تحلیل اثر تنش شوری و سالیسیلیک اسید بر برخی ویژگی‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی

مرزه خوزستانی(Satureja khuzistanica .Jamzad)

زهرا آریان^1*، محمد جواد مرآتی¹، حسن ابراهیم‌زاده ¹، جواد هادیان² و مسعود میرمعصومی ¹ 

¹تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی

² تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی 

تاریخ دریافت: 9/10/93                تاریخ پذیرش: 27/12/95 

چکیده

مرزه خوزستانی(Satureja khuzistanica) یک گیاه دارویی با ارزش متعلق به تیره نعناعیان می‌باشد که در مناطق گرم و خشک جنوب‌غربی ایران می‌روید. در این پژوهش اثر غلظت‌های 0، 50، 100، 150 و 200 میلی‌مولار شوری (NaCl) و غلظت‌های 0، 5/0 و 0/1 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید (SA) در طرح فاکتوریل و به‌صورت کاملا تصادفی با 8 تکرار در کشت گلخانه‌ای روی پارامترهای بیوشیمایی و فیزیولوژیکی این گونه در بخش‌های هوایی بررسی و مقایسه شد. داده‌ها بوسیله نرم‌افزار SPSS و با آزمون دانکن آنالیز شدند. براساس نتایج؛ وزن تر (FW) و مالون دی آلدهید (MDA) تحت تنش شوری کاهش و مقدار پرولین افزایش یافت ولی تیمار SA تغییر معنی‌داری روی آنها نداشت. محتوای پروتئین تحت تنش شوری و تیمار SA تغییر معنی‌داری نشان نداد. فعالیت زیمایه سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) و پلی فنول اکسیداز (PPO) ابتدا افزایش و بعد کاهش یافت و تحت تیمار SA     کاهش نشان داد. فعالیت زیمایه پراکسیداز (POX) و مقدار پراکسید هیدروژن تحت تنش شوری و تیمار SA کاهش یافت. در کل نتایج نشان داد که دامنه مقاومت این گونه تا شوری Mm 100 بوده و سالیسیلیک اسید تا حدی موجب بهبود اثرات تنش شد.

واژه‌های کلیدی: مرزه خوزستانی، تنش شوری، زیمایه‌های پاداکساینده، پروتئین، پرولین

* نویسنده مسئول، تلفن: 09196514277، پست الکترونیکی: zahra_aryan2002@yahoo.com

مقدمه 

مرزه خوزستانیSatureja khuzistanica)) گیاهی دارویی از تیره نعناعیان و بومی مناطق گرم و خشک جنوب غرب زاگرس می باشد. این گیاه ابتدا در سال 1994 جمع آوری و به‌عنوان گونه جدید از سرده مرزه در ایران نام گذاری شد (17). این گیاه به علت غنی بودن از ترکیبات فنولی به‌ویژه کارواکرول و رزمارینیک اسید دارای اثرات دارویی متعدد ازجمله خاصیت ضد قارچ، ضد میکروب، ضد اسپاسم و ضد اسهال، پایین آورنده تری گلیسرید، پاداکساینده و غیره می باشد که این اثرات دارویی با بررسی های علمی اخیر بخوبی به اثبات رسیده است (15).

در سال های اخیر اهلی سازی و کشت مرزه خوزستانی برای تأمین مواد اولیه مورد نیاز صنعت آغاز شده است. با توجه به رویش این گیاه در مناطق خشک، به نظر می رسد مقاومت مناسبی به شرایط تنش داشته و گزینه ای مناسب برای کشت در مناطق تحت تنش از جمله مناطق شور و خشک باشد (15).

شوری خاک یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی برای گیاهان و مهمترین عامل محیطی محدود کننده رشد و تولید گیاهی محسوب می‌شود. شوری بیش از 60% کل مناطق خشکی جهان را تحت تأثیر خود قرار داده است. این تنش بر فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی اثر می‌گذارد که از آن‌ جمله می توان تنظیم اسمزی، سنتز پروتئین ها، اسمولیت های سازگار، سنتز و فعالیت برخی زیمایه‌ها را نام برد. تنش های محیطی باعث خسارت های اکسایشی به غشا می شوند. این خسارتها ناشی از تجمع گونه های فعال اکسیژن (ROS) همانند رادیکال سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال های هیدروکسیل می باشد. به‌منظور مقابله با این اثرات زیان بار ترکیبات ROS ، سلول های گیاهی سیستم های پاداکساینده ای را ایجاد کرده اند که زیمایه‌های پاداکساینده مانند سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) و پراکسیداز (POX) از جمله آنها می باشند (8 و 9). سالیسیلیک اسید (SA) ترکیب فنولی است که جزء فیتوهورمون ها به شمار می آید و در میان ترکیبات فنولیک مشتقات بنزوئیک و سینامیک اسیدها دارای اثراتی بر روی متابولیسم و بیوسنتز و همچنین فعالیت های اکسایشی فعالیت های زیستی مانند رشد و نمو، فتوسنتز، تنفس، جذب و انتقال یون ها، تغییر فعالیت برخی زیمایه های مهم و ساختار کلروپلاست می باشد (12، 13، 19). سالیسیلیک اسید زمانی که گیاه تحت تنش قرار می گیرد به‌عنوان بهبود دهنده اثراث منفی تنش را کاهش داده و گیاه را برای مقابله با تنش آماده می کند. مطالعه مشابهی روی درمنه کوهی توسط رضایتمندی و همکاران انجام شده است. در این تحقیق تأثیر تنش شوری و سالیسیلیک اسید بر فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مرزه خوزستانی بررسی شده است.

مواد و روشها

نشاهای مرزه خوزستانی از شرکت داروسازی خرمان واقع در شهرستان خرم آباد تهیه شدند. تمام نمونه‌های مورد آزمایش از کلون A78 این گیاه بودند. نشاها در گلدان هایی با قطر 18 سانتیمتر و ارتفاع 28 سانتی متر  و بستر کشت  پرلیت  کشت شدند و به‌منظور به دست آوردن مقدار زی توده مناسب به مدت دو ماه، یک روز در میان با محلول غذایی هوگلند یک چهارم غلظت تیمار شدند. شرایط رشد گیاهان شامل روشنایی طول روز، شدت خورشید که به وسیله سایه بان در اطراف گلخانه تعدیل شد، دمای شب/روز 22/23 درجه سانتی گراد و 40-45% رطوبت بود. سپس گیاهان به مدت یک ماه، یک روز در میان تحت تنش شوری NaCl  با غلظت های 0، 50، 100، 150 و 200 میلی مولار قرار گرفتند. مقدار 150 میلی لیتر محلول هوگلند و (NaCl) به هر گلدان داده شد. همچنین تیمار SA با سه غلظت 0، 5/0 و 0/1 میلی مولار در دو هفته آخر تنش شوری به تعداد دو بار و با فاصله زمانی ده روز اعمال شد و چهار روز پس از آخرین تیمار گیاهان برای بررسی برداشت شدند. وزن تر اندام های هوایی اندازه گیری شد و به‌منظور انجام آنالیزها، نمونه ها در فریزر 70− درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند.

استخراج پروتئین: 5/0 گرم ماده گیاهی در 4 میلی لیتر بافر (Tris-HCl) با 8/6=pH ساییده و بعد سانتریفیوژ شد. پس از جدا کردن روشناور،  حجم آن اندازه گیری شد.

سنجش میزان پروتئین: به‌منظور تعیین محتوای پروتئین از روش برادفورد استفاده گردید (12). بدین منظور عصاره پروتئینی استخراج و از هر محلول روشناور  سه تکرار تهیه شد، بدین صورت که در هر لوله مقدار 1/0  سی سی عصاره ریخته و بدان 5  میلی لیتر محلول برادفورد اضافه شد. سپس لوله ها به مدت 10 ثانیه  ورتکس و پس از گذشت 20 تا 25 دقیقه جذب آنها درnm 595 خوانده شد. برای تهیه منحنی استاندارد از آلبومین سرم گاوی استفاده شد.

اندازه‌گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدی: پراکسیداسیون لیپیدی با اندازه گیری محتوای MDA  تعیین می­شود (13). 2/0 گرم از ماده گیاهی در 5 میلی لیتر از تری کلرو استیک اسید (TCA) 1/0 درصد وزنی- حجمی ساییده شده و بعد در 10000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد­. به 1 میلی لیتر از روشناور، 4 میلی لیتر از تیوباربیوتیک اسید (TBA)  5 درصد در TCA 20 درصد اضافه گردید. مخلوط واکنش در 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. پس از سانتریفیوژ در 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه، جذب روشناور در 532 و 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu مدل UV-160 و مد Photometric خوانده شد. برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی برابر ¹mM^-cm^-1­155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول پراکسیداسیون لیپیدها است براساس میکرومول در گرم وزن تر محاسبه گردید.

سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت این زیمایه با قابلیت آن در بازدارندگی واکنش احیایی فتوشیمیایی نیتروبلوتترازولیوم NBT)) تعیین گردید. محلول واکنش بر اساس سنجش فعالیت زیمایه شامل بافر فسفات mM 50 با 5/7pH= ، متیونین mM13، Na-EDTA mM 1/0 ، نیتروبلو تترازولیوم (NBT)μM75، ریبوفلاوین μM75 و مقدار 100 میکرولیتر از عصاره می‌باشد. این روش بر اساس تبدیل NBT به فورمازان در حضور نور و تشکیل رنگ است. در صورتی که سوپراکسید دیسموتاز در محیط وجود داشته باشد، از انجام واکنش مذکور ممانعت کرده و تشکیل و ظهور رنگ را کاهش می‌دهد. پس از 16 دقیقه جذب آنها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu مدل UV-160 در مد Photometric و طول موج 560 نانومتر خوانده شد (14).

سنجش هیدروژن پراکسید: براساس روش Velikova و همکاران (2000)، 1 گرم بافت تر در حمام یخ با 5 میلی لیتر TCA 1/0% (w/v) هموژنیزه شد و بعد بر حسب گرم در  rpm 12000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. 5/0 میلی لیتر از محلول روشناور به 5/0 میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات  mM10  با 7=pH و 1 میلی لیتر پتاسیم یدید اضافه شد و بعد جذب آن در 390 نانومتر خوانده شد. منحنی استانداردی با استفاده از پراکسید هیدروژن رسم شد. در نهایت محتوای پراکسید هیدروژن نمونه ها با ضریب خاموشی mM^-1cm^-1 28/0 براساس میکرومول پراکسید هیدروژن به ازای گرم وزن تر محاسبه ­گردید.

سنجش فعالیت پراکسیداز: سنجش فعالیت سینتیکی پراکسیداز طبق روش Abeles, (1991)Biles  انجام شد. بدین منظور 4 میلی لیتر بافر استات (8/4=pH، M2/0) ، 400 میکرولیتر آب اکسیژنه و 200 میکرولیتر بنزیدین در یک لوله آزمایش با هم مخلوط شده و بعد 10 میکرولیتر عصاره زیمایه‌ای به آن اضافه شد. تغییرات جذب به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل Shimadzu، مد  kineticو طول موج 530 نانومتر خوانده شد. فعالیت پراکسیداز بر حسب واحد زیمایه ای در میلی گرم پروتئین محاسبه گردید.

سنجش فعالیت زیمایه پلی فنول اکسیداز: به‌منظور سنجش فعالیت سینتیکی زیمایه پلی فنل اکسیداز از روش Raymond و همکاران (1993) استفاده شد. در این روش 5/2 میلی لیتر بافر فسفات M2/0 (8/6=pH)، 0/2 میلی لیتر پیروگالول (M2/0) و 100 میکرولیتر عصاره زیمایه ای را در یک لوله آزمایش که در دمای 40 درجه سانتی گراد قرار داشت، مخلوط کرده و بلافاصله تغییرات جذب به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu مدل UV-160 در مد Kinetic و طول موج 430 نانومتر رسم گردید (Raymond و همکاران، 1993). در نهایت میزان فعالیت زیمایه بر حسب واحد زیمایه ای در میلی گرم پروتئین ((Unit mg-1 protein محاسبه گردید. برای زیمایه پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز واحد زیمایه ای بیانگر مقدار زیمایه ای است که بتواند گهرمایه را به محصول تبدیل نماید.

بررسی‌های آماری: داده های حاصل از بررسی ها بوسیله نرم افزار آماری SPSS (نسخه20) مورد تحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگین داده ها در سطح خطای 5% (5%>p) با آزمون دانکنDuncans Multiple) Range Test  ) انجام شد. همچنین برای یافتن ضریب همبستگی بین تیمارهای شوری و سالیسیلیک اسید با پارامترهای مذکور، داده ها پس از ثبت و مرتب سازی به روش های اسپیرمن، کندال و پیرسون آنالیز شدند که بهترین نتایج از روش پیرسون حاصل شد.

نتایج

پارامترهای فیزیولوژیکی: با افزایش غلظت NaCl، وزن تر گیاه کاهش پیدا کرد و در غلظت 200 میلی مولار به کمترین میزان خود رسید که همبستگی منفی و معنی داری بین این دو نشان داد (جدول 1)، همچنین سالیسیلیک اسید تغییر معنی داری در مقدار وزن تر گیاه ایجاد نکرد (شکل 1.A) (جدول 2).

پارامترهای بیوشیمیایی: پراکسیداسیون لیپید: براساس مقدار مالون دی آلدهید اندازه گیری شد که میزان پراکسیداسیون لیپیدی با غلظت های مختلف NaCl همبستگی منفی و معنی داری نشان داد ولی  تحت تأثیر SA تغییر چندانی نکرد (شکل 1.B) (جدول 1 و 2).

محتوای پروتئین: محتوای پروتئین با بالا رفتن سطح شوری و حتی با اعمال تیمار SA تغییر معنی داری نشان نداد ( شکل 2. A) (جدول 1 و 2).

محتوای پرولین: تحت تیمار شوری مقدار پرولین همبستگی مثبت و معنی داری نشان داد اما غلظت های مختلف SA باعث تغییر معنی داری در آن نشد (شکل 1. C) (جدول 1 و 2).

میزان پراکسید هیدروژن H₂O₂: مقدار آن با میزان شوری و تحت تیمار SA همبستگی مثبت و معنی داری نشان داد ( شکلD.1) (جدول 1 و 2).

فعالیت زیمایه‌های پاداکساینده: فعالیت زیمایه پلی فنول اکسیداز ( PPO ) با افزایش شوری تا غلظت   mM100 نمک افزایش و بعد کاهش یافت و SA نیز آن را کاهش داد (شکل 2. C). اما در کل همبستگی معنی داری نشان ندادند (جدول 1). فعالیت زیمایه پراکسیداز (POX) با افزایش غلظت نمک کاهش یافت که بیانگر همبستگی منفی و معنی دار بین این دو است (جدول1) و تیمار SA این کاهش را تا حدودی افزایش داد ( شکل. D 2). فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز (SOD) با افزایش شوری تغییر چندانی نداشت اما تحت تیمار SA با غلظت mM5/0 کاهش و با غلظت mM0/1 افزایش یافت (شکل . C2) (جدول 2) که در کل حاکی از همبستگی غیر معنی دار است (جدول 1).

بحث 

شوری خاک، یک تنش غیر زیستی و متداول برای گیاهان است. مهار رشد یک پاسخ رایج به شوری بوده و یکی از مهمترین شاخص های کشاورزی در تحمل شوری است (25). گونه های فعال اکسیَژن عامل اصلی پراکسیداسیون لیپیدی هستند (29).

رادیکالهای سوپر اکسید ایجاد شده تحت تنش شوری باعث پراکسیداسیون ­لیپیدهای غشاء (26) و افزایش میزان MDA و در نتیجه­ ­آسیب­ غشاء سلولی در طی ­تنش ­شوری ­می­شود (15). پراکسیداسیون لیپیدها که باعث آسیب رساندن به عملکرد غشاء می شود، می توان آن را انداره گیری کرد (27). شواهد نشان می دهد که  مالون دی آلدهید محصول تجزیه اسیدهای چرب غیر اشباع است که به‌عنوان یک نشانگر زیستی برای اندازه گیری  پراکسیداسیون لیپیدها مورد استفاده قرار می گیرد (24). پراکسیداسیون لیپیدی از طریق اندازه گیری محتوای مالون دی آلدهید در بخش های هوایی سنجیده شد. نتایج جدول 1 نشان داد همبستگی منفی و معنی داری میان مقدار پراکسیداسیون لیپیدی و تنش شوری دیده شد. اما تحت تیمار SA همبستگی معنی داری یافت نشد (22)( شکل 2. A). این نتیجه می تواند بیانگر این باشد که گونه های فعال سوپراکسید تأثیری بر پراکسیداسیون لیپیدی نداشته است. همچنین افزایش فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز تا سطح شوری mM 100 دلیلی بر کاهش غلظت گونه های فعال اکسیژن می باشد.  

جدول 1- تعیین ضریب همبستگی با روش 2-tailed  

جدول 2- تغییرات وزن تر، محتوای مالون دی آلدهید، پرولین، آب اکسیژنه، پروتئین کل و میانگین فعالیت سوپراکسیددیسموتاز، پلی فنوا اکسیداز و پراکسیداز در غلظت های مختلف شوری، SA1، SA2  و SA3  به ترتیب نمایانگر غلظت های 0، 0.5 و 1 میلی مولار سالیسیلیک اسید می باشد. 

شکل 1- تغییرات وزن تر، محتوای مالون دی آلدهید (MDA)، محتوای پرولین و محتوای H₂O₂در غلظت های مختلف NaCl.

SA1، SA2 و SA3 به ترتیب غلظت های 0، 0.5 و 1 میلی مولار سالیسیلسک اسید را نشان می دهند.

پرولین یک آمینو اسید قابل حل در آب بوده که دارای دو نقش اساسی در شرایط تنش است. 1: افزایش سنتز و تجمع آن به‌عنوان یک پاسخ متابولیسمی در گیاهان در شرایط تنش می باشد. 2: افزایش پرولین محلول به‌عنوان یک نشانه برای سازگاری و افزایش مقاومت گیاهان به شرایط نامساعد است. همچنین پرولین در تنظیم روابط آب درون سلولی نقش دارد. در شرایط تنش غلظت پرولین نسبت به سایر اسیدهای آمینه افزایش می یابد، پرولین به‌عنوان مخزن ذخیره ای نیتروژن و یا ماده محلولی که پتانسیل اسمزی سیتوپلاسم را کاهش می دهد عمل می نماید و گیاه را در تحمل به تنش یاری می کند (9). پرولین، پروتئین ها و غشاهای سلولی را از آسیب غلظت های زیاد یون ها محافظت می نماید. در این تحقیق محتوای پرولین با شوری افزایش یافته است (جدول 1) که با نتایج مطالعات مشابه مطابقت دارد (10 و28) و احتمالا نشان دهنده این است که با افزایش مقدار پرولین و کاهش پتانسیل اسمزی سیتوپلاسم، گیاه را در تحمل تنش یاری کرده است (شکل 1. C).

شکل 2- تغییرات محتوای پروتئین و فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، پلی فنول اکسیداز (PPO) و پراکسیداز در غلظت های مختلف شوری.  (POX)؛ SA1، SA2 و SA3 به ترتیب نمایانگر غلظت های 0، 0.5 و 1 میلی مولار سالیسیلیک اسید می باشد.