Using of wild accessions of A. officinalis in asparagus breeding programs

Document Type : Research Paper

Authors

1 Ph.D. Student of Horticulture Science, Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

2 Assistant Prof., Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

3 Assistance Prof. Department of Horticultural Sciences, Gorgan university of agricultural sciences and natural resources, Gorgan, Iran.

4 Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

5 Professor, Department of Genetic, Faculty of Genetic, University of Cordoba, Cordoba, Spain.

Abstract

A. officinalis is the most economically important species of asparagus. There are some wild accessions of this species from Iran that they are growing under different environmental conditions such as saline and dry soils and wide range of altitude and climate. Inter and intraspecific hybridization is a useful technique to introduce characteristics from wild species and accessions into crops. The overall purposes of the current study were to evaluate the possibility of using of wild accessions of A. officinalis species in asparagus crop breeding programs and also using of molecular markers as a valuable and useful tool to detect hybrid plants. In this study, successful interspecific hybridization was obtained for A. officinalis (2x) × A. persicus (2x) cross, by hand pollination. AG7 can be suitable molecular marker to detect interspecific plant for wild accession of A. officinalis (wild accession from Kerman province) in open pollination method and also controlled crosses. Specific allele in 187 bp length was identified by AG8 marker in A. officinalis wild accessions.

Keywords

Main Subjects

استفاده از توده­های خودرو  Asparagus officinalisدر برنامه­های اصلاحی مارچوبه

محمدابراهیم رنجبر1، زهرا قهرمانی1*، سید جواد موسوی­زاده2، طاهر برزگر1 و خوان خیل3

1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه علوم باغبانی

2 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه تولیدات گیاهی

3 اسپانیا، کوردوبا، دانشگاه کوردوبا، دانشکده ژنتیک، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 12/11/1398          تاریخ پذیرش: 25/10/1399

چکیده

مهم­ترین گونه تجاری مارچوبه Asparagus officinalis است. برخی از توده­های خودرو این گونه در ایران پراکنش دارند که در شرایط مختلف محیطی مانند خاک­های شور و خشک و بازه وسیعی از ارتفاع و شرایط آب و هوایی رشد می­کنند. تلاقی بین و درون­گونه­ای تکنیکی پرکاربرد در جهت معرفی صفات از گونه­ها و توده­های خودرو به ارقام تجاریست. اهداف کلی پژوهش حاضر بررسی امکان استفاده از توده­های خودرو گونه A. officinalis در برنامه­های اصلاحی محصول مارچوبه و همچنین استفاده از نشانگرهای ملکولی بعنوان ابزاری ارزشمند و پرکاربرد در جهت تشخیص گیاهان هیبرید بودند. در این پژوهش هیبریداسیون بین­گونه­ای موفق برای تلاقی A. officinalis (2x) × A. persicus (2x) ­بکمک گرده­افشانی دستی صورت پذیرفت. AG7 می­تواند نشانگر ملکولی مناسبی در جهت تشخیص گیاهان هیبرید بین­گونه­ای برای گونه A. officinalis (توده خودرو متعلق به استان کرمان) در روش گرده­افشانی آزاد و تلاقی­های کنترل­شده باشد. آلل اختصاصی به طول bp 187 بوسیله نشانگر AG8 در توده­های خودرو A. officinalis شناسایی شد.

واژه های کلیدی: توده­های خودرو، مارچوبه ایرانی، نشانگرهای SSR، هیبریداسیون بین­گونه­ای

* نویسنده مسئول، تلفن: 09125416960، پست الکترونیکی: z.ghahremani@znu.ac.ir

مقدمه

 

مهمترین گونه تجاری مارچوبه Asparagus officinalis است که ارقام مختلف آن در عین برخورداری از صفات زراعی مطلوب به بسیاری از تنش­های زنده و غیرزنده حساس هستند (9). پژوهش­هایی که در سال­های اخیر در داخل کشور صورت پذیرفت نشان داد که توده­های خودرویی از این گونه در مناطق مختلف کشور رشد و پراکنش دارند که به برخی از رایج­ترین تنش­ها در کشت و پرورش مارچوبه مقاومند و در شرایط مختلف محیطی مانند خاک­­های شور و بازه وسیعی از ارتفاع و شرایط آب و هوایی رشد می­کنند (9 و 13). تلاقی بین و درون­گونه­ای تکنیکی پرکاربرد برای انتقال صفات از گونه­ها و توده­های خودرو به ارقام تجاری مارچوبه است (15). بر اساس نتایج حاصل از پژوهش انجام شده در سال 2018 میلادی، امکان بکارگیری رقم مورادو دهتور (Morado de Huétor) که یک رقم مارچوبه متعلق به کشور اسپانیا است و دارای تنوع سطح پلوئیدی بوده بعنوان والد حدواسط جهت انتقال صفات از گونه­های وحشی مارچوبه با سطوح پلوئیدی مختلف به ارقام تجاری وجود دارد (4 و 12). از مزایای استفاده از نشانگرهای ملکولی در کنار نشانگرهای مورفولوژیکی در برنامه­های اصلاحی مارچوبه می­توان به تعداد نامحدود، تشخیص آسان، تولید چندشکلی بالا و تأثیرناپذیری از عوامل محیطی، اثرات اپیستازی و پلیوتروپی اشاره کرد (1 و 2). نشانگرهای مورفولوژیکی به علت محدود بودن و تأثیرپذیری زیادشان از عوامل محیطی، فاکتورهای چندان قابل اعتمادی در جهت تشخیص گیاهان هیبرید و تعیین ماهیت ژنتیکی آن­ها محسوب نمی­شوند (6 و 17). کاربرد موفق 23 نشانگر RAPD، در جهت شناسایی هیبریدهای بین­گونه­ای حاصل از تلاقی گونه­های خودرو A. acutifolius و A. maritimus با رقم تجاری مارچوبه گزارش شده است (17). اهداف کلی پژوهش حاضر، بررسی امکان تلاقی بین توده­های خودرو ایرانی A. officinalis با رقم تجاری مارچوبه بمنظور انتقال ژن­های مهم از توده­های خودرو به رقم تجاری، شناسایی نشانگرهای ملکولی مناسب جهت تشخیص و تعیین اصالت گیاهان هیبرید شکل گرفته و شناسایی نشانگرهای ملکولی مناسب با توانایی تشخیص آلل­ اختصاصی در گونه A. officinalis بود.

مواد و روشها

پژوهش حاضر در دو بخش مجزا شامل بخش اول، تلاقی بین و درون­گونه­ای بصورت دستی و بخش دوم، گرده­افشانی آزاد بین توده­های خودرو و ارقام تجاری مارچوبه در طی سال­های 1394 تا 1398 در دانشگاه زنجان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشگاه کوردوبا اسپانیا و مرکز تحقیقات ایفاپا (واقع در شهر کوردوبا اسپانیا) صورت پذیرفت.

تلاقی دستی: مواد گیاهی و برنامه تلاقی بینشان در جدول 1 قابل مشاهده است.

 

جدول 1- مواد گیاهی مورد استفاده و برنامه تلاقی بین­ و درون گونه­ای به صورت دستی

ردیف

مواد گیاهی

کد گیاه والد

سطح پلوئیدی

نوع

منشأ و شرایط آب و هوایی

ویژگی­های اصلاحی

برنامه تلاقی

کد گیاه هیبرید حاصل از تلاقی

1

A. officinalis 1

AO6

2n=2x

توده اهلی شده

ایران، البرز – مدیترانه­ای سرد

صفات زراعی مطلوب

AO6×Ape

Ao-Ap

2

A. officinalis 2

Ao4

2n=2x

توده خودرو

ایران، کرمان، جیرفت - بیابانی

1. مقاومت به خاک­ شور

2. مقاومت به خاک­ قلیایی

3. مقاومت به خشکی خاک

4. مقاومت به دمای بالا

Ht815×Ao4

Ht-Ao84

3

A. officinalis 3

Ao1

2n=4x

توده خودرو

ایران، البرز، طالقان – مدیترانه­ای سرد

1. مقاومت به خاک­ شور

2. مقاومت به خاک­ قلیایی

Ht262×Ao1

Ht-Ao21

4

Morado de Huetor 1

Ht815

2n=2x

رقم تجاری

اسپانیا، آندالوسیا، گرانادا – مدیترانه­ای گرم

صفات زراعی مطلوب

 

5

Morado de Huetor 2

Ht262

2n=4x

رقم تجاری

اسپانیا، آندالوسیا، گرانادا – مدیترانه­ای گرم

صفات زراعی مطلوب

 

 

6

A. persicus

Ape

2n=2x

گونه خودرو

ایران، گیلان، منجیل – مدیترانه­ای

1. مقاومت به خاک­ قلیایی

2. مقاومت به بیماری قارچی فوزاریومی

 

 

 

گیاهان مادری از طریق کشت بذر در گلدان­های پلاستیکی در شرایط گلخانه پرورش داده شدند تا به سن بلوغ جهت انجام تلاقی­ بین و درون­گونه­ای برسند. تلاقی­­ها در سطح پلوئیدی یکسان و بصورت دستی در شرایط کنترل شده در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه کوردوبا صورت پذیرفت. بذور پس از جداسازی از میوه­ها بخوبی با محلول 5 درصد هیپوکلرید­سدیم ضدعفونی شدند. سپس اقدام به کشت آن­ها در بستری مخلوط از پیت­ماس و پرلیت در اتاقک رشد (دمای 27 درجه) گردید. به­منظور تعیین و تأیید اصالت ژنتیکی نتاج، از روش ردیابی آلل­های اختصاصی والدین در نتاج استفاده شد.

تشخیص و ردیابی آلل­های اختصاصی: برای­ تشخیص آلل­های اختصاصی در گیاهان والدینی، 20 جفت نشانگر EST-SSR  طراحی­شده برای گونه تجاری مارچوبه (7) و 16 جفت نشانگر SSR طراحی­شده برای گونه تجاری مارچوبه (10) بکار گرفته شدند و پس از آن ردیابی آلل­های اختصاصی والدین در نتاج و تأیید ماهیت هیبریدی آن­ها انجام شد. استخراج DNA از یک گرم از انتهای برگ­های جوان با استفاده از روش تغییریافته دویل و دویل صورت پذیرفت (8). کمیت و کیفیت DNA بوسیله نانودراپ اسپکتوفتومتری (Denovix-Ds-11-Fx) ارزیابی شد. واکنش  PCRبر مبنای پژوهش کروسو و همکاران (7) صورت پذیرفت. الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/2 درصد در بافر TBE صورت پذیرفت و بوسیله محلول رد سیف (Red Safe nucleic acid staining solution 20000x) باندهای تولید شده مورد رنگ­آمیزی قرار گرفت. الگوهای چندشکلی تولید­شده بکمک اشعه فرابنفش و روش عکسبرداری قابل مشاهده و ارزیابی شدند. محصول PCR با کاربرد یک توالی­سنج مویین اُتوماتیک (ABI 3130 Genetic Analyzer; Applied Biosystems/Hitachi, Madrid, Spain) جداسازی گردید. اندازه باندهای تشکیل­شده بر اساس DNA استاندارد با نرم­افزار GeneScan محاسبه شده و نتایج بوسیله نرم­افزارGenotyper  ترجمه گردید.

گرده­افشانی آزاد: مواد گیاهی بکار گرفته شده در این بخش و برخی از مهم­ترین ویژگی­های آن­ها در جدول 2 قابل مشاهده است.

در این روش در فصل بهار در مزرعه تحقیقاتی موسسه ایفاپا (تمامی توده­های ذکر شده در جدول 2، در یک منطقه وسیع تحقیقاتی در این موسسه نگهداری می­شدند و توده­های ایرانی در طی سال 1394 برای اولین بار در این مجموعه کشت شدند)، گل­های پایه­های نر توده خودرو ایرانی (گونه  A. officinalis توده متعلق به استان کرمان، AO4) در چندین مرحله حذف و به پایه­های ماده این گونه اجازه دریافت دانه­گرده از پایه­های نر سایر توده­ها (جدول 2) توسط گرده­افشان­های طبیعی (گرده­افشانی طبیعی در مارچوبه بطور عمده توسط حشرات صورت می­گیرد و حشره زنبور مهم­ترین گرده­افشان طبیعی گیاه مارچوبه است (9)) داده شد. پس از پایان دوره گرده­افشانی اقدام به جمع­آوری میوه­ها­ از پایه­های ماده توده خودرو ایرانی و کشت بذورگردید.

تفکیک نتاج: با توجه به وجود پدیده چندجنینی، شکل­گیری جنین­های غیرجنسی و همچنین امکان گرده­افشانی شدن پایه­های ماده توده ایرانی با پایه­های نر خودی (با وجود اینکه گل­ها در پایه­های نر توده ایرانی با دقت و در چندین مرحله حذف شد اما با این وجود امکان بروز خطا و عدم حذف بموقع گل­های نر و همچنین امکان گرده­افشانی شدن با پایه­های نر موجود در سایر کرت­های آزمایشی وجود داشت)، در گام بعد اقدام به تفکیک نتاج هیبرید از نتاج غیر­هیبرید بکمک نشانگرهای ملکولی گردید. بدین منظور نیز از 10 گیاه مختلف با جنسیت­های متفاوت برای هر گونه، DNA ژنومی استخراج گردید و از ترکیب آن­ها بعنوان نمونه ژنومی برای هر گونه در واکنش PCR استفاده شد. واکنش PCR و الکتروفورز محصول PCR مشابه بخش تلاقی دستی صورت پذیرفت و الگوهای چندشکلی تولید  شده  به کمک  اشعه  فرابنفش  و  روش

عکسبرداری قابل مشاهده شدند.

سه نوع از الگوهای چندشکلی تولید­شده مطلوب و پرکاربرد در نظر گرفته شدند: 1) الگوهایی که در آن­ها بین باند تولید­شده برای توده AO4 و سایر گونه­ها تفاوت اندازه واضح وجود داشته باشد. 2) الگوهایی که در آن­ها برای تمامی توده­های مورد مطالعه به استثنای توده AO4 تولید باند شده باشد. 3) الگوهایی که در آن­ها فقط در توده AO4 تولید باند شده باشد و برای سایر توده­های مورد مطالعه باندی شکل نگرفته باشد.

 

 

جدول 2- برخی از ویژگی­های گونه‌ها و توده‌های مختلف مارچوبه مورد استفاده در گرده­افشانی آزاد

ردیف

گونه

کد

سطح پلوئیدی

نوع

منشاء

منطقه و شرایط آب و هوایی

1

A. officinalis L.

WR

2x

رقم تجاری

روسیه

ولگا- سرد و مرطوب

2

A. verticillatus L.

AV1

2x

توده خودرو

ایران

اردبیل- سرد و نیمه خشک

3

A. verticillatus L.

AV2

2x

توده خودرو

ایران

سمنان (شاهرود)- مدیترانه­ای

4

A. verticillatus L.

AV3

2x

توده خودرو

ایران

گیلان (لاهیجان)- سرد و مرطوب

5

A. officinalis L.

AO4

2x

توده خودرو

ایران

کرمان- بیابانی

6

A. officinalis L.

AO6

2x

توده اهلی شده

ایران

البرز - مدیترانه­ای سرد

7

A. persicus Baker.

Ape

2x

گونه خودرو

ایران

گیلان (منجیل)- مدیترانه­ای

8

A. officinalis L.

AU

2x

رقم تجاری

آمریکا

رقم مری واشنگتن

9

A. prostratus Dumort.

APB

4x

گونه خودرو

اسپانیا

لاکرونیا- مدیترانه­ای معتدل

10

A. officinalis L.

AO2

4x

توده خودرو

ایران

مازندران (محمودآباد) - گرم و مرطوب

11

A. officinalis L.

AO1

4x

توده خودرو

ایران

البرز (طالقان) - مدیترانه­ای سرد

12

A. acutifolius L.

AC

4x

گونه خودرو

اسپانیا

کوردوبا- مدیترانه­ای گرم

13

A. officinalis , Morado de Huétor

HT

4x

رقم تجاری

اسپانیا

گرانادا- مدیترانه­ای گرم

14

A. brachyphyllus Turz.

AB

6x

گونه خودرو

روسیه

ولگا- سرد و مرطوب

15

A. pseudoscaber Grec.

APS

6x

گونه خودرو

چک

موراویای- اقیانوسی مرطوب

16

A. maritimus L. Mill.

MA

6x

گونه خودرو

آلبانی

ولوره– معتدل و مرطوب

17

A. officinalis L.

AO3

8x

توده خودرو

ایران

مازندران (نور)- سرد و مرطوب

18

A. officinalis L.

AO7

8x

توده خودرو

ایران

مازندران (آمل)-مدیترانه­ای نیمه مرطوب

19

A. breslerianus Schult.

Abr

8x

گونه خودرو

ایران

سمنان (یزدو)- گرم و خشک

20

A. officinalis L.

AO5

10x

توده خودرو

ایران

کردستان- سرد و خشک

21

A. macrorrhizus Pedrol

MC

12x

گونه خودرو

اسپانیا

کارتاگنا- گرم مدیترانه­ای

 

 

درصد هیبریداسیون: پس از شناسایی نتاج هیبرید، درصد هیبریداسیون برای توده AO4 به­کمک معادله زیر محاسبه شد:

(5 و 11)    100 × (تعداد کل گیاهان مورد بررسی / تعداد گیاهان هیبرید) = درصد هیبریداسیون

تشخیص والد نر در نتاج هیبرید: تشخیص والد نر برای نتاج هیبرید حاصل از گرده­افشانی آزاد در طی دو مرحله صورت پذیرفت: 1) برآورد سطح پلوئیدی والد نر: در این مرحله با بکارگیری از تکنیک فلوسیتومتری بر اساس پژوهش مورنو و همکاران (12)، اقدام به تعیین سطح پلوئیدی نتاج هیبرید گردید. در این شرایط با دانستن سطح پلوئیدی والد ماده (توده AO4) و نتاج هیبرید، سطح پلوئیدی والد نر تعیین شد و توده­هایی که در سطح پلوئیدی مشخص شده نبودند از روند بررسی بعنوان والد نر حذف شدند. 2) تعیین دقیق والد نر بکمک نشانگرهای ملکولی با توانایی تشخیص آلل اختصاصی: در این مرحله با توجه به مشخص شدن سطح پلوئیدی والد نر از نشانگرهای مناسب در جهت تشخیص آلل­های اختصاصی والدین در هیبریدها استفاده شد و با تشخیص آلل­های اختصاصی والدهای نر در نتاج هیبرید، منشأ ژنتیکی دقیق نتاج هیبرید مشخص گردید.

نتایج

تلاقی دستی: در بخش اول پژوهش، نتایج حاصل از انجام تلاقی­­ دستی نشان از آن داشت که امکان انجام تلاقی موفق درون­گونه­ای:

Morado de Huetor (Ht815) × A. officinalis (Ao4) و Morado de Huetor (Ht262) × A. officinalis (Ao1) و همچنین تلاقی موفق بین­گونه­ای:  A. officinalis (AO6) × A. persicus (Ape)   در سطح پلوئیدی یکسان بمنظور انتقال صفات مرتبط به مقاومت (ذکر شده در جدول 1) از گونه و توده­های خودرو به ارقام تجاری مارچوبه وجود دارد. همچنین نتایج حاصل از بررسی الگو­های چندشکلی و توالی­یابی نشان داد که نشانگر TC1 توانایی تشخیص آلل اختصاصی به طول bp 1124 را در رقم تجاری موراد دهتور (HT)، نشانگر AG8 توانایی تشخیص آلل اختصاصی به طول bp 187 را در توده­های خودرو  Ao4وAo1 و همچنین توانایی تشخیص آلل­های اختصاصی به طول bp 187 و bp 123 را در توده اهلی­شده AO6 و نشانگرهای AG8، AGA1 و TC6 توانایی تشخیص آلل اختصاصی در گونه خودرو A. persicus به طول­های  bp232،  bp780 و  bp1086 را دارند. بکمک نشانگرهای ذکر­شده اقدام به ردیابی آلل­های اختصاصی والدین در نتاج گردید و بدین شکل از اصالت ژنتیکی نتاج هیبرید اطمینان حاصل شد. جدول 3 نتایج بدست آمده مربوط به تشخیص آلل اختصاصی برای توده­ها و گونه­های مورد بررسی و شکل 1 نحوه ردیابی آلل­های اختصاصی والدین در نتاج هیبرید برای تلاقی A. officinalis (AO6) × A. persicus (Ape) را نشان می­دهد.

 

شکل 1- نتایج حاصل از بکارگیری نشانگر AG8 برای تلاقی × A. persicus A. officinalis  (a والد ماده هموزیگوت A. officinalis (b والد نر هموزیگوت A. persicus  (c تأیید ماهیت هیبریدی گیاه F1 حاوی هر دو آلل والدینی (هتروزیگوت) (d ماهیت غیرهیبریدی گیاه F1 فقط حاوی آلل والد ماده (هموزیگوت).

 

جدول 3- نتایج مربوط به تشخیص آلل اختصاصی برای توده­ها و گونه­های مورد بررسی

ردیف

مواد گیاهی

کد

نشانگر

طول آلل اختصاصی (bp)

1

A. persicus

APe2

AG8

232

2

A. persicus

APe2

AGA1

780

3

A. persicus

APe2

TC6

1086

4

A. officinalis

AO1 AO2 AO3 AO7      AO5 AO4

AG8

187

5

A. officinalis

AO6

AG8

187 و 123

6

A. officinalis

AU

AG8

136

7

A. officinalis

WR

AG8

147

8

A. officinalis

Morado de Huétor

Ht167      Ht262  Ht815

TC1

1124

9

A. breslerianus

Abr-1

AG7

740

10

A.acutifolius L.

AC

AG5

690

11

A.acutifolius L.

AC

asp_c10809

134

12

A.acutifolius L.

AC

asp_c22357

96

13

A.acutifolius L.

AC

asp_c1401

112

14

A.acutifolius L.

AC

asp_c17476

270

15

A. verticillatus L.

AV3   AV2    AV1

asp_c12534

166

16

A. pseudoscaber

APS

AG8

150

17

A. macrorrhizus

MC

asp_c2370

263

18

A. prostratus

APB

asp_c1401

285

 

 

گرده­افشانی آزاد

بررسی الگو­های چندشکلی و تفکیک نتاج هیبرید از سایر نتاج: در بین نشانگرهای EST-SSR بکارگرفته شده بمنظور بررسی الگوهای چندشکلی تولید­شده، نشانگر AG7 الگو­ی چندشکلی مطلوبی تولید کرد. در مورد این نشانگر الگوی نوع دوم مشاهده شد. در این الگو، برای تمامی توده­های مورد مطالعه به­استثنای توده خودرو ایرانی AO4 تولید باند شد (شکل a2). در این حالت با استفاده از انجام PCR توسط دو نشانگر )نشانگری که در تمامی توده­ها تولید باند کند و نشانگری که در تمامی توده­ها به­استثنای توده AO4 تولید باند کند و بین باندهای تولید شده توسط نشانگر اول و دوم اختلاف اندازه واضح وجود داشته باشد( می­توان به ماهیت هیبریدی نتاج پی برد، بصورتی که نتاجی که تولید دو باند کنند هیبرید و آن­هایی که تولید یک باند کنند نتاج غیرهیبرید خواهند بود. همچنین لازم بذکر است که نتایج بررسی الگوهای چندشکلی نشان داد که نشانگر asp_c6470 توانایی تولید باند در تمامی توده­ها و گونه­های مورد بررسی را داشت (شکل b2). شکل c2، نتایج حاصل از بگارگیری دو نشانگر ذکرشده در جهت تشخیص و تفکیک نتاج هیبرید از غیرهیبرید برای توده خودرو ایرانی AO4 را نشان می­دهد. از اولین نمونه که مربوط به یکی از توده­های گونه خودرو A. verticillatus است تا نمونه مربوط به رقم موراد دهتور (HT)، نمونه ژنومی حاصل از ترکیب 10 گیاه با جنسیت­های متفاوت برای هر توده و گونه بوده که طبق شکل برای تمامی توده­ها و گونه­ها به استثنای توده خودرو ایرانی AO4 تولید دو باند شده است که باند بالایی مربوط به نشانگر asp_c6470 بوده که در تمامی توده­ها توانایی تولید باند را داشته و باند پایینی مربوط به نشانگر AG7 بوده که در تمامی توده­ها به­استثنای توده AO4 تولید باند می­کرد. نمونه AO4(2) مربوط به ژنوم تک گیاه بوده که مانند نمونه AO4(1) که مربوط به ترکیب ژنوم 10 گیاه است تنها تولید یک باند کرده است. نمونه­های 1-5 نیز مربوط به پنج گیاه حاصل از گرده­افشانی آزاد با والد مادری AO4 بوده که براساس نتایج، نمونه شماره 2 یک گیاه هیبرید (دو باند) بوده و سایر نمونه­ها مربوط به گیاهان غیرهیبرید (یک باند) است.

 

 

شکل 2- نتایج مربوط به تشخیص نتاج هیبرید حاصل از گرده­افشانی آزاد برای توده AO4

  1. a) الگوی چندشکلی حاصل از بکارگیری نشانگر AG7 b) الگوی چندشکلی حاصل از بکارگیری نشانگر asp_c6470 c) بکارگیری نشانگرهای AG7 و asp_c6470 در جهت تشخیص نتاج هیبرید برای توده AO4

 

درصد هیبریداسیون: در مجموع تعداد 309 گیاه، حاصل از گرده­افشانی آزاد با پایه مادری  AO4مورد بررسی قرار گرفت که از این تعداد، 9 گیاه ­بعنوان نتاج هیبرید تشخیص داده شد. با توجه به تعداد کل گیاهان مورد بررسی و تعداد گیاهانی که هیبرید بین­گونه­ای تشخیص داده شدند، درصد هیبریداسیون برای توده خودرو ایرانی AO4 میزان 91/2 درصد ارزیابی گردید.

تعیین والد گرده­دهنده در نتاج هیبرید: نتایج حاصل از بررسی سطح پلوئیدی نتاج هیبرید نشان داد که تمامی هیبرید­ها دیپلوئید هستند و این موضوع به این معنا است که با توجه به دیپلوئید بودن والد ماده (توده خودرو AO4)، سطح پلوئیدی والد نر نیز دیپلوئید است. بر اساس این دست­یافته از نشانگرهایی که توانایی تشخیص آلل اختصاصی در توده­ها و گونه­های دیپلوئید بکارگرفته شده در این پژوهش را داشتند بمنظور ردیابی آلل اختصاصی والد نر در نتاج و تعیین دقیق والد گرده­دهنده استفاده شد. نتایج نشان داد که در تمامی 9 گیاه هیبرید نشانگر AG8 آلل اختصاصی رقم تجاری مری واشنگتن متعلق به کشور آمریکا را شناسایی کرد. بدین ترتیب تلاقی(AU)   A. officinalis×(AO4)  A. officinalis ­بعنوان تلاقی تولیدکننده تمامی 9 گیاه هیبرید مشخص گردید، که یک تلاقی درون­گونه­ای (گونه A. officinalis) در سطح پلوئیدی یکسان (دیپلوئید - 2x) بین یک توده خودرو (توده متعلق به کرمان که دارای صفات مرتبط با مقاومت است) و یک رقم تجاری (رقم مری واشنگتن که دارای صفات زراعی مطلوب است) بود.

بحث و نتیجه گیری

تلاقی بین و درون­گونه­ای از جمله تکنیک­های رایج در اصلاح محصول مارچوبه بوده که برای اولین بار در سال 1913 میلادی اقدام به انجام آن شده است (9). استفاده از نشانگرهای ملکولی در جهت تعیین ماهیت نتاج حاصل از تلاقی­های بین و درون­گونه­ای در مارچوبه در پژوهش­های متعددی مورد توجه قرار گرفته است. برای مثال پنج نشانگر AG2، AG3، AG7، AG10 و TC1 برای بررسی نتاج حاصل از تلاقی دو گونه دیپلوئید A. officinalis بکار برده شدند که نتایج نشان از کارآمد بودن آن­ها در تعیین منشاء ژنتیکی نتاج داشت (16). در پژوهشی دیگر اقدام به ایجاد تلاقی بین گونه­های A. officinalis و A. verticillatus و همچنین گونه­های A. amarus و A. verticillatus (همگی در سطح تتراپلوئید) شد. پس از انجام تلاقی و کشت نتاج اقدام به بررسی فاصله ژنتیکی والدین و نتاج هیبرید تولید­شده بوسیله نشانگرهای RAPD گردید (14). از جمله اشکالاتی که به نتایج حاصل از این پژوهش می­توان وارد دانست اینکه پس از انجام تلاقی و شکل­گیری نتاج اقدامی در جهت بررسی اصالت ژنتیکی نتاج صورت نپذیرفت و احتمالاَ ماهیت هیبریدی نتاج ­بکمک نشانگرهای مورفولوژیکی تعیین گردید. با توجه به احتمال شکل­گیری جنین­های غیرجنسی در مارچوبه، احتمال بروز خطا در گرده­افشانی دستی، احتمال گرده­افشانی شدن پایه ماده با گرده­افشان­های طبیعی و در نهایت تأثیرپذیری زیاد نشانگرهای مورفولوژیکی از شرایط محیطی (1، 2 و 9)، تعیین ماهیت ژنتیکی نتاج بکمک نشانگرهای مولکولی مناسب در این پژوهش الزامی بنظر می­رسید و عدم انجام این مرحله را می­توان از نواقص جدی در ارائه نتایج چنین پژوهش­هایی دانست. تاکنون گزارشی از بررسی و معرفی الگوهای چندشکلی مناسب در جهت تشخیص و تفکیک نتاج هیبرید حاصل از تلاقی­های بین و درون­گونه­ای در گیاه مارچوبه گزارش نشده است و پژوهش حاضر را می­توان اولین گزارش جامع در مورد تشخیص اصالت نتاج حاصل از تلاقی­های بین و درون­گونه­ای در مارچوبه با محوریت مارچوبه­های ایرانی بکمک بررسی الگوهای چندشکلی حاصل از بکارگیری نشانگرهای ملکولی دانست، اما پژوهش­هایی در همین زمینه در طی سال­های اخیر بر روی سایر محصولات صورت پذیرفت که از نظر ساختار آزمایش و نتایج بدست­آمده با پژوهش حاضر در یک راستا قرار دارند. برای مثال از نشانگرهای RAPD و SSR بمنظور بررسی الگوهای چندشکلی تولید­شده از تلاقی بین سه لاین اینبرد ذرت استفاده شد. نتایج نشان داد که از بین پنج نشانگر RAPD مورد استفاده سه نشانگر تولید الگوهای چندشکلی مناسب نموده که از آن­ها در تشخیص نتاج هیبرید استفاده شد (3). همچنین در نتایج حاصل از پژوهشی دیگر اظهار شده است که نشانگرهای STMS ابزاری کم­هزینه و قابل اطمینان در جهت تعیین اصالت ژنتیکی نتاج حاصل از تلاقی بین­گونه­ای گیاه نخود هستند و استفاده از این نشانگرها در مراحل اولیه برنامه اصلاحی نخود می­تواند از اتلاف وقت و پیشبرد برنامه اصلاحی در مسیری نامناسب و اشتباه جلوگیری کند (6).

نتایج کلی حاصل از پژوهش حاضر نشان داد:

1) امکان انجام تلاقی موفق درون­گونه­ای:

Morado de Huetor (Ht815) × A. officinalis (Ao4)

Morado de Huetor (Ht262) × A. officinalis (Ao1)

و همچنین تلاقی موفق بین­گونه­ای:

  1. officinalis (AO6) × A. persicus (Ape)

در سطح پلوئیدی یکسان بمنظور انتقال صفات مرتبط با مقاومت از گونه و توده­های خودرو به ارقام تجاری مارچوبه وجود دارد. 2) نشانگر AG8 توانایی شناسایی آلل­ اختصاصی در توده ­های خودرو گونه A. officinalis را دارا است. 3) از ترکیب نشانگرهای AG7 و asp_c6470 می­توان در جهت تشخیص نتاج هیبرید حاصل از گرده­افشانی آزاد با والد مادری Ao4 استفاده کرد.

لازم بذکر است که نتاج هیبرید حاصل از تلاقی دستی و گرده­افشانی آزاد در ادامه از نظر صفات مرتبط با مقاومت (موجود در والد خودرو) و صفات زراعی (موجود در والد تجاری) مورد ارزیابی قرار گرفته و نتاج برتر مشخص و تفکیک شده و در ادامه روند اصلاحی قرار خواهند گرفت.

سپاسگزاری

بدین وسیله از حمایت­های مالی معاونت پژوهشی دانشگاه زنجان و همچنین از مساعدت­ها و حمایت­های علمی و عملی اساتید و مسئولین گروه ژنتیک دانشگاه کوردوبا تقدیر و سپاسگزاری بعمل می­آید.

  • 1 - سیه چهره، م.، کیانی، غ.، و کاظمی­تبار، ک.، 1399. القاء تنوع ژنتیکی در ارقام برنج طارم محلی و هاشمی با استفاده از اتیل متان سولفونات و بررسی تنوع ایجاد شده از طریق نشانگرهای SSR. پژوهش­های گیاهی (زیست­شناسی ایران)، 3، صفحات 592-579.

    2 - طلوعی، ز.، عارفی ترک­آبادی، م.، و حسینی تفرشی، ع.، 1399. بررسی تنوع ریخت­شناسی جمعیت­های مختلف گل محمدی در شهرستان کاشان و ارتباط آن با بازده اسانس، پژوهش­های گیاهی (زیست­شناسی ایران)، 1، صفحات 178-167.

     

    • Abdel-Mawgood, A., Ahmed, M. and Ali, B. A. 2006. Application of molecular markers for hybrid maize (Zea mays) identification. Journal of Food, Agriculture and Environment. 4(2): 176-8.
    • Amian, L., Rubio, J., Castro, P., Gil, j. and Moreno, R. 2018. Introgression of wild relative asparagus spp. germplasm into the Spanish landrace ‘ Morado de Huetor’. XIVth international asparagus symposium. Acta Horticulture. 1223: 33-38.
    • Asif, M., Rahman, M. U., Mirza, J. I. and Yusuf, Z. 2009. Parentage confirmation of cotton hybrids using molecular markers. Pakistan Journal of Botany. 41: 695-
    • Caballo, C., Castro, C., Gil, J., Izquierdo, I., Millan, T., and Rubio, J. 2018. STMS molecular markers as a valuable tool to confirm controlled crosses in chickpea (Cicer arietinum) breeding programs. Euphytica. 214: 231-237.
    • Caruso, M., Federici, C. T. and Roose, M. L. 2008. EST-SSR markers for asparagus genetic diversity evaluation and cultivar identification. Molecular Breeding. 21:195-204.
    • Doyle, J. J. and Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15.
    • Kanno, A. and Yokoyama, J. 2011. Asparagus. In Wild Crop Relatives: Genomic and Breeding Resources, K. Chittaranjan, 1ed. (Berlin, Germany: Springer Berlin Heidelberg). p.23-42.
    • Mercati, F., Riccardi, P., Leebens-Mack, J., Abenavoli, R., Falavigna, A. and Sunseri, F. 2013. Single nucleotide polymorphism isolated from a novel EST dataset in garden asparagus (Asparagus officinalis). Plant Science, 115(23): 203-204.
    • Morais, S., Vieira, A., Almeida, L., Rodrigues, L., Melo, P., Faria, L., Melo, L., Pereira, H. and Souza, T. 2016. Application of microsatellite markers to confirm controlled crosses and assess genetic identity in common bean. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 16: 234-239.
    • Moreno, R., Espejo, J, A., Cabrera, A., Millan, T. and Gil, J. 2006. Ploidic and molecular analysis of ‘Morado de Huetor’ asparagus (Asparagus officinalis) population; a Spanish tetraploid landrace. Genetic Resources and Crop Evolution, 53(4): 729-736.
    • Mousavizadeh, S. J., Hassandokht, M. R. and Kashi, A. 2015. Multivariate analysis of edible Asparagus species in Iran by morphological characters. Euphytica, 206: 445-457.
    • Nothnagel, T., Kramer, R., Budahn, H., Schrader, O., Ulrich, D., Rabenstein, F. and Schreyer, L. 2012. Enlargement of the genetic variability of garden Asparagus (Asparagus officinalis) to improve resistance to biotic and abiotic stresses and quality associated compounds. XIIth international asparagus symposium. Acta Horticulture, 950.
    • Ochiai, T., Sonoda, T., Kanno, A. and Kameya, T. 2002. Interspecific hybrids between Asparagus schoberioides Kunth and officinalis L. Acta Horticulture, 589: 225-229.
    • Ozaki, Y., Takeuchi, Y., Iwato, M., Sakazono, S. and Okubo, H. 2014. Occurrence of a Spontaneous Triploid Progeny from Crosses between Diploid Asparagus (Asparagus officinalis ) Plants and Its Origin Determined by SSR Markers. JournalofJapanese Society for Horticultural Science, 2: 1-5.
    • Valente, M. T., Sabatini, E., Casali, P. E. and Falavigna, A. 2009. Molecular markerassisted introgression of wild Asparagus species genome into the cultivated Asparagus officinalis. In: Proceedings of the 53rd Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress, Torino, Italy 16-19 September, ISBN 978-88-900622.
Volume 35, Issue 2
June 2022
Pages 264-278
  • Receive Date: 01 February 2020
  • Revise Date: 04 January 2021
  • Accept Date: 14 January 2021