از گونه‌های بومی آویشن در ایران است. این گونه در مناطق کوهستانی خزری و ایرانی تورانی در ارتفاع 250 تا 3750 متری در استان­های مازندران، گیلان، گلستان، آذربایجان، تهران، قزوین و کردستان رویش دارد (11). ترکیب‌های عمده اسانس این گونه شامل تیمول و کارواکرول (3،6،10) است و گاهی اوقات لینالول  (16،‌ 21) و ترپینیل استات (17)‌ نیز به عنوان ترکیب غالب گزارش شده است. از گونه­های آویشن به ویژه گونه Th. fedtschenkoi برای درمان سرماخوردگی و عفونت­های دستگاه تنفسی و نیز به عنوان طعم دهنده و نگهدارنده مواد غذایی استفاده می‌شود.

محتوای اسانس گیاهان دارویی و فعالیت زیستی آنها براساس روش‌های مختلف کشت، خاستگاه، مرحله رویشی و فصل رویش تغییر می‌کند (5). فعالیت ضدمیکروبی گونه‌های مختلف آویشن در تحقیقات متعدد مطالعه شده است و به نظر می‌رسد تیمول مسئول ویژگی­های ضدمیکروبی اسانس آویشن ‌باشد. در مطالعه مقایسه­ای ترکیب‌های شیمیایی و فعالیت آنتی­اکسیدانی و ضدمیکروبی انواع خودرو (وحشی) و کاشته شده گونه Th. fedtschenoi از آذربایجان­شرقی مطالعه شد. ترکیب‌های عمده نمونه خودرو شامل تیمول (21 تا 49 %)، پاراسیمن (20 تا 15 %)، کارواکرول (10 تا20 %) و ترکیب‌های اصلی در نمونه کشت شده شامل تیمول (33/62 %) و کارواکرول (12/7 %) بود. شاخص MIC برای نمونه خودرو بین g/mlµ128-2 و نمونه کشت شده g/mlµ16-2 بود (12). در مطالعه دیگری خواص ضد‌میکروبی اسانس و عصاره گونه Th. daenesis بر ضد Candida albicans، Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Klebsiella pneumonia تائید شده است (7). در تحقیقی اثرات ضد‌میکروبی و ترکیب شیمیایی اسانس گونه آویشن دنایی مطالعه شد. ترکیب‌های عمده شامل تیمول (8/29 %)، کارواکرول (6/13 %)، پاراسیمن (3/11 %)، بورنئول (8/6 %)، 1، 8-سینئول (89/5 %) بود. فعالیت ضدمیکروبی اسانس بر ضد باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی و سه قارچ با استفاده از روش انتشار از دیسک مطالعه شد. نتایج این مطالعه نشان داد که باکتری S. aureus حساس­ترین باکتری به اسانس است و اسانس این گونه فعالیت ضد­‌قارچی بر ضد همه قارچ­های مورد آزمون نشان داده است (23). در تحقیق دیگری فعالیت ضدمیکروبی گونه
Th. fedtschenkoi با استفاده از آزمون­های MBC و MIC تائید شده است (4). اثرات ضدمیکروبی Th. kotschyanus بر ضد K. pneumonia ‌تائید شده است. تاثیر اسانس بر
S. aureus و Staphylococous epidermidis یکسان ولی کمتر ازK. pneumonia گزارش شد (14). اثرات ضدباکتریایی اسانس گیاه Th. trautvetteri ، روی 7 باکتری نشان داد که اثر بازدارنده اسانس بر رشد باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت بسیار خوب بوده است. حساس­ترین باکتری S aureus با MIC  برابر µg/ml 125 بود (22). در مطالعه­ی دیگر ترکیب­های شیمایی در مراحل مختلف رویشی و اثرات ضد میکروبی اسانس
Th. caramanicus بر ضد باکتری­های مختلف مطالعه شد. بر اساس نتایج این مطالعه،‌ کارواکرول،‌ پارا-سیمن،‌ گاما-ترپینن، تیمول و بورنئول ترکیب­های غالب اسانس در این گونه بودند و اسانس این گونه اثرات ضد میکروبی را در مراحل مختلف رشد نشان داد. همچنین حساس­ترین باکتری به اسانس این گونه Bacillus subtilis و مقاوم­ترین باکتری Pseudomonas aeruginosa بود (20). علاوه بر گونه های آویشن سایر گونه های جنس نعنا شامل گونه های مختلف مرزه، اسطوخودوس و رزماری دارای فعالیت ضد باکتری و ضد قارچ هستند (1 و 2)

هدف از این مطالعه تعیین اثرات ضد‌میکروبی اسانس
Th. fedtschenkoi دو اکسشن زنجان و سمنان، بر ضد باکتری‌های Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis و قارچ Candida albicans، تعیین مقادیر MIC و MBC و مقایسه اثر اسانس با آنتی­بیوتیک‌های Ceftizoxime  و Ciprofloxacin بود.

مواد و روشها

روش بررسی یافته ها

کشت گیاهان: بذر دو اکسشن از گونه Th. fedtschenkoi از رویشگاه‌های طبیعی آن در استان­های سمنان و زنجان جمع­آوری شد و در مزرعه گیاهان دارویی باغ گیاهشناسی ملی ایران کشت گردید. نمونه‌های هرباریومی توسط سرکار خانم دکتر جمزاد شناسایی و در هرباریوم بخش گیاهشناسی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور نگهداری شد.

استخراج اسانس و شناسایی ترکیب‌ها: از سرشاخه های گلدار در مرحله گلدهی کامل، به روش تفطیرباآب اسانس گیری شد. درصد و نوع ترکیب‌های موجود در اسانس با استفاده از گاز کروماتوگرافی (GC) و گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) شناسایی شدند (18)

بررسی اثر ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک (Disk diffusion method): باکتری­های Escherichia coli، Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa وBacilus subtilis  و قارچ Candida albicans در محیط کشت تریپتوکیس‌سوی آگار (ساخت شرکت مرک) به مدت 18 ساعت کشت شدند. غلظت معینی از باکتری‌ها معادل استاندارد شماره 1 مک­فارلند (7) در محیط کشت تریپتوکیس سوی برات تهیه گردید. ml 500 از سوسپانسیون میکروبی به محیط کشت تریپتوکیس سوی آگار منتقل و با سواپ استریل به شکل یکنواخت بر روی سطح پخش شدند اسانس‌های هر کدام از نمونه‌ها، با استفاده از دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) که فاقد اثر ضدمیکروبی است به نسبت‌های یک‌پنجم، یک‌بیست‌وپنجم و یک‌پنجاهم رقیق شده و 30 میکرولیتر از محلول رقیق شده اسانس بر روی دیسک‌های کاغذی 6 میلی‌متری قرارداده شد. دیسک‌های آغشته به مقادیر مشخص از اسانس بر روی محیط کشت قرار داده شد و سپس پلیت­ها در دمای مناسب (37) بمدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه­گذاری شدند. از دو آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین (mg 5) و سفتی‌زوکسیم (mg30) برای مقایسه اثر ضدمیکروبی اسانس‌ها استفاده شد هاله ممانعت از رشد بر حسب میلی‌متراندازه­گیری‌ شده و با مقادیر آنتی­بیوتیک­های استاندارد (شکل­های 1 و2) مقایسه گردید (8).

 

 

شکل 1 – هاله های ممانعت از رشد ایجاد شده توسط اسانس Thymus fedchenkoi از استان زنجان با روش انتشار از دیسک

 

شکل 2 – هاله های ممانعت از رشد ایجاد شده توسط اسانس Thymus Fedchenkoi از استان سمنان با روش انتشار از دیسک

 

تعیین حداقل غلظت بازدارنده (MIC) (Minimum inhibitory concentration) و حداقل غلظت کشنده (MBC) (Minimum bactericidal concentration): از روش رقت لوله‌ای (Serial dilution method)، برای تعیین مقادیرMIC و MBC استفاده شد. به این منظور، رقت­های متوالی از هر کدام از نمونه‌های اسانس، بین 75/3 تا g/mlμ 600 تهیه و به هر کدام 100 میکرولیتر از کشت 18 ساعته میکروارگانیسم‌ها با غلظت معادل استاندارد 1 مک فارلند ( cfu/ml8 10×3) اضافه شد. میکروپلیت­ها در37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند و پس از گذشت 24 ساعت، کمترین غلظتی از اسانس که فاقد رشد میکروبی است (فاقد کدورت) بعنوان MIC تعیین شد. برای تعیین MBC، 5 میکرولیتر از هر کدام از چاهک‌های میکروپلیت برداشت شده و به محیط‌ کشت فاقد اسانس منتقل و در 37 درجه سانتی‌­گراد بمدت 24 ساعت گرمخانه‌­گذاری شدند و غلظتی که مانع از رشد میکروارگانیسم شدند بعنوان MBC تعیین گردید.

تجزیه و تحلیل  آماری  داده­ها:  اطلاعات  بدست  آمده توسط نرم افزارهای SAS  و  MSTAT-C  مورد  تجزیه و تحلیل  قرار  گرفت. مقایسه میانگین نیز توسط آزمون چند

دامنه­ای دانکن انجام شد.

نتایج

بازده و ترکیب‌های شیمیایی عمده اسانس: در اکسشن زنجان بازده اسانس Th. fedtschenkoi  در سال اول 95/0درصد و در سال دوم 73/0 درصد بود. ترکیب‌های عمده شامل پاراسیمن (4/6 % و 24/12 %)،‌ لینالول (04/14 % و74/14%)، تیمول (33/8% 63/13 %) و کارواکرول (67/30 % و 18/19 %)  به­ترتیب در سال اول و دوم بود (جدول 1).

در اکسشن سمنان بازده اسانس Th. fedtschenkoi  در سال اول 83/0 درصد و در سال دوم 86/0 بود. در اکسشن سمنان ترکیب‌های غالب شامل پاراسیمن (88/10% و 51/16%)،‌ تیمول (41/66% و 16/58 %) و کارواکرول (75/2 % و 97/1 %) به­ترتیب در سال اول و دوم بود (جدول 1).

اثرات ضدمیکروبی: تجزیه واریانس اثرات ضدمیکروبی اسانسTh. fedtschenkoi  اکسشن استان زنجان نشان داد که نوع میکروارگانیسم، مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک و رقت‌های مختلف اسانس) و اثر متقابل آنها بر قطر هاله عدم رشد در سطح یک درصد معنی‌دار بود (جدول2).

 

 

جدول 1- درصد اسانس و ترکیب‌های شیمیایی عمده اکسشن‌های استان­های زنجان و سمنان گونه Thymus fedtschenkoi کاشته شده در باغ گیاهشناسی ملی ایران

ردیف

ترکیب شیمیایی

ایندکس بازداری (RI)

استان زنجان

استان سمنان

 

 

 

سال اول

سال دوم

سال اول

سال دوم

1

p-cymene

1028

4/6

24/12

88/10

51/16

2

1,8-cineole

1035

95/3

68/3

13/3

09/5

3

γ-terpinene

1065

73/2

12/2

98/1

59/2

4

linalool

1100

04/14

74/14

05/0

05/0

5

borneol

1167

t

t

t

t

6

α –terpineol

1190

t

t

t

t

7

geraniol

1257

t

t

t

t

8

thymol

1293

33/8

63/13

41/66

16/58

9

carvacrol

1300

67/30

18/19

75/2

97/1

10

α -terpinyl acetate

1353

t

t

t

t

11

geranyl acetate

1386

t

t

t

t

                 

 

 

جدول2- نتایج آنالیز واریانس اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها و رقت­های مختلف اسانسTh. fedtschenkoi) اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد

منبع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات قطر هاله عدم رشد

میکروارگانیسم

4

488/206**

مواد ممانعت کننده رشد

5

733/2690**

اثر متقابل میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد

20

662/49**

خطا

90

550/1

کل

119

367/15412

 

 

مقایسه میانگین‌ها نشان داد، بیشترین قطر هاله عدم رشد اسانس اکسشن استان زنجان مر بوط به قارچ C. albicans به مقدار 29/19 میلی­‌متر بود. قطر هاله عدم رشد اسانس با رقت‌های یک‌پنجم، یک‌بیست‌وپنجم و یک‌پنجاهم به ترتیب 75/18، 00/12 و 70/10 میلی‌متر با یکدیگر و با آنتی‌بیوتیک‌های سفتی‌زوکسیم (75/25 میلی‌متر) و سیپروفلوکساسین (50/32 میلی‌متر) اختلاف معنی‌دار داشتند (جدول­های 3 و 4).

نتایج آزمون MIC اکسشن زنجان نشان داد که E. coli، B. subtilis و C. albicans با MIC معادل μg/ml75/23 حساس­ترین و P. aeruginosa با MIC بیش از μg/ml380 مقاوم­ترین باکتری بود. مقادیر MBC و MIC مشابه و برای C. albicans و P. aeruginosa به­ترتیب μg/ml75/23 و بیش ازμg/ml  380 تعیین شد (جدول5).

تجزیه واریانس بررسی اثرات ضد میکروبی اسانس
Th. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان نشان داد که همانند اکسشن زنجان، نوع میکروارگانیسم، مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها و رقت‌های مختلف اسانس) و اثر متقابل آنها بر قطر هاله عدم رشد در سطح یک درصد معنی‌دار بود (جدول 6).

 

جدول 3- مقایسه میانگین‌های اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها و رقت‌های مختلف اسانس Th. fedchenkoi اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن

تیمار

قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)

میکروارگانیسم

 

E. coli

 b 58/16

S. aureus

b 67/16

P. aeruginosa

c 83/11

C. albicans

 a29 /19

B. subtilis

71/18 a

  مواد ممانعت کننده رشد

 

 رقت یک‌پنجم

c 75/18

رقت یک‌بیست‌وپنجم

d 00/12

 رقت یک‌پنجاهم

 e 70/10

Ceftizoxime

Ciprofloxacin

b 75/25

a 50/32

 

جدول 4- مقایسه میانگین‌های اثر متقابل نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت‌کننده رشد (آنتی بیوتیک و رقت‌های مختلف اسانسTh. fedchenkoi   اکسشن استان زنجان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن

میکروارگانیسم × مواد ممانعت‌کننده رشد

قطر هاله عدم رشد (میلی متر)

E. coli´  

g 17

E. coli ´

hi 75/12

E. coli ´  

ij 75/10

E. coli ´ Ceftizoxime

 de75/26

E. coli ´ Ciprofloxacin

b 25/32

S. aureus ´

f 50/19

S. aureus ´

hij 50/11

S. aureus ´

ij 75/10

S. aureus ´ Ceftizoxime

c 50/29

S. aureus ´ ciprofloxacin

cd 75/28

P. aeruginosa ´

j 75/9

P. aeruginosa ´

j 50/9

P. aeruginosa ´

j 9

P. aeruginosa ´ Ceftizoxime

hij 50/11

P. aeruginosa ´ Ciprofloxacin

bc 25/31

C. albicans ´

e 25/26

C. albicans ´ 

hi 50/12

C. albicans ´

hij 50/11

C. albicans ´ Ceftizoxime

bc 75/30

C. albicans ´ Ciprofloxacin

a 75/34

B. subtilis ´

f 25/21

B. subtilis ´   

h 75/13

B. subtilis ´  

hij 50/11

B. subtilis ´ Ceftizoxime

bc 25/30

B. subtilis ´ Ciprofloxacin

a 50/35

 

 

 

جدول 5- حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و کشنده (MBC) اسانس Th. fedtschenkoi اکسشن استان زنجان

نام میکروارگانیسم

 

B. subtilis

C. albicans

P. aeruginosa

S. aureus

E. coli

نام آزمون

75/23

75/23

 380 ≤

5/47

75/23

MIC (μg/ml)

5/47

75/23

380 ≤

5/47

75/23

MBC (μg/ml)



جدول 6- نتایج آنالیز واریانس اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها) و رقت­های مختلف اسانسTh. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد

منبع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات قطر هاله عدم رشد

میکروارگانیسم

4

083/1513 **

مواد ممانعت کننده رشد

5

793/3531**

اثر متقابل میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد

20

368/274**

خطا

90

139/6

کل

119

967/8205

**: اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد C.V.=6.04%

 

 

مقایسه میانگین‌ها نشان داد که بیشترین قطر هاله عدم رشد در اکسشن استان سمنان درC. albicans  به مقدار 3/32 میلی‌متر بود. قطر هاله عدم رشد اسانس با رقت‌های یک‌پنجم، یک‌بیست‌وپنجم و یک‌پنجاهم به ترتیب 7/37، 6/24 و 8/13 میلی‌متر با یکدیگر و با آنتی‌بیوتیک‌های سفتی‌زوکسیم (1/25 میلی‌متر) و سیپروفلوکساسین (3/30 میلی‌متر) اختلاف معنی­‌دار داشتند (جدول­های 7 و 8).

 

 

جدول 7- مقایسه میانگین‌های اثر نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها و رقت‌های مختلف اسانس Th. fedchenkoi) اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن

تیمار

قطر هاله عدم رشد (mm)

نوع میکروارگانیسم

 

E. coli

 c21/19

S. aureus

 c71/20

P. aeruginosa

 d13/11

C. albicans

 a33/32

B. subtilis

 b21/26

 L

 

رقت یک‌پنجم اسانس

 a70/37

رقت یک‌بیست‌وپنجم اسانس

 c60/24

رقت یک‌پنجاهم اسانس

d 80/13

Ceftizoxime

Ciprofloxacin

 c10/25

 b30/30

حروف مشابه بیانگر عدم اختلاف معنی­دار می­باشد

جدول 8 - مقایسه میانگین‌های اثر متقابل نوع میکروارگانیسم و مواد ممانعت‌کننده رشد (آنتی­بیوتیک­ها و رقت‌های مختلف اسانسTh.  fedchenkoi  اکسشن استان سمنان بر قطر هاله عدم رشد با استفاده از آزمون دانکن

میکروارگانیسم × مواد ممانعت‌کننده رشد

قطر هاله عدم رشد (میلی­متر)

E. coli ´  

 fghi28

E. coli ´ 

jk 25/22

E. coli ´

mno 75/12

E. coli ´ Ceftizoxime

 hij25

E. coli ´ Ciprofloxacin

fghij 25/27

S. aureus ´

defg 32

S. aureus ´

ij 24

S. aureus ´

lmn 25/14

S. aureus ´ Ceftizoxime

efgh 25/29

S. aureus ´ Ciprofloxacin

hij 75/24

P. aeruginosa ´

no 75/9

P. aeruginosa ´

o 9

P. aeruginosa ´

o 9

P. aeruginosa ´ Ceftizoxime

no 10

P. aeruginosa ´ Ciprofloxacin

fghi 29

C. albicans ´

a 67

C. albicans ´ 

cd 75/36

C. albicans ´

l 75/17

C. albicans ´ Ceftizoxime

cde 25/34

C. albicans ´ Ciprofloxacin

c 25/38

B. subtilis´

b 75/51

B. subtilis´  

efg 31

B. subtilis´

lm 25/15

B. subtilis´ Ceftizoxime

ghij 27

B. subtilis ´ Ciprofloxacin

def 25/32

حروف مشابه در هر ستون نشانگر عدم اختلاف معنی دار می باشد

 

 

نتایج آزمون MIC اکسشن استان سمنان نشان داد که
S. aureus با MIC معادل  μg/ml34/17 حساس­ترین و
C. albicans و E. coli با MIC بیش از g/ml 5/277 مقاوم ترین بودند. مقادیر MBC برایS. aureus  معادل μg/ml69/34 و برای C. albicans  و E. coli بیش از μg/ml555 ارزیابی شد (جدول 9).

 

 

جدول 9- حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و کشنده (MBC) اسانس Th. fedtschenkoi اکسشن استان سمنان

میکرو ارگانیسم

 

B. subtilis

C. albicans

P. aeruginosa

S. aureus

E. coli

نام آزمون

75/138

5/277

38/69

34/17

5/277

MIC (μg/ml)

5/277

0/555

38/69

69/34

0/555

MBC (μg/ml)

 

بحث و نتیجه گیری

با توجه به افزایش مصرف گیاهان دارویی در سرتاسر دنیا و نیز بالا رفتن مقاومت میکروارگانیسم­ها به آنتی­بیوتیک­ها،‌ یافتن داروهای جدید یک نیاز و از اولویت های مهم برای مقابله با عفونت­های میکروبی است. با توجه به اثرات ضد میکروبی گیاهان دارویی از جمله آویشن، در این مطالعه ترکیبات تشکیل دهنده اسانس Th. fedtschenkoi اکسشن­های استان­های سمنان و زنجان و اثرات ضدمیکروبی آنها مطالعه شد.

در اغلب مطالعات انجام شده تیمول و کارواکرول به عنوان ترکیبات عمده  اسانس در  Th. fedtschenkoiمعرفی شده­اند که با نتایج این مطالعه در اکسشن سمنان مطابقت دارد (3،6، 10). اگر چه در برخی دیگر از مطالعات ترکیب‌های دیگری همچون ترپینیل استات و لینالول به تنهایی و یا همراه با ترکیبات فنلی مانند تیمول و کارواکرول به­عنوان ترکیب­های عمده در اکسشن­های دیگر این گونه شناسایی شده است (17). در این مطالعه نیز لینالول به­عنوان یکی از ترکیب‌های عمده در اکسشن زنجان شناسایی شده است. تفاوت­های مشاهده شده در ترکیبات عمده تشکیل دهنده اسانس می­تواند ناشی از تنوع ژنتیکی درتفاوت اقلیم­های اولیه رویشگاه­های مبداء آنها باشدکه بر خواص و کاربرد آنها موثر می­باشد (15،‌ 26)‌. 

بر اساس روش انتشار از دیسک بالاترین هاله عدم رشد در اکسشن زنجان در باکتری­های C. albicans و B. subtilis و در اکسشن سمنان در C. albicans مشاهده شد. حساسیت بالای C. albicans به اسانس گونه­های دیگر آویشن نیز قبلاَ گزارش شده است (9).  بر اساس مقادیر MIC و MBC، حساس­ترین باکتری به اسانس اکسشن زنجان باکتری­های C. albicans و B. subtilis و E. coli است در حالی که به اسانس اکسشن استان سمنان S. areus بیشترین حساسیت را نشان داده است. در مطالعات قبلی نیز باکتری S. aureus به عنوان حساس‌ترین باکتری به اسانس گونه آویشن دنائی و trautvetteri Th. گزارش شده است (22). استافیلوکوکوس آرئوس به عنوان یک باکتری همزیست و نیز بیماریزا عمل می­کند. در شرایط بیماریزایی S. areus می­تواند انواع متفاوتی از عفونت­های سطحی پوستی تا انواع سیستماتیک را ایجاد کند. درمان عفونت­های حاصله از این باکتری به دلیل مقاومت آن به انواع آنتی­بیوتیک­ها با مشکلات جدی همراه است و حساسیت بالای آن به اسانس این گونه از آویشن با منشاء‌ استان سمنان می­تواند در درمان عفونت­های آن امیدوار کننده باشد. تفاوت­های مشاهده شده در حساسیت میکروارگانیسم­های مورد بررسی می تواند ناشی از تفاوت در ترکیبات تشکیل دهنده و نیز درصد آنها باشد که باعث می­شود میکروارگانیسم خاصی حساسیت بیشتر و یا کمتری داشته باشد که البته برای اثبات این امر نیاز به مطالعات بیشتر ، استخراج ترکیبات اصلی و بررسی اثر ضد میکروبی آن­ها به صورت مجزا وجود دارد. به­علاوه در حساسیت میکروارگانیسم­ها بین دو روش انتشار از دیسک و رقت های متوالی تفاوت مشاهده می­شود. این تفاوت­ها می تواند ناشی از تفاوت در قدرت انتشار اسانس­ها از دیسک و نیز نحوه رشد باکتری­هادر محیط جامد باشد که بشکل بیوفیلم است. این شکل از رشد می­تواند مانع دسترسی اسانس به آنها و عملکرد ضدمیکروبی آن شود در حالی که در محیط کشت­های مایع سلول­ها در محیط منتشر بوده و به شکل یکدست در معرض اسانس و یا آنتی­بیوتیک قرار دارند (13). 

در مجموع می­توان گفت که اسانس­های بررسی شده دارای خواص ضد میکروبی متفاوت بر میکروارگانیسم­های مختلف هستند که می­تواند راهی برای تولید مواد ضد میکروبی جدید باشد.

سپاسگزاری

نگارندگان از مسئولان محترم مؤسسه و رییس بخش تحقیقات گیاهان دارویی به‌دلیل امکاناتی که جهت اجرای این طرح در اختیارشان قرار دادند، صمیمانه قدردانی و سپاسگزاری می نمایند. از همکاران آزمایشگاه شیمی گیاهی به‌ویژه آقای دکتر میرزا به دلیل تهیه طیف های GC/MS و سرکار خانم مهندس فکری به‌دلیل تهیه طیف‌های GC و از خانم دکتر جمزاد به‌دلیل شناسایی گونه و نمونه‌های گیاهی بی‌نهایت قدردانی می شود. در پایان لازم است از کلیه همکارانی که ما را در اجرای این تحقیق یاری کردند، تشکر و سپاسگزاری نماییم.

  • احسانی، ا.، سفید کن، ‌ف.، حسینی،‌ف. 1396. بررسی اثر اسانس سه گونه مرزه ( macrantha، S. rechingeri، S. spicigera علیه باکتریهای عامل عفونت بیمارستانی و قارچ کاندیدا آلبیکنس،‌ مجله پژوهشهای سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 30 (2): 107-119.
  • احمدی اسب‌چین، س.،‌ مصطفی پور، م. ج. 1397. اثرات متقابل ضد باکتریایی اسانس رزماری و اسانس اسطوخودوس روی دو باکتری گرم مثبت و سه باکتری گرم منفی در محیط آزمایشگاهی. مجله پژوهشهای سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 31 (2): 121-136.

 

3-Abousaber, M., Hadjakhoondi, A., Shafiee, A. 2002. Composition of the essential oil of Thymus pubescens Boiss. Et Kotschy ex Celak and Thymus fedtschenkoi Ronniger from Iran. Journal of Essential oil Research. 14(3): 154-155.

4-Aminkhani, A., Sharifi, R., Ranjbar, E., Chalabian, F., Katouzian, F. 2019. Antimicrobial activities and chemical constituents of essential oil extracted from stem, leaf, and flower of Thymus fedtschenkoi from Khoy, Iran. J Food Process preserv. 43(10): e14149. http: //doi.org/10jfpp.14149.

5-Askari, F., Teimouri, M. 2019. Antimicrobial activity of essential oil of Thymus fedtschenkoi R. collected from Semnan province. 8th congress on medicinal plants, Iran. 24-25 April: 271.

6-Baser, KHC., Demirci, B., Kirimer, N., Satil, F., Tumen, G. 2002. The essential oil of Thymus migricus and T. fedtschenkoi var. Handellii from Turkey. Flavour and Fragrance Journal. 17(1): 41-45.

7-Bauer, AW., Kirby, WM., Sherris, JC., Turck, M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 45: 49 (European )

8-Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eighteenth informational supplement, vol. 28, no. 1. CLSI, Wayne, PA.

9-Ghasemi Pirbalouti, A., Emami Bistghani, Z., Malekpoor, F. 2015. An overview on genus Thymus. Journal of Herbal Drugs. 6(2): 93-100. 

10-Ghelichnia, H., 2018. Essential oil composition of Thymus fedtschenkoi Ronniger at different growing altitudes in Mazandaran, Iran. Cercetari Agronomica in Moldova. 2 (174): 75-83.

11-Jamzad, Z. 2009. Thymus and Satureja Species of Iran. Research Institute of forest and rangelands. Tehran, Iran. 171p

12-Kazemi, A., Elmib, F., Moradic, A. 2019. Chemical composition and biological activities of essential oils and methanolic extracts obtained from wild and cultivated types of Thymus fedtschenkoi from East Azarbayjan, Iran. Advanced Herbal Medicine. 5(1):1-13.

13-Khalili, H., Soltani, R.,  Negahban, S., Abdollahi, A.,  Gholami,  K. 2012. Reliability of disk diffusion test results for the antimicrobial susceptibility testing of nosocomial gram-positive microorganisms: is e-test method better? Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 11(2): 559–563.

14-Khayami, M., Noujavan Asghari, M., Rasouli, B. 2002. Antibacterial effects of essential oils of  Stachys and Thymus of sumach and wild maunt atlas pistacia in vitro. Pajouhesh-Va-Sazandegi. 15(1): 36-39.

15-Matrotti, M., Dellacecca, V., Piccaglia, R., Glovanelli, E. 1993. Agronomic and chemical evaluation of three varieties of Foeniculum vulgar Mill. Acta horticulture. 331:63-69.

16-Mericli, F. 2004. Volatile oils of Thymus kotschyanus var. glabrescens and Thymus fedtschenkoi var. handelii. Journal of Natural products. 49(5): 942.

17-Mirza, M., Ahmadi, L. 2000. Efficacy of DB-5 and DB-1 columns in Identifying Thymus fedschenkoi ronniger essential oil compounds. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic plants. 6(1): 128-139.

18-Mirza, M. 2012. Extraction, qualitative and quantitative analyses of the essential oil of different Thymus species (National Botanic Garden of Iran). Research Institute of Forest and Rangelands. Tehran, Iran.

19- Mozaffarian, V. 2006. A dictionary of Iranian Plant Names. Farhang Moaser publisher. Tehran, Iran. 596p.

20-Nejad Ebrahimi, S., Hadian, J., Mirjalili, MH., Sonboli, A., Yousefzadi, M. 2008. Essential oil composition and antibacterial activity of Thymus caramanicus at different phenological stages. Food Chemistry. 110 (4): 927-931

21-Rustaiee, AR., Mirahmadi, SF., Sefidkon, F., Tabatabaei, MF., Omidbaigi, R. 2011. Essential oil content and composition of Thymus fedtschenkoi Ronniger at different phonological stages. Journal of essential oil bearing plant. 14(5): 625-629.

22-Shahnazi, S., Khalighi sigaroudi, F., Ajani, Y., Yazdani, D., Ahvazi, M., Taghizad Farid, R. 2007. Study on chemical composition and antibacterial activity of thyme essential oil of Thymus trautvetteri Klokov & Dest.-Shost. Journal of Medicinal Plants. 6(23): 80-88.

23-Teimouri, M. 2012. Antimicrobial activity and essential oil composition of Thymus daenensis Celak from Iran. Journal of Medicinal Plants Research. (4): 631-635. 

24-Teimouri, M., Askari, F. 2019. Comparison of Antimicrobial activities of Essential oil of Thymus vulgaris from two Iranian localities (Gazvin and central provinces), 8th congress on medicinal plants. Iran, 24-25 April: 114.

25-Tohidi, B., Rahimmalek, M., Trindade, H. 2019. Review on essential oil, extracts composition, molecular and phytochemical properties of Thymus species in Iran. Industrial Crops and Products. 134: 89-99.

26-Zarezadeh, A., Mirza, M., Sharifi Ashurabady, E., Mirhosseini, A., Arabzadeh, M.R. 2013. Survey on quality and quantity of essential oil different accessions of Thymus pubescens in province Yazd. Eco-phytochemical Journal of Medical Plants. 1(3): 35-43.

Volume 35, Issue 3
October 2022
Pages 450-466
  • Receive Date: 12 September 2020
  • Revise Date: 24 August 2021
  • Accept Date: 28 November 2021