بررسی سازگاری گرده­افشانی با استفاده از روش­های بیولوژیکی و مولکولی در برخی از ژنوتیپ­های برتر آلبالو

صمد علیون نظری^1*، جعفر حاجی­لو¹ و مهرشاد زین ­العابدینی²

¹ ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

² ایران، کرج، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج

تاریخ دریافت: 23/11/1398          تاریخ پذیرش: 17/12/1399

چکیده

در آلبالو همانند سایر گونه­های جنس پرونوس خودناسازگاری گامتوفیتی وجود دارد. در این پژوهش روابط گرده با مادگی تعداد 10 ژنوتیپ برتر آلبالو با استفاده از روش­های بیولوژیک و مولکولی مورد بررسی قرار گرفت. در روش بیولوژیکی، دانه گرده در مرحله بادکنکی (در مرحله D فنولوژیکی) از گل­ها تهیه و پس از ارزیابی رشد و درصد جوانه­زنی در محیط کشت، در زمان مناسب اقدام به اخته کردن گل­ها کرده و گرده­افشانی به صورت گرده افشانی آزاد، خود و دگر گرده افشانی کنترل شده در باغ صورت گرفت. در روش مولکولی از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای عمومی برای شناسایی آلل­های S استفاده شد. نتایج نشان داد که بیشترین میزان جوانه­زنی دانه گرده در سطح کلاله در حالت خودگرده­افشانی و از نظر تعداد لوله گرده در بخش بالایی و پایینی خامه و درون تخمدان بیشترین مربوط به حالت گرده­افشانی آزاد بود. نه آلل S (S4، S6، S9، S6m2، S24، S26، S35، S36b و S36a) شناسایی شد که آلل­های S6/S6m2، S24 و S9 دارای بیشترین فراوانی می­باشد. مطالعه ما ثابت کرد که تنوع آلل­های S پایین بوده که نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین در بین ژنوتیپ­های مورد بررسی می­باشد. با توجه به رشد لوله گرده در طول خامه و تخمدان در تمامی حالت­ های گرده­افشانی در تمامی ژنوتیپ­ها می­توان گفت که همه ژنوتیپ­ها از لحاظ گرده­افشانی سازگار هستند.

واژه های کلیدی: آلبالو، آغازگرهای عمومی، ناسازگاری، واکنش زنجیره­ای پلیمراز

* نویسنده مسئول، تلفن: 04142552599  ، پست الکترونیکی: Saliyoun66@gmail.com

مقدمه

خودناسازگاری عبارت است از عدم توانایی گیاه دارای گامت نر و ماده فعال برای تولید جنین بوسیله خودگرده افشانی که نقش مهمی را در ایجاد تنوع ژنتیکی بازی می‍کند (8 و 12). تشخیص وضعیت خودناسازگاری با روش­های مختلف صورت می­گیرد، که شامل روش­های بیولوژیکی و مولکولی می­باشد (18). در روش بیولوژیکی، گرده­افشانی، جوانه­زنی دانه و رشد لوله گرده در شرایط آزمایشگاه و تعیین درصد تشکیل میوه در شرایط مزرعه بررسی می­شود. در صورتی که در روش­های مولکولی از الکتروفورز ریبونوکلئاز­های خامه و واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با آغازگر­های عمومی و اختصاصی استفاده می­شود. خودناسازگاری در گونه­های جنس Prunus عموما از نوع گامتوفیتی بوده، که تحت کنترل یک مکان ژنی چند آللی می­باشد (22). این مکان ژنی دارای دو عامل به هم پیوسته است که شامل عوامل مربوط به S مادگی (S-RNase)و S گرده (SFB) می­باشد. عامل S مادگی یک گلیکو­پروتئین اساسی با فعالیت ریبونوکلئازی است که نقش مهمی را در عدم پذیرش دانه­های گرده خودی بازی می­کند. ژن S دانه گرده برای گونه­های مختلف جنس Prunus در چندسال اخیر شناخته شده است که یک پروتئین F-box لینک شده با S  آن­ را کنترل می­کند (20 و 38). منشاء تنوع آللی مکان S سالیان زیادی است که توجه محققان علم ژنتیک را به خود جلب کرده است، به طوری­که تاکنون، با استفاده از تکنیک­های مولکولی آلل­های S مختلفی در گیلاس (6 ، 31 و 39) ، بادام (17،23، 24، 25و 28)، زردآلوی ژاپنی (34)، زردآلوی اروپایی (11) و آلوی ژاپنی (2) شناسایی شده است.

آلبالو (Prunus cerasus L.) یک گونه آلوتتراپلوئید است که هیبرید خود­به­خودی گیلاس (Prunus avium L.) (2n=2x=16) و گراند چری (Prunusfruticosa Pall.) (2n=4x=32) می­باشد و لذا منابع ژنتیکی آللی گیلاس و آلبالو دارای همپوشانی می­باشند. گرده­افشانی و لقاح گل­ها برای آلبالو از فاکتورهای مهم و تاثیر­گذار برای تشکیل میوه می­باشد. بر اساس مطالعات، بعضی از ویژگی­های بیولوژیکی آلبالو نظیر توان باروری پایین ارقام، دوره گرده­افشانی کوتاه و کیفیت پایین دانه گرده که باعث کاهش سطح گرده افشانی می­گردد می­تواند دلیلی بر تشکیل کم میوه باشد (33). مطالعات خودسازگاری در آلبالو به خاطر منشا پلی پلوئیدی این گونه به نحوی پیچیده است. تغییراتی که باعث غیرعملکردی شدن هاپلوتایپ­های S شده اند در بر­گیرنده تغییراتی در مناطق کد کننده و تنظیمی که شامل جهش­های در SFB یا S-RNase که موجب ایجاد کدون­های پایانی نابالغ، الحاق عناصر قابل انتقال در SFB و بالادست ژن S-RNase می­باشد (36 و 41). تسوکاماتو و همکاران (2008 و 2010) نشانگر­های PCR مفیدی را برای تشخیص هاپلوتایپ­های s  غیرعملکردی طراحی کردند که قابلیت تشخیص بین ژنوتیپ­های خودسازگار و ناسازگار را داشت. آغازگر­های اختصاصی آلل­ها و نشانگر­های CAPS  (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) می‍توانند بین آلل­های موتانت و نوع وحشی در مواردی مثل S₁/S_1´؛ S_6/S6m/S_6m2؛ S₁₃/S_13m/S₁₃´؛ S₃₆/S_36a/S_36b/S_36b2/S_36b3 تشخیص قایل شود. نشانگر­ها بر اساس چند­شکلی طول و توالی برای تشخیص زودهنگام در مرحله دانهال در آلبالو مفید واقع بشوند که نهایتا باعث کاهش هزینه و صرفه جویی در زمان می­شوند. عملکرد پایین ارقام و ژنوتیپ­های بومی از مهمترین عوامل محدود کننده کشت و کار این محصول در ایران می­باشد و ارقام اصلاح شده خارجی وارد شده هم کیفیت خشکباری ندارند. مطالعات و مشاهدات حاکی از آن است که با وجود گلدهی زیاد و گرده­افشانی کافی، میزان تشکیل میوه در ژنوتیپ­های بومی پایین می­باشد که ممکن است ناشی از وجود ناسازگاری گرده افشانی در ارقام و ژنوتیپ­های بومی یا مشکلات مربوط به مورفولوژی گل­ها و فاکتور­های محیطی باشد. این پژوهش با هدف شناسایی آلل­های ناسازگاری برای تعیین وضعیت سازگاری گرده­افشانی برخی از ژنوتیپ­های برتر آلبالو با استفاده از روش­های گرده­افشانی کنترل شده در باغ و تکثیر آلل­ها با آغازگرهای اختصاصی در واکنش زنجیره­ای پلیمراز انجام گرفته است.

مواد و روشها

مواد گیاهی: در این پژوهش تعداد 10 ژنوتیپ برتر آلبالو از شهرستان شبستر، استان آذربایجان شرقی (6 ژنوتیپ از روستای علی بیگلو و 4 ژنوتیپ از نظرلو) که از نظر زمان گلدهی دارای همپوشانی بودند انتخاب و مورد مطالعه قرار گرفتند. ژنوتیپ های برتر توسط کشاورزان محلی طی سالیان متمادی انتخاب شده بودند. همچنین از دو رقم خارجی سیگانی و بوترمو که ژنوتیپ آلل خودسازگاری آنها قبلا توسط محققین شناسایی و به عنوان ارقام خودسازگار معرفی شده بودند به عنوان شاهد برای مقایسه با ژنوتیپ­های بومی استفاده گردید. ژنوتیپ­ها بر اساس نام منطقه جمع آوری نامگذاری شدند.

تعیین درصد جوانه زنی دانه گرده: قبل از انجام گرده­افشانی برای ارزیابی قدرت جوانه­زنی دانه گرده اقدام به تهیه گرده کافی و سالم از ژنوتیپ­های مورد مطالعه شد. برای این منظور شاخه­های حاوی جوانه­های گل کافی در مرحله بالونی (D فنولوژیکی) از درختان مورد مطالعه انتخاب و در داخل سطل­های حاوی آب به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از تورم کامل جوانه ها و ظاهر شدن گلبرگ­ها، تمامی اعضای گل حذف شده و بساک­ها از میله پرچم جدا شده و در داخل پتری دیش­های برچسب دار ریخته شدند. سپس به مدت 48 ساعت در شرایط خشک و در دمای معمولی اتاق جهت خشک شدن و آزاد شدن دانه­های گرده از بساک نگه­داری شدند. بعد از جمع آوری، دانه­های گرده داخل شیشه­های کوچک آزمایشگاهی در یخچال در دمای 5 درجه سانتیگراد تا زمان استفاده در باغ نگه­داری (حدودا 5 روز) شدند. پس از تهیه دانه گرده، درصد جوانه­زنی و طول لوله گرده در ژنوتیپ­های مورد مطالعه با کشت گرده­ها در محیط کشت حاوی 2/1 % آگار و 15 % ساکارز تعیین شد (23). پس از تهیه محیط کشت و توزیع آن در پتری دیش­ها، دانه­های گرده به طور یکنواخت با استفاده از قلم موئی روی محیط کشت پخش شدند. بعد از 24 ساعت فرایند جوانه­زنی و رشد لوله گرده با اضافه کردن چند قطره کلروفرم متوقف گردید. محاسبه درصد جوانه­زنی و رشد لوله گرده با میکروسکوپ نوری مجهز به اکولر مدرج در چهار میدان دید مختلف انجام گرفت. برای جلوگیری از اثر توده­ای شمارش دانه­های گرده جوانه زده از میان میدان­های دیدی صورت گرفت که دانه­های گرده به صورت یکنواخت توزیع شده بودند (10). داده­های حاصل در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار مورد تجزیه آماری قرار گرفت و مقایسه میانگین داده­ها با آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام گرفت.

گرده افشانی کنترل شده در باغ و ردیابی لوله گرده درون مادگی: بدین منظور شاخه­هایی با تعداد کافی جوانه گل در جهات مختلف جغرافیایی درختان انتخاب و سپس برای جلوگیری از گرده­افشانی ناخواسته توسط کیسه­های پارچه­ای ململ پوشانده شدند. 24 ساعت پس از اخته کردن، گرده­افشانی گل­ها با گرده­های ژنوتیپ­های مورد نظر به صورت گرده­افشانی آزاد، خود و دگر گرده­افشانی با قلم موی انجام شد. دگرگرده­افشانی با دو ژنوتیپ N01 و N02 انجام شد (شکل 1) (جدول 1). 96 ساعت بعد از گرده افشانی مادگی گل های گرده افشانی شده جدا و در محلول FAA (حاوی الکل 70 درصد، فرمالدهید 40 درصد و اسیداستیک گلاسیال با نسبت 1:1:18) تثبیت شدند. جهت ردیابی نفوذ لوله گرده در خامه، ابتدا نمونه­ها به مدت سه ساعت با آب مقطر شستشو و سپس برای نرم شدن در محلول سولفیت سدیم هفت درصد اتوکلاو شدند و در ادامه 24 ساعت پس از رنگ­آمیزی با محلول آنیلین بلو، روند رشد لوله گرده حداقل در 10 مادگی که تعداد گرده کافی در کلاله آنها دیده می­شد از هر ترکیب گرده­افشانی بررسی شد (10). بعد از کرک­زدایی کامل مادگی­ها با پنس­های مخصوص و له کردن آنها روی لام، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت (Olympus BX51) روند رشد لوله­های گرده در خامه مادگی­ها مورد ارزیابی قرار گرفت. صفات درصد جوانه­زنی دانه گرده در سطح کلاله، تعداد لوله گرده در بخش­های بالایی و پایینی خامه و در درون تخمدان تعیین شدند. تجزیه داده­های حاصل در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 18 و مقایسه میانگین داده­ها با آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد صورت گرفت.

مطالعات مولکولی: مواد گیاهی: این آزمایش با برداشت نمونه­های برگی از برگ­های جوان ژنوتیپ­های مورد مطالعه در آزمایشگاه ژنومیکس پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج انجام شد.

استخراج DNA: برای استخراج دی.ان.ای از روش Vroh Bi و همکاران (1996) با کمی تغییر استفاده شد به طوری که مرحله شست و شو با کلروفرم-ایزوآمیل الکل دو بار انجام گرفت. پس از استخراج برای تعیین کمیت و کیفیت دی.ان.ای از الکتروفورز دی.ان.ای در ژل آگارز 1 درصد و همچنین برای تعیین غلظت نیز از دستگاه پیکو­دراپ (PicoDropμlspectrometry, Cambridge, UnitedKingdom) استفاده شد.

OP: گرده آزاد

شکل 1- مراحل مختلف انتخاب، اخته کردن، گرده­افشانی  و پوشاندن گل­ها در  مطالعات گرده­افشانی کنترل شده

تکثیر آلل­های خودناسازگاری و توالی یابی آنها: تکثیر آلل­ها با استفاده از پنج جفت آغازگر عمومی (جدول 2) مربوط به گیلاس، آلبالو، بادام و سایر گونه­های جنس Prunus انجام شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز با واسرشت سازی اولیه دی.ان.ای ژنومی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه آغاز و با 10 چرخه شامل دمای 94 درجه به مدت 10 ثانیه برای واسرشت سازی، اتصال آغازگرها به رشته الگو به مدت 2 دقیقه (دمای اتصال آغازگرها در جدول 2آورده شده است)، گسترش رشته جدید به مدت دو دقیقه در دمای 68 درجه و به دنبال آن 25 چرخه شامل دمای 94 درجه برای 10 ثانیه، دو دقیقه برای اتصال آغازگر ها و گسترش نهایی در دمای 68 درجه به مدت 2دقیقه دنبال شد به طوری که به ازای هر چرخه 10 ثانیه اضافه تا نهایتا دما به 68 درجه برسد. پس از الکتروفورز، قطعات تکثیر شده، جدا سازی و سپس با کیت NucleoSpin® Geland PCR Clean-up (ماخری-ناژل، آلمان) خالص سازی انجام گرفت. سپس با استفاده از محصول حاصله از تخلیص دوباره واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگر­های مورد نظر انجام شد تا غلظت نمونه به حد مناسبی برای توالی یابی برسد. پس از انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز محصولات دوباره الکتروفورز شدند تا از صحت انجام واکنش اطمینان پیدا شود. نهایتا نمونه­ها در تیوپ­های 2 میلی لیتری برای توالی یابی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شدند.

نتایج

جوانه­زنی و رشد لوله گرده در شرایط درون­شیشه­ای:  محدوده تغییرات درصد جوانه­زنی و رشد لوله­های گرده در ژنوتیپ­های مورد مطالعه به ترتیب 9/22-4/42 درصد و 5/390 – 5/567 میکرون بود. ژنوتیپ­هایA02، N01 و N02 با بیشترین درصد جوانه­زنی (به ترتیب 3/37، 4/36 و 4/42 %) تفاوت معنی­داری با بقیه ژنوتیپ­ها داشتند و کمترین درصد جوانه­زنی نیز متعلق به ژنوتیپ N03
(9/22 %) بود. بیشترین و کمترین رشد لوله گرده به ترتیب مربوط به ژنوتیپ­های N01 (5/567 میکرون) و A02 (5/390 میکرون) بود (جدول 3).

گرده­افشانی کنترل شده و بررسی روند رشد لوله گرده در خامه و تخمدان : گرده­افشانی دستی باید یک الی دو روز پس از اخته کردن گرده­افشانی دستی انجام گیرد. در این مطالعه دو روز پس از اخته کردن گل­ها گرده­افشانی دستی صورت گرفت. مطالعات نشان داده برای رسیدن لوله گرده به پایین خامه در گیلاس و آلبالو 3-2 روز، و برای رسیدن به تخمدان 8-6 روز زمان نیاز است. در آلبالو تا 4 الی5 روز پس از گرده افشانی (بسته به رقم) تعداد لوله گرده رسیده به 3/1 انتهای خامه افزایش پیدا می­کند در حالی که در زمان­های دیرتر تفاوتی مشاهده نمی­شود. در شرایط مزرعه با میانگین دمای روزانه 2/11 درجه سانتیگراد 6 روز زمان لازم است که لوله گرده به تخمدان برسد (4).

جدول 3

حروف مشترک در ستون ها نشانگر عدم تفاوت معنی­دار بین ژنوتیپ­ها است.

مطابق جدول 4 از نظر درصد جوانه­زنی دانه گرده روی کلاله ژنوتیپ N01 با میانگین 24/50 درصد اختلاف معنی­داری با سایر ژنوتیپ­ها داشت و ژنوتیپ­های منطقه نظرلو (N) دارای درصد جوانه­زنی بالاتری نسبت بهعلی بیگلو (A) بودند که نتایج حاصل از مطالعات درون­شیشه­ای نیز این مطلب را تائید می­کند (جدول3). از نظر تعداد لوله گرده در بخش بالایی و پایینی خامه و درون تخمدان نیز در بین تمامی ژنوتیپ­ها و سطوح گرده­افشانی تفاوت معنی­داری مشاهده شد که بیشترین تعداد لوله گرده در بخش بالایی خامه با میانگین 15/7 عدد، بخش پایینی خامه 6/3 عدد و بخش تخمدان 3/2 عدد برای تمامی ژنوتیپ­ها، در حالت گرده­افشانی باز مشاهده شد. با توجه به نتایج در تمامی سطوح گرده­افشانی (چهار سطح) لوله­های گرده به پایین خامه و تخمدان رسیده­اند که این پدیده نشان دهنده خودسازگاری در ژنوتیپ­های مورد مطالعه بود. بر اساس گزارش اکثر محققین در صورت توقف رشد لوله گرده در شرایط خود­گرده­افشانی در یک سوم بخش بالایی خامه حالت خودناسازگاری پیش می­آید.

مقایسه میانگین داده­ها نشان داد که بیشترین میزان جوانه­زنی دانه گرده در سطح کلاله در ژنوتیپ A13 در حالت خود­­گرده­افشانی با میانگین 25/66 درصد مشاهده شد. از نظر تعداد لوله گرده در بخش بالایی خامه ژنوتیپ A13 با میانگین 5/17 عدد در حالت خود گرده افشانی بالاترین میزان را به خود اختصاص داد. همچنین در صفات تعداد لوله گرده در بخش پایینی خامه و درون تخمدان ژنوتیپ­های N01 و N02 با میانگین­های 5/6 و 6 عدد برای صفت بخش پایینی خامه و میانگین­ 5/4 عدد برای صفت درون تخمدان در حالت گرده­افشانی باز مشاهده شد (جدول 5). میزان جوانه­زنی دانه گرده در حالت دگرگرده­افشانی نسبت به حالت­های خودگرده­افشانی و گرده­افشانی باز پایین­تر می باشد همچنین در حالت دگرگرده­افشانی تعداد لوله گرده کمتری در طول خامه و تخمدان مشاهده شد. بنابراین به توجه نتایج می­توان تائید کرد که ژنوتیپ­هایی با درصد جوانه زنی بالا، قابلیت تامین رشد لوله­های گرده بالاتری دارند.

روابط سازگاری ژنوتیپ­های مورد مطالعه با واکنش زنجیره­ای پلیمراز: نتایج حاصل از تکثیر جفت آغازگر اختصاصی PaCons I-F/PaCons I-R2new که اینترون اول مکان ژنی آلل S جنس Prunus را تکثیر می­کنند نشان داد که دو قطعه با اندازه تقریبی 360 و 450 جفت­باز تکثیر شدند (جدول 6).

قطعات تکثیر شده بعد از جدا و خالص سازی جهت شناسایی آلل­های S توالی­یابی شدند. نتایج حاصل از بلاست توالی 360 جفت بازی نشان داد که قطعه تکثیر شده شباهت بالایی(98 درصد) با توالی نسبی آلل S₉ گیلاس که توسط Sonneveld و همکاران (2003) در پایگاه NCBI ثبت شده بود نشان داد. بلاست توالی 450 جفت بازی نشان داد که قطعه تکثیر شده با شباهت 99 درصدی با توالی نسبی S₆ در رقم کرونیو گیلاس (32)، همچنین با شباهت 99 درصدی با توالی کامل آلل  S_6m2آلبالو (36) که در پایگاه NCBI ثبت شده بودند داشت بنابراین با احتمال بالایی آلل­های تکثیر شده همان S₉ ، S₆ یا S_6m2 می­باشند.

با استفاده از جفت آغازگر­های اختصاصی اینترون دوم PaConsII-F/PaConsII-R؛ PruC2/PruC4R؛ PruC2/PCE-R و EM-PC2ConsFD/EM-PC5ConsRD یازده نوار در محدوده 370 الی 1000 جفت باز در ژنوتیپ­های مورد مطالعه تکثیر شدند (جدول 6). پس ازتوالی­یابی قطعات و بلاست کردن آنها در پایگاه NCBI وجود آلل­های S₂₄، S₉، S₆/S_6m2، S₂₆، S₄وS₃₅ ، S_36a/S_36b در این ژنوتیپ­ها مشخص شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگر اختصاصی اینترون دوم PruC2/PruC4R چهار باند با اندازه­های 440، 470، 650 و 680 را تکثیر کرد (شکل 2). همچنین جفت آغازگر EM-PC2ConsFD/EM-PC5ConsRD توانست قطعه تقریبا 1000 جفت بازی را در همه ژنوتیپ­ها و دو رقم سیگانی و بوترمو تکثیر کند با توجه به اینکه در رقم سیگانی آلل S_36b2 و در رقم بوترمو S_36a ثابت شده است بنابراین برای تایید اینکه کدام آلل در ژنوتیپ­های بومی حضور دارد نیاز به تکثیر با آغازگر اختصاصی است که بتواند تفاوت قطعات را نشان دهد. در مطالعه­ای تائید شد که فراوانی هاپلوتایپ S_36a در بین ارقام آلبالو بیشتر از دیگر هاپلوتایپ­های S₃₆ می­باشد (37 ؛ 15)، بنابراین احتمال حضور این آلل در ژنوتیپ­های بومی بیشتر است و حضور هر کدام از این آلل­ها باعث القا خودسازگاری می­گردد.

شکل 2- الگوی باندی حاصل از آغازگر اختصاصی  Pruc2 – PruC4R پس از انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز در ژنوتیپ­های مورد مطالعه (A01 (1)، A02 (2)، A04 (3)، A05 (4)، A12 (5)، A13 (6)، N01 (7)، N02 (8)، N03 (9)، N04 (10)، سیگانی (Cig)، بوترمو (Bot) و سایز مارکر(M)

بحث

Bolat and Pirlak (1999) جهت بررسی قوه نامیه، درصد جوانه­زنی و رشد لوله گرده در 5 رقم زردآلو، 4 رقم گیلاس و یک رقم آلبالو، چهار روش 2-2-5- تری فنیل تترازولیوم، یدید پتاسیم، سافرانین و محیط کشت آگار را به کار بردند نتایج نشان داد که قوه نامیه، درصد جوانه­زنی و رشد لوله گرده بر اساس گونه متفاوت بود و بالاترین درصد جوانه­زنی و رشد لوله گرده در همه گونه­ها و ارقام در محیط کشت آگار با 15 درصد ساکارز حاصل شد به­ طوریکه درصد جوانه­زنی گرده­ها در آلبالو 82/53 % گزارش شد. Davarynejad و همکاران (2008) محدوده جوانه زنی دانه گرده را در شرایط آزمایشگاهی در برخی از ارقام خارجی 12/29 – 59/64 درصد گزارش کردند. شرایط آب و هوایی سرد و بارانی در دوره گلدهی به طور معنی­داری میزان جوانه­زنی دانه گرده و به تبع آن تشکیل میوه را کاهش می­دهد. علاوه بر فاکتور­های محیطی، برخی ویژگی­های بیولوژیکی آلبالو نظیر پتانسیل باروری پایین گل­ها در ارقام، دوره کوتاه گرده­افشانی و کیفیت پایین گرده روی کارایی گرده­افشانی تاثیر منفی گذاشته و میزان تشکیل میوه را کاهش می­دهند (1 و 33).

Milatovic and Nicolic  (2007) در ارزیابی خود (نا) سازگاری 36 رقم زردآلو به این نتیجه رسیدند که در صورت نفوذ فقط یک لوله گرده به تخمدان، خود­سازگار محسوب می­شود. همچنین در مشاهدات Kamali (1387) تعداد لوله گرده نفوذ کرده در قسمت­های مختلف خامه در ارقام خودسازگار بالاتر از ارقام خودناسازگار بادام بوده و حتی در برخی از ارقام خودناسازگار تعداد زیادی لوله گرده تا میانه خامه رشد می­کند. در مطالعات Hajilou و همکاران (2006) که خود (نا)سازگاری مهمترین ارقام زردآلو را مورد بررسی قرار داده بودند اختلاف معنی­داری را بین حالت­های خود­گرده­افشانی و دگر­گرده­افشانی از لحاظ درصد میوه­بندی و تعداد لوله گرده در تخمدان مشاهده نکردند.

Khadivi-Khub و همکاران (2014) در بررسی تنوع آلل­های S در 8 گونه وحشی و دو گونه اهلی (گیلاس و آلبالو) زیرجنس Cerasus ثابت کردند که چندشکلی بالایی از لحاظ آلل­های S در بین گونه­های مورد مطالعه وجود دارد و آلل S₃ در بین ارقام محلی گیلاس دارای بیشترین فراوانی بود و آلل­های S₁، S₂،S₇، S₁₄، S₂₀ و چندین آلل نامعلوم در گونه­های وحشی دیده شدند، همچنین گزارش نمودند که آلل­ های S₆، S₉، S₁₃ و S₂₇ در ژنوتیپ­های ایرانی آلبالو مشاهده شد، که در این پژوهش نیز وجود آلل­های S₆ و S₉در ژنوتیپ­های بومی تائید شد. در مطالعه دیگری تنوع آلل­های S در 123 نمونه (Accession) گیلاس وحشی مورد بررسی، نتایج نشان داد که هاپلوتایپ­های S₁₄ و S₁ بیشترین و S₂₀ کمترین فراوانی را در بین جمعیت­های گیلاس داشتند (29). مطالعه حاضر نشان داد تنوع زیادی از لحاظ آلل­های S در بین ژنوتیپ­های مورد بررسی وجود ندارد ولی هاپلوتایپ­های S₂₄، S₆، S₉ دارای بیشترین فراوانی بودند. تنوع آلل S برای هر منطقه جغرافیایی خاص همان منطقه است، در ژرم­پلاسم ایتالیا آلل­های S₃، S₁₃، S₆ و S₁₆ دارای بیشترین فراوانی (19)، و در ارقامی که از جنوب شرق اسپانیا منشا گرفته بودند آلل­های S₃، S₆، S₁₂ و S₂₂ غالب بودند (7). همچنین در مقایسه ژنوتیپ­های S ارقام اکراینی و جمهوری چک نشان داده شد که آلل­های S₃، S₁ و S₄ در ارقام جمهوری چک و S₂، S₅، S₆ و S₉ در ارقام اکراینی دارای بیشترین فراوانی بودند (15). در مناطقی که سطح تنوع ژنتیکی بالا بوده خصوصا در مناطقی که منشا گونه­ها و ارقام محسوب می­شوند تنوع بالایی در آلل­های S وجود دارد. بنابراین مکان ژنی S می­تواند به عنوان یک نشانگر مفید برای مطالعه سطح تنوع ژنتیکی ارقام مختلف به کار برده شود (16).

نتیجه گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که در تمامی ترکیبات تیماری درصد جوانه­زنی دانه گرده هم در شرایط باغ و هم در شرایط آزمایشگاهی در حد مناسبی صورت گرفته که این امر بیانگر عدم وجود مشکلات جوانه­زنی دانه گرده در ژنوتیپ­های مورد بررسی می­باشد. علاوه بر این نتایج حاصل از روند رشد لوله گرده نشان داد که با توجه به رشد لوله گرده در قسمت­های مختلف خامه و نهایتا رسیدن به تخمدان در تمامی حالت­های گرده­افشانی در ژنوتیپ­های مورد مطالعه ناسازگاری وجود ندارد. همچنین نشان داده شد که آغازگر­های عمومی آلل­های S به تنهایی نمی­توانند برای تعیین ژنوتیپ S قابل اطمینان باشند، بنابراین برای داشتن اطمینان و جلوگیری از واکنش­های اضافی پیشنهاد می­شود از تجزیه دو مرحله­ای در مرحله اول از آغازگر­های عمومی برای پیش غربالگری و سپس استفاده از آغازگر­های تخصصی برای تائید و یا رد آلل­های که توسط آغازگر­های عمومی تکثیر شدند برای شناسایی آلل­های S استفاده گردد. با توجه به نتایج آزمایشات گرده­افشانی کنترل شده و داده­های مولکولی می­توان نتیجه گرفت که ژنوتیپ­های مورد بررسی سازگار بوده و دلیل باردهی پایین می­تواند متاثر از موفولوژی گل­ها و فاکتور محیطی باشد. مطالعات قبلی ثابت کرده بودند که رابطه مستقیم بین آلل­های S و درصد تشکیل میوه وجود ندارد و این نشان دهنده این واقعیت است که علاوه بر ژنوتیپ آلل­های S عوامل دیگری نظیر فاکتور­های محیطی روی میزان تشکیل میوه و باردهی درخت تاثیر می­گذارند.

سپاسگزاری

پژوهش حاضر مستخرج از رساله دکتری و با حمایت­های مادی و معنوی دانشگاه تبریز و پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج انجام گرفته و لذا بر خود لازم می­دانیم که نهایت تشکر و سپاس را از دانشگاه و پژوهشکده مذکور داشته باشیم.