In silico identification of drought responsive miRNAs target genes in Canola (Brassica napus)

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran

2 Department of Water Engineering, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding, and regulatory molecules that play an important role in post gene expression regulation in response to biotic and abiotic stresses. Although Canola (Brassica napus) is a globally important oilseed, little is known about its regulation mechanisms target genes of drought-responsive miRNAs. Then, in this study drought-responsive miRNAs target genes of bna-miR156b, bna-miR156c, bna-miR156g, bna-miR171a, bna-miR171d, bna-miR171e, bna-miR172d, bna-miR399a, bna-miR399b, bna-miR396a, bna-miR395d, bna-miR395e and bna-miR395f in Canola were identified by bioinformatics tools. Molecular function, biological process, cellular component, proteins interaction, and relation of their pathways were investigated. In the present study were identified 225 target genes for miRNAs. Bioinformatics study showed that ribosome, proteasome, and chaperon-related genes of RPP1C, RPL36AA, RPL9D, RPS11, RPT1A, RPT2a, RPT4A, RPN11, HSF1, HSFA1E, HSF4, and HSFB2B are targets of drought-responsive miRNAs of bna-miR172d ،bna-miR156b/c/g، bna-miR860، bna-miR396a and bna-miR395d. Ribosomes, proteasomes, and chaperons are regulated by drought-responsive miRNAs for protein regulation and stress tolerance under drought conditions. Laboratory study of identified genes in this study can be a fundamental step in the production of drought-resistant Canola cultivars in inbreeding and genetic engineering programs.

Keywords

Main Subjects

شناسایی بیوانفورماتیکی ژن­های هدف miRNA­های پاسخ دهنده به تنش خشکی در کلزا    (Brassica napus)

مریم پسندیده ارجمند1، حبیب اله سمیع زاده لاهیجی*1، محمد حسن بیگلویی2 و محمد محسن زاده گلفزانی1

1 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه مهندسی آب

تاریخ دریافت: 25/01/1400          تاریخ پذیرش: 14/07/1400

چکیده

miRNA­ها مولکول­های کوچک، غیرکدکننده و تنظیمی هستند که نقش مهمی در تنظیمات پس از بیان ژن در پاسخ به تنش­های زیستی و غیرزیستی دارند. با این­ که کلزا (Brassica napus) گیاه دانه روغنی بسیار مهمی در سطح جهانی است، هنوز اطلاعات کمی درباره­ی مکانیسم­های تنظیمی ژن­های هدف miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی در آن وجود دارد. لذا در این پژوهش ژن­های هدف miRNA­های پاسخ دهنده به خشکی bna-miR860،bna-miR156b ،bna-miR156c ، bna-miR156g ،bna-miR171a ،bna-miR171d ،bna-miR171e ،bna-miR172d ،bna-miR399a ، bna-miR399b،bna-miR396a ، bna-miR395d، bna-miR395e­ و bna-miR395f در کلزا توسط روش­های بیوانفورماتیکی شناسایی شدند. سپس عملکرد مولکولی، فرآیند بیولوژیکی، اجزای سلولی، برهمکنش پروتئین­ها و ارتباط مسیرهای عملکردی آن­ها مورد بررسی قرار گرفت. در پژوهش حاضر 225 ژن هدف برای miRNA­ها شناسایی شد. بررسی بیوانفورماتیکی نشان داد که ژن­های ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B تحت تاثیر miRNA­های پاسخ دهنده به خشکیbna-miR172d ،bna-miR156b/c/g ، bna-miR860، bna-miR396a و bna-miR395d/e/f قرار می­گیرند و در شرایط تنش خشکی ریبوزوم، پروتئازوم و انواع چاپرون­ها توسط miRNAها در جهت تنظیم پروتئین­ها و تحمل تنش تنظیم می­شوند. بررسی آزمایشگاهی ژن­های شناسایی شده در این پژوهش می­تواند گامی مهم و بنیادین در ایجاد ارقام مقاوم به خشکی کلزا در برنامه­های بهنژادی و مهندسی ژنتیک باشد.

واژه های کلیدی: پروتئازوم، چاپرون، ریبوزوم، IntaRNA،  STRING

* نویسنده مسئول، تلفن: 01333690281،  پست الکترونیکی: hsamizadeh@guilan.ac.ir    

مقدمه

 

تنش­های محیطی مانند خشکی، گرما، شوری و غیره سبب کاهش تولید گیاهان زراعی از جمله کلزا (Brassica napus) می­شوند (16). کلزا یکی از مهم­ترین محصولات روغنی در سراسر جهان است که به خشکی حساس بوده و هر ساله تنش خشکی سبب کاهش شدید عملکرد آن می­شود (70). در شرایط تنش مجموعه­ای از مکانیسم­های تنظیمی ژن مانند تنظیم پس از بیان بمنظور حفظ هموستازی در گیاه اتفاق می­افتد (38 و 68). خاموشی پس از بیان ژن (PTGS) (Post-transcriptional gene silencing) یک مکانیسم تنظیمی برای سرکوب RNA پس از بیان است. این مکانیسم در مراحل رشد و نمو و در پاسخ به تنش­های محیطی مانند خشکی نقش بسیار مهمی دارد. این مکانیسم مهم توسط RNA­های مداخله کننده کوچک (siRNA) (Small interfering RNA) و miRNA  (MicroRNA) انجام می­شود (26). miRNA­ها مولکول­های کوچک، غیرکدکننده و تنظیمی با طول حدود 18 تا 26 نوکلئوتید هستند که از RNA­های بزرگتری که کدکننده پروتئین نیستند، مشتق می­شوند (7). miRNAها نقش مهمی در جنبه­های مختلف رشد و نمو گیاهان اعم از مرفولوژی برگ، تشکیل ریشه­های جانبی، علامت­دهی هورمونی، انتقال از مرحله رویشی به زایشی، تنظیم زمان گلدهی و تولیدمثل برعهده دارند. یکی از نقش­های مهم miRNA گیاهان تنظیمات پس از بیان ژن در پاسخ به تنش­های زیستی و غیرزیستی است (24، 30، 50 و 52). روش­های بیوانفورماتیکی در شناسایی miRNA­های حفاظت شده در گیاهان و جانوران و همچنین شناسایی ژن­های هدف آن­ها بسیار موفق بوده است (4، 46 و 51). شناسایی miRNAها و ژن­های هدف آن­ها در گیاهان از این جهت بسیار حائزاهمیت است که اکثر ژن­های هدف­miRNA ها، ژن­های بسیار مهم مانند فاکتورهای بیانی هستند (53). این موضوع سبب می­شود که­miRNA ها در مرکز تنظیم بیان ژن­ها قرار گیرند (46). هنوز در مورد این ­که تنظیم تولید پروتئین­ها بطور کامل تحت کنترل miRNAهاست، تردید وجود دارد. اما با استفاده از تکنولوژی­های با کارایی بالا مشخص شده است که­miRNAها بر پاسخ­های پروتئینی در شرایط تنش بسیار موثر هستند (16). در آرابیدوپسیس پروتئین­های ریبوزومی توسط ژن­های گوناگون کد می­شوند. ژن­های پروتئین­های ریبوزومی برای نگهداشتن سطح طبیعی پروتئین ریبوزومی در سلول نقش تنظیمی دارند. یکی از این ژن­های مهم RPS11  (Ribosomal protein small subunit) است که پروتئینی ضروری در ساختار ریبوزوم است و با پروتئین­های مهاجم در شرایط تنش برهمکنش ایجاد می­کند (14). در پژوهشی مشخص شد که اعمال تنش خشکی در آرابیدوپسیس سبب افزایش چشمگیر پروتئین­های ریبوزومی می­شود (6). همچنین مطالعه پروتئومیکس نشان داد که در شرایط تنش خشکی خانواده پروتئینی ریبوزوم L6 (RPL) (Ribosomal protein large subunit) افزایش می­یابند. تاخیر رشد مراحل ابتدایی نمو و مرگ رویان با موتاسیون در RPL9C و RPL9D نشان می­دهد که تعداد نسخه و فراوانی این ژن­ها در سلول بسیار حیاتی و مهم است (14). RPP2B (Ribosomal protein P2B) نیز ژن­های ریبوزومی مهمی هستند که در شرایط تنش­های محیطی توسط miRNA­ها مورد هدف قرار می­گیرند (55). ارتباط تنظیمی مهمی بین ژن­های کدکننده پروتئین ریبوزومی و فاکتور شوک حرارتی (HSF)( Heat-shock transcription factor) وجود دارد که می­تواند در شرایط تنش نقش محافظت از پروتئین­های ریبوزومی را داشته باشد. پروتئین­های شوک حرارتی (HSP)( Heat- shock proteins) نقش بسیار کلیدی در بیوژنز ریبوزوم و پردازش rRNA دارند. از طرفی HSPها با چندین مسیر علامت­دهی سلولی، فاکتورهای بیانی و پروتئین­های پاسخ به استرس­های سلولی در ارتباط هستند (42). بدون تردید برای حفظ حیات موجود، کارکرد ریبوزوم­ها و پروتئین­های سنتز شده توسط آن­ها باید تنظیم شوند (8). مطالعات نشان داده است که ریبوزوم­ها خود توسط سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم تنظیم می­شوند (25، 36، 49 و 63). در آرابیدوپسیس PRN11  (Regulatory particle non-triple-A ATPases) ژن هدف miRNA156 است (3). RPN11 نوعی آنزیم DUBs (Deubiquitinating enzymes) مرتبط با پروتئازوم است که با حذف یوبیکوئیتین از پروتئین شرایط را برای دیوبیکوئیتینه شدن فراهم می­کند (48).  miRNA156با اثر بر ژن PRN11 سبب دیوبیکوئیتینه شدن پروتئین­ها می­شود. نقش miRNA162 بر آنزیم­های یوبیکوئیتینه شدن و miRNA408 و miRNA398 بر زیرواحدهای پروتئازوم در شرایط تنش محیطی ثابت شده است (3). اخیراً نقشی از سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم در رابطه با سنتز پروتئین در ریبوزوم­ها عنوان شده است که سوالات زیادی را درباره چگونگی کارکرد این دو سیستم بطور مستقل یا با هم ایجاد کرده است (8). گیاهان از مسیرهای انتقال سیگنال برای درک محرک­های محیطی و تغییرات بیان ژن برای ایجاد یک پاسخ هماهنگ استفاده می­کنند و این موضوع نقش miRNA­ها در هماهنگی تنظیم بیان ژن در شرایط تنش را بطور واضح­تری نمایان می­کند (3 و 48). تنش خشکی در کلزا سالانه سبب کاهش چشمگیر عملکرد می­شود. شناسایی مکانیسم­های تنظیمی پاسخ به تنش بسیار حائز­اهمیت هستند. لذا در این پژوهش انواع miRNA­های موثر در تنش خشکی در گیاهان بویژه کلزا که در سایر مطالعات شناسایی شده­اند تعیین می­شوند و ژن­های هدف آن­ها توسط روش­های بیوانفورماتیکی شناسایی شده و ارتباط مسیرهای عملکردی آن­ها مورد بحث قرار خواهد گرفت.

مواد و روشها

تعیین miRNAهای پاسخ دهنده به تنش خشکی: پس از جمع آوری اطلاعات و مرور منابع و همچنین بررسی پایگاه داده miRBase (http://miRbase.org/)، miRNA­هایی که تغییر بیان آن­ها در تنش، بویژه در تنش خشکی در چندین گیاه از جمله کلزا با روش تعیین توالی miRNA (miRNA sequencing)  ثابت شده بود، انتخاب شدند (جدول 1).

بر این اساس­miRNA هایbna-miR860 ،bna-miR156b ،bna-miR156c ،bna-miR156g ،bna-miR171a ،bna-miR171d ،bna-miR171e ،bna-miR172d ، bna-miR399a، bna-miR399b، bna-miR396a، bna-miR395d،bna-miR395e  و bna-miR395f بمنظور بررسی انتخاب شدند و توالی این miRNAها از پایگاه داده miRBase (http://miRbase.org/) بدست آمد.

 

 

 

جدول 1- اسامی miRNAهای انتخابی در منابع مختلف

References

Stresses

miRNAs

Plants

(22)

Drought

miRNA860

Brassica napus

(5 و 22)

Heat, Drought

miRNA156b/c/g

Brassica rapa

Brassica napus

(17، 22 و 69)

 

Drought

miRNA171a/d/e

 

 

Brassica napus

Arabidopsis thaliana

Oryza sativa

(5، 10، 18، 22 و 69)

 

 

Heat, drought

 

 

miRNA172d

Brassica rapa

Brassica napus

Brassica Juncea

Oryza sativa

Arabidopsis thaliana

(9 و22)

ABA treatment, Drought, Salinity

miRNA399a/b

Arabidopsis thaliana

Brassica napus

(28 و 69)

Drought

miRNA396a

Arabidopsis thaliana

Oryza sativa

(22 و 69)

Drought

miRNA395d/e/f

Brassica napus

Oryza sativa

 

 

شناسایی ژن­های هدف miRNAها : بمنظور شناسایی ژن­های هدف miRNAهای تعیین شده، ابتدا از سرور  psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)  استفاده شد (13) و برای هرکدام از miRNAها ژن­های هدف بالقوه شناسایی شد. ژن­های شناسایی شده دارای منشا گیاهی انتخاب و توالی آن­ها ذخیره شد. سپس برای اطمینان از صحت اتصالmiRNA ها و ژن­های هدف از دو نرم افزار RNAhybrid و IntaRNA نیز با استفاده از پارامترهای پیش­فرض استفاده شد. در هر دو نرم افزار از حداقل انرژی آزاد (mfe) (Minimum free energy) برای پیش بینی اتصال استفاده شده است (31 و 43).

تعیین اسم ژن­ها: برای تعیین اسم ژن­ها از دو سایت NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) و UniProt (https://www.uniprot.org/) استفاده شد. هر کدام از ژن­ها با نام UniRef بدست آمده از psRNATarget جستجو شدند. در صورتی که با نام UniRef قابل جستجو نبودند، از طریق نام کامل در توضیحات موجود در uniprotKB یا براساس BLASTn توالی در NCBI مورد جستجو قرار گرفتند (41 و 54).

بررسی هستی شناسی ژن­ها (GO) و شناسایی مسیرهای عملکردی ژن­های هدف: بمنظور طبقه­بندی عملکرد مولکولی، فرآیند بیولوژیکی، اجزای سلولی و پروتئین از سیستم رده بندی PANTHER (http://www.pantherdb.org ) استفاده شد (34). جهت بررسی هستی شناسی ژن­های شناسایی شده از پایگاه بیوانفورماتیک DAVID (v6.8) (https://david.ncifcrf.gov/) و سایت KEGG (https://www.genome.jp/kegg/) با استفاده از پارامترهای پیش­فرض استفاده شد (23).

بررسی برهمکنش پروتئین- پروتئین (PPI): برای رسم شبکه ژنی از STRING (نسخه 11) (https://string-db.org/) و همچنین افزونهSTRING  در نرم افزار Cytoscape (نسخه 2.8.3) با پارامترهای پیش­فرض استفاده شد (37 و 56). سپس شبکه ژنی آنالیز شد و ژن­های با درجه ارتباط بیش­تر یا مساوی 5 انتخاب شدند. برای شناسایی ژن­های مهم در شبکه از افزونه  CytoHubba در نرم افزار Cytoscape و با استفاده از روش MCC  (Maximal clique centrality) استفاده شد (40).

کنترل صحت ژن­های انتخاب شده: پس از انتخاب ژن­ها بمنظور تعیین صحت وجود ژن در کلزا ابتدا توالی ژن­ها در NCBI بلاست شد و پس از آن توالی ژن در کلزا بدست آمد و مورد هدف قرارگرفتن ژن توسط miRNA مورد نظر در psRNATarget، RNAhybrid و IntaRNA نیز تایید شد. سپس برهمکنش پروتئینی ژن­های انتخاب شده و ارتباط مسیرهای عملکردی ژن­ها مورد بررسی قرارگرفت.

در نهایت براساس مسیرهای عملکردی شناسایی شده از پایگاه بیوانفورماتیک DAVID، بررسی برهمکنش ژن­ها در شبکه پروتئینی و همچنین مرور منابع در مورد ژن­های انتخاب شده در سایر گیاهان، تعداد 12 عدد از مهم­ترین ژن­های موثر در تنش خشکی بعنوان کلیدی­ترین ژن­های هدف miRNA­های پاسخ دهنده به تنش خشکی در کلزا انتخاب شدند و ارتباط مسیرهای عملکردی آن­ها مورد بحث قرار گرفت.

نتایج

پس از انتخاب miRNA­های پاسخ دهنده به تنش خشکی و جمع آوری اطلاعات از تغییر بیان آن­ها در شرایط تنش در مطالعات miRNA-seq، توالی miRNA بالغ از طریق پایگاه داده miRBase بدست آمد. پس از جستجوی امکان اتصال توالی بالغ miRNA­ها به ژن­های هدف در psRNATarget، تعداد 571 ژن هدف برای miRNAها شناسایی شد. پس از بررسی مجدد ژن­ها در UniProt و NCBI، تعداد 225 ژن انتخاب شدند و سایر ژن­ها بدلایل مختلف مانند ناشناخته بودن ژن­ها یا فاقد توالی شناسایی شده کامل حذف شدند. اتصال miRNA به توالی هدف براساس حداقل  انرژی  آزاد

در RNAhybrid و IntaRNA نیز مورد بررسی قرار گرفت.

در نهایت بترتیب برایbna-miR860 ،bna-miR156b/c/g ، bna-miR171a/d/e ، bna-miR172d ،bna-miR399a/b، bna-miR396a، bna-miR395d/e/f تعداد 17، 50، 16، 36، 13، 59 و 34 ژن هدف شناسایی شد. پس از آن ژن­های شناسایی شده از نظر مسیرهای عملکردی و برهمکنش پروتئین نیز مورد بررسی قرار گرفتند. عملکرد مولکولی ژن­ها مربوط به فعالیت آداپتور مولکولی GO:0060090))( Molecular adaptor activity)، اتصال (GO:0005488) (Binding)، فعالیت مولکول ساختاری (GO:0005198) (Structural molecule activity)، تنظیم کننده عملکرد مولکولی GO:0098772))، فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) و فعالیت ترانسپورتری (GO:0005215) بود. فرآیندهای بیولوژیکی ژن­های شناسایی شده نیز شامل فرآیندهای سلولی (GO:0009987)، جانمایی (Localization)(GO:0051179) ، تعامل بین گونه­ای ارگانیسم­ها (Interspecies interaction between organisms) (GO:0044419)، تنظیم بیولوژیکی GO:0065007))، پاسخ دهنده به محرک­ها (GO:0050896)، علامت­دهی (GO:0023052)، فرآیندهای نموی (GO:0032502)، فرآیندهای ارگانیسمی پرسلولی (Multicellular organismal process) (GO:0032501) و فرآیندهای متابولیکی (GO:0008152) بود. اجزای سلولی نیز شامل ساختار سلول (Cellular anatomical entity) (GO:0110165)، کمپلکس پروتئینی (Protein-containing complex) (GO:0032991) و درون سلولی (Intracellular) (GO:0005622) بود. بیش­ترین فراوانی در عملکرد مولکولی ژن­ها مربوط به فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) (4/%45) و اتصالGO:0005488) ) (%30) بود. همچنین بیش­ترین فراوانی در فرآیندهای بیولوژیکی مربوط به فرآیندهای سلولی  (GO:0009987)(5/%39)، فرآیندهای متابولیکی GO:0008152)) (5/%33) و تنظیم بیولوژیکی GO:0065007)) (5/%13) بود. بیش­ترین فراوانی اجزای سلولی نیز شامل ساختار سلولی (GO:0110165) (5/47 %)  و درون سلولی (GO:0005622) (5/%41) بود (شکل 1).

طبقه­بندی پروتئین­ها در PANTHER نیز نشان داد که پروتئین­ها شامل آنزیم­های تغییردهنده پروتئین (PC00260)، ترانسپورتر (PC00227)، پروتئین­های غشایی (PC00150)، چاپرون (PC00072)، پروتئین­های متابولیسم اسیدنوکلئیک (PC00171)، گیرنده علامت­دهی غشا (Transmembrane signal receptor) (PC00197)، پروتئین­های متصل شونده به کلسیم (PC00060)، پروتئین­های اسکلت سلولی (PC00085)، تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن (PC00264)، پروتئین­های تنظیمی (PC00263)، آنزیم­های تبدیل متابولیتی (PC00262) و کروماتین/ اتصال کروماتین یا پروتئین­های تنظیمی مرتبط با کروماتین­ها (Chromatin/chromatin-binding, or -regulatory protein) (PC00077) بود. بیش­ترین فراوانی طبقه­بندی پروتئین­ها مربوط به آنزیم­های تغییردهنده متابولیت­ها (PC00262) (1/%28)، آنزیم­های تغییردهنده پروتئین (PC00260) (%18)، ترانسپورتر (PC00227) (3/%13)، پروتئین­های متابولیسم اسیدنوکلئیک (PC00171) (7/%11) و تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن­ (PC00264) (5/%12) بود (شکل 1). بررسی هستی شناسی ژن­ها در DAVID نیز نشان داد که بیش­ترین فرآیند بیولوژیکی ژن­های مورد بررسی مربوط به بیان و تنظیم بیان بود. همچنین بیش­تر ژن­های مورد بررسی در مسیر متابولیکی نقش داشته و در هسته و سیتوسول حضور دارند و بیش­تر آن­ها از نظر عملکرد مولکولی نقش اتصال به ATP، پروتئین و فعالیت فاکتور بیانی و اتصال به جایگاه اختصاصی در DNA را دارا می­باشند. بررسی مسیر عملکردی ژن­ها در DAVID نشان داد که اکثر ژن­های شناسایی شده مربوط به مسیرهای متابولیکی هستند.

آنالیز شبکه پروتئینی و تعیین درجه اتصال 225 ژن شناسایی شده در Cytoscape نشان داد که ژن­های RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B برهمکنش بسیار زیادی در شبکه پروتئینی داشته و با سایر ژن­ها ارتباط زیادی دارند (شکل 2 و 4). ژن HSP81.4 نیز برهمکنش زیادی در شبکه پروتئینی داشت و بعنوان ژن هدف miRNA396a در psRNATarget و IntaRNA شناسایی شد.

 

 

       
 

A

 
 

B

 
 

 

 

 

 

C

 

D

 

 

 

 

 

 

شکل 1- نمودار دایره­ای هستی شناسی ژن­های هدف miRNA­ها در  A .PANTHER: عملکرد مولکولی، B: فرآیندهای بیولوژیکی، C: اجزای سلولی، D: طبقه بندی پروتئین

 

اما در RNAhybrid موردتایید قرار نگرفت. لذا جهت افزایش صحت انتخاب بعنوان مهم­ترین ژن­ها معرفی نگردید. پس از آنالیز شبکه پروتئینی، صحت وجود ژن­های مذکور در کلزا و موردهدف قرارگرفتن آن توسط miRNA­های پاسخ دهنده به خشکی (جدول 2 و شکل 3) و همچنین مسیرهای عملکردی آن­ها (شکل 5) نیز مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی هستی شناسی 12 ژن کاندید نشان داد که عملکرد مولکولی 7/46 درصد مربوط به اتصال GO:0005488)) و 7/26 درصد مربوط به تنظیم کننده عملکرد مولکولی (GO:0098772)، 3/13 درصد فعالیت مولکول ساختاری (GO:0005198) و 3/13 درصد ژن­ها نیز مربوط به فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) می­باشد.

 

شکل 2- برهمکنش شبکه پروتئین-پروتئین با استفاده از STRING برای ژن­های شناسایی شده

RPT1A

bna-miR172d

 

 

RPT2a

bna-miR396a

 

 

RPL9D

bna-miR172d

 

 

RPL36AA

bna-miR156b/c/g

 

 

RPP1C

bna-miR156b/c/g

 

 

HSF1

bna-miR395d/e/f

 

 

RPT4A

bna-miR396a

 

 

RPS11

bna-miR860

 

 

HSFB2B

bna-miR395d/e/f

 

 

HSF4

bna-miR395d/e/f

 

 

HSFA1E

bna-miR395d/e/f

 

 

RPN11

bna-miR156b/c/g

 

 

 

 

شکل 3- اتصال miRNA به ژن هدف براساس حداقل انرژی آزاد در RNAhybrid

 

جدول 2- اطلاعات کلی اتصال miRNA­ها به توالی­های هدف بر اساس حداقل انرژی آزاد در intaRNA

Hybridization Energy (kcal/mol)

Energy

(kcal/mol)

Target RNA

position

miRNA position

miRNA

Gene

-20.53

-18.59

584-599

1-16

bna-miR156b/c/g

 

1-AT5G47700 (RPP1C)

 

-16.99

-14.78

444-458

4-18

bna-miR156b/c/g  

 

2-AT3G23390 (RPL36AA)

 

-18.23

-14.6

142-155

2-15

bna-miR172d

3-AT4G10450 (RPL9D)

 

-20.44

-15

515-534

1-20

bna-miR860

 

4-AT5G23740 (RPS11)

 

-21.99

-14.01

988-1006

1-19

bna-miR172d

 

5-AT1G53750 (RPT1A)

-15.7

-15.01

1328-1338

8-18

bna-miR396a

 

6-AT4G29040 (RPT2a)

 

-18.66

-11.57

230-248

2-20

bna-miR396a

 

7-AT5G43010 (RPT4A)

 

-21.42

-17.96

1045-1062

1-18

bna-miR156b/c/g  

 

8-AT5G23540 (RPN11)

 

-28.58

-25.71

265-281

2-18

bna-miR395d/e/f

9-AT4G17750 (HSF1)

 

-19.06

-13.44

915-927

1-13

bna-miR395d/e/f

 

10-AT3G02990 (HSFA1E)

-23.36

-20.64

504-520

2-18

bna-miR395d/e/f

 

11-AT4G36990 (HSF4)

 

-23.28

-20.76

710-726

2-18

bna-miR395d/e/f

12-AT4G11660 (HSFB2B)

 

 

شکل 4- برهمکنش شبکه پروتئین-پروتئین با استفاده از STRING برای ژن­های معرفی شده

 

فرآیندهای بیولوژیکی بترتیب 8/34، 8/34، 1/26 و 3/4 درصد ژن­ها مربوط به فرآیندهای سلولی (GO:0009987)، فرآیندهای متابولیکی (GO:0008152)، تنظیم بیولوژیکی (GO:0065007) و پاسخ به محرک­ها (GO:0050896) بود. همچنین بررسی اجزای سلولی ژن­های کاندید نشان داد که بترتیب 3/42، 8/30 و 9/26 درصد ژن­ها مربوط به فضای بین سلولی (GO:0005622)، ساختار سلول (GO:0110165) و کمپلکس­های پروتئینی (GO:0032991) بود. طبقه­بندی پروتئین ژن­های کاندید نیز نشان داد که بترتیب 7/41، 3/33 و 25 درصد ژن­ها، پروتئین­های ترجمه (PC00263)، تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن (PC00264) و آنزیم تغییردهنده پروتئین (PC00260) (Protein modifying enzyme) بود. مسیرهای عملکردی شناسایی شده ژن­های کاندید شامل پروتئازوم، ریبوزوم و چاپرون­ها بود. برخی از ژن­های کاندید در سیتوپلاسم و برخی نیز فقط در هسته فعالیت دارند.

 

 

 

 

شکل 5- مسیر KEGG ژن­های ریبوزوم و پروتئازوم در DAVID

 

 

بحث و نتیجه گیری

ژن­های هدف miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی می­توانند نقش مهمی در شبکه تنظیمی پاسخ گیاه به خشکی را ایفا کنند. شناسایی ژن­های تنظیمی مهم در این پژوهش بعنوان ژن هدف miRNAها، نشان دهنده این است که ژن­های تنظیمی خود توسط تنظیم­کننده­های دیگری مانند miRNAها تنظیم می­شوند. ژن­های ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی از ژن­های بسیار مهم تنظیمی هستند (8، 21 و 48). در جانوران حدود 60 درصد از ژن­های کدکننده پروتئین توسط­­miRNA ها تنظیم می­شوند. در گیاهان تعداد ژن­هایی که توسط­miRNA ها تنظیم می­شوند، بسیار کم­تر شناسایی شده­اند (53). بنابراین شناسایی مهم­ترین ژن­های تنظیمی در واکنش به تنش خشکی می­تواند درک بهتری از مکانیسم شبکه تنظیمی در پاسخ به تنش را ایجاد کند. 81 پروتئین ریبوزومی مختلف در آرابیدوپسیس شناسایی شده است که نقش بسیار مهمی در ساخت پروتئین دارند (45). نتایج پژوهش حاضر نشان داده است که ژن RPP1C توسط bna-miR156b/c/g سرکوب می­شود. در شرایط تنش خشکی ژن­های کدکننده پروتئین­های ریبوزومی خانواده S60 مانند RPP1C نقش مهمی برعهده دارند و تنش خشکی سبب افزایش RPP1C و RPL36AA می­شود (6). همچنین در تنش خشکی میزان بیان bna-miR156b/c/g در کلزا افزایش می­یابد (22). احتمالاً افزایش بیان پروتئین­های ریبوزومی در شرایط تنش نوعی مکانیسم پاسخ دهنده در جهت افزایش سنتز پروتئین­های موردنیاز موجود است و افزایش bna-miR156b/c/g می­تواند نقش تنظیمی برای کاهش بیش از حد پروتئین­های ریبوزومی داشته باشد. در پژوهشی مشخص شد که RPL9D از ژن­های مهم در ساخت پروتئین­های ریبوزومی است (14) که مورد هدف miRNA172d قرار می­گیرد. در تنش خشکی بیان bna-miR172d در کلزا افزایش می­یابد (22). افزایش بیان bna-miR172d سبب برش و سرکوب ژن ریبوزومی RPL9D می­شود. بالعکس در خشکی بیان bna-miR860 در کلزا کاهش می­یابد (22). با کاهش بیان bna-miR860 انتظار می­رود که بیان ژن RPS11 افزایش یابد و یا حداقل کمتر تحت اثر این miRNA قرار بگیرد. کاهش bna-miR860 نشان می­دهد که تغییر بیان miRNAهای موثر بر ژن­های ریبوزومی نمی­تواند کاهش سنتز پروتئین­ها توسط ریبوزوم­ها را به اثبات برساند. با این حال تغییر بیان miRNAهای سرکوب کننده ژن­های ریبوزومی نشان از اهمیت زیرواحدهای ریبوزومی در تنظیم پاسخ به تنش خشکی دارد و این موضوع اهمیت مطالعه بیش­تر در زمینه تغییر بیان زیرواحدهای ریبوزومی در تنش خشکی را مطرح می­کند. در پژوهشی آنالیز فیلوژنتیکی ژن­های ریبوزومی RPL9 در براسیکاسه و سایر گیاهان دولپه و تک لپه نشان داد که تعداد نسخه­های تکثیر ژن RPL9 در گونه­های مختلف متفاوت است و وجود چندین کپی از ژن­های ریبوزومی خانواده ژنی RPL4، RPL5، RPL27a، RPL36a و RPS6 در براسیکاسه بسیار حفاظت شده بوده و حاصل دوبرابر شدن ژنوم و یا حذف ژن در طی تکامل گونه است. همچنین نتایج این تحقیق نشان داد که عملکرد خانواده ژنی RPL9  بسیار وابسته به تعداد نسخه­های ژنی در سلول است (14). بنابراین miRNA172d بعنوان یکی از عوامل تنظیمی، می­تواند در تنظیم عملکرد RPL9  موثر باشد. با توجه به مورد هدف قرارگرفتن پروتئین­های ریبوزومی و همچنین تغییر بیان ژن­های سازنده پروتئین­های ریبوزومی در تنش خشکی، به احتمال زیاد ژن­های کدکننده پروتئین­های ریبوزومی نقش بسیار مهمی را در مکانیسم دفاعی پاسخ به تنش برعهده دارند.

تحقیقات اخیر نشان داده است که پروتئین­ها پس از ساخته شدن در ریبوزوم­ها می­توانند برای تنظیم به سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم یا سیستم اتوفاژی وارد شوند (8). انتقال پروتئین از ریبوزوم به مسیر پروتئازوم یا اتوفاژی اهمیت نقش miRNA­ها را در تنظیم و هماهنگی این مسیرها بیش از پیش نمایان می­کند. سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم یک کمپلکس پروتئینی وابسته به ATP برای تغییر و یا تخریب پروتئین است (12). در شرایط تنش خشکی، پروتئین­ها تغییر شکل داده و در سلول تجمع می­یابند. در یوکاریوت­ها تجزیه اکثر پروتئین­ها توسط پروتئازوم انجام می­شود (11). تغییر در ساختار، جایابی و پایداری پروتئین می­تواند بر عملکرد آن موثر باشد و عملکرد صحیح پروتئین­ها وابسته به تجزیه آن­ها است (62). با تغییر پروتئین در شرایط تنش خشکی، پروتئین هدف توسط آنزیم­های E1 (ubiquitin-activating enzyme; UBA)، E2 (ubiquitin-conjugating enzyme; UBC) و E3 (ubiquitin ligase; UBL) توسط یک یا چند مولکول یوبیکوئیتین یوبیکوئیتینه می­شود (48). بر خلاف اتصال برگشت پذیر زنجیره یوبیکوئیتین، مرحله دوم اتصال محکم­تری به پروتئازوم را توسط RPT1-6 ایجاد می­کند و شرایط را برای تخریب پروتئین فراهم می­کند (39). پلیمر یوبیکوئیتین بصورت کووالانسی به پروتئین هدف متصل می­شود. اتصال یوبیکوئیتین به پروتئین نوعی نشانه­گذاری برای تجزیه پروتئین در پروتئازوم است (62). اتصال سوبسترا باعث ایجاد تغییرات ساختاری در 19S RP (بخش تنظیمی) می­شود که باعث فعال شدن پروتئازوم و باز شدن مسیر برای ورود پلی پپتید به 20S CP (بخش مرکزی) می­شود (32). ابتدا پروتئین باز شده و سپس توسط فعالیت پروتئازی20S CP به پپتیدهای کوتاه 3 تا 20 آمینواسیدی شکسته می­شود (48). RPT1A و RPT2a نقش تنظیمی در عملکرد پروتئازوم ایفا می­کنند و نتایج این پژوهش نشان داد که این بخش­های تنظیمی نیز خود توسط miRNA­ها مورد هدف قرار می­گیرند.miRNA172d  با mRNA ژن RPT1A پروتئازومی مکمل شده و آن را برش می­زند. در شرایط تنش خشکی bna-miR172d در کلزا بطور چشمگیری افزایش بیان پیدا می­کند (22). افزایش این miRNA­ها سبب اتصال بیش­تر به توالی هدف می­شود و در نتیجه تعداد بیش­تری از نسخه­های بیان شده ژن را سرکوب می­کند. بنابراین انتظار می­رود که کاهش mRNA ژن RPT1A در خشکی  اهمیت زیادی داشته باشد. کاهش بیان ژن­های تنظیمی پروتئازوم سبب افزایش فعالیت PTGS می­شود (26). برش ژن RPT2a و RPT4A توسطmiRNA396a  می­تواند سبب سرکوب این ژن تنظیمی در پروتئازوم و کاهش شناسایی پروتئین­های هدف توسط پروتئازوم شود. درنتیجه ATP مصرفی برای  شناسایی و اتصال پروتئین آسیب دیده به پروتئازوم کاهش می­یابد و پروتئین­های آسیب دیده توسط مکانیسم خاموشی بیان ژن در مرحله بیان و پس از بیان تنظیم می­شوند (26).RPT2a  در مسیر علامت­دهی نقش مهمی در افزایش مقاومت گیاه به تنش­های محیطی دارد. نقشRPT2a  درتحمل به تنش گرما، کمبود روی و بیماری به اثبات رسیده است (27، 44 و 64).miRNA ­ها می­توانند با اثر بر پروتئین­های پروتئازومی بر تجزیه پروتئین نیز اثر بگذارند. در شرایط تنش زیرواحد RPT2a شروع کننده خاموشی پس از بیان است و ایجاد موتاسیون در این ژن سبب سرکوب PTGS می­شود و در نتیجه این عمل سبب تجمع پروتئین در سلول می­شود.RPT2a  عملکرد خاصی را به پروتئازوم در PTGS می­دهد (26) و با اثر بر افزایش تجمع siRNAها سبب افزایش PTGS می­شود. در واقع RPT2a با سرکوب ماشین کنترل کیفی سبب افزایش PTGS در شرایط تنش می­شود (26). بنابراین می­توان مورد هدف قرار گرفتن ژن RPT2a توسط miRNA را عاملی برای افزایش siRNAها و مرکز اصلی شروع فرآیند PTGS دانست. ممکن است سرکوب شدن بیان RPT1A نیز مرتبط با افزایش PTGS در تنش ­باشد. در واقع افزایش بیانmiRNA172d  در تنش خشکی، سبب سرکوب بیش­تر RPT1A که مسئول شناسایی ژن­های هدف برای تخریب است، می­شود و فعالیت پروتئازوم بنفع PTGS کاهش می­یابد. دیوبیکوئیتینه شدن پروتئین نیز توسط آنزیم DUBs انجام می­شود (48). miRNA156 سبب سرکوب ژن RPN11 که ژن دیوبیکوئیتینه است، می­شود. در پژوهشی موتاسیون اجزای RP در پروتئازوم سبب کاهش تحمل به تنش در آرابیدوپسیس شد. آرابیدوپسیسی که دارای ژن موتانت RPN10 بود، تحمل کم­تری نسبت به شوری، گرما و پرتو UV داشت (47). همچنین موتانت RPN1a به تنش شوری و گرما حساس بود (61). در پژوهش دیگر موتاسیون در RPN12a و RPT2a سبب کاهش تحمل تنش گرما (27) و موتاسیون در RPT5a سبب کاهش تحمل کمبود روی شد (44). miRNA­های سرکوب کننده ژن­های پروتئازوم در کلزا بطور هماهنگ افزایش بیان می­یابند (22). افزایش بیان این miRNAها در خشکی می­تواند نشان دهنده کاهش فعالیت پروتئازوم و در نتیجه افزایش فعالیت PTGS باشد. بنظر می­رسد تنظیم پروتئازوم نقش بسیار مهمی در مقاومت به تنش خشکی برعهده دارد. برای محدود کردن اثرات مخرب گسترش و تجمع پروتئین­ها در تنش خشکی، سلول­ها چندین مسیر تاشدگی و تجزیه­­­شدن را برای بازگشت بحالت طبیعی بکار می­گیرند (35). مسیر دیگر برای بهبود و محدودکردن تجمع پروتئین­های آسیب دیده، استفاده از چاپرون­ها است. چاپرون­ها مولکول­هایی هستند که بازشدن برگشت ناپذیر پروتئین را محدود می­کنند و با ممانعت از تجمع پروتئین­ها سبب تاشدن صحیح پروتئین­ها می­شوند و در صورت عدم ترمیم پروتئین­های آسیب دیده آن­ها را از بین می­برند (19). همچنین ترکیباتی که مانند چاپرون عمل می­کنند، می­توانند سبب حفظ پایداری آنزیم­های تثبیت کننده CO2، کاهش تجمع ROS، حفظ ساختار پروتئین­ها، افزایش فعالیت آنزیم­ها و در نهایت کاهش اثر تنش شوند (1 و 2). HSP­ها همچنین برای پاکسازی پروتئین­های تجمع یافته به پروتئازوم­ها وابسته هستند. فاکتور شاتلUbiquilin 2 اتصالاتHSP70  را شناسایی کرده و آن­ها را برای تجزیه به مجموعه پروتئازوم می­رساند (19). هم افزایی HSP­ها و پروتئازوم در برهمکنش با تنش­های محیطی سبب کاهش تجمع پروتئین­های آسیب دیده در سلول می­شود (33). در آرابیدوپسیس ژن­های  HSF1و HSFA1E بطور مداوم بیان می­شوند و مسئول تحریک و راه اندازی پاسخ به تنش حرارتی هستند. این فاکتورهای بیانی به فاکتورهای تنش حرارتی متصل می­شوند (65).  bna-miR395d/e/fدر شرایط تنش خشکی کاهش می­یابد (22). بنابراین انتظار می­رود که بیان ژن­های HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B در این شرایط افزایش یابد. در آرابیدوپسیس HSF4 و HSFB2B سبب سرکوب تحریک HSP­ها در زمان ریکاوری پس از تنش می­شوند (20). آنالیز بیان ژن نشان داده است که ایزوفرم­های HSF70 در شرایط خشکی، گرما، شوری و  ABAموثر هستند (57). مطالعات بیش بیانی و سرکوب بیان ژن­های HSF70 در گیاهان توتون، سویا و مرکبات نقش محافظتی آن­ها را در طول تنش خشکی نشان می­دهد (66). از طرفی bna-miR395d/e/f کلزا در خشکی افزایش یافته و انتظار می­رود که بیان HSP81-4 کاهش یابد. در برنج بیان ژن­های OsHSP90-2 و OsHSP90-4 که مشابه HSP81-4 است، در خشکی، سرما، گرما و شوری افزایش یافت (67). HSFA1E، HSFA7b و HSFB2B بوسیله افزایش بیان HSFA3 تحریک می­شوند، بیان بیش از حد HSFA3 در شرایط معمول باعث افزایش بیان HSFA1E می­شود. اما بیان HSFA2 را که توسط HSFA1E  پس از گرما یا تنش نور زیاد ایجاد می­شود را افزایش نمی­دهد. این اتصالات پیچیده و حلقه­های بازخورد نشان می­دهد که چندین سیگنال ورودی می­توانند پاسخ­های همپوشان اما متفاوت HSF / HSP را فعال کنند (21). احتمالاً پس از سنتز پروتئین­ها در ریبوزوم بخش مهمی از پاسخ گیاهان در برابر تنش خشکی مربوط به تغییر یا تجزیه پروتئین­ها در ارتباط با چاپرون­ها و پروتئازوم است. تنظیم هماهنگی بین این واحدها نیز خود در گرو عوامل تنظیمی دیگر مانند miRNA­های پاسخ دهنده به خشکی است. بطور کلی نتایج بررسی بیوانفورماتیکی در این پژوهش نشان داد که ژن­های ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B تحت تاثیر miRNA­های پاسخ دهنده به خشکیbna-miR156b/c/g ،bna-miR172d ، bna-miR860، bna-miR396a و bna-miR395d/e/f قرار می­گیرند و احتمالاً در شرایط تنش زیرواحدهای سازنده ریبوزوم، پروتئازوم و انواع چاپرون­ها جهت کاهش یا افزایش تجزیه پروتئین­ها بنفع سیستم تنظیمی  PTGSو برای حفظ حیات موجود تغییر می­یابند. در سایر مطالعات نقش miRNAهای مورد بررسی در این پژوهش در شرایط خشکی با روش­های پیشرفته آزمایشگاهی در کلزا و سایر گیاهان به اثبات رسیده است (جدول 1). این پژوهش بمنظور شناسایی ژن­های هدف این miRNAها و بررسی ارتباط مسیرهای عملکردی آن­ها نسبت به یکدیگر انجام شده است. بر اساس نتایج بدست آمده پیشنهاد می­شود که با اعمال تنش خشکی در ارقام مختلف گیاه کلزا، بیان miRNAهای پیشنهادشده و ژن­های هدف شناسایی شده در این پژوهش با روش­های آزمایشگاهی بررسی شود تا بتواند گامی مهم و بنیادین برای شناسایی ژن­های مهم جهت ایجاد ارقام مقاوم به خشکی کلزا در برنامه­های بهنژادی و مهندسی ژنتیک باشد.

1- سلیمانی اقدم، م.، نادری، ر.، عسکری سرچشمه، م.، بابالار، م. 1398. تاثیر تیمار قبل و پس از برداشت گاما آمینوبوتیریک اسید (GABA) بر کنترل سرمازدگی گل شاخه بریده آنتوریوم (Anthurium andraeanum L). مجله زیست شناسی ایران. 32 (1): 86-96.
2- علیخانی، ع.، عباسپور، ح.، صفی پور افشار، ا.، متولی زاده کاخکی، ع. 1398. تاثیر هورمون متیل جاسمونات بر تجمع کادمیوم، ظرفیت آنتی اکسیدانی و برخی صفات فیزیولوژیک دانه رست گندم (Triticum aestivum L). مجله زیست شناسی ایران. 32(4): 764-774.
3- Abreu, P. M., Gaspar, C. G., Buss, D. S., Ventura, J. A., Ferreira, P. C. and Fernandes, P. M. 2014. Carica papaya microRNAs are responsive to Papaya meleira virus infection. PloS One, 9(7): e103401.
4- Achakzai, H. K., Barozai, M. Y. K., Din, M., Baloch, I. A. and Achakzai, A. K. K. 2018. Identification and annotation of newly conserved microRNAs and their targets in wheat (Triticum aestivum L.). PloS One, 13(7): e0200033.
5- Ahmed, W., Xia, Y., Li, R., Bai, G., Siddique, K. H. and Guo, P. 2020. Non-coding RNAs: Functional roles in the regulation of stress response in Brassica crops. Genomics, 112(2): 1419-1424.
6- Alqurashi, M., Chiapello, M., Bianchet, C., Paolocci, F., Lilley, K. S. and Gehring, C. 2018. Early responses to severe drought stress in the Arabidopsis thaliana cell suspension culture proteome. Proteomes, 6(4): 38.
7- Ambros, V., Bartel, B., Bartel, D. P., Burge, C. B., Carrington, J. C., Chen, X., Dreyfuss, G., Eddy, S. R., Griffiths-Jones, S. A. M., Marshall, M. and Matzke, M. 2003. A uniform system for microRNA annotation. RNA, 9(3): 277-279.
8- An, H. and Harper, J.W. 2020. Ribosome abundance control via the ubiquitin–proteasome system and autophagy. Molecular Biology, 432(1): 170-184.
9- Baek, D., Chun, H. J., Kang, S., Shin, G., Park, S. J., Hong, H., Kim, C., Kim, D. H., Lee, S. Y., Kim, M. C. and Yun, D. J. 2016. A role for Arabidopsis miR399f in salt, drought, and ABA signaling. Molecules and Cells, 39(2): 111.
10- Bhardwaj, A. R., Joshi, G., Pandey, R., Kukreja, B., Goel, S., Jagannath, A., Kumar, A., Katiyar-Agarwal, S. and Agarwal, M. 2014. A genome-wide perspective of miRNAome in response to high temperature, salinity and drought stresses in Brassica juncea (Czern) L. PloS One, 9(3): e92456.
11- Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y. and Hochstrasser, M. 2017. Proteasome structure and assembly. Molecular Biology, 429(22): 3500-3524.
12- Collins, G. A. and Goldberg, A. L. 2017. The logic of the 26S proteasome. Cell, 169(5): 792-806.
13- Dai, X., Zhuang, Z. and Zhao, P. X. 2018. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research, 46(W1): W49-W54.
14- Devis, D., Firth, S. M., Liang, Z. and Byrne, M. E. 2015. Dosage sensitivity of RPL9 and concerted evolution of ribosomal protein genes in plants. Frontiers in plant science, 6:1102.
15- Finley, D. 2009. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annual Review of Biochemistry, 78: 477-513.
16- Gharechahi, J., Sharifi, G., Mirzaei, M., Zeinalabedini, M. and Salekdeh, G. H. 2019. Abiotic stress responsive microRNome and proteome: How correlated are they?. Environmental and Experimental Botany, 165: 150-160.
17- Hajdarpašić, A. and Ruggenthaler, P. 2012. Analysis of miRNA expression under stress in Arabidopsis thaliana. Basic Medical Sciences, 12(3): 169.
18- Han, Y., Zhang, X., Wang, Y. and Ming, F. 2013. The suppression of WRKY44 by GIGANTEA-miR172 pathway is involved in drought response of Arabidopsis thaliana. PLoS One, 8(11): e73541.
19- Hjerpe, R., Bett, J. S., Keuss, M. J., Solovyova, A., McWilliams, T. G., Johnson, C., Sahu, I., Varghese, J., Wood, N., Wightman, M. and Osborne, G. 2016. UBQLN2 mediates autophagy-independent protein aggregate clearance by the proteasome. Cell, 166(4): 935-949.
20- Ikeda, M., Mitsuda, N. and Ohme-Takagi, M. 2011. Arabidopsis HsfB1 and HsfB2b act as repressors of the expression of heat-inducible Hsfs but positively regulate the acquired thermotolerance. Plant Physiology, 157(3): 1243-1254.
21- Jacob, P., Hirt, H. and Bendahmane, A. 2017. The heat‐shock protein/chaperone network and multiple stress resistance. Plant Biotechnology, 15(4): 405-414.
22- Jian, H., Wang, J., Wang, T., Wei, L., Li, J. and Liu, L. 2016. Identification of rapeseed microRNAs involved in early stage seed germination under salt and drought stresses. Frontiers in Plant Science, 7: 658.
23- Jiao, X., Sherman, B. T., Huang, D. W., Stephens, R., Baseler, M. W., Lane, H. C. and Lempicki, R. A. 2012. DAVID-WS: a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis. Bioinformatics, 28(13): 1805-1806.
24- Jones-Rhoades, M. W. and Bartel, D. P. 2004. Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Molecular Cell, 14(6): 787-799.
25- Juszkiewicz, S. and Hegde, R. S. 2018. Quality control of orphaned proteins. Molecular cell, 71(3): 443-457.
26- Kim, M. H., Jeon, J., Lee, S., Lee, J. H., Gao, L., Lee, B. H., Park, J. M., Kim, Y. J. and Kwak, J. M. 2019. Proteasome subunit RPT2a promotes PTGS through repressing RNA quality control in Arabidopsis. Nature Plants, 5(12): 1273-1282.
27- Kurepa, J., Toh‐e, A. and Smalle, J. A. 2008. 26S proteasome regulatory particle mutants have increased oxidative stress tolerance. The Plant, 53(1): 102-114.
28- Liu, H. H., Tian, X., Li, Y. J., Wu, C. A. and Zheng, C. C. 2008. Microarray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsis thaliana. RNA, 14(5): 836-843.
29- Lv, Q., Zhang, L., Zan, T., Li, L. and Li, X. 2020. Wheat RING E3 ubiquitin ligase TaDIS1 degrade TaSTP via the 26S proteasome pathway. Plant Science, 296: 110494.
30- Mallory, A. C. and Vaucheret, H. 2006. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants. Nature Genetics, 38(6): S31-S36.
31- Mann, M., Wright, P. R. and Backofen, R. 2017. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA–RNA interactions. Nucleic Acids Research, 45(W1): W435-W439.
32- Matyskiela, M.E., Lander, G. C. and Martin, A. 2013. Conformational switching of the 26S proteasome enables substrate degradation. Nature Structural and Molecular Biology, 20(7): 781.
33- McLoughlin, F., Kim, M., Marshall, R. S., Vierstra, R. D. and Vierling, E. 2019. HSP101 interacts with the proteasome and promotes the clearance of ubiquitylated protein aggregates. Plant Physiology, 180(4): 1829-1847.
34- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T. and Thomas, P. D. 2013. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols, 8(8): 1551-1566.
35- Mogk, A., Bukau, B. and Kampinga, H. H. 2018. Cellular handling of protein aggregates by disaggregation machines. Molecular Cell, 69(2): 214-226.
36- Nguyen, A. T., Prado, M. A., Schmidt, P. J., Sendamarai, A. K., Wilson-Grady, J. T., Min, M., Campagna, D. R., Tian, G., Shi, Y., Dederer, V. and Kawan, M. 2017. UBE2O remodels the proteome during terminal erythroid differentiation. Science, 4(357): 6350.
37- Otasek, D., Morris, J. H., Bouças, J., Pico, A. R. and Demchak, B. 2019. Cytoscape Automation: empowering workflow-based network analysis. Genome Biology, 20(1): 1-15.
38- Pei, Y., Bai, J., Guo, X., Zhao, M., Ma, Q. and Song, X. 2019. Comparative proteome analysis of drought-sensitive and drought-tolerant maize leaves under osmotic stress. Plant Science, 99(4): 467-479.
39- Peth, A., Uchiki, T. and Goldberg, A. L. 2010. ATP-dependent steps in the binding of ubiquitin conjugates to the 26S proteasome that commit to degradation. Molecular Cell, 40(4): 671-681.
40- Pezeshkian, Z., Mirhoseini, S. Z. and Ghovvati, S. 2020. Identification of hub genes involved in apparent metabolizable energy of chickens. Animal Biotechnology, 1-8.
41- Pruitt, K. D. and Maglott, D. R. 2001. RefSeq and LocusLink: NCBI gene-centered resources. Nucleic Acids Research, 29(1): 137-140.
42- Ramsøe, A., Clark, M. S. and Sleight, V. A. 2020. Gene network analyses support subfunctionalization hypothesis for duplicated hsp70 genes in the Antarctic clam. Cell Stress and Chaperones, 25: 1111-1116.
43- Rehmsmeier, M., Steffen, P., Höchsmann, M. and Giegerich, R. 2004. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA, 10(10): 1507-1517.
44- Sakamoto, T., Kamiya, T., Sako, K., Yamaguchi, J., Yamagami, M. and Fujiwara, T. 2011. Arabidopsis thaliana 26S proteasome subunits RPT2a and RPT5a are crucial for zinc deficiency-tolerance. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 75(3): 561-567.
45- Salih, K. J., Duncan, O., Li, L., Troesch, J. and Millar, A. H. 2019. Refining the composition of the Arabidopsis thaliana 80S cytosolic ribosome. BioRxiv, 764316:1-18.
46- Shamloo-Dashtpagerdi, R., Razi, H. and Ebrahimie, E. 2015. Mining expressed sequence tags of rapeseed (Brassica napus L.) to predict the drought responsive regulatory network. Physiology and Molecular Biology of Plants, 21(3): 329-340.
47- Smalle, J., Kurepa, J., Yang, P., Emborg, T. J., Babiychuk, E., Kushnir, S. and Vierstra, R. D. 2003. The pleiotropic role of the 26S proteasome subunit RPN10 in Arabidopsis growth and development supports a substrate-specific function in abscisic acid signaling. The Plant Cell, 15(4): 965-980.
48- Stone, S. L. 2019. Role of the ubiquitin proteasome system in plant response to abiotic stress. Cell and Molecular Biology, 343: 65-110.
49- Sung, M. K., Porras-Yakushi, T. R., Reitsma, J. M., Huber, F. M., Sweredoski, M. J., Hoelz, A., Hess, S. and Deshaies, R. J. 2016. A conserved quality-control pathway that mediates degradation of unassembled ribosomal proteins. Elife, 5: e19105.
50- Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J. and Zhu, J. K. 2007. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science, 12(7): 301-309.
51- Sunkar, R. and Jagadeeswaran, G. 2008. In silico identification of conserved microRNAs in large number of diverse plant species. BMC Plant Biology, 8(1): 1-13.
52- Sunkar, R., Kapoor, A. and Zhu, J. K. 2006. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. The Plant Cell, 18(8): 2051-2065.
53- Sunkar, R., Li, Y. F. and Jagadeeswaran, G. 2012. Functions of microRNAs in plant stress responses. Trends in Plant Science, 17(4): 196-203.
54- Suzek, B. E., Huang, H., McGarvey, P., Mazumder, R. and Wu, C. H. 2007. UniRef: comprehensive and non-redundant UniProt reference clusters. Bioinformatics, 23(10): 1282-1288.
55- Swapna, M. and Kumar, S. 2017. MicroRNAs and their regulatory role in sugarcane. Frontiers in Plant Science, 8: 997.
56- Szklarczyk, D., Gable, A. L., Lyon, D., Junge, A., Wyder, S., Huerta-Cepas, J., Simonovic, M., Doncheva, N. T., Morris, J. H., Bork, P. and Jensen, L. J. 2019. STRING v11: protein–protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research, 47(D1): D607-D613.
57- Tang, T., Yu, A., Li, P., Yang, H., Liu, G. and Liu, L. 2016. Sequence analysis of the Hsp70 family in moss and evaluation of their functions in abiotic stress responses. Scientific Reports, 6(1): 1-14.
58- Verma, R., Aravind, L., Oania, R., McDonald, W. H., Yates, J. R., Koonin, E. V. and Deshaies, R. J. 2002. Role of Rpn11 metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Science, 298(5593): 611-615.
59- Vierstra, R. D. 2009. The ubiquitin–26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 10(6): 385-397.
60- Vierstra, R. D. 2012. The expanding universe of ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Plant Physiology, 160(1): 2-14.
61- Wang, S., Kurepa, J. and Smalle, J. A. 2009. The Arabidopsis 26S proteasome subunit RPN1a is required for optimal plant growth and stress responses. Plant and Cell Physiology, 50(9): 1721-1725.
62- Xu, F. Q. and Xue, H. W. 2019. The ubiquitin‐proteasome system in plant responses to environments. Plant, Cell and Environment, 42(10): 2931-2944.
63- Yanagitani, K., Juszkiewicz, S. and Hegde, R. S. 2017. UBE2O is a quality control factor for orphans of multiprotein complexes. Science, 357(6350): 472-475.
64- Yao, C., Wu, Y., Nie, H. and Tang, D. 2012. RPN1a, a 26S proteasome subunit, is required for innate immunity in Arabidopsis. The Plant, 71(6): 1015-1028.
65- Yoshida, T., Ohama, N., Nakajima, J., Kidokoro, S., Mizoi, J., Nakashima, K., Maruyama, K., Kim, J. M., Seki, M., Todaka, D. and Osakabe, Y. 2011. Arabidopsis HsfA1 transcription factors function as the main positive regulators in heat shock-responsive gene expression. Molecular Genetics and Genomics, 286(5): 321-332.
66- Yu, A., Li, P., Tang, T., Wang, J., Chen, Y. and Liu, L. 2015. Roles of Hsp70s in stress responses of microorganisms, plants, and animals. BioMed Research International, 10319: 1-8.
67- Zhang, H., Li, L., Ye, T., Chen, R., Gao, X. and Xu, Z. 2016. Molecular characterization, expression pattern and function analysis of the OsHSP90 family in rice. Biotechnology and Biotechnological equipment, 30(4): 669-676.
68- Zhang, J., Xu, Y., Huan, Q. and Chong, K. 2009. Deep sequencing of Brachypodium small RNAs at the global genome level identifies microRNAs involved in cold stress response. BMC Genomics, 10(1): 1-16.
69- Zhou, L., Liu, Y., Liu, Z., Kong, D., Duan, M. and Luo, L. 2010. Genome-wide identification and analysis of drought-responsive microRNAs in Oryza sativa. Experimental Botany, 61(15): 4157-4168.
70- Zhu, J., Cai, D., Wang, J., Cao, J., Wen, Y., He, J., Zhao, L., Wang, D. and Zhang, S. 2021. Physiological and anatomical changes in two Rapeseed (Brassica napus L.) genotypes under drought stress conditions. Oil Crop Science, 6(2): 97-104.
Volume 36, Issue 2
July 2023
Pages 110-126
  • Receive Date: 14 April 2021
  • Revise Date: 20 July 2021
  • Accept Date: 06 October 2021