Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Assessment of hormonal effects on test tube micropropagation of Saintpaulia 'Pretty Miss Kelly' using micro leaf segments

Document Type : Research Paper

Authors

University of Guilan, Rasht, I.R. of Iran

Abstract

African violet as one of the important economic ornamental plants could be propagated through tissue culture technique in a short time and limited space. The effect of different growth regulators on shoot production, leave number, root number and rooting time was measured. 'Pretty Miss Kelly' young leaves were collected, and after disinfection, were divided into pieces with dimensions of 1cm*1cm. Therefore, effect of different combination of NAA, BAP, and IAA on shoot regeneration from leaf segments was monitored. Moreover, the effects of various combinations of BAP and AdS has been evaluated on the number of leaves. Subsequently, different root induction mediums including ½ MS with 0.005 mg/l NAA, MS without growth regulators and sterile sand were investigated. The obtained data was analysed by factorial experiment in a completely randomized design with 4 replications. The results showed that 0 mg/l NAA or 0.1 mg/l NAA in combination with 0.1 mg/l BAP and also 0 mg/l IAA in combination with with 0.1 mg/l of BAP are most suitable for shoot production. The best level of AbS and BAP regarding leaf number was inturn 15 mg/l and 0.2 mg/l. A better performance for root induction happened in sterile sand with an average of 25 roots per plantlet. In the case the root induction time, ½ MS with with 0.005 mg/l NAA with an average of 10 days was the best. Therefore, the most appropriate nutrient mediums in various stages for In vitro micrpropagation of African violet from leaf segments was identified.

Keywords

Main Subjects

بررسی تأثیر تنظیم­کننده­های رشد بر ریزازدیادی درون­شیشه­ای بنفشه آفریقایی

'Pretty Miss Kelly')(Saintpaulia از ریزقطعات برگ

رضا شیرزادیان­خرم­آباد* و فرشته تقی­پور­جیردهی

ایران، رشت، دانشگاه گیلان، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 2/2/95                  تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

استفاده از فناوری کشت بافت میتواند از جمله مطلوبترین روشهای تکثیر سریع گیاهان زینتی در زمانی کوتاه و فضایی محدود محسوب می شود. این پروژه بمنظور دستیابی به مناسبترین محیط غذایی جهت تکثیرانبوه گیاه زینتی بنفشه آفریقایی از ریزقطعات برگ در شرایط درون­شیشه­ای انجام شد. اثر تنظیم­کننده­های مختلف بر میزان تولید شاخساره، تعداد برگ، تعداد ریشه و مدت زمان ریشه­زایی بررسی شد. لذا برگهای جوان از پایه مادری رقم 'Pretty Miss Kelly' جدا و پس از ضدعفونی به ریزقطعات با اندازه یک سانتی­مترمربع تقسیم شدند. اثر تنظیم­کننده­های رشدی شامل BAP بهمراه NAA یا IAA بصورت ترکیبی و در سطوح مختلف بر تولید شاخساره، اثر BAP و AdS بر تعداد برگ ، اثر محیط­های مختلف ریشه­­زایی مورد بررسی قرار گرفت. جهت آنالیز داده­ها از آزمایش فاکتوریل بر مبنای طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. نتایج این بررسی نشان داد که mg/l NAA 0.1 یا mg/l NAA 0 بهمراه mg/l0.1 از BAP و همچنین  mg/l IAA0 بهمراه BAP mg/l0.1 مناسبترین ترکیب­ برای تولید شاخساره هستند. افزایش تعداد برگ بترتیب با استفاده از AdS  mg/l 15 و BAP mg/l 0.2 رخ داد. میانگین تولید ریشه هر گیاهچه  در ماسه استریل نسبت به دو محیط دیگر مناسبتر بود. در زمینه زمان ریشه­دهی محیط MS 2/1  بهمراه 0.005 میلی­گرم در لیتر NAA با میانگین 10 روز مناسبترین محیط بود. بنابراین در این مطالعه مناسبترین محیط­های غذایی در مراحل مختلف جهت تکثیر انبوه بنفشه آفریقایی معرفی شد.

واژه­های کلیدی: بنفشه آفریقایی، تکثیر انبوه، هورمونها، In vitro

* نویسنده مسئول، تلفن: 09117061208، پست الکترونیکی: R.shirzadian@guilan.ac.ir

مقدمه

 

بنفشه آفریقایی در سال 1892 در شرق آفریقا توسط Baron Walter von Saint Paul شناسایی گردید. جنس بنفشه آفریقایی (Saintpaulia spp.) نیز به افتخار او نامگذاری شده است (11). بنفشه آفریقایی از تیره Gesneriaceae بوده و دارای 20 گونه است (10). برگهای گیاه کرکین و تا حدی آبدار بوده و بر روی یک ساقه فشرده و کوتاه قرار دارند. گلها به شکل ستاره با کناره­های شفاف، موج­دار، نازک و حاشیه­دار بر روی ساقه طویل شده­ای ایجاد می­شوند (10). ویژگیهایی از قبیل جاذبه بصری، سازگاری با فضاهای تحت سایه، توانایی گلدهی تحت نور مصنوعی، سهولت تکثیر رویشی قابل توجه و آسان در تمام طول سال باعث شده­اند که بنفشه آفریقایی یک گیاه آپارتمانی محبوب باشد (16)؛ بعلاوه این گیاه به دلیل بی­تفاوت بودن به طول روز در تمام طول سال گل­دهی دارد (6). بنفشه آفریقایی با استفاده از بذر و قلمه برگ بهمراه قسمت کوچکی از دمبرگ قابل تکثیر است (4). تعداد بسیار کمی از ارقام بنفشه آفریقایی از بذر بدست آمده اند(11)؛ با این وجود در روش تکثیر با بذر باید از ارقامی برای بذرگیری استفاده نمود که دارای کیفیت ثابتتری هستند و در نسلهای بعد کمتر دچار تغییر می­شوند (4). تکثیر رویشی بنفشه آفریقایی توسط قلمه برگ صورت می­گیرد (32). هرقطعه 5-3 گیاه جوان تولید می­کند که بطور معمول حدود 9 ماه پس از قلمه­زنی به گل می­روند (18). هنگامی که یک یا چند شاخه مجاز به رشد بر روی یک قطعه باشند، تراکم تحمیل شده توسط تعدد گیاهچه­ها در فضای رشدی محدود، موجب تولید گیاهان نامتقارن با دمبرگ کشیده و متمایل به یک سمت می­شود. برای غلبه بر این مشکل، از تکثیر در شرایط آزمایشگاهی استفاده می­شود که بموجب آن تعداد زیادی گیاه تک ساقه شکل می­گیرند (32). بعلاوه تکثیر بنفشه آفریقایی از طریق روش سنتی قلمه برگ بسیار وقت­گیر است و تعداد محدودی گیاه از طریق این روش تولید می­شود؛ در نتیجه، توسعه یک روش تکثیر سریع برای این گونه­های گیاهی، یک منفعت بزرگ اقتصادی در صنعت گیاهان زینتی خواهد بود. یکی از بهترین روشها برای تکثیر سریع گیاهان، تکنولوژی کشت بافت است که تکثیر سریع گیاه را در زمان کوتاه و فضای محدود ممکن می­سازد (14). یک مزیت مهم دیگر این است که گیاهان مشتق شده از کشت بافت نسبت به گیاهان تولید شده با روشهای معمولی از کیفیت بیشتر و سلامت بهتری برخوردار می­باشند (24). ریزازدیادی تا حد زیادی جهت تکثیر سریع ارقام جدید و یا تکثیر شیمرهایی که نمی­توان از طریق قلمه برگ آنها را حفظ نمود، مورد استفاده قرار می­گیرد (11). بعلاوه از این روش برای تکثیر در مقیاس بالا و آغاز تغییرپذیری ژنتیکی برای توسعه کولتیوار جدید استفاده می­شود(28). بنفشه آفریقایی یک گیاه زینتی مهم اقتصادی با گونه­هایی با رنگها و اشکال متنوع می­باشد (14). گیاهانی از این قبیل علاوه بر زیبایی بسیار زیاد گل­ها، بدلیل توانمندی تولید گل در طول سال مورد توجه تولیدکنندگان تجاری قرارگرفته­اند و ظرفیت بالایی در باززایی درون­شیشه­ای و درنتیجه پتانسیل زیادی در تولید انبوه دارد(31) به گونه ای که پرورش این گونه گیاهان در حوزه علوم باغبانی بصورت یک صنعت در آمده است (21). کشت درون­شیشه­ای بنفشه آفریقایی با موفقیت از چندین ریزنمونه مختلف از جمله: برگ (29)، جوانه گل (22)، بساک (33) و پروتوپلاست (17) انجام شده است و به خاطرداشتن خصوصیات ویژه، بعنوان یک گیاه مدل در شرایط درون شیشه­ای مورد توجه بسیاری از محققین قرارگرفته است(20)

 

شکل1- بنفشه آفریقایی رقم
 'Pretty Miss Kelly')(Saintpaulia

نتایج مطالعات Taha و همکاران نشان داد محیط MS بهمراه mg/L NAA 1 و mg/L BAP 2- 0.5 بهترین محیط برای باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ و دمبرگ بنفشه آفریقایی است(28). بر طبق مطالعات Ghasemi و همکاران بیشترین تعداد شاخه­های نابجا در محیط کشت حاوی BA mg/l 0.5همراه با IBA mg/l 0.5مشاهده شد (13). در مشاهدات امیری و همکاران بیشترین درصد شاخساره­زایی و پرآوری در محیط کشت MS (23) حاوی BA mg/l 2 بدست آمد (1). نتایج مطالعات Ghasemi و همکاران نشان داد: بهترین محیط ریشه­زایی برای بنفشه آفریقایی محیط MS حاوی مقدارmg/l NAA 1 است (13). عوامل مختلف از قبیل تنظیم­کننده­های رشد، نوع ریزنمونه، جهت­گیری ریزنمونه و شرایط رشد (نور و دما) بر میزان باززایی تأثیر می­گذارد (13). بهینه­سازی در شرایط In vitro برای ارگانوژنز و جنین­زایی سوماتیکی، هزینه­های مرتبط را کاهش داده و تولید تجاری بنفشه آفریقایی را بهبود می­بخشد (27). با وجود در دسترس بودن متون کافی، بسیاری از روشهای موفق بعلت جنبه­های تجاری منتشر نشده است (13).

این پروژه با تمرکز بر تغییر میزان تنظیم­کننده­های غذایی کم هزینه و در دسترس و بمنظور یافتن بهترین بستر غذایی جهت تکثیر انبوه بنفشه آفریقایی به بررسی باززایی شاخساره از ریز قطعات برگ، تقویت رشد شاخساره­ها و ریشه­زایی آنها در شرایط درون شیشه­ای (In vitro) جهت رسیدن به پروتکلی کارآمد و اقتصادی پرداخته است. ژنوتیپ مورد استفاده در این تحقیق رقم'Pretty Miss Kelly' بوده که با توجه به اندازه بوته، به گروه Standard تعلق داشته و بعلت داشتن برگهای سبز تیره و گلهای صورتی یکی از زیباترین واریته­های بنفشه آفریقایی محسوب می­شود.

مواد و روشها

جهت آماده­سازی گیاهان مادری رقم 'Pretty Miss Kelly'، ابتدا این گیاهان بمدت یک ماه در گلخانه نگهداری و مواظبتهای لازم از قبیل استفاده از کود مایع و تیمار با قارچ­کش (بنومیل) و حشره­کش (مالاتیون) بمنظور تهیه گیاهان مادری سالم انجام شد. سپس برگهای شاداب و با طراوت و عاری از بیماری، از پایه مادری جدا و با محلول تجارتی هیپوکلرید سدیم %1.5 بمدت 7 دقیقه ضدعفونی و سپس سه مرتبه توسط آب مقطر استریل شستشو گردیدند. قطعات برگ با رعایت شرایط استریل به ریز قطعاتی به اندازه یک سانتی­متر­مربع تقسیم و به محیط­های غذایی منتقل شدند. پتریهای محتوی ریزقطعات برگ بنفشه آفریقایی در دمایC 125 و شدت نور Lux4000 با شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در ژرمیناتور انکوبه شدند. در بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشدی بر میزان تولید شاخساره از هر ریزنمونه، فاکتورها شامل BAP (بنزیل آمینوپورین) به غلظتهای (0.5 و 0.1) میلی­گرم در لیتر بهمراه NAA (1-نفتالن استیک اسید) با غلظتهای (2 -1 -0.5 -0.1 -0)میلی­گرم در لیتر و یا IAA (ایندول3- استیک اسید) با غلظتهای (2 -1 -0.1 -0) میلی­گرم در لیتر بوده است. محیط کشت مورد استفاده محیط MS، حاوی %3 ساکارز،   % 0.8 آگار با 5.7pH= بود. شاخساره­های حاصل از این مرحله تفکیک شده و بمنظور بررسی تعداد برگ، به محیط­های غذایی MS بهمراه 0.1 میلی­گرم در لیتر NAA، آدنین سولفات (AdS) با مقادیر 15و30 میلی­گرم در لیتر و BAP با مقادیر 0.2 و 0.4 و 0.8 میلی­گرم در لیتر انتقال یافتند. پس از مرحله اخیر، جهت بررسی مدت زمان ریشه­زایی شاخساره­ها و تعداد ریشه­های حاصله، سه نوع محیط ریشه­زایی شامل: محیط MS با 2/1 غلظت مواد معدنی و 2% ساکارز بهمراه 0.005 میلی­گرم در لیتر NAA، محیط MS بدون تنظیم­کننده رشد و ماسه استریل مورد بررسی قرار گرفت. گیاهچه­های حاصل بمنظور سازگاری جهت رشد مطلوبتر به خاک پیت منتقل و بمدت 15 روز در شرایط رطوبتی بالا نگهداری شدند. آنگاه گیاهان حاصله به گلدان منتقل شده و در گلخانه نگهداری شدند. بمنظور آنالیز داده­های حاصله از بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشدی و محیط­های مختلف بر رشد ریزنمونه­ها، از آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در چهار تکرار استفاده گردید. تجزیه آماری داده­ها با استفاده از نرم­افزار آماری ((version 9.00 SAS انجام گرفته و نمودارها با استفاده از نرم افزار ((Microsoft Office 2013 رسم گردیدند.

نتایج

بررسی اثر NAA در ترکیب با BAP بر میزان تولید شاخساره: تجزیه واریانس داده­های حاصله از بررسی اثرNAA  بر میزان تولید شاخساره از هر ریزنمونه، معنی­دار شدن اثرNAA  را در سطح احتمال %1 بر تعداد شاخساره تولید شده از ریزقطعات برگ نشان داد. اما با توجه به جدول 1، بین سطوح مختلف BAP به تنهایی اختلاف معنی­داری دیده نشد. مقایسه میانگین بروش LSD در سطح احتمال %5 برتری دو سطح NAA شامل (mg/l0، mg/l0.1) در ترکیب با mg/l0.1 از BAP با میانگین 9 شاخساره به ازای هر ریزقطعه را نشان می­دهد.

جدول1- تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد NAA و BAP بر تعداد شاخساره حاصله از هر ریزقطعه برگ

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

تعداد گیاهچه

ns12.1

1

BAP

**55.41

4

NAA

** 42.03

4

BAP*NAA

3.28

30

خطا

 

39

کل

c.v. = 34.84

ns، *، ** بترتیب بمعنای: عدم معنی دار بودن، معنی دار در سطح احتمال 5%، معنی دار در سطح احتمال1%

در حالیکه در سطح mg/l0.5 از BAP بیشترین میزان تولید شاخساره به غلظتهایmg/l  0.5 و mg/l 1 از NAA با میانگین 7.5 شاخساره به ازای هر ریزقطعه تعلق داشت. لذا با حضور BAP میزان تأثیر NAA بر میزان تولید شاخساره از هر ریز نمونه به نحو قابل توجهی تغییر می­کند. این موضوع در بررسی اثر متقابل دو هورمون مشاهده می­شود. اثر متقابل حاصل از BAP, NAA نیز در سطح %1 معنی­دار شده است. این بدان معنی است که بین ترکیبات تیماری BAP و  NAAاز نظر عملکردی تفاوت قابل توجهی وجود دارد. با حضور و افزایش غلظت NAA، در سطح mg/l0.1 از BAP، از میزان تولید شاخساره کاسته می­شود. هرچند در سطح mg/l0.5 از BAP، این روند متفاوت است؛ در غلظتهای پایین NAA (mg/l0، mg/l0.1) افزایش BAP ازmg/l 0.1 به mg/l0.5 موجب کاهش تعداد شاخساره می­شود، اما در غلظتهای mg/l0.5، mg/l1 و mg/l2 از NAA، افزایش BAP موجب افزایش تعداد شاخساره شده و به تولید بیشتری منجر می­شود. جالب اینکه پایینترین تعداد شاخساره در 2 حالت فوق هم مربوط به بالاترین غلظت NAA یعنی mg/l2 می­باشد. بنابراین با توجه به شکل 2، ترکیب تیماری mg/l NAA 0.1 و mg/l NAA0 در ترکیب با mg/l0.1 از BAP مناسبترین محیط برای تکثیر شاخساره تعیین شد. مقایسه میانگین سطوح  NAAبروش  LSD(α=5%)نشان داد که حضور و افزایش میزان NAA موجب کاهش تولید شاخساره شده و استفاده از آن در تکثیر بنفشه آفریقایی چه از لحاظ عملکردی و چه از لحاظ اقتصادی مناسب نمی­باشد.

 

 

شکل2- مقایسه میانگین اثر ترکیبات تیماری  BAP, NAAبر تولید شاخساره از هر ریزقطعه برگ که بروش LSD انجام شده است. ستونهایی که حداقل یک حرف مشابه دارند، در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با هم ندارند.

 

بررسی اثرIAA  در ترکیب باBAP  بر میزان تولید شاخساره: تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از بررسی اثرIAA  بر میزان تولید شاخساره از هر ریزنمونه نشان داد کهBAP  به میزان 0.1 میلی­گرم در لیتر به تنهایی اثر معنی­داری بر میزان تولید شاخساره از ریز نمونه­های برگی با میانگین 11 دارد. استفاده از غلظتهای مختلف IAA در ترکیب با BAP mg/l0.1 موجب کاهش تولید شاخساره از ریز­نمونه­های برگی می­شود. به بیان دیگر اثر متقابل IAA و BAP وجود داشته و در سطح احتمال %1 معنادار است (جدول 2). بنابراین آنچه اهمیت دارد اثر متقابل این دو تنظیم­کننده­رشد و بررسی ترکیبات تیماری حاصل از آنهاست. با توجه به شکل 3، افزایش غلظت IAA در ترکیب با BAP  mg/l0.1 نقشی منفی و کاهنده بر تعداد شاخساره دارد؛ اما این افزایش غلظت در ترکیب با BAP  mg/l0.5 مثبت و مطلوب بوده و روند تولید شاخساره افزایشی است. همانطور که در شکل 3 ملاحظه می­شود مقایسه میانگین انجام شده بروش LSD(α=5%) نشان داد که چهار ترکیب تیماری بعنوان مناسبترین ترکیبات با سطح a مطرح هستند. بنابراین با در نظر گرفتن مسائل اقتصادی، استفاده از محیط کشت MS حاوی  mg/l IAA0، و BAP mg/l0.1 بعنوان مناسبترین تیمار هورمونی تعیین می­گردد. بدان معنی که محیط غذایی که در آن BAP بمیزان 0.1 میلی­گرم حضور دارد می­تواند بنحو مطلوبی میزان قابل توجهی از شاخساره­ها را در ریزبرگها القاء نماید (شکل 4). لازم بذکر است که با افزایش میزان BAP به 0.5 میلی­گرم در لیتر میزان القاء شاخساره در ریزنمونه­ها بنحو قابل توجهی کاهش می­یابد.

جدول2- تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از بررسی اثر تنظیم­کننده­های رشد IAA و BAP بر تعداد شاخساره حاصله از هر ریزقطعه برگ

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

تعداد شاخساره

ns10.12

1

BAP

ns6.7

3

IAA

** 59.87

3

BAP*IAA

5.20

24

خطا

 

31

کل

c.v. =    29.21

ns، *، ** بترتیب بمعنای: عدم معنی­دار بودن، معنی­دار در سطح احتمال 5%، معنی­دار در سطح احتمال1%

 

 

شکل3- مقایسه میانگین اثر ترکیبات تیماری  BAP, IAAبر تولید شاخساره از هر ریزقطعه برگ که بروش LSD انجام شده است. ستونهایی که حداقل یک حرف مشابه دارند، در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با هم ندارند.

 

ولی با حضور IAA در مقادیر استفاده شده در شکل 3، میزان القاء شاخساره در ریزنمونه­ها تقویت می­گردد. لذا بر اساس نتایج این آزمایش ضمن تائید نقش حضور میزان 0.1 میلی­گرم در لیتر BAP به تنهایی بر تولید شاخساره، بر نقش مثبت IAA در ترکیب با 0.5 میلی­گرم در لیتر BAP صحه می­گذارد. جالب اینکه برآیند تأثیر سطوح مختلف BAP معنی­دار نیست. در واقع اثر متقابل غلظتهای بالاتر IAA با میزان بیشتر BAP در این آزمایش نتیجه مطلوبتر  و

معنی­داری داشته است.

 

شکل 4- تشکیل برگچه و ظهور گره انشعاب بر روی بافت برگی بنفشه آفریقایی.

بررسی اثرBAP  در ترکیب با آدنین سولفات  (AdS)بر تعداد برگ: شاخساره­های حاصله در مرحله قبل تفکیک شده و بمنظور بررسی تعداد برگ القایی در هر شاخساره به محیط­های غذایی حاوی BAP و آدنین سولفات (AdS) منتقل و مورد ارزیابی قرار گرفتند. با توجه به تجزیه واریانس داده­های آزمایش فوق و همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، سطوح مختلف آدنین سولفات (AdS) و BAP در این بررسی در سطح %5 اختلاف معناداری در تعداد برگ تولید شده از هر شاخساره داشته­اند. بعلاوه اثر متقابل این دو فاکتور نیز در سطح %5 معنادار است. مقایسه میانگین بروش LSD(α=5%) نشان داد که در غلظت mg/l AdS 15، سطوح مختلف استفاده شده BAP تأثیر مطلوبی و قابل توجهی بر تعداد برگ تولید شده از هر شاخساره دارند. البته تأثیر مقادیر مختلف BAP در ترکیب با mg/l AdS 15دارای اثر معنی­داری نیست. با افزایش AdS بهmg/l 30 این وضعیت تغییر می­کند و تنها تیمارmg/l BAP 0.2 + AdS mg/l30 با سطح a دیده می‍شود (شکل5). با توجه به این نتایج، بهترین سطح AdS،mg/l  15 و بهترین سطح BAP، mg/l 0.2 است. در بررسی اثر متقابل دو فاکتور نیز با توجه به شکل 5، مناسبترین ترکیب تیماری در افزایش تعداد برگ، mg/l AdS 15و  mg/l BAP0.2 تعیین می­شود.

جدول3- تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از بررسی اثر تنظیم­کننده­رشد BAP و بر AdS تعداد برگ تولید شده در هر شاخساره

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

تعداد برگ

*6.0

      1

BAP

*4.16

      2

AdS

* 3.5

      2

BAP* AdS

0.88

5

خطا

 

18

کل

c.v. =    43.51

ns، *، ** بترتیب بمعنای: عدم معنی دار بودن، معنی دار در سطح احتمال 5%، معنی دار در سطح احتمال1%

 

 

شکل5- مقایسه میانگین اثر ترکیبات تیماری BAP , AdS بر تعداد برگ تولید شده در هر شاخساره که بروش  LSDانجام  شده است. ستونهایی که حداقل یک حرف مشابه دارند، در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با هم ندارند.

 

چرا که استفاده از این ترکیب در بین 4 ترکیب سطح a، از نظر اقتصادی بصرفه­تر است. این نتیجه حکایت از آن دارد که با استفاده همزمان AdS و BAP جهت افزایش تعداد برگ در هر شاخساره، سطوح پایینتر این تیمارها مورد نیاز است.

بررسی   تأثیر   محیط­های   مختلف   ریشه­زایی   بر

شاخساره‍ها: پس از تکثیر شاخساره، جهت بررسی مدت زمان ریشه­زایی شاخساره­ها و تعداد ریشه­های حاصله، شاخساره­ها به سه محیط غذایی شامل محیط MS بدون تنظیم­کننده­رشد، محیط 1/2 MS بهمراه 0.005 میلی­گرم در لیتر NAA و ماسه استریل منتقل شدند. با توجه به جدول 4، اختلاف معنی­داری در سطح %1 بین محیط­های مختلف ریشه­دهی در زمینه القاء ریشه و همچنین زمان ریشه­دهی مشاهده می­شود. مقایسه میانگین انجام شده بروش LSD(α=5%) (شکل 6) حاکی از آنست که ماسه استریل با تولید میانگین حدود 26 ریشه نسبت به دو محیط دیگر عملکرد مناسبتری را نشان داده است.

جدول4- تجزیه واریانس داده­های بدست آمده از بررسی اثر محیط­های ریشه­دهی برتعداد ریشه و زمان ریشه­دهی

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

ریشه دهی

تعداد ریشه

 **289.33

**225.0

2

محیط ریشه دهی

1.66

9.11

9

خطا

 

 

11

کل

c.v. =    6.5                        c.v. = 15.8

ns، *، ** بترتیب بمعنای: عدم معنی دار بودن، معنی دار در سطح احتمال 5%، معنی دار در سطح احتمال1%

 

 

شکل6- مقایسه میانگین اثر محیط­های مختلف ریشه­دهی برتعداد ریشه بروش LSD. ستونهایی که حداقل یک حرف مشابه دارند، در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با هم ندارند.

 

پس از ماسه محیط غذایی MS کامل با متوسط 20 ریشه قرار می­گیرد. اما در زمینه زمان ریشه­دهی (شکل 7) محیط MS با 2/1 غلظت مواد معدنی بهمراه 0.005 میلی­گرم در لیتر NAA برترین محیط با میانگین 10 روز بوده است و لذا ریشه­دهی در این محیط در مقایسه با دیگر شرایط بمدت زمان کمتری نیاز دارد.

 

شکل7- مقایسه میانگین اثر محیط­های مختلف ریشه­دهی بر زمان ریشه­دهی بروشLSD. ستونهایی که حداقل یک حرف مشابه دارند، در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری با هم ندارند.
 

 

محیط غذایی MS کامل با متوسط 20 روز ریشه­زایی بعنوان گزینه دوم مطرح می­باشد. بعبارت دیگر هر چند ماسه استریل توانسته تعداد ریشه را افزایش دهد، اما زمان ریشه­دهی در ماسه طولانیتر است. لذا برای تعیین محیط مناسب باید در نظر داشت که کدام پارامتر (تعداد ریشه­دهی یا زمان ریشه­دهی) برای تولید کننده بنفشه آفریقایی در محیط درون­شیشه­ای بیشتر اهمیت دارد. شاخساره­های ریشه دار شده (گیاهچه­ها) جهت سازگاری با محیط In vivo   به خاک استریل مناسب رشد این گیاه انتقال و بقیه مراحل رشد و نمو را در گلخانه پشت سر گذاشتند (شکل 8).

 

شکل8- انتقال شاخساره­های ریشه دار به گلدان­های حاوی خاک استریل

بحث

در این پژوهش اثر غلظتهای مختلف از: تنظیم­کننده­های­رشدی سیتوکینین و اکسین، آدنین سولفات و محیط MS بر روی تکثیر اندام هوایی و ریشه بنفشه آفریقایی مورد بررسی قرارگرفت.

در بررسی اثر دو اکسینNAA  و IAA بر تولید شاخساره­های بنفشه آفریقایی از ریز­قطعات برگ، ترکیبهای تیماری mg/l NAA0.1 و mg/l NAA0 بهمراه mg/l0.1 از BAP و  mg/l IAA0، بهمراه BAP mg/l0.1 مناسبترین ترکیبات تیمارهای تعیین شدند. از طرف دیگر حضور BAP به تنهایی تأثیر قابل توجه و مثبتی بر تولید شاخساره از برگهای بنفشه آفریقایی داشت و این تأثیر در غلظتهای مختلف NAA و IAA متفاوت است. با توجه به مشاهدات ایرانبخش و همکاران BAP به تنهایی توانایی بیشتری نسبت به NAA در افزایش تعداد شاخه و برگهای تشکیل شده دارد. سطح مناسب غلظتBAP  بدون NAA برای اندام­زایی در آزمایش آنها  mg/l 0.12- 0.08 بود و غلظتهای بالای BAP و NAA بخصوص غلظتهای بالای NAA اثر بازدارنده بر شاخساره­زایی داشت. گمان می­رود این غلظتهای بیش از حد با اثر سمیت، شاخساره­زایی را کاهش می­دهند (2). نتایج آزمایشات فوق با نتایج ارائه شده در این مطالعه تطبیق دارد. Torres علت اصلی تکثیر انبوه بنفشه آفریقایی با استفاده از مقادیر محدود NAA را کاسته شدن میزان وزن و تولید جوانه­های نابجا و گیاهچه بنفشه در غلظتهای یک میلی­گرم و بیشتر از NAA می­داند (32). آزمایشات زبرجدی و همکاران نشان داد که هورمون BAP به تنهایی یا در ترکیب با NAA در گیاه سرخارگل (Echinacea purpurea L.) موجب تولید نوساقه­های متعدد می­شود(5). مطالعات Al-Hussein و همکاران نشان داد، محیط MS حاوی μM NAA  0.54 بهترین غلظت BA برای باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ است(8). در مشاهدات زید و همکاران مشخص شد، محیط GA3 μM 0.58+ IBA μM 1.47+ BA μM 4.44+ MS بهترین حالت برای القاء تولید شاخساره جدید بنفشه آفریقایی بوده است(7).  Sunpuiو Kanchanapoom در پژوهشی نشان دادند محیطMS  حاوی  mg/L BA3 به تنهایی یا بهمراه mg/ L1 NAA بالاترین درصد باززایی شاخساره را دارد(30). مطالعات انجام شده توسط Godo و همکاران  بر روی قسمتهای برگی لیسیانتوس، جنس دیگری از خانواده جسنریاسه نیز نشان داد که بیشترین ساقه از ریزنمونه برگ در محیط حاوی غلظت کم (2-0.5 میکرومولار) از NAA القاء می­شود (15). مشاهدات Kaviani روی بر شاخساره انتهایی لیسیانتوس نشان داد که تیمارهای mg/l KIN 1 و 0.5 بدون NAA بهترین محیط شاخساره­زایی است؛ در حالی که در تیمارهای حاوی mg/l NAA 2 و 1، بدون KIN هیچ شاخساره­زایی صورت نگرفت (19). Daud و همکاران پس از گذشت 8 هفته، کشتهای محیط MS حاوی  mg/L IAA 1 بهمراه mg/L Zeatin 3 را دارای بالاترین تعداد شاخساره، معرفی نمودند(12). مشاهدات Shepherd و Almeida بر روی جوانه جانبی
(Sinningia allagophylla) نیز نشان داده است که بالاترین درصد شاخساره­­زایی (100%) در محیط کشت حاویIAA  mg/l 0 و BA mg/l 0.1 بوده است (9).

در بررسی تعداد برگ تأثیر مثبت هر یک از تیمارهایBAP  و AdS بر افزایش تولید برگ مشاهده شد. بعلاوه نتایج نشان داد که حضور همزمان AdS و BAP جهت افزایش تعداد برگ سطوح پایینتری از این تیمارها را نیاز دارد بطوری که بهترین سطح AdS،mg/l  15 و بهترین سطح BAP، mg/l 0.2 بود. در مطالعه­ای بر روی قسمتهای برگی بنفشه آفریقایی مشخص شد که محیط MS حاوی mg/l BA 0.4 و mg/l AdS 30 بهترین محیط ساقه­زایی است(16). در نتایج مطالعات انجام شده توسط Raman آمده است: ریزنمونه­های Streptocarpus در محیط MS حاوی %3 گلوکز و mg/l 40 آدنین پس از 6-4 هفته شروع به تولید جوانه نمودند. وی نتایج مشابهی را از محیط MS حاوی غلظتهای کم از آدنین سولفات(mg/l10) بهمراه  mg/l1 کینتین بدست آورد. Raman همچنین در بررسی خود روی ساقه گل گلوکسینیا Gloxinia (Sinningia speciosa) مشخص نمود: در محیط حاوی %3 گلوکز بهمراه mg/l NAA1 و mg/l BAP1 یا محیط حاوی %3 گلوکز بهمراه  mg/l NAA1 و  mg/l40 آدنین، تعداد زیادی جوانه همراه با ریشه تولید می­شود. وی در تفسیر نتایج حاصله بیان داشت: آدنین و آدنین­سولفات به تنهایی یا بهمراه کینتین برای تولید جوانه در غیاب BAP ضروری هستند و با افزایش غلظت آدنین یا آدنین سولفات تعداد جوانه تولید شده در هر قطعه افزایش یافته است (26). این بررسی نیز نشان داد که با حضور BAP سطوح پایینتری از آدنین­سولفات برای افزایش تولید برگ نیاز است؛ چرا که سطحmg/l  15 از آدنین سولفات نسبت به سطحmg/l  30 عملکرد بهتری را نشان داده است.

در ارزیابی اثر محیط­های مختلف ریشه­زایی، ماسه استریل با تولید میانگین حدود 25 ریشه نسبت به دو محیط دیگر عملکرد مناسبتری را نشان داد. اما در زمینه زمان ریشه­دهی محیط MS با 2/1 غلظت مواد معدنی بهمراه 0.005 میلی­گرم در لیتر NAA برترین محیط با میانگین 10 روز بود. بنابراین ماسه استریل توانست تعداد ریشه را افزایش دهد، اما بهمان نسبت زمان ریشه دهی را نیز افزایش داد. هورمون اکسین و ترکیبات مشابه آن عامل مناسب برای ریشه­زایی می­باشند. این هورمون به راحتی سبب تحریک سلولهای دایره محیطی در بخشهای بالایی ناحیه تارهای کشنده می­شود، این تحریک منتج به تقسیم سلولهای این منطقه و در نهایت تشکیل ریشه می­گردد(3). مطالعات انجام شده توسط Ghasemi و همکاران نشان داد بهترین محیط ریشه­زایی برای بنفشه آفریقایی محیط MS حاوی مقدارmg/l NAA 1 است (12). مشاهدات Kaviani بر روی شاخساره انتهایی لیسیانتوس نشان داد که تیمارهای mg/l KIN 2 با  mg/l NAA0.5 و mg/l KIN 0.5 با mg/l NAA 0 بالاترین ریشه­زایی را داشته­اند (17). با توجه به مشاهدات Godo و همکاران بر روی قسمتهای برگی لیسیانتوس، بیشترین القاء ریشه از ریزنمونه برگ در محیط حاوی μM 128-32 از NAA بدست آمد(15). در مطالعه ای دیگر بر روی شاخساره انتهایی لیسیانتوس مشخص شد تیمارNAA  μM 1.62 بالاترین درصد ریشه­زایی (100%) را داشته است(25).

نتیجه­ گیری نهایی

تحقیق حاضر با تبیین اثرNAA  و IAA در تولید اندام هوایی بنفشه آفریقایی، بررسی نقش پررنگBAP  در تولید شاخساره و برگ، ارزیابی نتایج حضور AdS بر تعداد برگ تولید شده و مقایسه محیط­های مختلف ریشه­دهی، می­تواند کمک بسیار مؤثری جهت حصول ترکیب تیماری مناسب هر مرحله از رشد گیاه بنفشه آفریقایی نماید و در راستای تکثیر صنعتی این گیاه زینتی محبوب مورد استفاده قرار گیرد.

1- امیری، ا.، تقی زاده، م.، شور، م.، نعمتی، س.ح.، تهرانی فر، ع.، 1393. بررسی جنبه‌­های باززایی درون‌شیشه‌ای بنفشه آفریقایی (Saintpaulia ionantha Wendl) و ریشه‌زایی برون‌شیشه‌­ای آن.دوفصلنامه فنآوری تولیدات گیاهی (علمی-پژوهشی) 14(1): 121-131.‎
2- ایرانبخش، ع.، عبادی، م.، حمدی، س.م.م.، 1388. تکثیر نیمه صنعتی گیاه بنفشه آفریقایی (Saintpaulia inonata) به روش ریزازدیادی. فصلنامه زیست شناسی تکوینی10:4-1.
3- پیوندی، م.، کاظمی، ل.، مجد، ا.، تاثیر سیتوکینین‌های مختلف بر ریز ازدیادی گیاه اسطوخودوس  (Lavandula vera)، مجله زیست شناسی ایران، 28 (2): 257-263
4- خلیقی، ا.، 1364. گلکاری- پرورش گیاهان زینتی ایران. انتشارات روزبهان. تهران
5- زبرجدی، ع.ر.، معتمدی، م.ج.، طراوت، ا.، اسماعیلی، ا.، 1392، ریز‌ازدیادی گیاه دارویی سرخارگل(.Echinacea purpurea L) با استفاده از قطعات کوتیلدون و هیپوکوتیل، مجله زیست شناسی ایران، 26 (3):311-319
6- قائم مقامی، س.ع.،1382. بهینه سازی تکثیر درون شیشه ای بنفشه آفریقایی، مجله علمی پژوهشی علوم کشاورزی108:3-99.
7- زید، س.، التیناوی، ع.، عبدالقادر، أ.،2008 . تأثیر بعض مکونات الأوساط الغذائیه فی الإکثار الدقیق للبنفسج الإفریقی(Saintpaulia ionantha L.). مجله جامعه تشرین للبحوث و الدراسات العلمیه- سلسله العلوم البیولوجیه30(3): 111-122.
 
8- Al-Hussein, S., Shibli, R.A., Karam, N.S., 2010. Regeneration in African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.) using different leaf explants, cytokinins sources, and light regimes. Jordan Journal of Agricultural Sciences 2(4): 361-371.
9- Almeidia, V.P.D., Shepherd, S.L.K., 1999. Sinningia allagophylla (Gesneriaceae): In vitro cultivation of a native plant of the Brazilian cerrado. Brazilian Journal of Botany 22(3): 381-384.
10- Brickell, c., 1995. The Royal Horticultural Society Encyclopedia of Gardening A-Z. Dorling Kindersley, Great Britain.
11- Chen, J., Henny, R. J., 2015. Cultural Guidelines for Commercial Production of African Violets (Saintpaulia ionantha). Environmental Horticulture Department, UF/IFAS Extension.
12- Daud, N., Taha, R.M., Hasbullah, N.A., 2008. Studies on plant regeneration and somaclonal variation in Saintpaulia ionantha Wendl.(African violet). Pakistan journal of biological sciences: PJBS, 11(9): 1240-1245.
13- Ghasemi, Y., Nematzadeh, G. A., Omran, V. G., Dahestani, A., Hosseini, S., 2012. The effect of explant type and phytohormones on African violet (Saintpaulia ionantha) micropropagation efficiency. Biharean Biologist 2: 73–76.
14- Ghorbanzade, Z., Ahmadabadi, M., 2014. An improved system for rapid In vitro regeneration of Saintpaulia ionantha. Plant Tissue Culture Biotechnology 1: 37‐45.
15- Godo, T., Lu, Y., Mii, M., 2010. Micropropagation of Lysionotus pauciflorus Maxim (Gesneriaceae). Protocols for In vitro Propagation of Ornamental Plants: 127-139.
16- Grout, B. W. W., 1990. African violet. Handbook of Plant Cell Culture 5:181-205.
17- Hoshino, Y., Nakano, M., Mii, M., 1995. Plant regeneration from cell suspension-derived protoplasts of Saintpaulia ionantha Wendl. Plant Cell Reports 14: 341-344.
18- Ioannou, M., 1987. Micropropagation of African violet from petiole and leaf blade tissue. Agricultural Research Institute, Ministry of Agriculture and Natural Resource 92:1-4.
19- Kaviani, B., 2014. Micropropagation of ten weeks (matthiola incana) and lisianthus (Eustoma grandiflorum) (two ornamental plants) by using kinetin (KIN), naphthalene acetic acid (NAA) and 2, 4-dichlorophenoxy acetic acid (2, 4-D). Acta Scientiarum Polonorum-Hortorum Cultus, 13(1): 141-154.
20- Lineberger, R. D., Druckenbrod, M., 1985. Chieral nature of the pinwheel flowering African violets (saintpaulia,Gesneriaceae). American. Jornal of Botany 8:1204-1212.
21- Lo, K. H., 1997. Factors affecting shoot organogenesis in leaf disc culture of African violet. Scientia Horticulturae 72: 49-57
22- Molgaard, J. P., Roulund, N., Deichmann, V., Irgens-Moller, L., Andersen, S. B., Farestveit, B., 1991. In vitro multiplication of Saintpauliaionantha Wendl. by homogenization of tissue cultures. Scientia Horticulturae 48: 285-292.
23- Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 472–497.
24- Murashige, T., 1978. The impact of plant tissue culture on agriculture. Frontiers of plant tissue culture: 15- 26.
25- Paek, K. Y., Hahn, E. J., 2000. Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and anatomical characteristics of shoot-tip cultures of Lisianthus [Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn]. In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 36(2): 128-132.
26- Raman, K., 1977. Rapid multiplication of Streptocarpus and Gloxinia from In vitro cultured pedicel segments. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 83 (5): 411-418.
27- Rout, G.R., Mohapatra, A., Mohan Jain, S., 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotechnology Advances 24: 531-560.
28- Shukla, M., Sullivan, J.A., Jain, S.M., Murch, S.J., Saxena, P.K., 2013. Micropropagation of African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.). Protocols for Micropropagation of Selected Economically.ImportantHorticultural Plants. Methods in Molecular Biology : 279-289.
29- Start, N. D., Cumming, B. G., 1976. In vitro propagation of Saintpaulia ionantha Wendl. Horticultural Science  11(3): 204-206.
30- Sunpui, W., Kanchanapoom, K., 2002. Plant regeneration from petiole and leaf of African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.) cultured In vitro. Songklanakarin J. Sci. Technol 24(3): 357-364.
31- Taha, R.M., Daud, N., Hasbullah, N.A., 2008. Establishment of Efficient Regeneration System, Acclimatization and Somaclonal Variation in Saintpaulia ionantha H. Wendl. IV International Symposium on Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants. 865: 115-121.
32- Torres, K., 1988. In vitro Propagation of African Violets. Tissue Culture Techniques for Horticultural Crops: 80-85.
33- Weatherhead, M. A., Grout, B. W. W., Short, K. C., 1982. Increased haploid production in Saintpaulia ionantha Wendl. by anther culture. Scientia Horticulturae 17: 137-144.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 32, Issue 1
April 2019
Pages 125-136
  • Receive Date: 21 April 2016
  • Revise Date: 10 January 2017
  • Accept Date: 04 December 2017