Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran
2 Department of Agricultural Biotechnology,, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University Hamedan, Iran
3 Department of Agriculture, Payame Noor University
Abstract
Drought stress increases production of secondary metabolites in wide ranges of plants and accumulation of these components usually occurs under stress. Secondary metabolites are natural compounds produced by plants that play different physiological roles in plants. Artemisinin is a sesquiterpene lactone, produces by some of Artemisia species. This secondary metabolite is one of the most important antimalarial drugs. This study was conducted to investigate the effect of drought stress on antioxidant enzymes activity and artimisinin content in Artemisia siberi. The experiment was carried out in a completely randomized design in greenhouse with four treatments of irrigation regime (control, 70, 50 and 30 percent of field capacity. intermittent drought stress was performed for 8 weeks. Drought stress caused increased the antioxidant activity of ascorbate peroxidase, peroxidase, superoxide dismutase and catalase. Highest activity for these enzymes was observed at 30% of field capacity. The amount of artemisinin were not significantly different between drought treatments and control. The results showed that drought stress does not always increase secondary metabolites and medicinal compounds such as artemisinin.
Keywords
Main Subjects
اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و میزان آرتمیزینین گیاه درمنه دشتی (Artemisia sieberi)
ندا عباسی1، اصغر میرزائی اصل1* و لیلا خدائی2
1 ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، گروه بیوتکنولوژی
2 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی
تاریخ دریافت: 20/11/1398 تاریخ پذیرش: 6/12/1399
چکیده
تنش خشکی میزان تولید متابولیتهای ثانویه را در طیف گستردهای از گیاهان افزایش میدهد و این ترکیبات در شرایط تنش در گیاه تجمع مییابند. متابولیتهای ثانویه گیاهی، نقشهای فیزیولوژیکی متفاوتی در گیاهان دارند. آرتمیزینین یک سزکوئی ترپن لاکتون است که در برخی گونههای درمنه تولید میشود و یکی از موثرترین داروها برای مقابله با عامل بیماری مالاریا است. این پژوهش به منظور بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و میزان آرتمیزینین در گیاه درمنه دشتی صورت گرفت. این آزمایش به صورت طرح کاملا تصادفی با 4 تیمار رژیم آبیاری (شاهد، 30، 50 و 70 درصد ظرفیت زراعی ) در گلخانه اعمال شد. تنش خشکی دورهای به مدت 8 هفته انجام گرفت. تنش خشکی سبب افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز، پراکسیداز، سوپر اکسیددیسموتاز و کاتالاز شد. بالاترین میزان فعالیت این آنزیمها در تیمار خشکی 30 درصد ظرفیت زراعی بدست آمد. مقدار آرتمیزینین بین سطوح تنش خشکی و شاهد تفاوت معنیداری نداشت. نتایج نشان داد که تنش خشکی موجب افزایش همه متابولیتهای ثانویه و ترکیبات با خواص دارویی نظیر آرتمیزینین نمیشود.
واژههای کلیدی: تنش خشکی، آنزیمهای آنتی اکسیدانی و آرتمیزینین
* نویسنده مسئول، تلفن: 09125800769، پست الکترونیکی: a.mirzaie@basu.ac.ir
مقدمه
درمنه گیاهی چند ساله از خانواده کاسنی یا گل ستارهای (Astraceae) است که در نقاط مختلف کرهی زمین پراکندهاست. درمنه دشتی بوتهای به رنگ سبز متمایل به خاکستری، عمودی، با ارتفاع 10 تا 30 سانتی متر است که در مناطق نیمه بیابانی انتشار یافته است (5). این گیاه دارای اسانسهای فرار و مواد موثره مانند آرتمیزیا کتون، کامفور، 1-8سینول، کامفن، آلفاپینن، سانتونین و موارد دیگر میباشد. این گیاه دارای فعالیت ضد میکروبی، ضد انگل، ضد سرفه، ضد اسپام ، ضد قارچی و هم چنین خواص آنتی اکسیدانی میباشد (8).
آرتمیزینین یک سزکوئی ترپن لاکتون است که در گونههای
مختلف درمنه تولید میشود(21). این متابولیت ثانویه یکی از موثرترین داروها برای مقابله با عامل بیماری مالاریا در جهان است. علاوه بر این، از این ترکیب برای درمان هپاتیت B، سرطانهای مختلف و شیستوزومیازیس نیز استفاده میشود (33).
گیاهان طی دوران رشد خود با تنشهای متعدد محیطی مواجه میشوند. هر یک از این تنشها میتوانند با توجه به میزان حساسیت و مرحله رشد گونه گیاهی اثرهای متفاوتی بر رشد، متابولیسم و عملکرد گیاهان داشته باشند (1). تنش خشکی یکی از تنشهای اصلی است که در اکثر مراحل رشد گیاهان ، تأثیر گذاشته و دستیابی به نتیجه مطلوب را دشوار میسازد. اصطلاح خشکی به شرایطی اطلاق میشود که در نتیجه آن رطوبت موجود در خاک به نقطهای میرسد که گیاه قادر به جذب آب با سرعت کافی برای جبران تعرق نباشد (29). تنش خشکی علاوه بر کاهش رشد رویشی و تغییر در ساختارهای بیرونی گیاه از طریق ایجاد تنشهای ثانویه مانند تنش اکسیداتیو سبب در تغییر در مسیرهای سنتز ترکیبات و متابولیتهای ثانویه میشود (12). یکی ازتغییرات بیوشیمیایی گیاهان در شرایط خشکی، تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکال سوپر اکسید، پراکسیدهیدروژن و رادیکال هیدروکسیل است که میتواند باعث ایجاد تنش اکسیداتیو شود. تنش اکسیداتیو به پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک صدمه میزند و باعث دناتوره شدن پروتئینها، موتاسیون DNA و پراکسیداسیون لیپیدها میشود. گیاهان از سازوکارهای آنزیمی و غیرآنزیمی مختلف برای مقابله با این صدمات استفاده میکنند. آنتیاکسیدانهای آنزیمی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیدازها و ترکیبات آنتیاکسیدانی غیرآنزیمی مانند کارتنوئید، توکوفرول، آسکوربات و گلوتاتیون از جمله ترکیباتی هستند که در برابر اثرات منفی رادیکالهای اکسیژن از سلولهای گیاه محافظت میکنند (11).
متابولیتهای ثانویه نقش بسیار مهمی در سازگاری گیاهان به تغییرات محیطی در شرایط تنش دارند. در واقع اندامهای گیاهی از متابولیتهای ثانویه به عنوان ابزاری برای فائق آمدن بر تنش استفاده میکنند (13). مطالعات نشان دادهاند که تنش خشکی میزان تولید و تجمع متابولیتهای ثانویه را در اغلب گیاهان افزایش میدهد. پژوهش حاضر با هدف بررسی اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و همچنین بر میزان آرتمیزینین در گیاه درمنه دشتی انجام گرفت.
مواد و روشها
این پژوهش در سالهای 1395 و 1396 در گلخانه
دانشکده کشاورزی وآزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه بوعلی سینا همدان، انجام گرفت. بذر گیاهان از موسسه پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. کاشت گیاهان در اسفند ماه 1395 درگلخانه در گلدانهای شش کیلویی و حاوی خاک، ماسه وکود دامی با نسبت 1:1:1 انجام شد. گیاهان تا اردیبهشت ماه در گلخانه نگهداری شدند وبرای اعمال تیمارها از اردییبهشت تا مهر به فضای آزاد منتقل گردیدند. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی درچهار تیمار و سه تکرار انجام شد. اعمال تیمارها از دوم مردادماه شروع و به مدت هشت هفته انجام گرفت. تیمارهای آزمایشی شامل: شاهد بدون تنش، آبیاری با 70 درصد ظرفیت زراعی، 50 درصد ظرفیت زراعی و30 درصدظرفیت زراعی صورت گرفت. تنش خشکی دورهای به مدت 8 هفته انجام شد و گیاهان شاهد هر روز آبیاری گردید. برای اعمال تیمارهای رطوبتی از روش وزنی (12) استفاده شد. به منظور تعیین درصد رطوبت، نمونهای از خاک در آون در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت خشک گردید و وزن ذرات جامد خاک ریخته شده درگلدانها تعیین وجرم مخصوص ظاهری آنها محاسبه شد. در نهایت تیمارهای خشکی بر گیاههای مورد نظر اعمال گردید. برای تعیین وزن گلدان در هریک از سطوح تنش به ترتیب زیر عمل شد. قبل از شروع از اعمال تنش، میزان رطوبت نمونه خاک در ظرفیت زراعی مزرعه (FC) و نقطهی پژمردگی دائم (PWP)، با استفاده از نرم افزارRetc (نسخه 02/6) تعیین شد. سپس رطوبت وزنی نمونه خاک با استفاده از رابطه 1 محاسبه گردید.
رابطه (1)
در این رابطه Qm = رطوبت وزنی خاک، Ws = وزن خشک نمونه و Ws+w= وزن تر نمونه می باشد. وزن خاک خشک هر گلدان (Ws) با کمک رابطه 2 محاسبه شد.
رابطه (2)
سپس آب قابل دسترس (AW) از تفاضل رطوبت وزنی خاک درظرفیت زراعی مزرعه و رطوبت وزنی خاک در نقطه پژمردگی دائم بدست آمد (رابطه 3).
رابطه (3)
رطوبت وزنی نمونه خاکPWP -رطوبت وزنی نمونه FC =AW
در ادامه برای تعیین رطوبت قابل دسترس در هر یک از سطوح تنش از رابطه 4 استفاده شد.
رابطه (4)
در این رابطه ضریب معادل سطح تنش مورد نظر، رطوبت قابل دسترس در هر یک از سطوح تنش میباشد. رابطه (5) برای محاسبهی وزن خاک مرطوب گلدان در هریک از سطوح تنش مورد استفاده قرار گرفت.
رابطه (5)
در رابطه ی فوق، معادل وزن خاک مرطوب گلدان در سطح تنش رطوبتی ɑ میباشد. در انتها وزن نهایی گلدان برای هریک از تنش های رطوبتی، از رابطه (6) محاسبه شد.
رابطه (6)
در رابطه (6) برابر وزن نهایی گلدان در سطح رطوبتی میباشد.
در پایان دوره اعمال تنش خشکی، فعالیت آنزیمهای کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و میزان آرتمیزینین اندازهگیری شد.
برای عصارهگیری 500 میلیگرم نمونه تر برگ به همراه پنج میلیلیتر متانول 85 درصد در هاون له شد. سپس عصاره به مدت یک ساعت در شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه تکان داده شد و 15 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی جدا شد و برای فاز زیرین (باقی مانده) همان مراحل قبلی تکرار شد و به عنوان عصاره برای اندازهگیری فعالیت آنزیمهای کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز مورد استفاده قرار گرفت (9).
اندازهگیری آنزیم کاتالاز: سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس روش برگمیر انجام گرفت (10). میزان فعالیت آنزیم کاتالاز، با استفاده از ضریب جذب آب اکسیژنه (036/0 میلی مولار بر سانتی متر) در طول موج 240 نانومتر و برحسب واحد در گرم برگ تازه طبق رابطه (9) محاسبه گردید. هر یک واحد فعالیت آنزیم کاتالاز مقداری از آنزیم است که موجب تجزیه یک میکرومول آب اکسیژنه در هر دقیقه میشود.
رابطه (7)
که در آن: t1 و t2 به ترتیب، ابتدا و انتهای بازه زمانی مورد بررسی (بر حسب ثانیه)، A240(t1) و A240(t2) به ترتیب،مقادیر جذب نور در طول موج 240 نانومتر در زمانهای t1 و t2، Vt حجم نهایی محلول واکنش (بر حسب میلیلیتر)، Vs حجم عصاره آنزیمی مورد استفاده (بر حسب میلیلیتر) و E ضریب تجزیه H2O2 (عدد ثابت 036/0 میلی مولار بر سانتی متر) میباشد. لازم به ذکر است که فاصله دو نقطه در قسمت خطی منحنی جذب نور (t1 و t2) طول بازه زمانی مورد بررسی در نظر گرفته شد.
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز طبق روش ناکانو و آسادا انجام گرفت (26). به دنبال اکسید شدن آسکوربات با شروع واکنش آنزیمی کاهش جذب در طول 290 نانومتر، دو دقیقه پس از شروع واکنش محاسبه شد. در نهایت میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب آسکوربات در طول موج 290 نانومتر (8/2 میلی مولار بر سانتی متر) بر حسب واحد در گرم وزن تازه برگ طبق رابطه (7) محاسبه شد.
فعالیت آنزیم پراکسیداز: سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز بر اساس روش هرزوگ و فهیمی اندازهگیری شد (17) و سپس میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب جذب آب اکسیژنه (6/26 میلی مولار بر سانتی متر) و بر حسب واحد در گرم برگ تازه محاسبه گردید (رابطه 8 ). هر یک واحد فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز مقداری از آنزیم است که موجب اکسیده شدن یک میکرومول گایاکول در هر دقیقه میشود.
رابطه (8)
سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD): برای سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز از روش جیانوپلیتیس و ریس استفاده گردید (16). مخلوط واکنش شامل: 5/2 میلی لیتر فسفات 50 میلی مولار با 7pH= ، 2/0 میلی لیتر میتونین13 میلی مولار، 1/0 میلی لیتر نیترو بلوتترازلیوم 75 میکرو مولار، 1/0 میلی لیتر ریبو فلاوین 2 میکرو مولار، 5/0 میلی لیتر عصاره آنزیمی بود. نمونهها به مدت 15 دقیقه در معرض نور قرار داده شدند و پس از این مدت جذب آنها در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفومتر خواندهشد. در این آزمایش دو نمونه شاهد مورد استفاده قرار گرفت که هر دو فاقد عصاره آنزیمی بودند. نمونه اول بدون دریافت نور و نمونه دوم 15 دقیقه در مقابل نور قرار گرفت. زیرا به دلیل عدم وجود آنزیم، احیای نیترو بلوتترازلیوم در حضور نور به طور 100 درصد، انجام میگیرد.
تعیین مقدار آرتمیزینین: برای تعیین غلظت آرتمیزینین از دستگاه HPLC (مدل (KNAUER استفاده شد. این دستگاه مجهز به تشخیص دهندهUV با طول موج 210 نانومتر، ستون C18 دارای اندازه ذرات 5 میکرومتر، قطر6/4 میلی متر بود. فاز متحرک شامل استونیتریل و اسید استیک یک درصد به نسبت (60:40) و با سرعت جریان 1 میلی لیتر
در دقیقه بود.
استخراج آرتمیزینین برای HPLC به روش پو و همکاران با کمی تغییر انجام شد (28). مقدار 100 میلی گرم از برگ خشک پودر شده و 20 میلی لیتر پترولیوم اتر به آن اضافه شد و مخلوط به مدت 30 دقیقه تحت اولتراسونیک قرارداده شد. سپس این مخلوط با استفاده از کاغذ واتمن از فیلتر عبور دادهشد. مخلوط بدست آمده تا تبخیر شدن پترولیوم اتر در یک ظرف شیشهای نگهداری شد. باقی مانده در پنج میلی لیتر استونیتریل حل و از فیلتر 45/0 میکرو مولار عبور دادهشد و برای تزریق بهHPLC استفاده گردید. استاندارد آرتمیزینین از شرکت سیگما آلدریچ تهیه شد وغلظتهای ppm200، ppm400، ppm600 وppm1000 تهیه و20 میکرو مولار به دستگاه تزریق شد.
ابتدا آزمون نرمالیته روی تمامی دادهها بدست آمده، انجام گردید و تجزیه واریانس با استفاده از نرم افزار SAS (نسخه 2/9) و مقایسه میانگین به روش چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.
نتایج
اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی: تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی آنزیمی شامل آسکورابات پراکسیداز، پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز در سطح 01/0 تاثیر معنیدار نشان داد (جدول 1).
تنش خشکی موجب افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز شد. بیشترین فعالیت این آنزیم در آبیاری با 30 درصد ظرفیت زراعی مشاهده شد، در حالی که در آبیاری 70 درصد ظرفیت زراعی تفاوت معنی داری با شاهد نداشت. در تنش شدید آبیاری با 30 درصد ظرفیت زراعی میزان آسکوربات پراکسیداز بیش از دو برابر میزان آن در تنش متوسط 50 درصد ظرفیت زراعی بود.
جدول 1- مقایسه میانگین اثر تنش خشکی برفعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در گیاه درمنه دشتی
تیمار |
آسکوربات پراکسیداز (واحد/ میلی گرم) |
پراکسیداز (واحد/ میلی گرم) |
سوپر اکسید دیسموتاز (واحد/ میلی گرم) |
کاتالاز (واحد/ میلی گرم) |
شاهد |
c02/0 |
c02/0 |
d121/1 |
b111/0 |
ظرفیت زراعی 70% |
c05/0 |
bc07/0 |
c67/2 |
b118/0 |
ظرفیت زراعی 50% |
b10/0 |
b13/0 |
b25/3 |
a174/0 |
ظرفیت زراعی 30% |
a21/0 |
a3/0 |
a66/3 |
a171/0 |
حروف مشابه در هر ستون و گروه تیماری نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار در سطح یک درصد میباشد. واحد/میلی گرم: واحد آنزیمی در میلی گرم برگ تر
اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در سطح یک درصد نیز معنیدار شد. مقایسه میانگین تیمارها طبق جدول 1 نشان داد که تنش خشکی موجب افزایش آنزیم پراکسیداز شده است و با افزایش شدت تنش نیز میزان فعالیت آنزیم افزایش یافته است.
اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سطح یک درصد معنیدار شد (جدول 1). تنش خشکی موجب افزایش آنزیم سوپراکسید دیسموتاز شده است و با افزایش شدت تنش میزان این آنزیم نیز افزایش یافته است.
نتایج نشان داد که تنش خشکی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز را نیز افزایش دادهاست. میزان فعالیت این آنزیم در تنش شدید و متوسط معنی دار نبود.
اثر تنش خشکی بر میزان آرتمیزینین
اندازه گیری میزان آرتمیزینین گیاه درمنه دشتی با روش کروماتوگرافی با کارایی بالا در تیمارهای مختلف رژیم آبیاری انجام شد. نتایج نشان داد که تنش خشکی باعث افزایش آرتمیزینین در گیاه درمنه دشتی نشده است. مقایسه میانگین دادهها در جدول2 آمده است.
جدول 2- مقایسه میانگین اثر تنش خشکی بر آتمیزینین در گیاه درمنه دشتی
تیمار |
آرتمیزینین (میکرو گرم بر میلی لیتر) |
شاهد |
a63/8 |
ظرفیت زراعی 70% |
a51/9 |
ظرفیت زراعی 50% |
a73/7 |
ظرفیت زراعی 30% |
a27/13 |
بحث و نتیجهگیری
در این پژوهش، تنش خشکی موجب افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی مورد بررسی شامل آسکورابات پراکسیداز، پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز گردید. آسکوربات پراکسیداز با عمل اﺣﯿﺎﮐﻨﻨﺪگی خود بر روی رادﯾﮑـﺎلﻫـﺎی آزاد و ﺑﻪ ﺧﺼﻮص ﭘﺮاﮐﺴﯿﺪ ﻫﯿﺪروژن ﺧﺴﺎرت ﻧﺎﺷـﯽ از ﺗﻨﺶ اﮐﺴﯿﺪاﺗﯿﻮ را ﺑﻪ ﮐﻢ ﺗﺮﯾﻦ ﻣﻘﺪار ﻣﯽرساند. سیستم اصلی برای سمزادیی پراکسید هیدروژن در کلروپلاست گیاه توسط چرخه آسکوربات- گلوتاتیون اتفاق میافتد که در آن، آسکوربات پراکسیداز یک آنزیم کلیدی محسوب میشود. آنزیم آسکوربات پراکسیداز با بهرهگیری از آسکوربات به عنوان دهنده خاص الکترون، تبدیل پراکسید هیدروژن به آب را کاتالیز میکند. این آنزیم در کلروپلاست، سیتوزول، میتوکندری و پراکسیزوم نقش مهار کردن گونههای فعال اکسیژن را بازی میکند (7). افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز تحث تنش متوسط و شدید در استولون و برگهای گیاه شیرین بیان گزارش شده است (27). در پژوهشی که توسط نجف آبادی و احسان نژاد انجام شد، افزایش بیان این آنزیم در گیاه کنجد تحت تنش خشکی گزارش گردید (25).
آنزیم پراکسیداز در از بین بردن گونههای فعال اکسیژن به منظور جلوگیری از آسیب بیش از حد غشای پلاسمایی فعال است. مالون دی آلدئید یکی از محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپدهای غشایی است و در اثر آسیب گونههای فعال اکسیژن تولید میشود (18). پراکسیداز نقش اصلی در حذف پراکسید هیدروژن (H2O2) و مالون دی آلدئید دارد و در نتیجه باعث حفظ یکپارچگی ساختار غشای سلولی می شود. در این پژوهش، تنش خشکی موجب افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز شده است. مشخص شده است که در گیاه بامیه (2) و گیاه شیرین بیان (27) نیز تنش خشکی سبب افزایش میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز نسبت به گیاه شاهد شده است. اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت انزیم پراکسیداز درنمونههای بذری دوگونه مختلف بابونه کاذب و بابونه زرد نشان داد که تنش خشکی سبب افزایش میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در هر سه نمونه بذری بابونه کاذب در تنش شدید (35% ظرفیت زراعی) شده است، اما در بابونه زرد میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در تنش خشکی متوسط (55% ظرفیت زراعی) افزایش پیدا کردهاست (3).
تنش خشکی موجب افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز شد. آنزیمهای سوپر اکسید دیسموتاز نقش عمدهای در محافظت سلول علیه تنش اکسیداتیو بر عهده دارند، زیرا آنها رادیکال سوپر اکسید را به پراکسید هیدروژن و اکسیژن مولکولی تبدیل میکنند. افزایش فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز میتواند به دلیل افزایش رادیکال سوپر اکسید و یا یک مکانیسم دفاعی علیه تنش اکسیداتیو در گیاهان باشد (29). افزایش فعالیت این آنزیم در برنج (23)، گیاه دارویی خرفه (19) و کنجد (25) نیز گزارش شدهاست.
تنش خشکی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز را نیز افزایش دادهاست. آنزیم کاتالاز از دسته پروتئینهای آهن دار محسوب میشود. در سلولهای گیاهی و جانوری، زمانی که مقدار پراکسید هیدروژن در محیط زیاد باشد، این آنزیم وارد عمل میشود. فعالیت کاتالاز برای رفع سمیت پراکسید هیدروژن در پراکسیزوم توسط اکسیدازها در اکسیداسیون اسیدهای چرب و کاتابولیسم پورین نقش دارد. ادروا و همکاران بیان کردند که کاتالاز سلولها را از اثرات پراکسید هیدروژن محافظت میکند. کاتالاز پراکسید هیدروژن را به آب واکسیژن تبدیل میکند(14). افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در اثر تنش خشکی در گیاه داروئی گل گاوزبان (4) و گیاه داروئی خار مریم (34) گزارش شدهاست. همچنین افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در اثر تنش خشکی روی دو گونه زینتی میخک (31) مشاهده شده است که با نتایج حاضر مطابقت دارد. این در حالی است که در گیاه شیرین بیان میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در استولون و برگها کاهش بیش از دو برابری داشته است (27). افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی یک واکنش طبیعی معمول گیاهان به تنش خشکی گزارش شده است (15). طبق نتایج بدست آمده در این پژوهش ، با وجود اینکه تنش شدید خشکی باعث افزایش بیش از 10 برابری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی آسکوربات پراکسیداز، پراکسیداز و افزایش بیش از سه برابری سوپر اکسید دیسموتاز در مقایسه با شاهد شده است، اما افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز به افزایش دو برابری نیز نمیرسد. فعالیت کاتالاز برای رفع سمیت پراکسید هیدروژن است و یک مولکول کاتالاز میتواند در یک دقیقه 6 میلیون H2O2 را به آب و اکسیژن مولکولی تبدیل کند (14). شاید عدم افزایش چشمگیر کاتالاز به قدرت فعالیت مولکولهای این آنزیم مربوط باشد.
گیاه در شرایط آبیاری دورهای با 70 درصد ظرفیت زراعی با تنش خشکی مواجه نمیگردد. در نتایج بدست آمده برای آنزیمهای آنتی اکسیدانی آسکوربات پراکسیداز، پراکسیداز و کاتالاز تفاوت معنیداری با شاهد، مشاهده نشد (جدول 1)، در حالی که از نظر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز این تیمار تفاوت معنیداری با شاهد دارد. این نتایج نشان داد که احتمالا فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، به میزان رطوبت در دسترس گیاه حساس است.
طبق نتایج پژوهش حاضر، تنش خشکی موجب افزایش یا کاهش آرتمیزینین در درمنه دشتی نشد. سونی و آبدین اثر تنش اکسیداتیو ناشی از کمبود آب را بر میزان آرتمیزینین گیاه Artemisia annua L. بررسی کردند. نتایج این تحقیق نشان داد که تنش خشکی مقدار آرتمیزینین را در این گیاه کاهش میدهد (30). یاداو و همکاران معتقدند تنش طولانی مدت بر میزان آرتمیزینین Artemisia annua L. تاثیر منفی دارد (35). در حالیکه مطالعه دیگری افزایش محتوای آرتمیزینین در شرایط کمبود آب را نشان میدهد. مارخس و همکاران تنش خشکی 38 و 62 ساعت را بر میزان آرتمیزینین برگ Artemisia annua L بررسی کردند. فقط تنش 38 ساعته باعث افزایش محتوای آرتمیزینین کل گیاه و برگ شد(24). نتایج یک مطالعه نشان میدهد تنش شوری متوسط میتواند باعث افزایش میزان آرتمیزینین Artemisia annua L شود (6).
دربسیاری از پژوهشها، تنش خشکی موجب افزایش متابولیتهای ثانویه شدهاست. متابولیتهای ثانویه نقش مهمی در سازگاری گیاهان به تغییرات محیطی در شرایط تنش دارند (13). بتیاب و همکاران گزارش کردند که تنش خشکی سبب افزایش اسانسهای مانند کامفور، 1و8 سینئول و آلفا توجین در گیاه مریم گلی شدهاست (11). همچنین در گزارشی دیگر که بر روی گونهی دیگر از مریم گلی انجام شد نشان دادکه تنش خشکی سبب افزایش رزماریک اسید شدهاست (22). اثر تنش خشکی بر روی گیاه تشنه داری از خانواده میمون، باعث افزایش گلیکوزیدهای مهم شدهاست (32). تنش خشکی باعث افزایش بیان ژنهای کلیدی مسیر بیوسنتزی تریترپنوئیدها در گیاه شیرین بیان و افزایش میزان گلیسیریزین در شرایط تنش شدید میشود (27). با این حال، گزارشهایی نیز مبنی بر عدم تاثیر تنش خشکی بر میزان متابولیتهای ثانویه وجود دارد. خراسانینژاد و همکاران در تحقیقی که بر روی نعناع فلفلی انجام شده بود، نشان دادند که تنش خشکی باعث کاهش میزان منتول و منتول فوران شده بود (20). تنش خشکی، میزان متابولیتهای ثانویه را در بیشتر گیاهان افزایش میدهد اما به نظر میرسد برخی از متابولیتهای ثانویه نقشی در سازگاری گیاه به شرایط خشکی ندارند.
در این پژوهش، با اعمال تنش خشکی دوره ای میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در شرایط تنش دورهای متوسط و شدید در گیاه درمنه دشتی افزایش یافت. در برخی گیاهان دارویی مشخص شده است که اعمال تنش خشکی پایان دوره، پیش از برداشت محصول و یا تنش دوره ای میتواند میزان متابولیتهای ثانویه را افزایش دهد، اما در این تحقیق مشخص شد که تنش خشکی بر افزایش یا کاهش تولید مادهی آرتمیزینین موثر نیست. نتایج این تحقیق می تواند در شناخت مکانیسم مقاومت به تنش خشکی کمک نماید.
سپاسگزاری
از جناب آقای دکتر حسین بیات عضو هیات علمی گروه خاکشناسی دانشگاه بوعلی سینا به خاطر راهنمایی ارزنده در نحوه اجرای تنش خشکی، صمیمانه قدردانی میشود.