بررسی تکوین میکروگامتوفیت و مگاگامتوفیت در Mill Ageratum houstonianum

زهرا بقایی فر^1*، سید ابراهیم حسینی نیا¹، عاطفه مهرافزا¹، لیلا خدائی² و فاطمه غدیرپور¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

تاریخ دریافت: 10/12/1399          تاریخ پذیرش: 14/07/1400

چکیده

بررسی تکوین دانه گرده و تخمک در گیاه Ageratum houstonianum که از اهداف این پژوهش است، می­تواند الگوی مناسبی برای گونه­های دارای گل‌آذین کپه­ای باشد. بدین منظور، گل‌ها و غنچه­ها در مراحل مختلف نمو برداشت شده، در FAA₇₀ تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شدند. نمونه­ها پس از قالب­گیری در پارافین، با ضخامت 5-7 میکرومتر با میکروتوم برش­گیری­ شدند و رنگ­آمیزی با ائوزین و هماتوکسیلین انجام شد. لام­های تهیه ‌شده با استفاده از میکروسکوپ نوری مورد بررسی و عکس­برداری قرار گرفتند. نتایج نشان داد گلچه­های دوجنسی شامل پنج پرچم با میله­های آزاد و جدا از هم هستند. بساک از نوع تتراسپورانژی و تکوین دیواره بساک از نوع دولپه­ای است و از یک لایه اپیدرم، لایه مکانیکی، یک لایه میانی و لایه تاپی تشکیل شده است. لایه مغذی آن از نوع آمیبی است و آرایش تترادهای میکروسپور از نوع تتراهدرال می­باشد. دانه­های گرده در زمان انتشار دارای  سه منفذ رویشی با تزئینات سوزنی‌شکل هستند. تخمک از نوع واژگون، تک‌پوسته­ای و کم­خورش است. تقسیمات سلول مادر مگاسپور از هر دو نوع عرضی و طولی مشاهده شد که منجر به تشکیل تترادهای خطی و توده­ای می­شود. نمو کیسه­ رویانی براساس الگوی تک­­اسپوری و تیپ پلی­گونوم واقعی در تصاویر دیده نشد. هشت سلول همردیف دیده شدند. براساس این پژوهش، کریستال­ در لایه مکانیکی، سلول‌های دیواره اپیدرم تخمک، مشاهده شد که از خصوصیات این گونه است. همچنین اپیدرم ترشحی کرک‌مانند در بخش درونی گلبرگ، کرک­های تک‌رشته­ای و تک‌سلولی در سطح بیرونی گلبرگ مشاهده گردید.

واژه‌های کلیدی: آفتابگردان، تاپی، تخمک، مگاسپورزایی، میکروسپورزایی، Ageratum houstonianum

* نویسنده مسئول، تلفن: 08132546730 ، پست الکترونیکی: Z_baghaeifar@pnu.ac.ir

مقدمه

خانواده گیاهی کاسنی با نام‌های علمی Compositae، Composae، Asteraseae و Synantherea بزرگ‌ترین تیره گیاهی دولپه­ای‌ها به شمار می­رود (8). از مشکلات عمده آرایه­شناختی در این تیره ارتباط بین سرده­ها، طایفه­ها و همچنین وجود گونه­های پلی­مورف (18). گیاهان این خانواده توزیع جهانی داشته، در مناطق معتدل و حاره­ای پراکنده­اند (1). پراکنش جهانی، سرده­ها و گونه­های فراوان این تیره که شامل تعداد زیادی گونه گیاه باارزش صنعتی، غذایی و دارویی است، این تیره را موضوع مطالعات متعددی نموده است (29).  جنس Ageratum متعلق به تیره آفتاب­گردان (Asteraseae) می­باشد (3). Ageratum houstonianum گیاهی زینتی است که به دلیل وجود انواع فلاونوئیدها و آلکالوئیدها و نیز چربی‌های ضروری، دارای اهمیت دارویی است (3). انواع فلاوون‌های چندزیرواحدی و پلی‌متوکسی فلاوون‌ها، در این گیاه شناسایی شده­اند ( 25). چهار نوع آلکالوئید پیرولیزیدین از این گیاه جدا شده است که احتمالاً کاندیدای مناسبی برای مطالعات داروسازی هستند (42). این گیاه دارای گل‌های پرزدار به رنگ‌های آبی، صورتی، ارغوانی، بنفش و سفید و ساقه‌ای پوشیده از کرک‌های متراکم محافظ و ترشحی است. اپیدرم در هر دو سطح برگ­ها کرک­دار و حاشیه برگ‌ها دندانه­دار است (3). این گیاه بومی آمریکای مرکزی و جنوبی بوده و جهت کاربردهای زینتی به ایران صادر شده است و معمولا در حاشیه و لبه­های باغچه­ها یا پارک­ها و...... کاشته می­شوند (3).

مطالعات تکوینی و رویان شناختی محدودی در این تیره انجام شده است. از جمله بررسی­های صورت گرفته در این زمینه می­توان به مطالعه میکروسپورزایی و مگاسپورزایی در گیاه شکر تیغال Echinopsilicifolius (4) مراحل تکوین دانه گرده و تخمک در Anthemis odontosteph ana Boiss. Cv. (5) و رویان شناختی در Conyzoidesl  Ageratum وFastigiatum Ageratum (16) اشاره کرد.

زیست­شناسی تکوینی تولید­مثلی که بررسی مراحل مختلف تکوین گل یعنی اندام­زایی و تکوین پرچم، دانه گرده، مادگی، تخمک و کیسه رویانی را شامل می­شود، اخیراً به طور چشمگیری مورد توجه قرار گرفته است (1). مطالعات متعدد هسته شناسی، سلول شناسی و شیمی گیاهی در این آرایه صورت گرفته است (11 و 28)، اما با وجود این، به نظر می­رسد مطالعات تکوینی و رویان­شناختی محدودی در این تیره انجام شده است؛ بنابراین هنوز انجام مطالعات جدید تکوینی برای افزایش دانش و آگاهی درباره گیاهان این تیره ضروری است (27). همچنین پیش­بینی می­شود، مطالعات تکوینی و رویان­شناختی در کنار سایر مطالعات بتوانند در حل مشکلات آرایه­شناختی این گروه نیز همانند سایر تیره­های گیاهی استفاده شوند (20).

براساس مطالعات رویان­شناختی محدودی که در این تیره انجام شده است، ویژگی‌های استثنایی و نادری از قبیل: وجود پدیده Nemec یعنی تشکیل ساختارهایی شبیه به کیسه­ رویانی در دانه گرده (9 و 13)، افزایش یاخته­های قرینه (سینرژیدها) در کیسه ­رویانی (12 و22)، افزایش یاخته­های آنتی­پود (17و 26)، تکوین کیسه 4 یاخته­ای (14) و وجود آپومیکسی (11) گزارش شده است. طبق بررسی­های مرجع­شناختی ما، تاکنون مطالعه رویان­شناختی در این گونه انجام نشده است. هدف از این پژوهش، بررسی مراحل تکوینی گامتوفیت نر و گامتوفیت ماده به عنوان الگویی از گل­آذین‌های کپه­ای در تیره مرکبان بود.

مواد و روشها

بمنظور مطالعه رویان­شناختی در A.houstonianum، غنچه­ها در مراحل مختلف نموی، از پارک‌ها و فضای سبز شهر همدان جمع­آوری­ شدند و جهت تثبیت در محلول فیکساتور FAA قرار داده شده و پس از شستشو در الکل70% نگهداری شدند. بمنظور آماده کردن نمو­نه­ها جهت برش­گیری، آبگیری از نمونه­ها توسط درجات افزایشی الکل (30، 50، 70، 80، 90 و 100) صورت گرفت. شفاف­سازی نمونه­ها با درجات مختلف مخلوط الکل و تولوئن (4/1، 4/2، 4/3 و 4/4) انجام شد.

سپس نمونه­ها پارافین­دهی و قالب­گیری شده و با روتاری میکروتوم مدل DS 4055 با ضخامت 7-5 میکرومتر برش‌گیری شدند. بمنظور رنگ­آمیزی برش‌ها، لام­های مورد نظر پارافین­زدایی شده و سپس لام‌ها با عبور از الکل­هایی با درجات کاهشی، آب‌دهی شدند. رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین (رنگ­آمیزی هسته) و ائوزین (رنگ­آمیزی سیتوپلاسم) طبق روش Yeung (1984) انجام شد (30). بعد از این مرحله، نمونه‌ها با عبور از الکل‌های 90 و 100 آبگیری شده و در نهایت چند دقیقه داخل تولوئن قرار داده شدند. سپس لام‌ها به وسیله چسب انتالن لامل­گذاری شدند. لام­های آماده‌شده توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی­های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند و مراحل مختلف تکوین دانه گرده و تخمک، توسط دوربین دیجیتال مدل 500 LABOMED LX عکس‌برداری شد.

نتایج

گیاه A.houstonianum، علفی، یک­ساله و زینتی است. گل­های این گیاه پرزدار به رنگ­های آبی، صورتی، ارغوانی، بنفش و سفید می­باشد. گل‌آذین این گیاه مانند گل‌آذین در سایر گیاهان تیره آفتابگردان، از نوع کپه و پرزدار است و شامل گلچه­های لوله­ای  (زایا) و فاقد گلچه زبانه­ای  می­باشد (تصویر A). تمام قسمت‌های هوایی این گیاه شامل برگ‌ها، کاسبرگ‌ها، ساقه و غنچه­ها با کرک‌های بسیار نرم و ظریفی پوشیده شده است (تصاویر B، C و E).  غنچه نابالغ، با کرک‌های نرم و ظریف قابل مشاهده می­باشد (تصویر  E). گلچه لوله­ای، با کرک‌های نرم و ظریف قابل تشخیص است (تصویر F). غنچه در مرحله رشد و شکوفایی و گلچه­­های نمو یافته کاملاً قابل تشخیص هستند (تصویر G).

تصویر 1- گیاه Ageratum houstonianum مشاهده‌شده توسطاستریومیکروسکوپ، ابژکتیو×40

1. A) گل­آذین کپه و پرزدار است. B) تمام قسمت‌های هوایی گیاه با کرک‌های نرم و ظریفی پوشیده شده است. C) ساقه با کرک‌های متراکم پوشیده شده است. D) غنچه­های گل با کرک‌های نرم و ظریفی پوشیده شده است. E) غنچه جوان و گلچه­های لوله­ای (↑) و کرک‌ها قابل تشخیص هستند. F) گلچه لوله­ای و کرک‌های نرم و ظریف قابل تشخیص هستند. G) غنچه در حال شکوفایی و گلچه­های نمو یافته (↑) قابل تشخیص هستند. H) میوه فندقه و کاسبرگ‌های براکته‌مانند قابل مشاهده است. مخفف­ها: Re: نهنج، TF: گلچه لوله­ای.

تکوین مریستم زایشی و تبدیل به اجزاء گل در گیاه Ageratum houstonianum : مشاهدات میکروسکوپی غنچه­های گل و برش­های طولی آنها در مراحل مختلف تکوینی نشان می­دهد که در نتیجه تقسیمات شعاعی تونیکا و مماسی در کورپوس، مریستم در مقایسه با حالت رویشی حجیم‌تر شده، و سطح مریستم افزایش یافته و بر تحدب مریستم افزوده شده است. در نتیجه تقسیم سلول‌های تونیکا و کورپوس، مریستم بارده یا هاگ‌زا حاصل می­شود. به علت تقسیمات و تمایز سلول‌ها، در ناحیه باقیمانده حلقه بنیادی در حاشیه مریستم براکته­ها تشکیل شده­اند. پریموردیوم­های گلچه­ای که حاصل تسهیم مریستم هاگزای (مریستم بارده) به سهم­های گلچه­ای هستند، با تمایز و تکوین آکروپتال در حال تشکیل هستند (تصویر A). در مراحل تکوینی پیشرفته­تر در  هر پریموردیوم گلچه، فرورفتگی­ای ایجاد شده که در پیرامون آن ابتدا جام گل بنیانگذاری و سپس بخش­های زایشی به روش به سوی مرکز تمایز می­یابند  (تصویر B).

تصویر2- تکوین مریستم زایشی و تبدیل به اجزاء گل در گیاه Ageratum houstonianum

1. A) برش طولی مریستم زایشی در مرحله تسهیم به مریستم­های گلچه­ای (↑) و براکته­ها قابل تشخیص هستند. B) برش طولی بخشی از گل‌آذین کپه و شکل‌گیری گلچه­ها (↑) و اجزای آنها روی نهنج، قابل تشخیص می­باشد. مخفف­ها: TF: گلچه لوله­ای، br: براکته، PF: پریموردیم گلچه­ای.

تکوین پرچم، بساک و دانه گرده در Ageratum houstonianum : پرچم‌ها، ابتدا به صورت برجستگی‌های کوچک مریستمی روی نهنج و در زیر پوشش گلبرگ‌ها پدیدار می­شوند و سپس به سرعت رشد و نمو می­یابند (تصویرA). تعداد پرچم­ها در گونه مورد بررسی پنج عدد است که به صورت جدا از هم و با آرایش چرخه­ای روی یک دایره قرار گرفته­اند و استوانه­ای را در اطراف خامه تشکیل می­دهند (تصویر B). بساک از نوع تتراسپورانژی (چهار کیسه گرده­ای) است (تصویر C). هر میکروسپورانژ در ابتدای نمو، از یک گروه یاخته­های زیر اپیدرمی به نام آرکئوسپور متمایز می­شود و برای تشکیل یاخته­های بیرونی (جداری) و داخلی (هاگ‌زا) به صورت مماسی تقسیم می­شود (تصویر D). به دنبال تقسیمات مماسی یاخته­های لایه جداری، ساختار چهارلایه­ای دیواره میکروسپورانژ یا کیسه گرده به وجود می­آید که این لایه­ها از سمت خارج به داخل شامل اپیدرم، لایه مکانیکی، لایه میانی و لایه مغذی (تاپی) با یاخته­های تک‌هسته­ای هستند، اما تمایز چندانی میان یاخته­های تشکیل‌دهنده این لایه­ها دیده نمی‌شود. هر یک از چهار لایه مذکور صرفاً از یک ردیف یاخته تشکیل شده­اند (تصویر E). بافت احاطه‌کننده بساک (اپیدرم)، اگزوتسیوم نیز نامیده می­شود (تصویر E). به تدریج و با ورود یاخته­های مادر میکروسپور به میوز، یاخته­های لایه مغذی متمایز شده و به صورت یاخته­هایی بزرگ با سیتوپلاسم متراکم دیده می­شوند، اما در سه لایه دیگر تغییری دیده نشد. و این لایه­ها همچنان بدون تمایز و مشابه یکدیگرند. یاخته­های تاپی اغلب تک­هسته­ای هستند که این یاخته­ها بافت هاگ‌زای بساک را در بر ­می­گیرند. یاخته­های لایه تاپی در این گونه، بیضی و تا حدی دوکی هستند. با توجه به اندازه هسته به نظر می­رسد این یاخته­ها پلی­پلوئیدی بالایی را نشان می­دهند که برای متابولیسم آنها ضروری است. همچنین یاخته­های تاپی به علت نقش مغذی، بیشترین رنگ­پذیری را نسبت به سایر یاخته­های دیواره بساک دارند. از آنجایی که در برخی از نمونه­های مورد مشاهده، یاخته­های لایه تاپی در مراحل ابتدایی نمو بساک شروع به حرکت به داخل حفره بساک می­کنند و در آنجا با یاخته­های در حال تقسیم و نمو تماس مستقیم پیدا می­کنند، بنابراین می­توان گفت لایه تاپی در این گونه، از نوع پلاسمودیومی است که این حالت از شروع تلوفاز I دیده می­شود (تصویر H). همچنین در زمان  رها شدن  میکروسپورها از تتراد نیز در لابه­لای آنها شروع به تحلیل رفتن می­کنند (تصویر J)، به طوری که زمانی که دانه­های گرده دویاخته­ای تشکیل می­شود، آنها کاملاً تجزیه شده­اند. به دنبال تقسیمات میتوزی در توده یاخته­های آرکئوسپور، این یاخته­ها مستقیماً به میکروسپوروسیت یا یاخته­های مادر دانه گرده تمایز می‌یابند. میکروسپوروسیت­ها با سیتوپلاسم متراکم، اندازه بزرگ و هسته­های درشت با رنگ­پذیری بالا از یاخته­های مجاور متفاوت می­شوند (تصویر E). در طی فرایند میکروسپورزایی، تقسیم میوز با تشکیل دیواره ویژه با ماهیت کالوزی در اطراف یاخته­های میکروسپوروسیت آغاز می­شود. هر یاخته مادر گرده (میکروسپوروسیت) در طی میوز از مراحل پروفازI (تصویر F)،  متافازI (تصویرG)، تلوفازI (تصویر H)، پروفاز II، متافاز II، آنافاز II و تلوفاز II، منجر به تشکیل تترادهای میکروسپوری که بیشتر از نوع تتراهدرال (چهارضلعی) هستند، می­شود (تصویرI). بین هسته­های حاصل از مرحله تلوفاز I، دیواره­ای تشکیل نمی­شود و سیتوکینز از نوع همزمان است که پس از پایان تلوفاز II رخ می­دهد. لایه کالوزی لابه­لای مونادها، دیادها و اطراف تترادها به وضوح قابل تشخیص است (تصویر I).

میکروسپورها در دو بساک مجاور همدیگر از نظر نموی تقریباً همزمان هستند. همزمان با تحلیل رفتن لایه کالوزی، یاخته­های تشکیل‌دهنده تتراد از هم جدا می­شوند و میکروسپورها آزاد می‌گردند که در زمان آزاد شدن هنوز واکوئله نبوده و دارای سیتوپلاسم متراکم، هسته حجیم و شکل منظم هستند و تغذیه آنها توسط لایه تاپی انجام می­گیرد (تصویر J). میکروسپورها واکوئله شده و هسته آنها به کناری رانده می­شود و اگزین شروع به تکوین می­نماید (تصویر K).  نمو میکروسپور با انجام یک تقسیم میتوز کامل می­شود، به این صورت که تقسیم نامساوی موجب تشکیل دو یاخته متفاوت از نظر عملکردی و ریختی می­شود: یک هسته بزرگ رویشی و یک هسته کوچک زایشی که منجر به تشکیل دانه گرده بالغ می­شود. اطراف میکروسپورهای رها شده از پوشش کالوزی توسط دیواره اگزین در بر گرفته می­شود. دیواره پکتوسلولزی دیگری به نام انتین در مجاورت سیتوپلاسم شکل می­گیرد. شکل نهایی دانه گرده بالغ در گیاه ابری، کروی است (تصویر L). بلوغ دانه­های گرده با شکل­گیری تزئینات اگزین و تشکیل خارها به اتمام می­رسد که در این حالت لایه تاپی کاملاً تحلیل رفته است (تصویر L). همزمان با تکوین دانه گرده، دیواره بساک به ویژه لایه مکانیکی متحمل تغییراتی می­شود، بدین ترتیب که لایه مکانیکی تکامل می­یابد و ضخیم­شدگی­های فیبری در مرحله دانه­های گرده دو یاخته­ای دیده نشد و یاخته­ها هنوز زنده­اند (تصویرO). در مرحله بلوغ دانه­های گرده، لایه مکانیکی به رشد و ضخیم شدن خود ادامه می­دهد، سرانجام یاخته­های آن می­میرند و با شکافته شدن این لایه به دانه­های گرده اجازه پراکندگی داده می­شود (تصویر M). دانه­های گرده بالغ دارای سه منفذ رویشی برای خروج لوله­های گرده هستند (تصویر N). از ویژگی‌های شاخص این گونه گیاهی، وجود  کریستال در لایه مکانیکی است (تصویرO). از ویژگی‌های گیاه مورد مطالعه، تنوع در یاخته­های حاصل از میوز است، به طوری که حتی در یک بساک و کیسه گرده وجود همزمان تتراد، دیاد و موناد قابل رویت است (تصویر I).

تکوین مادگی، تخمک و گامتوفیت ماده در Ageratum houstonianum : همزمان با تشکیل پریموردیوم پرچم، توده مریستمی مرکزی جهت تشکیل مادگی شکل می­گیرد (تصویر A). تکوین پرچم و مادگی تقریبا همزمان است؛ به طوری که  قبل از تکوین پرچم پریموردیوم تخمکی قابل تمایز می­باشند (تصویر B). مادگی این گونه گیاهی، تک­برچه­ای است. سطح خارجی توده سلولی سازنده مادگی به وسیله اپیدرم که از تحولات لایه سطحی تونیکایی به وجود می­آید، پوشیده شده است. کمی بعد از طرح اولیه، مادگی طویل و کشیده می­شود و نهایتاً به سه بخش تمایز می­­یابد؛ یک بخش گلابی‌شکل که حفره تخمدان نامیده می­شود و تخمک در آن تمایز می­یابد. یک بخش به نام خامه که در گونه مورد مطالعه، همزمان با تشکیل پریموردیوم تخمکی تمایز می­یابد و تک توخالی دوشاخه است (تصویر B) و یک نوع بافت ترشحی که کلاله نامیده می­شود.

تصویر3- تکوین پرچم، نمو دیواره بساک و گامتوفیت نر در Ageratum houstonianum

1. A) پرچم­ها به صورت برجستگی­های کوچک مریستمی روی نهنج و در زیر پوشش گلبرگ‌ها پدیدار می­شوند. B) بخشی از گل‌آذین کپه نشان‌دهنده گلچه­ها و پرچم­های جدا از هم که در این گونه 5 عدد است. C) برش عرضی از یک گلچه با پنج بساک تتراسپورانژی. D) برش طولی گلچه لوله­ای و یاخته­های آرکئوسپوری با رنگ­پذیری زیاد قابل تشخیص هستند. E) برش طولی از بساک: یاخته­های میکروسپوروسیت در مرکز بساک و لایه­های تشکیل‌دهنده بساک شامل اپیدرم، لایه مکانیکی، لایه میانی و تاپی است. F) برش طولی از بساک در مرحله پروفاز I. G) برش طولی از بساک در مرحله متافازI.H ) برش طولی از بساک در مرحله تلوفاز I . I) برش طولی از بساک، دیاد، موناد و تتراد میکروسپور که از نوع تتراهدرال هستند، قابل تشخیص می­باشند. J) برش طولی از بساک، رها شدن میکروسپورها از تتراد و هسته منفرد در مرکز یاخته قابل تشخیص می­باشند. K) برش طولی از بساک، میکروسپورها واکوئله شده و هسته آنها به کنار رانده شده است. L) برش طولی از بساک، دانه گرده بالغ و سلول رویشی و زایشی قابل مشاهده و تزئینات سطح اگزین خاردار است.  M) برش عرضی از گلچه: شکفتگی بساک و خارج شدن دانه­های گرده بالغ کروی‌شکل قابل مشاهده هستند.N) دانه گرده دارای سه منفذ رویشی برای خروج لوله گرده است.  O) لایه مکانیکی و یاخته­های آن و کریستال در آن قابل تشخیص می­باشد. مخفف­ها: Pe: گلبرگ،:An : بساک، Ca: برچه، Sta: پرچم،  Sty: خامه، Mic: میکروسپور، Cal: لایه کالوز، Te: تتراد، Di: دیاد، Cry: کریستال، Pmc: میکروسپوروسیت، Ar: آرکئوسپور، Ep: اپیدرم، En: لایه مکانیکی، Ta: تاپی، Me: لایه میانی، Po: دانه گرده، Vc: سلول رویشی، gn: سلول زایشی، Ex: اگزین، In: انتین.

در گونه مورد مطالعه، پاپیل­های یاخته­های اپیدرمی کلاله، سطحی پذیرنده برای دانه­های گرده فراهم می­کنند (تصویرO). اولین آثار تشکیل تخمک، به صورت برجستگی کوچک کم و بیش کروی (پریموردیوم تخمک) قبل از اتمام تکوین بخش‌های فوقانی تخمدان، خامه و کلاله، در جدار تخمدان پدیدار می­شود (تصویر B). بنیان تخمکی، پایه­گرا و به صورت برآمدگی کوچکی دیده می­شود. جایگزینی تخمک در تخمدان (تمکن) از نوع قاعده­ای است (تصویر B). خورش از بخش راسی پریموردیوم تخمکی توسعه می­یابد. تخمک در گونه مورد مطالعه، از نوع کم­خورش و اپیدرم خورشی دارای یک لایه یاخته کروی شکل است. تخمک از نوع واژگون و پریموردیوم تخمک، خمیدگی خود را از همان مراحل اولیه آغاز می­کند (تصویر D). با افزایش میزان خمیدگی ضمن رشد، تخمک به حالت واژگون در می­آید (تصویر I). در نتیجه بخشی از پوسته به بند متصل می­شود و رافه را تشکیل می­دهد (تصویر K). در گونه مورد مطالعه، تخمک تک‌پوسته­ای است و همانند گونه­های تیره آفتابگردان با تقسیمات شعاعی یاخته­های درمی از پریموردیوم تخمک، بنیانگذاری پوسته تخمک در طرفین جسم تخمک و در قاعده خورش به صورت برجستگی­های چند سلولی صورت می­گیرد  (تصویر K). انتهای آزاد پوسته در حین رشد در قطب سفتی تخمک ایجاد مجرای باریک میکروپیلی یا سفتی را می­کند که ورود لوله گرده به کیسه رویانی از این مجراست. در تخمک­های تک‌پوششی، پوسته منفرد سفت را به وجود می­آورد که در نمونه مورد بررسی، میکروپیل خطی صاف با کمی انحناست (تصویر K). لایه سطحی یاخته­های خورش، اپیدرم نامیده می­شود. در گونه مورد مطالعه، این لایه فقط شامل لایه دیواره مگاسپورانژ است که یاخته مادر مگاسپور را احاطه کرده است. به دنبال رشد سریع یکی از یاخته­های خورش، یاخته­ای به نام آرکئوسپور تمایز می­یابد (تصویر C). در گونه مورد مطالعه، تنها یک یاخته آرکئوسپوری وجود دارد که این یاخته به طور مستقیم (بدون تقسیم) به مادر مگاسپور یا مگاسپوروسیت سازمان می­یابد. این یاخته با حجم زیاد، متراکم و حجیم از سایر یاخته­های خورش قابل تشخیص است (تصویرD). یاخته مادر مگاسپور رشد می­کند و متحمل تقسیمات میوزی متوالی می­گردد که حاصل اولین تقسیم میوزی، تشکیل دو یاخته دیاد هاپلوئید است که به دو صورت عرضی و خطی در مجاور هم قرار گرفته­اند (تصاویر E و F). در این مرحله رشد پوسته تخمک شاخص است. دومین تقسیم میوزی، موجبات تشکیل چهار یاخته مگاسپور (تتراد) را فراهم می­کند. آرایش تترادها در این گونه، توده­ای (تصویرG) و خطی (تصویر H) است. از چهار یاخته حاصل از میوز، سه یاخته قطب سفتی تحلیل رفته و یاخته باقی­مانده که در موقعیت بنی قرار گرفته، مگاسپور عملکردی یا مادر کیسه­ رویانی نامیده می­شود که آغازگر پدیده مگاگامتوژنز است و اولین مرحله از تولید کیسه ­رویانی هشت‌هسته­ای است  (تصویر I). هسته یاخته مادری کیسه ­رویانی سه تقسیم میتوزی متوالی را انجام می­دهد. نخستین تقسیم میتوزی موجب تشکیل دو هسته هاپلوئیدی حجیم (کیسه­رویانی دوهسته­ای) می­شود (تصویرJ). دومین تقسیم میتوزی نیز موجب پیدایش چهار هسته هاپلوئید شده و در نتیجه کیسه ­رویانی چهارهسته­ای را به­ وجود می­آورد (تصویرK). در پایان تقسیم میتوزی سوم، همزمان با رشد طولی، کیسه­ رویانی هشت‌هسته­ای به وجود می­آید، که در یک ردیف دیده می­شوند (تصویرL). از ویژگی‌های  شاخص گونه مورد مطالعه، کرک‌ها در سطح گلبرگ و کرک­های ترشحی روی اپیدرم درونی گلبرگ (تصویر N) و حضور کریستال در یاخته­های دیواره اپیدرم تخمک است (تصویر H).

تصویر 4- تکوین مادگی، تخمک و گامتوفیت ماده در گیاه Ageratum houstonianum

1. A) توده مریستم مرکزی برای تشکیل مادگی قابل تشخیص است. B) تشکیل پریموردیوم تخمکی در کف جدار تخمدان؛ خامه دوشاخه همزمان با پریموردیوم تخمکی تمایز می­یابد. C) برش طولی تخمک و تمایز سلول آرکئوسپور در زیر اپیدرم. D) برش طولی تخمک و تمایز مگاسپوروسیت. E) برش طولی تخمک در مرحله دیاد میوز I (↑) و تقسیم عرضی است.F ) برش طولی تخمک در مرحله دیاد میوز I (↑) و تقسیم طولی است. G) برش طولی تخمک، آرایش تتراد مگاسپورها توده­ای است. H) برش طولی تخمک، آرایش تتراد مگاسپورها خطی است. کریستال در سطح اپیدرم تخمک قابل مشاهده است. I) برش طولی تخمک، مگاسپور عملکردی (زایا) در بخش بنی قابل تشخیص می­باشد. J) برش طولی تخمک نشان­دهنده کیسه ­رویانی دوهسته­ای (↑) است. K) برش طولی تخمک در مرحله کیسه رویانی چهارهسته­ای (↑) میکروپیل خطی صاف با کمی انحناست. L) برش طولی از تخمک واژگون در مرحله کیسه رویانی هشت‌سلولی .(↑) M) برش طولی گلچه، کاکل فلسی‌شکل قابل تشخیص است. N) کرک در سطح بیرونی گلبرگ، کرک­های ترشحی روی اپیدرم درونی گلبرگ تشخیص است. O) خامه دوشاخه با کرک­های ترشحی اطراف آن قابل مشاهده می­باشد. مخفف‌ها: An: بساک، Pe: گلبرگ، Sty: خامه، Po: پریموردیوم تخمکی، Sti: کلاله، Ar: آرکئوسپور، Me: مگاسپوروسیت ، In: پوسته، Ne: خورش، Cry: کریستال، R: رافه، Mic: میکروپیل، P: کاکل، Tr: کرک. fme: مگاسپور عملکردی.

بحث و نتیجه­گیری

بساک و گامتوفیت نر:  نتایج بررسی­ها نشان داد، که ساختار مریستم رویشی در A.houstonianum از الگوی عمومی گیاهان دولپه توصیف‌شده توسط Popham (23) تبعیت می­کند. مریستم زایشی از مریستم رویشی تحول می­یابد. فعالیت حلقه بنیادی کاهش پیدا می‌کند، در مقابل فعالیت تونیکا و کورپوس افزایش یافته و تقسیمات میتوزی اوج می­گیرد و با افزایش سطح جوانه، بنیانگذاری پریموردیوم­های اعضای گل انجام می­شود. در A.houstonianum ، نمو چهارلایه­ای دیواره بساک بر اساس تیپ دولپه­ای انجام می­گیرد که با نظریه Pullaiah (24) در مورد گیاهان تیره Asteraceae مطابقت دارد. در مرحله اولیه نمو بساک، ردیف­هایی از یاخته­های آرکئوسپوری در زیر اپیدرم بساک متمایز گردیده و برای تشکیل یاخته­های بیرونی (جداری) و داخلی (هاگ­زا) به صورت مماسی تقسیم می­شوند. بساک بالغ یک ساختمان تتراسپورانژی دارد. براساس نتایج ما در گونه مورد مطالعه، لایه میانی نمو پیدا می­کند و بساک دارای چهار لایه است در نهاندانگان، دو تیپ اصلی نمو لایه تاپی بساک قابل تشخیص است (21): ترشحی (جداری) و آمیبی (periplasmodial). در گیاه مورد مطالعه، لایه تاپی از نوع پلاسمودیومی است (16). یاخته­های لایه تاپی درجه بالایی از پلی­پلوئیدی را نشان می­دهند که نمایانگر فعالیت متابولیسم بالای آنهاست که از این نظر مشابه یاخته­های آنتی­پود کیسه رویانی هستند (21). درگیاه  A.houstonianum یاخته­های اولیه هاگ‌زا که از تقسیمات یاخته­های آرکئوسپوری حاصل شده­اند مستقیماً به یاخته­های مادر گرده تمایز پیدا می­کنند؛ که به صورت دو ردیف در بخش میانی بساک استقرار دارند. گونه­های معدودی وجود دارند که استقرار یک ردیف یاخته­های مادر گرده را از خود نشان می‌دهند (19). میوز در هر میکروسپوروسیت منجر به تشکیل تتراد می­شود. آرایش میکروسپورهای داخل دیواره کالوزی در گونه مورد پژوهش، از نوع تتراهدرال بود. وجود تترادهای تتراهدرال و صلیبی‌شکل نیز در گیاهان تیره Asteraceae گزارش شده است (21). تکوین میکروسپورهای دو کیسه گرده هم جوار به دو شکل هم­زمان و غیر همزمان امکان­پذیر است. در گونه مورد مطالعه، تکوین میکروسپورهای دو کیسه گرده هم­جوار، در بیشتر مواقع همزمان می­باشد. میکروسپورها بعد از آزاد شدن دارای یک سیتوپلاسم متراکم، شکل منظم با یک هسته حجیم قرار گرفته در بخش میانی هستند. واکوئله شدن میکروسپورها بعد از رها شدن تتراد انجام می­شود. هسته بزرگ هر میکروسپور با یک تقسیم میتوزی و نابرابری که انجام می­­دهد دو هسته نابرابر به وجود می آورد که هسته بزرگ‌تر رویشی و هسته کوچک‌تر زایشی است، بنابراین ابتدا دانه گرده دوهسته­ای و بعد دانه گرده دویاخته­ای تشکیل می­شود. دانه گرده در گونه A.houstonianum ، به صورت دویاخته­ای، سه منفذی و با تزئینات سوزنی‌شکل در زمان انتشار است که با گزارشات روی گونه Inula aucheriana DC. و Tajetes patula (6 و7) مطابقت دارد. ضخیم‌شدگی­های فیبری لایه مکانیکی در مرحله پایانی نمو دانه­های گرده انجام نمی­شود، این یافته با گزارش­های پیشین روی گونه Hieracium مطابقت دارد (31).

 از ویژگی­های شاخص گونه مورد مطالعه، حضور کریستال در لایه مکانیکی بساک است (15). از دیگر ویژگی­های گونه مورد مطالعه، حضور کرک­های تک‌رشته­ای، تک­سلولی و بسیار طویل در سطح بیرون گلبرگ و کرک­های ترشحی روی اپیدرم درونی گلبرگ می­باشد.

تخمک و کیسه رویانی: نتایج این مطالعه نشان داد در هر تخمدان فقط یک تخمک واژگون،  از نوع کم­خورش  و یک­پوسته­ای وجود دارد (2، 4 و 5). یاخته آرکئوسپوری یک یا چند یاخته لایه زیر اپیدرمی در منطقه راسی پریموردیومی خورش است که به طور مستقیم (بدون تقسیم) یا به دنبال جدا شدن از یاخته­های پوششی به یاخته مادر مگاسپور یا مگاسپوروسیت سازمان می­یابد (10).

موقعیت زیر اپیدرمی یاخته مگاگامتوسیت در سایر گیاهان این تیره نیز گزارش شده است (11). مطالعه روی مگاسپورانژ نشان می­دهد که آرایش تترادها در این تیره دارای تنوع بسیار زیادی است. در A.houstonianum آرایش تترادها به صورت خطی و توده­ای مشاهده شد. آرایش تتراد خطی و توده­ای در گونه Achillea bieberestiniiAfan و Anthemis odontostephana Boiss. Cv. گزارش شده است. در گیاه A.houstonianum ، مگاسپور عملکردی (زایا) در قطب بنی که به وسیله دیواره کالوزی پوشیده نشده است، کیسه رویانی هشت‌هسته­ای را به وجود می­آورد که بعد به کیسه رویانی بالغ تمایز می­یابد.  سه مگاسپور دیگر در قطب سفتی که به صورت غیرعملکردی هستند، توسط دیواره کالوزی احاطه شده و نهایتاً تخریب می­شوند. مونوسپوری تیپ پلی­گونوم که متداول­ترین الگوی نمونه کیسه ­رویانی در گیاهان گل­دار است، در تصاویر مشخص نبود. چون هشت سلول به صورت ردیفی پشت سرهم قرار گرفته بودند.

 تشکیل کریستال‌های بیضوی تا چندضلعی در یاخته­های لایه اپیدرم تخمک، از شاخص­های ویژه این گونه گیاهی است. تشکیل کریستال­های بیضوی تا چندضلعی در قسمت بالایی دیواره تخمدان در گیاه Anthemis odontostephana Boiss. Cv. Odontostephana گزارش شده است (5).

براساس مطالعات مرجع­شناختی ما، اگرچه گونه­هایی از گیاهان تیره آفتاب­گردان از نظر تکوین پرچم و تخمک مورد مطالعه بوده­اند، ولی گزارش حاضر اولین گزارش در مورد توصیف دقیق مراحل تکوین میکروگامتوفیت و مگاگامتوفیت گونه Ageratum houstonianum می­باشد.