Bioinformatics evaluation of transgenic organisms for allergenicity potential

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Plant Sciences and Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Velenjak, Tehran, Iran.

2 Department of Plant Biology & Biotechnology, Faculty of Life science and biotechnology, Shahid Beheshti University

3 Associate Professor of Biotechnology, Department of Plant Sciences & Biotechnology, Faculty of Life science and biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Tehran, Iran

Abstract

One of the evaluation steps in the safety of transgenic crops is the potential for allergenicity. Therefore, it is necessary to investigate the allergenicity of the produced proteins of transgenic organisms using bioinformatics analysis before anything else. In this study, three allergen databases (Allergenonline, SDAP and Allermatch) were used to evaluate the bioinformatics of six important proteins of transgenic products. Query sequences were analyzed for survey of allergen sequences by full FASTA and 80 amino acids with more than 50% and 35% similarity in allergen databases, respectively. Among the studied proteins, Chitinase and PRP (pathogenesis-related proteins) showed high homology with allergen proteins, that these proteins have plant origin and are naturally and are consumed by humans. In contrast, growth hormone protein (Growth Hormone-1), Cry1AC (resistant to insect pest), CspB (drought tolerance protein) and (Rpi-vnt1.2) has not shown any homology to allergenic proteins. The results showed that the evaluation of allergenicity and other analysis (study of total proteins) before commercialization of these products seems necessary to confirm the safety of transgenic products.

Keywords

Main Subjects

ارزیابی بیوانفورماتیکی موجودات تراریخته برای پتانسیل آلرژی زایی

عباس سعیدی*، زهره حاجی برات، زهرا حاجی برات و مسعود توحیدفر

ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه علوم و زیست فناوری گیاهی

تاریخ دریافت: 05/05/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

یکی از مراحل ارزیابی ایمنی محصولات تراریخته پتانسیل آلرژی زا بودن آن است. بدین منظور بررسی آلرژی­زا بودن پروتئین­های تولید شده توسط این محصولات با استفاده از تجزیه و تحلیل­های بیوانفورماتیکی، امری ضروری تلقی می­شود. در این مطالعه برای ارزیابی بیوانفورماتیکی شش پروتئین مهم محصولات تراریخته از سه پایگاه داده آلرژنها ( Allergenonlineو SDAP  و Allermatch) استفاده شد. توالی­های ورودی (Query) محصولات برای بررسی مشابهت با توالی کامل و آمینواسیدهای 80 تایی با شباهت بیشتر از 50 و 35 درصد بترتیب در پایگاه داده آلرژن مورد بررسی قرار گرفتند. از بین پروتئین­های مورد مطالعه، کیتیناز و PRP که مصرف انسانی دارند شباهت بالایی با پروتئین­های آلرژن نشان دادند.  این  پروتئین­ها  منشا گیاهی داشته و بطور طبیعی آلرژن محسوب می شوند. درحالی که پروتئین هورمون رشد (Growth Hormone-1)، Cry1AC (پروتئین کریستال دفع آفات)­، CspB (پروتئین تحمل به خشکی) و (Rpi-vnt1.2) شباهتی با پروتئین­های آلرژن نشان ندادند. نتایج به دست آمده نشان می‌دهد که ارزیابی آلرژی­زا بودن و آنالیزهای بیشتر (بررسی کل پروتئین ها­) قبل از تجاری سازی این محصولات لازم است تا ایمنی محصولات تراریخته تایید شود.

واژه های کلیدی: حساسیت­زایی، شباهت توالی، ارزیابی سلامت، محصولات تراریخته

* نویسنده مسئول، تلفن: +9822431664 ، پست الکترونیکی: abbas.saidi@gmail.com

مقدمه

 

با توجه به روند افزایش سریع جمعیت و براساس آمار جهانی، تقاضا برای غذا در سال 2050 نسبت به سال 2006 به اندازه‌ی 70 درصد افزایش خواهد یافت (3). بنابراین، برای تامین غذا برای این جمعیت استفاده از اصلاح کلاسیک و روش­های موجود کافی نمی باشد، در نتیجه برای پاسخگوی به این نیاز، استفاده از محصولات تراریخته ضروری بنظرمی­رسد. با توجه با اینکه کشت محصولات کشاورزی به دلیل استفاده ازآفت­کش­ها و علف کش­ها بر محیط زیست اثر می­گذارد و باعث تغییر در الگوی تنوع زیستی کشاورزی می­شود. برای رفع این نگرانی­ها می­توان با استفاده از محصولات تراریخته این نگرانی­ها را کاهش داد (12). تولید این محصولات از طریق تکنیک­های مهندسی ژنتیک می­تواند یک روش تکمیلی در برنامه های اصلاح ژنتیک گیاهان جهت مقاومت در برابر پاتوژن‌ها، علف‌کش‌ها و استرس‌های محیطی­ باشد (21).

قبل از تجاری­ سازی محصولات تراریخته، ارزیابی پتانسیل حساسیت­زایی آنها بسیار مهم می­باشد. یکی از روش های ارزیابی  پتانسیل حساسیت­زایی محصولات تراریخته استفاده از ابزار بیوانفورماتیکی است. ماهیت و محتوای پایگاه­های اطلاعاتی از محصولات تراریخته ارتباط مستقیمی با درجه تاثیر و کارایی تجزیه و تحلیل های بیوانفورماتیکی این پایگاه­ها برای بررسی حساسیت­زایی محصولات تراریخته دارد. اخیرا تعداد پایگاه­های اطلاعاتی آلرژن­ها افزایش یافته است و هر کدام برخی از نیازهای موردنظر را برآورده می­سازند. این پایگاه­های اطلاعاتی درحجم داده، سازماندهی (Organization) و قابلیت (Capability) تفاوت دارند که مهم ترین آنها SDAP ، Allermatch وAllergenonline است(17). گزارش Codex (1) نشان داده است که برای بررسی تشابه بین توالی پروتئینی مورد نظر با توالی موجود در پایگاه اطلاعاتی باید معیار خاصی در نظر گرفته شود. معمولا این معیار با در نظر گرفتن 35 درصد شباهت توالی در 80 یا بیش از 80 آمینواسید توصیه می­شود. براساس چندین گزارش، تطابق شش آمینو اسیدی با هر توالی آلرژن به تنهایی، به طور تصادفی اتفاق می‌افتد بنابراین استفاده از این معیار پیش‌بینی حساسیت­زایی را محدود می‌­کند (10 و 17). از الگوریتم های دیگری که در این خصوص استفاده می شود توالی کامل پروتئین است. در اینصورت شباهت بالای 50 درصد با E-value کمتر 10-8 آلرژن در نظر گرفته می­شود. این دو روش مود تایید سازمان جهانی همچون WHO است. سطح زیر کشت محصولات تراریخته در حال حاضر 200 میلیون هکتار است که اکثر آنها پروتئین هایی به شرح زیر (به جزء پروتئین هورمون رشد برای ماهی تراریخته) می­باشند. PRP و کیتیناز متعلق به پروتئین­‌های مرتبط با پاتوژینسیتی مرتبط با عوامل بیماری­زای گیاهی هستند. این دو پروتئین با منشاء گیاهی،  مورد توجه بیوتکنولوژیست­ها است و برای ایجاد گیاه مقاوم در برابر قارچ های گیاهی اسفاده شده است (16). ژنCspB  با منشاء باکتریایی که در شوک گرمایی فعال شده، به ذرت انتقال یافت (23). این ذرت تراریخته با نام تجاری MON87460  دارای ژن  cspB (cold shock protein B)  بوده که تحت پروموتر اکتین برنج، باعث ایجاد مقاومت به شرایط خشکی در ذرت شده است. اولین ماهی تراریخته سالمون، در سال ۲۰۱۵ به سرعت زیادی در آمریکا پرورش یافت .این ماهی حاوی ژن هورمون رشد (GH-1) است که نقش مهمی در بسیاری از فرایندهای تنظیمی در بافت‌­های مختلف مهره‌داران ایفا می‌­کند(19). منشاء این ژن از ماهی سالمون آتلانتیک ( (Atlantic salmonبود. این ماهی تراریخته در  سال ۲۰۱۵، توسط اداره غذا و داروی آمریکا (FDA)  برای تولید تجاری تایید شد (8). همچنین، ژن­های Rpi-vnt1.2 و Cry 1Ac به ترتیب به سیب‌زمینی و نیشکر انتقال یافته و مورد ارزیابی قرار گرفتند. سیب زمینی تراریخته حاوی ژن Rpi-vnt1.2 باعث ایجاد مقاومت به قارچ Phytophthora infestans می­شود. ژن  Cry 1Acبرای مقاومت به آفات حشره­ای با منشا باکتریایی است. گیاهان زیادی همچون نیشکر، پنبه، سویا و کلزا  با ژنCry 1Ac  برای مقاومت به آفت، تراریخته و تجاری شدند. علیرغم اینکه محصولات تراریخته نقش مهمی در افزایش عملکرد دارند،  قبل از تجاری شدن باید ارزیابی­های لازم در مورد ایمنی آنها صورت گیرد. یکی از این ارزیابی­ها،  آلرژی­زایی  پروتئین‌­های بیان شده در محصولات تراریخته ‌است. هدف از این تحقیق ارزیابی آلرژی زایی موجودات تراریخته با استفاده از انالیز های بیوانفوماتیکی به عنوان یکی از روش های ارزیابی در راستای ایمنی محصولات تراریخته، قبل از تجاری شدن است.

مواد و روشها

انتخاب توالی­های پروتئینی: شش توالی پروتئینی (تراژن) مورد استفاده در این مطالعه شامل هورمون رشد (GH-1(Growth hormone-1)) از ماهی (No. Q5SDS1)، کیتیناز (No. M13968) (20)، ژن (Cry1Ac (Pesticidal crystal protein)) (No.P05068)، ژن  CSPB(Cold shock protein)ا(uniprot No.P32081)، ژن Rpi-vnt1.2  با شماره (uniprot No.B7U1D8) و توالی ژن PRP(Pathegenesis- related protein) (No. X14065) (13) از سایتNCBI  و  Uniprot دانلود شد (11). ژن GH-1 فاکتورهورمون رشد است که از ماهی AquAdvantage Salmon گرفته شده است، کیتیناز ژنی است که باعث مقاومت به بیماری های قارچی می شود و منشاء گیاهی دارد و cry1AC ژنی است که منشاء باکتری دارد و باعث مقاومت به آفت می شود. ژن CSPB منشاء باکتریایی داشته و باعث تحمل به خشکی می شود. ژن Rpi-vnt باعث  مقاومت به بیماری بلایت سیب زمینی می شود که از سیب زمینی وحشی گرفته شده است.

پایگاه­های اطلاعاتی آلرژن: بررسی شباهت توالی­ها، با مقایسه توالی­های پروتئینی با توالی­های موجود در پایگاه‌ اطلاعاتی آلرژن انجام گرفت. در مطالعه حاضر از سه پایگاه اطلاعاتی مهم و مورد تایید سازمان های جهانی کدکس و WHO به نام‌­های Allermatch، Allergenonline و پایگاه ‌داده ساختاری پروتئین‌­های آلرژنیک (SDAP) برای ارزیابی حساسیت­زایی استفاده شدند.

جستجوی پایگاه توالی برای همردیفی آمینواسیدها با توالی کامل: توالی­های موردنظر به فرمت FASTA با توالی­های موجود در پایگاه اطلاعاتی آلرژن با پروتئین های آلرژن  مقایسه شدند و بدنبال آن همردیف­سازی بین توالی­ها بر اساس دو الگوریتم همردیفی کامل  و 80 تایی صورت گرفت. در همردیفی توالی کامل ، پروتئین های با  50 درصد شباهت و بیشتر از آن با پروتئین های آلرژن موجود در پایگاه اطلاعاتی،  و E-Value  کمتر از 10-8  آلرژن محسوب می شوند (2،1)، در غیر اینصورت آلرژن شناخته نمی شوند (25).

در الگوریتم اسید آمینه 80 تایی معیار همردیفی با آلرژن‌های شناخته شده مبتنی بر میزان 35 درصد شباهت با استفاده از پنجره کشویی (sliding window) 80 اسیدآمینه و E-Value  کمتر از 10-8  است که این میزان باآلرژن شناخته شده استاندارد FAO/WHO نیز مطابقت  دارد. در این روش بجای اینکه کل توالی با آلرژن های موجود مقایسه شود  80 تا اسید آمینه از توالی مورد نظر، مورد مقایسه قرار می گیرد. در این روش پروتئین مورد نظر بصورت هم پوشان به قطعات 80 تایی تقسیم می شود. هر قطعه 80 آمینواسیدی با توالی­های موجود در پایگاه داده بررسی می شود. ارزیابی حساسیت­زایی پروتئین­های  مورد نظر براساس مقررات سازمان­های بین المللی نظیر FAO و WHO بصورت شباهت بالای 35 درصد و E-value کمتر از 10-8   می باشد.

پایگاه اطلاعاتیAllergenonline : پایگاه اطلاعاتی (http://www.allergenonline.org/) Allergenonline به سادگی امکان دسترسی به فهرست پروتئین­های آلرژن را فراهم نموده است. این پایگاه اطلاعاتی امکان شناسایی پروتئین­هایی که پتانسیل حساسیت­زایی دارند را فراهم می‌آورد و میزان آن را تعیین می‌نماید. این وب سایت برای ارزیابی ایمنی پروتئین­های جدیدی که به وسیله مهندسی­ژنتیک تولید شده اند، طراحی شده است. Allergenonline یکی از بهترین پایگاه­های اطلاعاتی برای ارزیابی بیوانفورماتیکی حساسیت­زایی پروتئین­ها می‌باشد (7).

پایگاه اطلاعاتی Allermatch: پایگاه اطلاعاتی (http://allermatch.org) Allermatch مطابق با توصیه­های کنونی کنوانسیون FAO/WHO برای پیش­بینی کارآمد و استاندارد حساسیت­زایی احتمالی پروتئین­ها است. Allermatch از ابزارهای مورد استفاده تحت وب می­باشد که برای شناسایی قطعات 80 آمینواسیدی با تشابه بیشتر از 35 درصد بکار می رود (4).

پایگاه اطلاعاتی SDAP : یکی از پرکاربردترین و معروف­ترین پایگاه­های اطلاعاتی مولکولی برای بررسی آلرژی زایی است https://fermi.utmb.edu/SDAP/sdap_fas.html)). این ابزار، اطلاعاتی را در زمینه وضعیت مولکولی و ساختاری، بویژه ساختار سه بعدی آلرژن­ها در  اختیار کاربر قرار می­دهد. همچنین در این وب سرور امکان مقایسه و تجزیه و تحلیل توالی­های پروتئینی نوترکیب نیز وجود دارد. SDAP داده‌های مربوط به سایر پایگاه‌های اطلاعاتی و ابزارهای محاسباتی متعدد را برای مطالعه آلرژن­ها گردآوری کرده است.

 

نتایج

در مطالعه حاضر، پتانسیل حساسیت­زایی شش توالی پروتئین بیان شده در محصولات تراریخته با استفاده از روش‌­های بیوانفورماتیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. جزئیات اطلاعات در مورد منابع، میزبان‌­ها، عملکرد تراژن­های مورد مطالعه در جدول ۱ آورده شده ‌است.

 

جدول 1- خلاصه  بررسی پتانسیل حساسیت­زایی ژن های مورد نظر

Table1. Summary of   evaluation of   allergenicity potential of target transgene.

ردیف

تراژن

منبع

میزبان

عملکرد و کاربرد

حساسیت­زایی

منابع

1

هورمون رشد (GH-1)

 Oncorhynchus tshawytscha

ماهی سالمون آتلانتیک

تنظیم کننده فرایندهای متابولیکی و رشدی در بافتهای مختلف مهره داران

-

)8(

2

کیتیناز

Phaseolus vulgaris

پنبه

درگیر در مقاومت به حمله قارچ و آفت

+

)21(

3

Cry1Ac

Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki strain HD73

نیشکر

مقاومت در برابر حشرات لیپدوپترا با انتخاب مصنوعی پوشش میانی خود را تنظیم می کند

-

)6(

4

CspB

Bacillus subtilis

ذرت

نگهداری حفظ عملکرد سلولی طبیعی تحت شرایط تنش آب با حفظ ثبات RNA  و ترجمه

-

)24(

5

Rpi-vnt1.2

Solanum venturii

سیب زمینی

مقاومت به بیماری بلایت دیرهنگام

-

)5(

6

PRP

Nicotiana tabacum

پنبه

مقاومت گیاه به پاتوژنها

+

)13(

 

 

ژن GH-1:  نتایج آنالیز آلرژی زایی ژن هورمون رشد نشان داد که بر اساس پایگاه اطلاعاتی Allergenonline هیچ شباهتی با توالی­های آلرژن­های شناخته شده مشاهده نشد(جدول1). ارزیابی همردیفی توالی کامل در دو پایگاه آلرژن SDAP و Allermatch نشان داد که  شباهت توالی مذکور با پروتئین­های آلرژن Tri a 14 و Rice c 3 a به ترتیب 2/7 و 8/36 درصد بود. در نتیجه  توالی GH-1  به دلیل شباهت پایین با توالی­های Tria 14, Rice 3 a  طبق استاندارد  FAO/WHO نمی تواند آلرژن محسوب شود (جدول 2).

 

جدول 2- تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی ژن GH-1 با استفاده از همردیفی توالی کامل و بررسی توالی 80 آمینواسیدی

Table 2. Bioinformatics analysis of GH-1 gene using full length alignment and 80 aa sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

% شباهت

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

SDAP

 

 

Tri a 14

Triticum aestivum

7.2

 

Allergenonline

هیچ شباهتی مشاهده نشد

هیچ شباهتی بزرگتر از 35 درصد مشاهده نشد

Allermatch

 

 

Ric c 3

Ricinus communis

36.8

 

 

 

ژن کیتیناز: بررسی همردیفی توالی کامل پروتئین کیتیناز با توالی­های آلرژن نشان داد که این پروتئین با پروتئین آلرژن   Pers a 1 در حدود 68/67 درصد شباهت دارد و می­توان نتیجه گرفت که احتمالا این پروتئین آلرژن است و با پروتئین آلرژن  اندوکیتیناز 74 درصد و با توالی Hev b در حدود 4/73 درصد، بالاترین شباهت در سه پایگاه آلرژن نشان داد (جدول 3). همچنین در بررسی سطح توالی 80 آمینواسیدی درتوالی ورودی، شباهت بالای 35 درصد با آلرژنهای Pers a 1 و اندوکیتیناز مشاهده شد. (جدول 3). بنابراین طبق استاندارد FAO/WHO می­توان کیتیناز را آلرژن در نظر گرفت .

 

جدول3- تجزیه و نحلیل بیوانفورماتیکی ژن کیتیناز با استفاده از همردیفی کامل و بررسی توالی 80 آمینواسیدی.

Table 3. Bioinformatics analysis of chitinase gene using full length FASTA alignment and 80 aa sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

% شباهت

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

SDAP

 

 

Pers a 1 (Persea Americana)

67.68

76.25

Hev b 11 .0101 ) Hevea brasiliensis)

65.55

73.75

Mus a 2 (Musa acuminate)

67.38

80

Hev b 11 .0102 (Hevea brasiliensis)

64.94

75

Allergenonline  

 

Endochitinase  (Persea Americana) 74

81.3

Putative class I chitinase (Heavea brasiliensis) 73.4

84

Putative chitinase  (Musa acuminate) 72

81.3

Class I chitinase (Heavea brasiliensis subsp.brasilien) 73

82.5

Allermatch

 

 

Hev b 11 .0101 (Hevea brasiliensis)

73.4

83.8

Pers a (Persea Americana)

74.7

82.5

Mus a (Musa acuminate)

71.9

81.27

Hev b11 .0102 (Hevea brasiliensis)

72.7

81.20

 

 

ژن Cry1Ac: پروتئینCry1Ac   با پروتئین های آلرژن   Tri a gliadin از گیاه  Triticum aestivum و توالی  Anac 2از گیاه Ananas comosu شباهتی درحدود 2-3 درصد  نشان داد. بررسی شباهت در سطح توالی 80 آمینواسیدی در پایگاه Allergenonline نشان داد که هیچ بخشی از توالی پروتئینی Cry1Ac با توالی­های آلرژن شناسایی شده در سایر پایگاه­های آلرژن شباهتی نداشت، در نتیجه نمی­توان که این پروتئین را آلرژن در نظر گرفت.

 

جدول4- تجزیه و نحلیل بیوانفورماتیکی ژن Cry1Ac با استفاده از همردیفی توالی کامل و بررسی با استفاده از توالی 80 آمینواسیدی

Table 4. Bioinformatics analysis of Cry1Ac gene using full length FASTA alignment and 80 aa sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

% شباهت

SDAP

 

 

Tri a gliadin (Triticum aestivum)

3.60

26.25

Ana c 2 (Ananas comosus)

3.60

23.75

Phl p 5  (Phleum pretense)

2.60

12.5

Chi t 6 (Chironomus thummi thummi)

3.50

28.75

Allergenonline

هیچ شباهتی مشاهده نشد

هیچ شباهتی بزرگتر از 35 درصد مشاهده نشد

Allermatch

 

 

Cor a 1.0102  (Corylus avellana)

27.6

 

Cor a 1.0101 (Corylus avellana)

28.6

 

 

 

ژن CspB: شباهت توالی پروتئین CspB با استفاده از همردیفی توالی کامل  در سه پایگاه آلرژن، با پروتئین های آلرژن   Que a 1.010از گیاه  Quercus albaو Orys1 از گیاه  Oryza sativaو نیز با توالی  Vig r 1 از گیاه    Vigna radiate پایین بود. به دلیل اینکه توالی پروتئین CspB از طول کمتر از 80 آمینواسید  برخوردار بود. بنابراین، تجزیه و تحلیل در سطح توالی 80 آمینواسیدی امکان پذیر نیود (جدول5).

 

جدول 5- تجزیه و نحلیل بیوانفورماتیکی ژن CspB با استفاده از همردیفی کامل توالی و بررسی با استفاده از توالی 80 آمینواسیدی

Table 5. Bioinformatics analysis of CspB gene using full length FASTA alignment and 80 aa sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

% شباهت

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

SDAP

 

 

 Que a 1.0101

Quercus alba

14.93

 

Ory s 1 (Oryza sativa)

25.37

 

 Asp o 13 (Aspergillus oryzae)

28.36

 

Mer a 1 (Mercurialis annua)

19.40

 

Allergenonline

هیچ شباهتی مشاهده نشد

هیچ شباهتی بزرگتر از 35 درصد مشاهده نشد

Allermatch

 

 

Que a 1 (Quercus alba) 66.7

 

Vig r1  (Vigna radiate)

66.7

 

 

 

 

ژن Rpi-vnt1.2: در پایگاه اطلاعاتی Allermatch ، بیشترین شباهت در همردیفی توالی کامل این پروتئین با پروتئین آلرژن Hev b از گیاه Hevea brasiliensis در حدود 38.1 درصد و با پروتئین آلرژن Art v 1 از گیاه Artemisia vulgaris 33.3 درصد ارزیابی شد. در در پایگاه اطلاعاتی SDAP این ژن با الگوریتم 80 آمینواسیدی با پروتئین  آلرژن Tyr p 24  از گیاه Tyrophagus putrescentiae  و پروتئین Alt a 10 از گیاه Alternaria alternate بترتیب شباهت 5/27 و  5/22 درصدی را نشان داده (جدول 6).

 

جدول 6- تجزیه و نحلیل بیوانفورماتیکی ژن Rpi-vnt1.2 با استفاده از همردیفی توالی کامل و توالی 80 آمینواسیدی

Table 6. Bioinformatics analysis of Rpi-vnt1.2 gene using full FASTA alignment and 80 amino acid sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

%شباهت

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

SDAP

 

 

Tyr p 24 (Tyrophagus putrescentiae)

3.65

27.5

Fra a 3 (Fragaria ananassa)

1.77

16.25

Alt a 10 (Alternaria alternate)

5.19

22.5

Mala s 6  (Malassezia sympodialis)

2.21

 

Allergenonline

هیچ شباهتی مشاهده نشد

هیچ شباهتی بزرگتر از 35 درصد مشاهده نشد

Allermatch

 

 

Myr p (Myrmecia pilosula)

27.3

 

Hev b (Hevea brasiliensis)

38.1

 

Art v 1 (Artemisia vulgaris)

33.3

 

 

 

پروتئین Rpi-vnt1.2 در پایگاه اطلاعاتی آلرژن Allergenonline با الگوریتم 80 آمینواسیدی هیچ شباهتی با توالی­های آلرژن موجود در این پایگاه  نشان نداد.

ژن PRP : با استفاده از بانک های اطلاعاتی آلرژن  SDAP ،  Allergenonline  و Allermatch ، نتایج  الگوریتم همردیفی توالی کامل پروتئین PRP با آلرژن Cynodon dactylon (Cyn d 24.01) بترتیب  شباهتی در حدود 33.33 ، 61.3 و 47.3 نشان داد (جدول 6). آنالیز الگوریتم 80 آمینواسیدی ، شباهت توالی پروتئین PRP با توالی Cyn d 24.01 از گیاه Cynodon dactylon 35 را درصد نشان داد (جدول 7).

 

جدول7- تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی ژن PRP با استفاده از همردیفی کامل و توالی 80 آمینواسیدی

Table 7.  Bioinformatics analysis of PRP gene using full FASTA alignment and 80 amino acid sliding window search.

پایگاه های آلرژن

همردیفی توالی کامل

% شباهت

همردیفی توالی ۸۰ اسیدآمینه ای

شباهت %

SDAP

 

 

Cyn d 24.01  (Cynodon dactylon)

33.33

45.0

Vesp c 5 (Vespa crabo)

25.42

 

Pol d 5 (Polistes dominulus)

25.42

 

Allergenonline

 

 

pathogen-related protein1 [inodoru]

61.3

66.7

art v2 allergen (Artemisia Vulgaris)

45.8

54.3

allergen 5 protein (Vespa maginifa)

35.8

39.5

Venom allergen 5 (Ag5-1)

34.9

39.5

Allermatch

 

 

Cyn d 24.01 (Cynodon dactylon)

43.7

47.0

Vesp c 5 (Vespa crabo)

34.9

38.5

Vesp m (Vespa mandarina)

34.4

39.5

Vesp c (Vespa crabo)

34.1

37.3

 

 

بحث و نتیجه گیری

یکی از اهداف مهندسی ژنتیک تولید پروتئین­های جدید در قالب موجودات ترایخته می‌باشد که اصلاح سنتی نمی‌تواند این نوع پروتئین­ها را تولید نماید. مهم‌ترین مسئله در استفاده از محصولات تراریخته، تضمین ایمنی زیستی و عدم حساسیت زایی آنها است (3). برای بررسی حساسیت­زایی توالی­های پروتئینی بیان شده در محصولات تراریخته قبل از هر چیز، استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی حائز اهمیت است . برای بررسی شباهت بین توالی­های ورودی و توالی­های شناخته‌ شده آلرژن،  از دستورالعمل­های FAO / WHO (2) وCodex  (1) استفاده می­شود که مور تایید مجامع بین المللی است. تشابه توالی آمینواسیدی اولین قدم برای ارزیابی حساسیت­زایی بوده که اطلاعات اولیه را درمورد توالی مورد نظر به ما می­دهد (19).  نتایج این مطالعه نشان داد که  پروتئین GH-1  شباهت پایینی با آلرژن های Tria 14, Rice 3 a دارد که حاکی از آلرژن نبودن این پروتئین است (جدول 2). ژن کیتیناز با آلرژن Hev b 11.0101 و Hev b 11.0102 که دو ایزوفرم متعلق به خانواده پروتئینی پاتوژنسیس مرتبط با پروتئین 3 PRP- و کلاس I کیتیناز خانواده GH19 هستند شباهت بالایی نشان داد (14). در مطالعه­ایی بر روی آلرژی زایی کیتیناز لوبیا،  مشخص شد که این ژن به عنوان آلرژن محسوب می شود که با نتایج ما مطابقت داشت (27). این ژن، در گیاهانی مثل گندم، جو و برنج بطور طبیعی موجود بوده و از گذشته مورد استفاده انسانی قرار داشته است ولذا نمی تواند به عنوان یک نگرانی محسوب شود (15).

همچنین آنالیز آلرژی زایی پروتئین Cry1Ac نشان داد که این پروتئین از پتانسیل حساسیت زایی برخوردار نمی­باشد. این پروتئین از باکتری باسیلوس تورنجینسیس گرفته شده­است که یکی از شرایط آلرژی ژایی بودن پروتئین، آلرژی زا بودن منشاء ژن است. نظر به اینکه باکتری باسیلوس غیر آلرژی زاست نهایتا نمی تواند ژن برگرفته از آن آلرژی زا باشد که این نتایج با نتایج Gao و همکاران مطابقت دارد(6). در گزارشی نیز اشاره شد که آنالیز بیوانفورماتیکی این پروتئین در ذرت تراریخته حاوی Cry1Ac پتانسیل حساسیت­زایی ندارد (5). براساس مطالعه­ایی که توسط سایر محققان انجام شده است پروتئین Cry Cry1Ac)) که در محصولات تراریخته تولید می­شود هیچ شباهتی با توالی­های آلرژن ندارد، در نتیجه پتانسیل حساسیت­زایی در این محصول ایجاد نخواهد کرد (5،23).

در این مطالعه بررسی پروتئین CspB با استفاده از الگوریتم همردیفی توالی کامل، نشان داد که شباهت معنی­داری بر اساس پروتکلWHO FAO/ با آلرژن های شناخته شده ندارد. همچنین طبق مطالعات  پیشین، هیچ گونه همردیفی بین CspB با سایر پروتئین‌های موجود در پایگاه داده آلرژن مشاهده نشد (13). بررسی پروتئین Rpi-vnt1.2 در پایگاه اطلاعاتی آلرژن Allergenonline بر اساس الگوریتم توالی کامل و مقایسه­ایی 80 آمینواسیدی،  نشان داد که هیچ شباهتی با توالی­های آلرژن موجود در این پایگاه ندارد.

نتایج این مطالعه نشان داد که توالی­های پروتئین ( Cry1Acو CspB وRpi-vnt1) ، که سطح زیادی از محصولات تراریخته در دنیا را بخود اختصاص داده ااند، شباهتی با توالی­های آلرژنهای شناسایی شده ندارند. لازم به یادآوری است که  اینگونه گیاهان تراریخته، بعد از ارزیابی ایمنی و طی کردن کلیه مراحل انالیزها از جمله ارزیابی آلرژی زایی توانستند مجور تجاری شدن را دریافت کنند و به مصرف انسان برسند. بطورکلی،  پایگاه­های آلرژن نقش کلیدی در بررسی آلرژی زایی محصولات تراریخته بر اساس پروتکلWHO FAO/ دارند (9).

 مطالعات نشان داده است که با استفاده از مهندسی ژنتیک می­توان ژن‌های تولید کننده پروتئین­های آلرژن را با استفاده از خاموشی ژن نیز حذف نمود. به عنوان مثال با مهار ژن آنزیم 5-متیل سیتوزین  DNA گلوکوزیلاز در گندم، می­توان گندم تراریخته را با کاهش 4/76 درصد گلوتن در بذر بدست آورد (25). بررسی شباهت توالی پروتئین جدید با آلرژن‌­های شناخته شده یکی از مهمترین مراحل در فرایند ارزیابی ایمنی زیستی می­باشد. در خصوص پروتئین­های جدید که شباهت بالایی در توالی یا ساختار کنفورماسیون با پروتئین­های آلرژن دارند،  لازم است بررسی ­های بیشتری اعم از in vivo و in vitro صورت گیرد. بررسی حساسیت­زایی پروتئین­های جدید در محصولات تراریخته برای محققان اهمیت زیادی دارد. پروتئین­های جدید ممکن است شباهت زیادی با هر آلرژن شناخته شده داشته باشند که در اینصورت ممکن است از نظر ایمونولوژیکی در بدن احتمال واکنش حساسیت­زایی را به­شدت بالا ببرند، اگرچه تا بحال چنین موردی مشاهده نشده است ولی ارزیابی آلرژی زایی بروش علمی، قبل از تجاری شدن محصولات تراریخته ضروری است. در این مطالعه، ژن­های cry1Ac ، CspB و هورمون رشد GH-1 هیچ شباهتی به الرژن ها نداشتند. برعکس، پروتئین­های کیتیناز و PRP شباهت بالایی را با آلرژن نشان دادند. گفتنی است که این ژن‌ها بطور طبیعی در گیاهان وجود داشته و لذا نمی­تواند به عنوان نگرانی محسوب شوند، چراکه در طول تاریخ مصرف آن باعث شده تا سیستم ایمنی بدن آنرا به عنوان آنتی ژن در نظر نگیرد. در انتها لازم به یادآوری است در صورت جدید بودن پروتئین، لازم است ارزیابی­‏های آزمایشگاهی تکمیلی نیز صورت گیرد.

  • Codex Alimentarius Commission. (2003). "Alinorm 03/34: Joint FAO/WHO Food Standard Programme, Codex Alimentarius Commission, Appendix III, Guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-DNA plants" Appendix IV, Annex on the assessment of possible allergenicity,25th Session, 30 June–5 July, Rome, Italy. pp 47–60.
  • (2009). "Indigenous people; food systems: the many dimension of culture diversity and environment for nutrition and health". Rome, FAO, and Ste. Anne de Bellevue, Canada, Centre for Indigenous Peoples’ Nutrition and Environment
  • Fard, N.A., Minuchehr, Z. and Mousawi, A. (2013). "Allergenicity study of genetically modified herbicide resistant crops (Bioinformatics Assessment)."  Env. Pharmacol. Life Sci2.3: 24-32
  • Fiers, M. W., Kleter, G. A., Nijland, H., Peijnenburg, A. A., Nap, J. P., & Van Ham, R. C. (2004). Allermatch™, a webtool for the prediction of potential allergenicity according to current FAO/WHO Codex alimentarius guidelines. BMC bioinformatics5(1), 133.
  • Foster, S.J., Park, T.H., Pel, M., Brigneti, G., Śliwka, J., Jagger, L., van der Vossen, E. and Jones, J.D. (2009). "Rpi-vnt1. 1, a Tm-22 homolog from Solanum venturii, confers resistance to potato late blight." Molecular plant-microbe interactions5: 589-600
  • Gao, S., Yang, Y., Wang, C., Guo, J., Zhou, D., Wu, Q., Su, Y., Xu, L. and Que, Y. (2016). "Transgenic sugarcane with a cry1Ac gene exhibited better phenotypic traits and enhanced resistance against sugarcane borer." PLoS One4: e0153929
  • Goodman, R. E., Ebisawa, M., Ferreira, F., Sampson, H. A., van Ree, R., Vieths, S., ... & Taylor, S. L. (2016). AllergenOnline: a peer‐reviewed, curated allergen database to assess novel food proteins for potential cross‐Molecular nutrition & food research60(5), 1183-1198.
  • Hevrøy, E.M., Tipsmark, C.K., Remø, S.C., Hansen, T., Fukuda, M., Torgersen, T., Vikeså, V., Olsvik, P.A., Waagbø, R. and Shimizu, M. (2015). "Role of the GH-IGF-1 system in Atlantic salmon and rainbow trout postsmolts at elevated water temperature." Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology188: 127-138.
  • Hileman, R.E., Silvanovich, A., Goodman, R.E., Rice, E.A., Holleschak, G., Astwood, J.D. and Hefle, S.L. (2002). "Bioinformatic methods for allergenicity assessment using a comprehensive allergen database." International archives of allergy and immunology4: 280-291
  • Ladics, G.S., Bannon, G.A., Silvanovich, A. and Cressman, R.F. (2007)."Comparison of conventional FASTA identity searches with the 80 amino acid sliding window FASTA search for the elucidation of potential identities to known allergens." Molecular nutrition & food research8: 985-998.
  • Mehdizadeh, V., Nassaghusseini, S. M., Safaei, N., Saidi, A. (2013). "NCBI: A Comprehensive Guide.  Agricultural Education and Extension Publication". 186 pages.  Tehran, Iran.
  • Rahman, M., Shaheen, T., Irem, S. and Zafar, Y. 2015. Biosafety risk of genetically modified crops containing CRY genes, Environmental Chemistry for a Sustainable World, 5, 307-334.
  • Raufi, A., Tohidfar, M., Soluki, M., Mohsenpour, M.(2012). "Isolation and Cloning of Two Genes from PR1 Family and Construction of Treble Plasmids Containing 3 Groups of Genes for Producing Transformed Plants Resistant to Fungal Diseases". Journal of Agricutural Biotechnology.2.27-46.
  • O'riordain, G., Radauer, C., Hoffmann‐Sommergruber, K., Adhami, F., Peterbauer, C.K., Blanco, C., Godnic‐Cvar, J., Scheiner, O., Ebner, C. and Breiteneder, H. (2002). "Cloning and molecular characterization of the Hevea brasiliensis allergen Hev b 11, a class I chitinase." Clinical & Experimental Allergy3: 455-462
  • Sánchez-Monge, R., Blanco, C., Perales, A. D., Collada, C., Carrillo, T., Aragoncillo, C., & Salcedo, G. (2000). Class I chitinases, the panallergens responsible for the latex-fruit syndrome, are induced by ethylene treatment and inactivated by heating. Journal of Allergy and Clinical Immunology106(1), 190-195.
  • Sexton, A. C., & Howlett, B. J. (2006). Parallels in fungal pathogenesis on plant and animal hosts. Eukaryotic Cell5(12), 1941-1949.
  • Mishra, A., Gaur, S. N., Singh, B. P., & Arora, N. (2012). In silico assessment of the potential allergenicity of transgenes used for the development of GM food crops. Food and chemical toxicology50(5), 1334-1339.
  • Silvanovich, A., Nemeth, M.A., Song, P., Herman, R., Tagliani, L. and Bannon, G.A. (2005). "The value of short amino acid sequence matches for prediction of protein allergenicity." Toxicological Sciences1: 252-258.
  • Singh, A.K., Singh, B.P., Prasad, G.B.K.S., Gaur, S.N. and Arora, N. (2008). "Safety assessment of bacterial choline oxidase protein introduced in transgenic crops for tolerance against abiotic stress." Journal of agricultural and food chemistry24: 12099-12104
  • Thompson, B.J., Shang, C.A. and Waters, M.J. (2000). "Identification of genes induced by growth hormone in rat liver using cDNA arrays." Endocrinology11: 4321-4324.
  • Tohidfar, M., Hossaini, R., Bashir, N.S. and Meisam, T.(2012). "Enhanced resistance to Verticillium dahliae in transgenic cotton expressing an endochitinase gene from Phaseolus vulgaris." Czech Journal of Genetics and Plant Breeding1: 33-41..
  • Van Montagu, Marc. (2011). "It is a long way to GM agriculture." Annual review of plant biology62: 1-23.
  • Verma, A.K., Misra, A., Subash, S., Das, M. and Dwivedi, P.D. (2011) "Computational allergenicity prediction of transgenic proteins expressed in genetically modified crops." Immunopharmacology and immunotoxicology3: 410-422.
  • Wang, C., Burzio, L.A., Koch, M.S., Silvanovich, A. and Bell, E. (2015) "Purification, characterization and safety assessment of the introduced cold shock protein B in DroughtGard™ maize." Regulatory Toxicology and Pharmacology2: 164-173.
  • Wen, S., Wen, N., Pang, J., Langen, G., Brew-Appiah, R.A., Mejias, J.H., Osorio, C., Yang, M., Gemini, R., Moehs, C.P. and Zemetra, R.S. (2012) "Structural genes of wheat and barley 5-methylcytosine DNA glycosylases and their potential applications for human health." Proceedings of the National Academy of Sciences50: 20543-20548.
  • 2011. Global Environmental Monitoring System, Food Contamination Monitoring and Assessment Programme (GEMS/Food). http://www.who.int/ foodsafety/chem/gems/en/.
  • Zou, Z., He, Y., Ruan, L., Sun, B., Chen, H., Chen, D., ... & Tao, A. (2012). A bioinformatic evaluation of potential allergenicity of 85 candidate genes in transgenic organisms. Chinese science bulletin57(15), 1824-1832.
Volume 34, Issue 4
December 2021
Pages 944-954
  • Receive Date: 09 April 2019
  • Revise Date: 26 July 2020
  • Accept Date: 28 September 2020