شناسایی عامل رونویسی موثر بر پروموتر مسیر بیوسنتزی کارتنوئیدی/آپوکارتنوئیدی در Crocus sativus L.

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی ، دانشگاه بوعلی سینا ، همدان ، ایران

2 عضو هیئت علمی

چکیده

این حقیقت به خوبی اثبات شده که کلاله به عنوان بخشی از گل زعفران محل اصلی برای سنتز بسیاری از کاروتنوئیدها و آپوکاروتنوئیدها مهم است و آن نیز در مرحله خاصی از مراحل رشد صورت می‌گیرد، اما هیچ چیز در خصوص مکانیسمی که سنتز آن را تنظیم می‌کند شناخته نشده است. تحقیقات گسترده در مورد آنزیم‌هایی که در بیوسنتز آپوکاروتنوئید‌های زعفران بخصوص کروسین نقش دارند نشان دهنده‌ی فراوانی حضور یکی از این آنزیم‌ها یعنی CsLcy-β2a در کلاله است. همچنین مشخص شده است این آنزیم باعث فعال‌سازی و افزایش تجمع بتاکاروتن می‌شود. عوامل رونویسی به عنوان یکی ازگروه‌های تنظیم کننده با تنظیم بیان ژن به صورت بافت اختصاصی و زمان اختصاصی از طریق توانایی آنها در اتصال به پروموتر ژن‌های هدف در بسیاری از فرآیند‌های بیولوژیکی و تکاملی گیاهان نقش حیاتی ایفا می‌کنند. در این تحقیق با استفاده از سیستم GoldenBraid سازه‌های حاوی عوامل رونویسی CsMYB، CsARF8، CsERF2 و CsZinc-figer CCCH و توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a در اتصال با ژن گزارشگر لوسیفراز (Firefly) ساخته شد و با روش آگرواینفیلتریشن به برگ‌های گیاه توتون گونه بنتامیانا (Nicotiana.bentamiana) تزریق شدند و میزان فعال‌سازی پروموتر تحت تاثیر عوامل رونویسی از طریق سنجش دوگانه لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. تنها برای یکی از عوامل رونویسی یعنی CsMYB، نسبت لومینسانس لوسیفراز بر رنیلا (LUC/REN) تغییر کرد. در مجموع، یافته‌های این پژوهش نشان می‌دهد که CsMYB یک تنظیم کننده مثبت مسیر بیوسنتز کاروتنوئید/آپوکاروتنوئیدها در زعفران است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Identification of transcription factor affecting a promoter of carotenoid/apocartenoid biosynthetic pathway in Crocus sativous L.

نویسندگان [English]

  • Zahra Azizi 1
  • Ali Deljou 2

1 Agricultural Biotechnology Dept., Engineering and Technology Faculty, Bu-Ali Sina University, Hamedan. Iran

2 academic staff

چکیده [English]

It is a well established fact that stigma part of the Crocus sativus L. flower is the actual site for synthesis of many important carotenoids and apocarotenoids, and that too done at specific stages of development, but nothing is known about the mechanism that regulates its synthesis. Extensive researches on enzymes involved in the biosynthesis of saffron apocartenoids, especially crocin, indicates the presence of one of these enzymes, CsLcy-β2a in the stigma and also it activates and boosts b-carotene accumulation. Transcription factors, as a group of regulators, regulate many developmental and physiological processes in plants via their ability to tissue-specific and time-specific binding to promoters of target genes in order to control of gene expression. In this study, constructs contains of sequences CsMYB, CsARF8, CsERF2, CsZinc-finger CCCH and sequence CsLcyβ2a promoter fused with firefly luciferase reporter gene made by GoldenBriad system, and they was transferred to tobacco leaves (Nicotiana benthamiana) by agro-infiltration .The interaction between transcription factors and promoter was evaluated using Dual-Luciferase System assays .luciferase/Renilla (Luc/Ren) luminescence ratio was changed for only one transcription factor )CsMYB). Taken together, our findings illustrate that CsMYB is a positive regulator of carotenoid/apocarotenoid biosynthetic pathway in saffron.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Crocus sativus L
  • transcription factors
  • GoldenBriad
  • agro-infiltration
  • Dual-Luciferase System Assays

شناسایی عامل رونویسی موثر بر پروموتر مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی/آپوکاروتنوئیدی در Crocus sativus L.

زهرا عزیزی و علی دلجو*

ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا همدان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: ۲۰/۱۱/۱۳۹۹          تاریخ پذیرش: ۲۵/۰۲/۱۴۰۰

چکیده

این حقیقت به خوبی اثبات شده که کلاله به عنوان بخشی از گل زعفران محل اصلی برای سنتز بسیاری از کاروتنوئیدها و آپوکاروتنوئیدها مهم است و آن نیز در مرحله خاصی از مراحل رشد صورت می­گیرد، اما هیچ چیز در خصوص مکانیسمی که سنتز آن را تنظیم می­کند شناخته نشده است. تحقیقات گسترده در مورد آنزیم­هایی که در بیوسنتز آپوکاروتنوئید­های زعفران بخصوص کروسین نقش دارند نشان دهنده­ی فراوانی حضور یکی از این آنزیم­ها یعنی CsLcy-β2a در کلاله است. هم­چنین مشخص شده است این آنزیم باعث فعال­سازی و افزایش تجمع بتاکاروتن می­شود. عوامل رونویسی به عنوان یکی ازگروه­های تنظیم­کننده با تنظیم بیان ژن به صورت بافت اختصاصی و زمان اختصاصی از طریق توانایی آن­ها در اتصال به پروموتر ژن­های هدف در بسیاری از فرآیند­های بیولوژیکی و تکاملی گیاهان نقش حیاتی ایفا می­کنند. در این تحقیق با استفاده از سیستم GoldenBraid سازه­های حاوی عوامل رونویسی CsMYB، CsARF8، CsERF2 و CsZinc-figer CCCH و توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a در اتصال با ژن گزارشگر لوسیفراز (Firefly) ساخته شد و با روش آگرواینفیلتریشن به برگ­های گیاه توتون گونه بنتامیانا (Nicotiana.bentamiana) تزریق شدند و میزان فعال­سازی پروموتر تحت تاثیر عوامل رونویسی از طریق سنجش دوگانه لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. تنها برای یکی از عوامل رونویسی یعنی CsMYB، نسبت لومینسانس لوسیفراز بر رنیلا (LUC/REN) تغییر کرد. در مجموع، یافته­های این پژوهش نشان می­دهد که CsMYB یک تنظیم­کننده مثبت مسیر بیوسنتز کاروتنوئید/آپوکاروتنوئیدها در زعفران است.

واژه های کلیدی: Crocus sativus L.، عوامل رونویسی، GoldenBriad، آگرواینفیلتریشن، سنجش دوگانه لوسیفراز.

* نویسنده مسئول، تلفن: ۰۹۱۸۱۱۱۱۵۶۷، پست الکترونیکی: 110deljou@gmail.com

مقدمه

 

کاروتنوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات هستند که از پیش ماده­های ایزوپرونوئیدی مشتق می­شوند و به عنوان اجزای سازنده مسیرهای فتوسنتزی، یعنی به عنوان پیش­سازهای فیتوهورمون­ها مانند اسیدآبسیزیک (ABA) واستریگولاکتون­ها عمل می­کنند. این ترکیبات مسئول ایجاد رنگ­های زرد تا قرمز در بسیاری از میوه­ها و گل­ها هستند. آپوکاروتنوئیدها ترکیبات زیستی مشتق شده از کاروتنوئیدها بوده که به طور متابولیکی حاصل از تجزیه اکسیداتیو کاروتنوئید C40 می­باشند (۶). برخی از آپوکاروتنوئیدها به دلیل خواص رنگدانه­ای خود توسط انسان مورد بهره برداری قرار می­گیرند، به عنوان مثال بیکسین (۲۹)، هترانتین و دیتاکسین (۲۳) و زعفران (۷). آپوکاروتنوئیدهای زعفران به عنوان اجزای فعال در نظر گرفته می­شوند زیرا آن­ها قادر به درمان بیماری­های مزمن و کاهش خطر ابتلا به سرطان هستند و اثرات مثبتی بر اختلالات عصبی دارند (۱۱).

کلاله­های قرمز خشک شده C. sativus L. در تهیه زعفران مورد استفاده قرار می­گیرند. این ادویه یکی از قدیمی­ترین مواد افزودنی طبیعی غذایی است که هم به عنوان طعم­دهنده و هم یک عامل رنگ­آمیزی مورد استفاده قرار می­گیرد. کلاله زعفران به طور استثنایی حاوی سطح بالایی از آپوکاروتنوئید قطبی معروف به کروسین است که رنگ را به ادویه زعفران می­بخشد. بیوسنتز کروسین در زعفران شامل یک مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدی ویژه در کروموپلاست است. در این اندامک سنتز کاروتنوئید برای تولید آپوکاروتنوئیدهای رنگی تجمع یافته در کلاله زعفران با کمک آنزیم­های ویژه­ی این مسیر (CsPSY2، CsLCY-β2، CsBCH2 و CCD2) صورت می­گیرد. بیان ژن­های کد کننده این چهار آنزیم موثر در بیوسنتز آپوکاروتنوئیدها در کلاله زعفران، در طول توسعه آن به طور هماهنگ افزایش می­یابد و در نتیجه باعث فعال شدن شدید جریان متابولیکی مسیر آپوکاروتنوئیدی می­شود (۶).

شناخت روزافزون ما از آنزیم­های کاروتنوژنیک که به طور ویژه در بافت­های کروموپلاستی بیان می­شوند، نقطه عطفی در مطالعه تنظیم کاروتنوژنسیس در بافت­های با ارزش اقتصادی بالا فراهم آورده است. چرخه لیکوپن، یک نقطه انشعاب کلیدی در مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها می­باشد که عمیقا بر ترکیب محتوای کاروتنوئیدی تاثیرگذار است. ویژگی منحصربفرد کلاله زعفران به واسطه دارا بودن مقادیر قابل توجه آپوکاروتنوئیدهای مشتق از بتا کاروتن و زئاگزانتین می­باشد. در بررسی­های فیلوژنتیکی و بیانی انجام شده بروی ژن CsLcy-β2a در زعفران مشخص شده است که این ژن، لیکوپن سیکلاز­های کروموپلاستی را کد می­کند و فراوانی حضور آن در کلاله با افزایش تجمع بتاکاروتن همراه است. از طرفی نتایج بیانی ژن CsLcy-β2a در کلاله گونه­های مختلف جنس کروکوس نشان داده است که تنظیم رونویسی این ژن بر محتوای کاروتنوئید و آپوکاروتنوئید در بافت کلاله تاثیر می­گذارد (۷).

عوامل رونویسی بسیاری از فرآیند­های مرتبط با رشد و فیزیولوژی در گیاهان را از طریق توانایی اتصال آن­ها به پروموترهای ژن­های هدف و کنترل بیان این ژن­ها تنظیم می­کنند. مشخص شده است که ژن­های AGAMOUS-like 1 و FRUITFULL متعلق به خانواده عوامل رونویسی MADS-box می­توانند تجمع کاروتنوئید را هنگام رسیدن در گیاه گوجه­فرنگی تنظیم کنند (۹) و در مطالعه­ای توسط Martel و همکاران (۲۰۱۱) نشان داده شده است که بازدارنده رسیدن گوجه­فرنگی (MADS-RIN) ازطریق برهمکنش با پروموترPSY1، غلظت کاروتنوئید میوه را تنظیم می­کند. همچنین گزارشاتی مبنی بر نقش عوامل رونویسی متعلق به زیر گروه AP2/ERF ارائه شده است که نشان می­دهد این عوامل نقش مهمی در تجمع کاروتنوئیدی دارند (۱۸). در گوجه­فرنگی نشان داده شده دو فاکتور از خانواده عوامل رونویسی NAC (SINAC1 و (SINAC2 تجمع کاروتنوئید را هنگام رسیدن میوه تعدیل می­کنند (۲۲ و ۳۸). در مرکبات CsMADS6، بیان ژن آنزیم­های PSY، PDS و CCD1 را از طریق اتصال مستقیم به پروموترهای این ژن­ها تنظیم می­کند، و این بدان معنی است که CsMADS6 تنظیم کاروتنوژنسیس چندین ژن هدف را تحت کنترل خود دارد (۲۰).

پژوهش­های دیگر نقش عامل رونویسی MYB را در تنظیم کاروتنوئیدی توصیف کرده­اند. عوامل رونویسی MYB یکی از بزرگترین خانواده­های عوامل رونویسی در گیاهان است و در فرآیندهای بسیاری از رشد گل و بذر، تا سیگنال­دهی هورمون­ها، بیوسنتز متابولیت­ها و رنگدانه­سازی بافت­ها نقش دارند که توسط جینومارتین (۱۹۹۹) بررسی شده­است. در مطالعه­ای بر روی Erythranthelewisii از طریق تجزیه و تحلیل داده­های تفرق بالک یک عامل رونویسی R2R3 MYB، کاهش­دهنده رنگدانه کاروتنوئید ۱ (RCP1) شناسایی شد که تنظیم­کننده مثبت سطح کاروتنوئید در گل­ها می­باشد (۳۰). در جهش یافته­هایE. lewisii با کاهش رنگ گلبرگ، نشان داده شد که RCP1 کل مسیر بیوسنتز کاروتنوئید را کنترل می­کند. RCP1 به زیر گروه MYB21 تعلق دارد (۳۳) که تاکنون نقش این عامل رونویسی در تنظیم تولید رنگدانه­های گیاهان مورد مطالعه قرار نگرفته است. پژوهشی دیگر بر روی جهش یافته­های Citrus reticulate به منظور توصیف نقش عوامل رونویسی MYB در تجمع کاروتنوئیدی، عملکرد بسیار متفاوتی ارائه داد. این پژوهشگران موفق به شناسایی یک عامل رونویسی MYB (CrMYB68) شدند، که به نظر می­رسد بافعالیت ژن­های مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها رابطه منفی داشته باشد (۳۹). در مطالعه­ی دیگری بر روی کیوی یک عامل رونویسی MYB شناسایی شد که از طریق اتصال به پروموتر ژن AdLcy-β منجر به فعال­سازی آن و در نهایت افزایش رونویسی در گیاهان مدل گردید (۹).

عوامل رونویسی درگیر در رشد گیاه معمولاً از طریق تجزیه و تحلیل فنوتیپ­های ایجادکننده آن­ها شناسایی می­شوند. با این حال، شناسایی عوامل رونویسی کنترل­کننده مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدی با استفاده از این روش احتمالاً به دلیل کشنده بودن جهش­های ایجاد شده در گیاهان با محدودیت مواجه شده است. از این رو، تله­های پروموتری (Promoter traps)، روش­های عمیق توالی­یابی یا اتصال عوامل رونویسی کاندید به پروموترهای ژن­های هدف، در درک تنظیم مسیر کاروتنوئیدی مورد توجه قرار گرفته­اند (۹).

با توجه به مطالب فوق پیدا کردن شناخت کافی پیرامون عوامل رونویسی کلیدی تنظیم­کننده مسیر بیوسنتز کاروتنوئید/آپوکاروتنوئید در زعفران ضروری بنظر می­رسد. پیش­تر توسط تیم تحقیقاتی پروفسور گومز یک خزانه ژنی از قسمت­های مختلف کلاله در گونه­های مختلف جنس کروکوس با هدف شناسایی عوامل رونویسی زعفران ساخته شده است (۴ و ۵). با توجه به مطالب بالا و اهمیت بررسی نقش عوامل رونویسی در مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی، در این تحقیق از چهار عامل رونویسی با طول کامل (CsARF8، CsMYB، CsERF2 و CsZinc-finger CCCH) به منظور بررسی اثر این عوامل در تنظیم بیان ژن لیکوپن بتا سیکلاز به عنوان یکی از آنزیم­های اصلی در مسیر بیوسنتز آپوکاروتنوئید کروسین در طول فرآیند تکامل کلاله زعفران استفاده شد. از سوی دیگر با توجه به آنالیز­های انجام گرفته و شناسایی توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a (۷)، در این پژوهش از این پروموتر استفاده شد تا نحوه اثر عوامل رونویسی منتخب در فعال­سازی بیان آنزیم CsLcy-β2a از طریق اتصال به این پروموتر مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روشها

در تحقیق حاضر از نتایج آنالیز ترانسکریپتوم کلاله زعفران در مراحل مختلف توسعه با روشRNA-seq ، که توسط تیم تحقیقاتی پرفسور گومز انجام شده بود استفاده گردید. چهار ژن کاندید عوامل رونویسی CsARF8، CsMYB، CsERF2 و CsZinc-finger CCCH برای آنالیز­های بعدی انتخاب شدند.

استخراج RNA و سنتز cDNA: استخراج RNA از بافت­های مختلف زعفران مثل کلاله، برگ­ها و کروم (غده) (طبق روش روبیو و همکاران، 2008) باکیت Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research) طبق پروتکل شرکت سازنده انجام گرفت وسپس جذب نمونه­ها با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی-فرابنفش اندازه گیری شد. برای سنتز cDNA ازFirst Strand cDNA Synthesis Kit  استفاده شد.

آنالیز Real-time PCR: با روش Real-timePCR، در مراحل مختلف از گلدهی زعفران و هم­چنین در اندام­های متفاوت (گل، برگ و غده) عوامل رونویسی فوق مورد ارزیابی قرار گرفتند. تا ضمن تایید نتایج حاصل از RNA-seq، اندام­های مختلف از نظر بیان این ژن­ها مورد ارزیابی قراربگیرند. در این آنالیز از MasterLight Cycler 480 SYBR Green I شرکت Roche شد. شرایط انجام واکنش بدین شرح بود: واسرشتگی اولیه بمدت ۵ دقیقه در دمای ℃ ۹۴ صورت گرفت. سپس ۴۰ چرخه، شامل واسرشتگی بمدت ۲۰ ثانیه در دمای ℃۹۴، اتصال بمدت ۲۰ ثانیه در دمای بهینه شده برای هر آغازگر و تکیثر بمدت ۲۰ ثانیه در دمای℃۷۲ انجام شد. در آخر تکثیر نهایی بمدت ۵ دقیقه در دمای℃۷۲ صورت پذیرفت. جهت ارزیابی و نرمال­سازی نتایج از ژن رفرنس 18srRNA استفاده شد. آغازگرهای اختصاصی عوامل رونویسی و همچنین ژن رفرنس (۸) در جدول ۱ آورده شده است.

 

جدول 1- آغازگرهای استفاده شده برای ارزیابی بیان عوامل رونویسی و ژن رفرنس.

Reverse sequence

Forward sequence

TFs

5′- AACTCCTGGTTTCCCTACTTTCT-3′

5- atgaactggactttagctttagGA-3′

ARF8

5′- TCATAACAATTCATCAGAGAAAGT -3′

5- gatatgggaagacctccttgt -3′

MYB

5′-TCAGTAGACATCATCCCAGATC -3′

5- atgtgtggaggatccatcatct -3′

ERF2

5′-CAGCCGCCTTTCTTGTAGTC -3′  

5- CCGTCGCTGGATCTCTACTC -3′

Zinc-finger CCCH

5′- CGAACGAGACCTCAGTCTGCTAA - 3′

5′- TTCAATCCGTAGGAGCGACA -3′

18s Rrna

 

 

تکثیر و خالص سازی توالی­ها: توالی عوامل رونویسی و پروموتر در ابتدا از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از TaqAdavantage (شرکت Promega) تکثیر شدند. طبق پروتکل کیت Wizard SV Gel and PCR Clean –Up System خالص­سازی باند­های تکثیر شده از روی ژل آگارز صورت گرفت. سپس کیفیت و کمیت DNA خالص­سازی شده توسط اسپکتروفتومتر مرئی-فرابنفش در OD260 نانومتر صورت گرفت.

باکتری­ها و ناقل­های مورد استفاده: در این تحقیق از سلول­های مستعد Stellar (اشریشیاکلای سویه HST08) شرکت تاکارا، برای کلونینگ و از آگروباکتریوم توموفشینز سویه GV3101 برای آگرواینفیلتریشن گیاه و آزمایشات ترانسفورماسیون استفاده شد. هم­چنین از روش GoldenBraid و ناقل­های آن (برای ساخت و سرهم بندی ناقل­های ورودی، مقصد و بیانی) استفاده گردید. در ابتدا توالی عوامل رونویسی، پروموتر و ژن گزارشگر لوسیفراز (Firefly) به صورت مجزا درناقل  pUPD2که حاوی ژن مقاومت به کلرامفنیکل است کلون شدند. برای ساخت ناقل­های مقصد، ابتدا توالی عوامل رونویسی کلون شده در ناقل pUPD2 در ناقل pDGBα1 درج و سازه (pDGBα1:p35s-TFs-T35s) ایجاد شد و سپس با استفاده از ناقل pDGBα2، سازه (pDGBα2:pCsLcy-β2-LUC-T35s) ساخته شد هر دو ناقلα1  و α2 دارای ژن مقاومت به کانامایسین هستند (در توالی ناقل pDGBα2 ژن گزارشگر رنیلا (Renilla) از قبل درج شده است). برای تهیه ناقل­های بیانی ازناقل pDGBΩ1 استفاده شد این ناقل دارای ژن مقاومت به آنتی­بیوتیک اسپکتینومایسین می­باشد. در نهایت سازه
pDGBΩ1: pDGBα1 [p35s-TFs-T35s]-pDGBα2 [pCsLcy-β2-LUC-T35s])) ایجاد شد. در این آزمایشات از آنزیم T4 DNALigase (M108B)شرکت Promegaو Esp3I/BsmbI شرکت فرمنتاز استفاده شد. شرایط واکنش ۳ ساعته در دستگاه ترموسایکلر به صورت زیر می­باشد: ۲۵ چرخه، ۲ دقیقه در ℃37، ۵ دقیقه در ℃ ۱۶.

انتقال ناقل به باکتری و خالص­سازی آن­ها: پس از هر مرحله از سرهم­بندی و ساخت ناقل، ترانسفورم کردن باکتری­های مستعد stellar انجام شد و محصول ترانسفورماسیون روی پلیت­های جداگانه­ی محیط LB حاوی آنتی بیوتیک­های مربوط به هر ناقل با غلظت ۲۵ میکروگرم در میلی­لیتر، IPTG با غلظت ۰/۵ میلی­مولار و XGal با غلظت ۴۰ میکروگرم در میلی­لیتر پخش گردید و به مدت یک شب در دمای ℃ ۳۷ نگهداری شد. سپس گزینش آبی-سفید صورت گرفت و روز بعد واکنشPCR انجام و محصول واکنش روی ژل الکتروفورز با تشکیل باند کلنی­های مثبت را مشخص کرد. این کلنی­های در محیط مایع LB حاوی آنتی بیوتیک­ها به مدت یک شب در شکیر انکوباتور با شرایط دمایی فوق نگهداری شدند. سپس خالص­سازی ناقل­ها با کیت QIAprep Spin MiniprepKit، طبق پروتکل شرکت سازنده صورت گرفت.

هضم آنزیمی ناقل­ها: کلون­هایی که پس از الکتروفورز مثبت بودند یک مرحله واکنش هضم با آنزیم­های DarI، EcoRI، BamHI، NedI، XohI داشتند. پس از آماده­سازی واکنش هضم نمونه­ها به مدت یک شب در انکوباتور در دمای ℃۳۷ نگهداری و سپس روی ژل آگارز ۱ درصد الکتروفورز شدند. غلظت نمونه­های DNA در هر مرحله با دستگاه اسپکتروفتومتر مرئی-فرابنفش در OD260 نانومتر سنجیده شد.

آگرواینفیلتریشن گیاه توتون: از باکتری Agrobacterium tumefaciens سویه GV30101 که حاوی ناقل­های نوترکیب pDGBΩ1 است برای بررسی آنالیز­های برهمکنش عوامل رونویسی با پروموتر استفاده شد. از سویه GV30101 که حاوی ناقل استاندارد GB0166 است به عنوان کنترل مثبت و از ناقل pDGBΩ1 که فاقد ژن­های مورد نظر بود به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

آماده­سازی سلول­های مستعد و تراریختی آگروباکتریوم سویه GV30101 به روش الکتروپوریشن انجام شد. نمونه­های آگروباکتریوم ترانسفورم شده روی محیط کشت (YEB= Yeast Extract Beef (YEB) Broth) حاوی آنتی­بیوتیک­های جنتامایسین، رافامپیسین و اسپکتینومایسین کشت داده شدند و در دمای℃ ۲۸ به مدت ۷۲-۴۸ ساعت انکوبه شدند. آماده­سازی سلول­ها جهت تزریق بر اساس روش اورزاز و همکاران (۲۰۰۶) انجام شد. بدین منظور کلنی­های آگروباکتریوم نوترکیب در ۵ میلی لیتر از محیط کشت در شیکرانکوباتور با شرایط ۱۶۰ دور در دقیقه و دمای℃ ۲۸ به مدت یک شب نگهداری شدند. سپس به کشت­های سلولی باکتری ۵۰ میلی لیتر از محیط القایی اضافه شد و مجددا در شرایط ذکر شده در بالا قرار گرفتند. باکتری­ها با سانتریفیوژدر ۴۰۰ دور در دقیقه رسوب داده شدند و در محیط اینفیلتریشن حاوی MES (mΜ ۱۰)، MgCl2(mΜ ۱۰) و استوسرینگون (µΜ۲۰۰) حل شدند و به مدت دو ساعت در دمای اتاق روی یک شکیر افقی تا حصول به ۸/۰=OD600 نانومتر نگهداری شدند. عمل آگرواینفیلتریشن در برگ­های جوان گیاه توتون گونه بنتامیانا با سرنگ ۲ میلی لیتر بدون سوزن انجام گرفت. سوسپانسیون­های باکتریایی به اپیدرم پشت برگ­های متصل به گیاه تزریق شدند. سپس گیاهان شب اول را در اتاق تاریک و سپس در دستگاه ژرمیناتور برای مدت ۴ تا ۵ روز تحت شرایط ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی در دمای ℃۲۰ نگهداری شدند.

آزمون سنجش دوگانه لوسیفراز: در این پژوهش برای سنجش فعالیت لوسیفراز از کیتDual-Luciferase Activity System  Assay (Promega: ایالات متحده) استفاده شد. در ابتدا برش­های دیراه­ای به قطر ۸/۰ سانتی­متر و وزن تقریبی ۱۹-۱۸ میلی­گرم از هر برگ آگرواینفیلتریت شده جدا شد و در ویال­های ۵/۱ میلی­لیتری با استفاده ازگوی­های فلزی و دستگاه RETSCH ball Mill MM400 همگن شدند. طبق پروتکل کیت مراحل آماده­سازی عصاره گیاه انجام شد. برای تعیین فعالیت لوسیفراز از یک پلیت ۹۶ چاهکی سفید استفاده شد. سنجش فعالیت لوسیفراز (LUC) و رنیلا (REN) طبق پروتکل شرکت سازنده کیت با استفاده از دستگاه GloMax 96 MicroplateLuminometer (Promega)صورت گرفت.

نتایج

بررسی الگوی بیان عوامل رونویسی از طریق تجزیه و تحلیل داده­های Real-time PCR: بیان عوامل رونویسی انتخاب شده در مراحل مختلف توسعه کلاله و در اندام­های برگ و کروم به واسطه­ی بررسی نتایج آنالیز
Real-time PCR صورت گرفته برای توالی عوامل رونویسی مذکور (CsMYB،CsERF2،CsARF8وCsZinc-finger CCCH) به تایید رسید (نمودار ۱) که با توجه به تجمع کروسین به عنوان اصلی­ترین ماده موثره در کلاله زعفران گام اول در انتخاب این عوامل رونویسی را تقویت بخشید.

نمودار ۱- بررسی بیان عوامل رونویسی در اندام­های مختلف زعفران. این عوامل در بافت کلاله در مراحل مختلف توسعه (Yellow، Orange و Red) بیان بالایی دارند ولی در اندام­های برگ و کروم بیان نمی­شوند یا بیان کمی دارند.

بررسی تکثیر و خالص­سازی توالی­ها: واکنش PCR عوامل رونویسی CsARF8،CsMYB،CsERF2 وCsZinc-finger CCCH به ترتیب منجر به تکثیر قطعاتی به طول bp۲۳۸۵، bp۷۸۳، bp۶۱۲ و bp۷۳۵ گردید. مطابق انتظار بدنبال واکنش PCR برای تکثیر توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a، قطعه با طول bp۷۷۱ تکثیر شد. محصول PCR توالی فاکتور­های رونویسی و پروموتر ودر الکتروفورز ژل آگارز ۱ درصد (شکل ۱) از روی ژل استخراج و توسط کیت مراحل خالص­سازی آن انجام شد. سنجش کمیت و کیفیت خالص­سازی با دستگاه اسپکتروفتومتر مرئی-فرابنفش در OD260 نانومتر صورت گرفت.

شکل ۱- تکثیر توالی عوامل رونویسی و پروموتر. چاهک­های a-e،به ترتیب CsARF8، CsMYB، CsZinc-finger CCCH، CsERF2، CsLcy-β2a. M: مارکر مولکولیPromega 1kb.

همسانه­سازی توالی­ها در ناقل pUPD2: نقشه ناقل همسانه­سازی pUPD2 در شکل ۲- الف نشان داده شده است. برای تهیه ناقل نوترکیب، ابتدا طی واکنش انجام شده در ترموسایکلر توالی عوامل رونویسی، پروموتر و ژن گزارشگر در ناقل pUPD2 سرهم­بندی شد. محصول واکنش اتصال (توالی­ها و ناقل) به سلول­های مستعد Stellar منتقل و سپس به منظور تایید درج توالی­ها در ناقل واکنش هضم با آنزیم­های DraI و XohI انجام شد (شکل ۲- ب). نتایج حاصل از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱ درصد تولید ناقل­های نوترکیب را تایید کرد.

 

شکل ۲- الف: تصویر شماتیک ناقل pUPD2. ب: تصاویر الکتروفورز ژل آگارز مربوط به ناقل­های pUPD2 پس از هضم آنزیمی. چاهک­هایa-c، به ترتیب محصول هضم آنزیمی ناقل­های pUPD2-CsMYB، pUPD2-CsERF2، pUPD2-CsLcy-β2a، با آنزیم DraI و چاهک­های d و e محصول هضم آنزیمی ناقل­های pUPD2-CsARF8 و pUPD2-CsZinc-finger CCCHبا آنزیمXohI. M: مارکر مولکولیPromega 1kb.

 

تهیه ناقل­های نوترکیب pDGBα1 و pDBGα2: برای تهیه این ناقل­ها، واکنش سرهم­بندی و اتصال در ترموسایکلر برای ناقل­های pUPD2 حاوی توالی عوامل رونویسی در ناقل pDGBα1 و ناقل­های pUPD2 حاوی توالی پروموتر و ژن لوسیفراز در ناقل pDBGα2 انجام شد. محصول واکنش به سلول­های مستعد باکتری ترانسفورم و در نهایت هضم آنزیمی سازه­های ژنتیکی ساخته شده با آنزیم­هایEcorI، NedI و DraI انجام شد. نتایج حاصل از هضم آنزیمی و تایید وجود توالی­های درج شده در ناقل­های نوترکیب در شکل ۳ نشان داده شده است. نتایج حاصل از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱ درصد تولید ناقل­های نوترکیب را تایید کرد.

 

شکل ۳- تصاویر الکتروفورز ژل آگارز مربوط به ناقل­های pDGBα1 و ناقل pDGBα2 پس از هضم آنزیمی.چاهک­هایa-c، به ترتیب محصول هضم آنزیمی ناقل­های pDGBα1-CsMYB، pDGBα1-CsARF8، pDGBα1-CsERF2، با آنزیم EcorI( طول توالی باندهای تشکیل شده برای چاهک b در سمت چپ ژل نشان داده شده است). چاهک d، محصول هضم آنزیمی ناقل pDGBα1-CsZinc-finger CCCH با آنزیم NedI. چاهک e، محصول هضم آنزیمی ناقل pDGBα2 با آنزیم DraI. M: مارکر مولکولیPromega 1kb.

 

ساخت ناقل­های بیانی pDGBΩ1: برای تهیه ناقل نهایی نوترکیب، از دستگاه ترموسایکلر برای درج توالی­های موجود درناقل­هایα1 و α2 و ساخت ناقل pDGBΩ1 استفاده شد و محصول واکنش طبق مراحل قبل به سلول­های Stellar منتقل و درنهایت غربالگری باکتری­های تراریخت از طریق گزینش آبی–سفید انجام شد. تایید درج توالی­ها در ناقل­های نوترکیب، از طریق واکنش هضم با آنزیم­های DraI و BamHIانجام شد (شکل ۴). نتایج حاصل از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱ درصد تولید ناقل­های نوترکیب را تایید کرد.

 

 

شکل ۴- تصاویر الکتروفورز ژل آگارز مربوط به واکنش PCR ناقل­های بیانی (pDGBΩ1) و هضم آنزیمی ناقل­ها. A1-D1، به ترتیب محصول PCR توالی عوامل رونویسی CsMYB، CsERF2، CsZinc-fingerCCCH، CsARF8. A2-D2، محصول PCR توالی پروموتر CsLcy-β2a. چاهک­هایa-c، به ترتیب محصول هضم آنزیمی ناقل­های pDGBΩ1-CsMYB، pDGBΩ1-CsERF2،pDGBΩ1-CsZinc-finger CCCH، با آنزیم DraI. چاهک d، محصول هضم آنزیمی ناقل pDGBΩ1-ARF8 با آنزیم BamHI. M، مارکر مولکولیPromega 1kb.

 

آگرواینفیلتریشن گیاه توتون و بررسی فعال­سازی پروموتر با آزمون سنجش دوگانه لوسیفراز: به منظور بررسی بیان پروموتر تحت کنترل عوامل رونویسی، ناقل­های بیانی pDGBΩ1 بر اساس متد الکتروپوریشن به سلول­های Agrobacterium tumefaciens (pGV3101) منتقل شدند، سپس آگروباکتریوم­های تراریخت شده جهت تراریختی برگ­های گیاه توتون با استفاده از روش آگرواینفیلتریشن بصورت بیان موقت (transient) استفاده شد. نتایج آزمون سنجش دوگانه لوسیفراز به منظور ارزیابی فعالیت عوامل رونویسی و چگونگی اثر مثبت یا منفی آنها بروی فعال­سازی رونویسی پروموتر ژن CsLcy-β2a نشان داد که در مقایسه با کنترل مثبت و منفی تنها عامل رونویسی CsMYB به طور مستقیم منجر به فعال­سازی رونویسی پروموتر ژنCsLcy-β2a می­شود (شکل ۶).

 

شکل ۶–فعال­سازی موقت پروموتر CsLys-β2a توسط عوامل رونویسی. الف و ب، به ترتیب نقشه­ی سازه بیانی تهیه شده در ناقل­های pDGBΩ1 و ناقل بیانی کنترل (GB0166). ج، نسبت لومینسانس (LUC/REN) اندازه گیری­شده برای ژن گزارشگر لوسیفراز در برگ­های توتون تراریخت با استفاده از ناقل­های حاوی توالی عوامل رونویسی و ناقل کنترل (استاندارد). ناقل pDGBΩ1 (empty) بعنوان کنترل منفی (C-) استفاده شد. نتایج به صورت میانگین (Means)  انحراف استاندارد (SE) سه تکرار نمایش داده شده­اند.

 

بحث و نتیجه­گیری

در پژوهش حاضر فعالیت چهار عامل رونویسیCsMYB، CsARF8، CsERF2 و CsZinc-finger CCCH با روش Real-TimePCR در بافت­های مختلف زعفران مشخص شد که این عوامل در بافت کلاله به عنوان اندام اصلی بیوسنتز کننده کاروتنوئیدها و آپوکاروتنوئیدها، بیشترین میزان بیان را نشان می­دهند که حاکی از نقش احتمالی این عوامل رونویسی در مسیر بیوسنتز ماده موثره زعفران می­باشد. این پژوهش با مطالعات پیشین در خصوص بررسی بیان عوامل رونویسی در بافت­های مختلف زعفران و گونه­های مختلف جنس Crocus به منظور آگاهی از وجود یا عدم وجود عوامل رونویسی در کلاله و نقش آن­ها در مسیر بیوسنتزی کاروتنوئید/آپوکاروتنوئید زعفران مطابقت دارد (۱۰ و ۱۶). با توجه به اینکه عوامل رونویسی می­توانند بر روی ژن­های مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی گیاهان تاثیر بگذارند، در این تحقیق از پروموتر ژن CsLcy-β2a بعنوان یکی از آنزیم­های اصلی مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی زعفران استفاده شد (۷).

در این مطالعه با استفاده از سیستم بیان موقت بر پایه آگرواینفیلتریشن و آزمون دوگانه لوسیفراز، اثر عوامل رونویسی بر روی پروموتر ژنCsLcy-β2a در ساختار ناقل بیانی pDGBΩ1 مورد بررسی قرار گرفت. با توجه کاربردهای متعدد گیاه توتون (Nicotiana.bentamiana) در مهندسی ژنتیک به منظور بررسی انتقال ژن­ها و مطالعه عوامل موثر در انتقال ژن (۱ و ۲) در این تحقیق از آن به عنوان گیاه مدل برای بررسی بیان موقت استفاده شد. عوامل بسیاری در کارایی آگرواینفیلتریشن موثرند. کیفیت مواد گیاهی، مراحل مختلف بافت گیاهی یا سنین مختلف بافت، طول روز، سویه آگروباکتریوم مورد استفاده، ترکیبات فنولی و مدت زمان سپری شده بعد از آگرواینفیلتریشن از جمله عوامل مهم تاثیرگذار هستند (۷). در میان عوامل مختلفی که بر بیان موقت تاثیر می­گذارند می­توان به مدت زمان کشت با آگروباکتریوم اشاره کرد. یک دوره زمانی کافی برای اتصال و انتقال قطعه T-DNA به نمونه، برای آگروباکتریوم مورد نیاز است (۲۱). دوره­ی زمانی مناسب ۷-۳ روز است و مدت زمان بیش از این حد به کارایی ترانسفورماسیون کمک نمی­کند (۲۱). در این پژوهش سطح بیان ژن گزارشگر چهار روز بعد از ترزیق ارزیابی شد. انتخاب این دوره براساس مطالعات انجام شده صورت گرفت. ترکیبات فنولی مانند استوسرینگون از دیگر عوامل تاثیر گذارند. ترکیبات فنولی با تاثیر بر ژن­های بیماری­زای باکتری میزان بیان راتحت تاثیر قرار می­دهند. ازاینرو در پژوهش خود از استوسرینگون با غلظت ۲۰۰ میکرومولار استفاده شد. کاستا و همکاران (۲۰۰۶) با اضافه کردن استوسرینگون در محیط القایی برای انتقال ژن در بادام کارایی ترانسفورماسیون را سه برابر افزایش دادند. عامل تاثیرگذار دیگر سویه باکتری مورد استفاده می­باشد. زمینه ژنتیکی سویه­های آگروباکتریوم به طور قابل ملاحظه­ای سطح بیان موقت را تحت تاثیر قرار می­دهد و مشخص شده است که تفاوت ترانسفورماسیون در بین سویه­ها به طور معنی­داری نوسان دارد (۱۴). در پروهش حاضر از آگروباکتریوم سویه GV3101 استفاده شد، زیرا در تحقیقات قبلی گزارش شده که اینفیلتریشن با سویه GV3101 بیشترین میزان بیان ژن را در مقایسه با سویه­های دیگر آگروباکتریوم (LBA4404، C58C1) نشان می­دهد (۳۲). کارایی استفاده از بیان موقت بر پایه آگروباکتریوم به منظور بررسی برهمکنش عوامل رونویسی با پروموتر ژن­های هدف در تحقیقات متعدد اثبات شده است (۳۸).

تاکنون در مطالعات فراوانی از سیستم آزمون دوگانه گزارشگر مبتنی بر لوسیفراز کرم شب تاب به منظور تایید برهمکنش عوامل رونویسی با پروموتر مربوط به ژن­ها استفاده شده است (۳۵، ۳۶ و ۳۷). در این پژوهش درون ناقل بیانی pDGBΩ1 بعد از توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a، توالی ژن­های گزارشگر لوسیفراز (LUC) و رنیلا (REN) درج شد تا امکان اندازه­گیری سطح بیان ژن­های گزارشگر و در نتیجه بررسی برهمکنش عوامل رونویسی با توالی پروموتر این ژن فراهم شود (ژن رنیلا تحت پروموتر جداگانه بیان شده و برای نرمال­سازی نتایج آزمون دوگانه لوسیفراز استفاده شد). زو و همکاران از روش لوسیفراز برای بررسی اثر عوامل رونویسی CpbHLH1/2 بر روی ژن­های لیکوپن بتا سیکلاز استفاده کردند. آنها نشان دادند که استفاده از CpbHLH1/2 به عنوان تنظیم کننده مثبت سبب افزایش تکثیر پروموتر ژن­های CpLCY-B و CpCYC-C می­شود (۳۷). فو و همکاران نشان دادند که افزایش بیان لوسیفراز وابسته به سطح بیان عامل رونویسی CpNAC1 و در نتیجه فعال­سازی پروموتر ژن­ها ی CpPDS2/4 می­باشد (۱۲). از نتایج سنجش لوسیفراز در این مطالعه مشخص شد تنها بیان عامل رونویسی CsMYB در برگ­های گیاه تراریخت N. bentamiana منجر به افزایش نسبت لومینسانس ژن گزارشگر لوسیفراز (LUC) بر رنیلا (REN) می­شود که این امر حاکی از برهمکنش CsMYB با توالی پروموتر ژن CsLcy-β2a می­باشد. آمپومه-دوامنا و همکاران از روش لوسیفراز برای بررسی اتصال عامل رونویسی به پروموتر ژن LCY-β استفاده کردند. آنها نشان دادند که استفاده از AdMYB7 به عنوان یک تنظیم­کننده مثبت سبب افزایش تکثیر ژن گزارشگر لوسیفراز و در نتیجه افزایش رونویسی ژن LCY-β در گیاهان مدل می­شود (۹). بر این اساس، نتایج بدست آمده در مطالعه حاضر نقش CsMYB را در متابولیسم کاروتنوئید/آپوکاروتنوئید احتمالاً ازطریق فعال­سازی رونویسی ژن­های مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی نشان می­دهد. نتیجه این تحقیق ازپیشرفت­های اخیر در توضیح نقش عوامل رونویسی MYB در تنظیم مسیر کاروتنوئیدی پشتیبانی می­کند. یکی از محدودیت­های این تحقیق عدم امکان بررسی نقش عوامل رونویسی مورد استفاده در بررسی فعال­سازی بیان سایر آنزیم­های مسیر بیوسنتزی کاروتنوئیدی/آپوکاروتنوئیدی می­باشد که امید است در پژوهش­های بعدی مورد استفاده قرار گیرد. آنالیزهای بیشتر عوامل رونویسی بر روی سایر ژن­های مسیر بیوسنتری ماده موثره زعفران درک ما را از چگونگی تنظیم ژن­های این مسیر به منظور بهینه­سازی بیان آنها و افزایش تولید و تجاری سازی آپوکاروتنوئید کروسین به عنوان اصلی ترین ترکیب ضد سرطانی زعفران ارتقا خواهد بخشید.

۱- حسامی، ر.، شریعتی، م. ۱۳۹۱. پاسخ شاخص کارایی فتوسنتزی (PIABS) نسبت به کمبود نیترات در گیاهان تنباکو (Nicotianaplumbaginifolia) تراریخته شده با ژن  ناقل نیترات AtNRT2.1 با استفاده از فلئورسنس کلروفیل a. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). ۴ (۲۷): ۵۶۹-۵۷۹.
۲- کوهی، ل.، زراع، ن.، امانی، ا.، شیخ­زاده مصدق، پ. ۱۳۹۶. تأثیر امواج فراصوت بر زنده­مانی سلول­های توتون. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). ۲ (۲۹): ۴۴۱-۴۵۱.
۳- فروزنده، س.، میزآخورلی، ن.، صفار، ب.، مهنام، ک. ۱۳۹۲. تعیین نقش دفنزین بیان شده در سیستم گیاهی جهت جذب فلز روی. پایان نامه کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی در کشاورزی. دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد.
 
4- Ahrazem O, Argandona, J., Fiore, A., Aguado, C., Lujan, R., Rubio-Moraga, A., Marro, M., Araujo-Andrade, C., Loza-Alvarez, P., Diretto, G. and Gomez-Gomez, L. 2018. Transcriptome analysis in tissue sectors with contrasting crocins accumulation provides novel insights into apocarotenoid biosynthesis and regulation during chromoplast biogenesis. Scientific reports. 8.1: 1-17.
5- Ahrazem, O., Argandoña,J., Fiore,A., Andrea, Rujas., Rubio-Moraga,A., Castillo, R., Gómez-Gómez, L. 2019. Multi-species transcriptome analyses for the regulation of crocins biosynthesis in Crocus. BMC Genomics. 20.1: 1-15.
6- Ahrazem, O., José López, A., Argandoña, J., Castillo, R., Rubio-Moraga, A., Gómez-Gómez, L. 2020.Differential interaction of Or proteins with the PSY enzymes in saffron.Scientific Reports.10.1: 1-11.
7- Ahrazem, O., Rubio-Moraga, A., Lopez, R. C. and Gomez-Gomez, L. 2010. The expression of a chromoplast-specific lycopene beta cyclase gene is involved in the high production of saffron’sapocarotenoid precursors. Journal of experimental botany. 61.1: 105-119.
8- Ahrazem, O., Rubio-Moraga, A., Trapero, A.,Gomez-Gomez, L. 2011. Developmental andstress regulation of gene expression for a 9-cisepoxycarotenoiddioxygenase, CstNCED,isolated from Crocus sativus stigmas. Journal ofExperimental Botany. 63.2: 681-694.
9- Ampomah-Dwamena, C., Thrimawithana, A.H., Dejnoprat, S., Lewis, D., EspleyR,V., Allan, A.C. 2018. A kiwifruit (Actinidia deliciosa) R2R3-MYB transcription factor modulates chlorophyll and carotenoid accumulation. New Phytologist. 221.1: 309-325.
10- Ashraf, N., Jain, D., Vishwakarma, R. 2015. Identification, cloning and characterization of an ultrapetala transcription factor CsULT1 from Crocus: a novel regulator of apocarotenoid Biosynthesis. BMC Plant Biology. 15.1: 1-12.
11- Bukhari, S. I., Manzoor, M. and Dhar, M. K. 2018. A comprehensive review of the pharmacological potential of Crocus sativus and its bioactive apocarotenoids. Biomed. Pharmacother. 98: 733–745.
12- Chang-chun, F., Han, Y.- C., Fan, Z.- Q., Chen, J.- Y., Chen, W.- X., Lu, W.- J. and Kuang, J.- F. 2016. The Papaya Transcription Factor CpNAC1 Modulates Carotenoid Biosynthesis through Activating Phytoene Desaturase Genes CpPDS2/4 during Fruit Ripening. J. Agric. Food Chem. 64. 27: 5454-5463.
13- Costa, M.S., Miguel, C.M. and Oliveira, M.M. 2006. An improved selection strategy and the use of acetosyringone in shoot induction medium increase almond transformation efficiency by 100-fold. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85.2: 205-209.
14- Gill, M.I.S., Singh, Z. and Agres V. 2004. Factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation in fruit and nut crops– An overview. Food Agriculture. Environment. 2: 327–347.
15- Gomez-Gomez, L., Parra-Vega, V., Rivas-Sendra, A., Segui-Simarro, J.M., Molina, RV., Pallotti, C., Rubio-Morga, A., Diretto, G., Prieto, A. and Ahrazem, O. 2017. Unraveling Massive Crocins Transport and Accumulation through Proteome and Microscopy Tools during the Development of Saffron Stigma. International journal of molecular sciences. 18.1: 76.
16- Gomez-Gomez, L., Trapero-Mozos, A., Dolores Gomez, M., Rubio-Moraga, A., Ahrazem, O. 2012. Identification and possible role of a MYB transcription factor from saffron (Crocus sativus). Journal of Plant Physiology. 169.5: 509-515.
17- Jin, H. and Martin, C. 1999. Multifunctionality and diversity within the plant MYBgene family. Plant Molecular Biology. 41: 577–585.
18- Lee, J.- M., Joung, J.- G., McQuinn, R., Chung, M.-Y., Fei, Z., Tieman, D., Klee, H. and Giovannoni, J. 2012. Combined transcriptome, genetic diversity and metabolite profiling in tomato fruit reveals that the ethylene response factor SlERF6 plays an important role in ripening and carotenoid accumulation. The Plant Journal. 70.2: 191-204.
19- Lu, S. and Li, L. 2008. Carotenoid metabolism: biosynthesis, regulation and beyond.Journal of Integrative Plant Biology. 50.7: 778-785.
20- Lu, SW., Zhang, Y., Zhu, K., Yang, W., Ye, J., Chai, L., Xu, Q., Deng, X. 2018. The citrus transcription factor CsMADS6 modulates carotenoid metabolism by directly regulating carotenogenic genes. Plant Physiol. 176.4: 2657-2676.
21- Mannan, A., Noorseyyed, T. and Mirza, B. 2009. Factors Affecting Agrobacterium Tumefacience Mediated Transformation of Artemisia absinthinium L. Pakistan Journal of Botany. 41.6: 3239-3246.
22- Ma, N., Feng, H., Meng, X., Li, D., Yang, D., Wu, C., Meng, Q. 2014. Overexpression of tomato SlNAC1 transcription factor alters fruit pigmentation and softening. BMC Plant Biology. 14.1: 1-14.
23- Méndez-Robles, M.D., Permady, H.H., Jaramillo-Flores, M.E., Lugo-Cervantes, E.C., Cardador-Martínez, A., Canales-Aguirre, A.A., Lopez-Dellamary, F., Cerda-Garcia-Rojas, C.M. and Tamariz, J. 2006. C-26 and C-30 Apocarotenoids from Seeds of Ditaxis h eterantha with Antioxidant Activity and Protection against DNA Oxidative Damage. Journal of natural products. 69.8: 1140-1144.
24- Milajerdi, A., Djafarian, K., Hosseini, B. 2016. The toxicity of saffron (Crocus sativus L.) and its constituents against normal and cancer cells. Journal of Nutrition & Intermediary Metabolism 3: 23-32.
25- Mitsuda, N. and Ohme-Takagi, M. 2009. Functional analysis of transcription factorsin Arabidopsis. Plant and Cell Physiology. 50.7: 1232–1248.
26- Moraga, A.R., Rambla, J.L., Ahrazem, O., Granell, A., Gómez-Gómez, L. 2009. Metabolite and target transcript analyses during Crocus sativus stigma development. Phytochemistry.70.8: 1009–1016.
27- Orzaez, D., Mirabel, S., Wieland, W.H., Granell, A. 2006. Agroinjection of tomato fruits: a tool for rapid functional analysis of transgenes directly in fruit. Plant Physiol. 140.1: 3-11.
28- Pireyre, M. and Burow, M. 2015. Regulation of MYB and bHLH Transcription Factors: A Glance at the Protein Level. Molecular Plant. 8.3: 378–388.
29- Rivera-Madrid, R., Aguilar-Espinosa, M., Cárdenas-Conejo, Y. and Garza-Caligaris, L.E. 2016. Carotenoid Derivates in Achiote (Bixaorellana) Seeds: Synthesis and Health Promoting Properties. Frontiers in plant science. 7: 1406.
30- Sagawa, J.M., Stanley, L.E., LaFountain, A.M., Frank, H.A., Liu, C., Yuan, Y.W. 2016. An R2R3-MYB transcription factor regulates carotenoid pigmentation in Mimuluslewisii flowers. New Phytologist. 209.3: 1049–1057.
31- Schwinn, K., Venail, J., Shang, Y., Mackay, S., Alm, V., Butelli, E., Oyama, R., Bailey, P., Davies, K. and Martin, C. 2006. A Small Family of MYB-Regulatory Genes Controls Floral Pigmentation Intensity and Patterning in the Genus Antirrhinum. The Plant Cell. 18.4: 831-851.
32- Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. 2014. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 86: e51204.
33- Stracke, R., Werber, M., Weisshaar, B. 2001. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Current Opinion in Plant Biology.4.5: 447-456.
34- Winterhalter, P. and Rouseff, R.L. 2002. Carotenoid-derived aroma compounds. Washington, DC: American Chemical Society. 1-17.
35- Xiang, L., Liu, X., Li, H., Yin, X., Grierson, D., Li, F., Chen, K. 2019. CmMYB#7, an R3 MYB transcription factor, acts as a negative regulator of anthocyanin biosynthesis in chrysanthemum. Journal of Experimental Botany. 70.12: 3111-3123.
36- Xu, Y., Jin, Z., Xu, B., Li, J., Li, Y., Wang, X., Wang, A., Hu, W., Huang, D., Wei, Q., Xu, Z. and Song, S. 2020. Identification of transcription factors interacting with a 1274 bp promoter of MaPIP1;1 which confers high-level gene expression and drought stress Inducibility in transgenic Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 20.1: 1-14.
37- Zhou, D., Shen, Y., Zhou, P., Fatima, M., Lin, J., Yue, J., Zhang, X., Chen, L.- Y. and Ming, R. 2019. Papaya CpbHLH1/2 regulate carotenoid biosynthesis-related genes during papaya fruit ripening. Horticulture Research. 6.1: 1-13.
38- Zhu, M.K., Chen, G.P., Zhou, S., Tu, Y., Wang, Y., Dong, T.T., Hu, Z.L. 2014. A new tomato NAC (NAM/ATAF1/2/CUC2) transcription factor, SlNAC4, functions as a positive regulator of fruit ripening and carotenoid accumulation. Plant and Cell Physiology. 55.1: 119–135.
39- Zhu, F., Luo, T., Liu, C., Wang, Y., Yang, H., Yang, W., Yang, H., Yang, W., Zheng, L., Xiao, X., Zhang, M., Xu, R., Xu, J., Zeng, Y., Xu, J., Xu, Q., Guo, W., Larkin, R.M., Deng, X. and Cheng, Y. 2017. An R2R3-MYB transcription factor represses the transformation of a- and b-branch carotenoids by negatively regulating expression of CrBCH2 and CrNCED5 in flavedo of Citrus reticulate. New Phytologist. 216: 178–192.
دوره 35، شماره 3
مهر 1401
صفحه 541-555
  • تاریخ دریافت: 20 بهمن 1399
  • تاریخ بازنگری: 01 اردیبهشت 1400
  • تاریخ پذیرش: 09 خرداد 1400