نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه بین المللی امام خمینی
2 دانشجوی دکتری رشته بیوتکنولوژی گیاهی / دانشگاه زنجان
3 کارشناس آزمایشگاه / دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)
چکیده
پایه رویشی پسته قزوینی به عنوان یکی از پایههای مهم پسته در تحمل به شوری، آهکی و مقاوم به خشکی بهشمار میآید. بمنظور تهیه یک دستور العمل مطمئن و تعیین محیط کشت بهینه برای ریزازدیادی این پایه، کارایی محیطکشتهای GNH تغییریافته (GNH-A و GNH-B) در مقایسه با محیطکشتهای MS، WPM، DKW یا GNH مورد مطالعه قرار گرفت. علاوه بر این تأثیر مقادیر مختلف BAP (1/1، 8/1 یا 6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) برای بهبود نرخ نوساقهزایی با کمترین نارساییهای فیزیولوژیکی بررسی شد. نتایج حاصله نشان داد که بیشترین تعداد جوانه و تعداد نوساقه بهازای هر ریزنمونه (جداکشت) با اختلاف معنیداری در محیطکشت GNH-A (بهترتیب 16/3 ± 46/34 و 46/0±23/4 ) در مقایسه با سایر محیطکشتها بدست آمد. همچنین اضافه نمودن مقادیر مختلف BAP به محیطکشت، تاثیر معنی داری روی تمامی صفات رشدی مورد مطالعه داشت؛ بطوریکه بیشترین تعداد نوساقه بهازای هر جداکشت (48/0± 66/6) در محیط-کشت GNH-A حاوی mg/l6/3 BAP بهدست آمد. افزودنmg/l 800 ال-گلوتامین به محیطکشت GNH-A با اختلاف معنیداری رشد طولی و وزن تر نوساقههای تولید شده را (به ترتیبcm 06/0±20/1 و g02/0 ± 31/0) در مقایسه با سایر مقادیر استفاده شده افزایش داد. علیرغم این، در مرحله ریشهزایی، درصد ریشهزایی با استفاده از NAA در مقایسه با IBA با اختلاف معنیداری افزایش یافت. انتظار میرود که نتایج ارائه شده در این مطالعه دیدگاههای جدیدی در زمینه توسعه محیطکشتهای کارآمد برای گیاهان با ارزش اقتصادی، از جمله پسته پیش روی محققین قرار دهد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Improvement of culture media and PGRs in Pistacia vera cv. Ghazvini micropropagation
چکیده [English]
Pistacia vera cv. Ghazvini rootstock is considered as one of the important pistachio rootstocks in tolerance to salinity, calcareous and resistant to drought. In order to providing a reliable protocol for micro-propagation of this rootstock, the efficiency of modified GNH media (GNH-A and GNH-B) compared to MS, WPM, DKW or GNH media was studied. Moreover, the effect of different concentration of BAP (1.1, 1.8 or 3.6 mg/l) and L-glutamine (0.0, 400, 800 or 1600 mg/l) to improve shoot-let production rate with the lowest physiological disorders was survived. Results revealed that the greatest buds and shoots number per explants (34.46 ± 3.16 and 4.23 ± 0.46, respectively) were attained significantly on GNH-A medium compared to the other media studied. Integration of BAP at different concentrations, affected significantly all the studied growth traits, producing the highest shoot number (6.66 ± 0.48) when GNH-A was supplemented with 3.6 mg/l BAP. Furthermore, application of exogenous 800 mg/l L-glutamine in GNH-A medium improved significantly both shoots height and fresh weight (1.20± 0.06cm and 0.31±0.02g, respectively), in comparison with control. In rooting stage, the incorporation of NAA into media significantly increased rooting percentage compared to IBA. Finally, we strongly believe that these results will open new insights for researchers towards efficient culture media improvements for economically important woody plants, Pistacia vera species, in particular.
کلیدواژهها [English]
بهبود محیط کشت و تنظیمکنندههای رشدی در ریزازدیادی پایه رویشی پسته قزوینی
قاسمعلی گروسی1*، سارا ملکی2 و اسمعیل نظامی آلانق1
1 قزوین، دانشگاه بینالمللی امام خمینی (ره)، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه بیوتکنولوژی
2 زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
تاریخ دریافت: 11/12/94 تاریخ پذیرش: 2/9/95
چکیده
پایه رویشی پسته قزوینی بهعنوان یکی از پایههای مهم پسته در تحمل به شوری، آهکی و مقاوم به خشکی بهشمار میآید. بهمنظور تهیه یک دستورالعمل مطمئن و تعیین محیط کشت بهینه برای ریزازدیادی این پایه، کارایی محیط کشتهای GNH تغییریافته (GNH-A و GNH-B) در مقایسه با محیطکشتهای MS، WPM، DKW یا GNH مطالعه شد. علاوه بر این تأثیر مقادیر مختلف BAP (1/1، 8/1 یا 6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) برای بهبود میزان نوساقهزایی با کمترین نارساییهای فیزیولوژیکی بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد که بیشترین تعداد جوانه و تعداد نوساقه بهازای هر ریزنمونه (جداکشت) با اختلاف معنیداری در محیط کشت GNH-A (بهترتیب 16/3 ± 46/34 و 46/0±23/4 ) در مقایسه با سایر محیط کشتها بدست آمد. همچنین اضافه نمودن مقادیر مختلف BAP به محیط کشت، تأثیر معنیداری روی تمامی صفات رشدی مورد مطالعه داشت؛ بهطوریکه بیشترین تعداد نوساقه بهازای هر جداکشت (48/0± 66/6) در محیط کشت GNH-A حاوی mg/l6/3 BAP بهدست آمد. افزودنmg/l 800 ال-گلوتامین به محیط کشت GNH-A با اختلاف معنیداری رشد طولی و وزن تر نوساقههای تولید شده را (بهترتیبcm 06/0±20/1 و g02/0 ± 31/0) در مقایسه با سایر مقادیر استفاده شده افزایش داد. باوجوداین، در مرحله ریشهزایی درصد ریشهزایی با استفاده از NAA در مقایسه با IBA با اختلاف معنیداری افزایش یافت. از اینرو انتظار میرود که نتایج ارائه شده در این مطالعه دیدگاههای جدیدی در زمینه توسعه محیط کشتهای کارآمد برای گیاهان با ارزش اقتصادی، ازجمله پسته پیش روی محققان قرار دهد.
واژههای کلیدی: Pistacia vera، پایه رویشی قزوینی، ریزازدیادی، ال-گلوتامین و تنظیمکنندههای رشدی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 02833901159 ، پست الکترونیکی: agaroosi90@yahoo.com
مقدمه
پایهرویشی پسته قزوینی (Pistacia vera cv. Ghazvini) به عنوان یکی از پایههای رویشی مهم متحمل به خاکهای شور و آهکی (26، 29) و مقاوم به تنشهای خشکی (7 و 40) محسوب میشود. تلاش برای ریزازدیادی آن در شرایط درونشیشه (in vitro) بجای استفاده از روشهای تکثیر سنتی باغبانی (45 ، 46)، با هدف تولید مقرون بهصرفه نونهالهای یکدست و عاری از هرگونه بیماری میتواند از راهکارهای مهم و عملی در تولید و کشت نهال پسته بهویژه در مناطق بیابانی و شورهزار کشور محسوب شود. علیرغم مزایای یاد شده، در این روش دستیابی به دستورالعملهای بومی بمنظور ریزازدیادی سریع و اقتصادی گیاهان باغی نیازمند بهینهسازی متغیرهای متعددی از قبیل ترکیبات معدنی محیط کشت و تنظیمکنندههای رشدی میباشد. مطالعات اخیر نشان دادهاند که ریزازدیادی برخی کولتیوارهای P. vera بااستفاده از محیط کشتهای متداول شامل DKW (19)، WPM (31) و MS (41) بهدلیل مشکلات متعددی از جمله سرعت پایین نوساقهزایی و نارساییهای رشدی و فیزیولوژیکی همراه بوده است (4، 21، 45، 56). بدین منظور بهینهسازی ترکیبات مختلف محیط کشت ازجمله منبع کربنی، تنظیمکنندههای رشدی و یا شرایط محیطی (نور، دما یا رطوبت محیط) مورد توجه بسیاری از محققان بوده است (4، 6، 11، 48، 51). نظر به تأثیر بارز ترکیبات معدنی محیط کشت روی شاخصهای رشدی از قبیل میزان نوساقهزایی و وزن تر تولید شده در ریزازدیادی درختان میوه (44)، این مهم در مطالعات ریزازدیادی پسته کمتر مورد توجه قرار گرفته است. از اینرو در این مطالعه تأثیر برخی از عناصر پرمصرف روی متغیرهای رشدی پایه رویشی قزوینی بررسی خواهد شد. گزارشهای متعددی از تأثیر تنظیمکنندهای رشدی مختلف از قبیل BAP (6-benzylaminopurine) در ریزازدیادی پسته توسط سایر محققان ارائه شده است (27، 48، 55). با توجه به اینکه عموما نیاز گیاه به تنظیمکنندههای رشدی، در شرایط درونشیشه با توجه به نوع و غلظت ترکیبات معدنی محیط کشت متفاوت است (22، 23، 54)؛ در این مطالعه تأثیر مقادیر مختلف این تنظیمکننده رشدی روی میزان نوساقهزایی همراه با محیطکشتهای تغییر یافته بررسی خواهد شد. ال-گلوتامین از مهمترین اسید آمینههای درونسلولی میباشد که به عنوان منبع نیتروژن نقشهای متعددی را در متابولیسم سلولی ایفا مینماید. افزودن این اسید آمینه به ترکیبات محیط کشت در بهبود بازدهی باززایی از کالوس، دانه گرده، جنینزایی سوماتیکی و همچنین بهبود شاخصهای رشدی در مرحله ریزازدیادی گونههای چوبی تأثیر بارزی داشته است (5، 15، 25، 52). در این مطالعه تأثیر ال-گلوتامین در مرحله نوساقهزایی پسته، به عنوان منبع نیتروژن در محیطکشتهای تغییر یافته روی میزان نوساقهزایی و رشد کیفی پایه رویشی مذکور مورد مطالعه قرار خواهد گرفت. ریشهزایی پسته در شرایط درونشیشه به عوامل مختلفی ازجمله ژنوتیپ، نوع و غلظت تنظیمکنندههای رشدی بستگی دارد؛ بهطوریکه استفاده از IBA (Indole-3-butyric acid) و NAA(1-Naphtaleneacetic acid) در گونههای مختلف Pistacia بیشترین درصد موفقیت را داشتهاند (4، 51، 55)؛ از اینرو در این مطالعه تأثیر مقادیر مختلف این تنظیمکنندههای رشدی در ریشهزایی پایهرویشی قزوینی مطالعه خواهد شد.
مواد و روشها
الف) ماده گیاهی، ضدعفونی و شرایط کشت: سرشاخههای پایهرویشی پسته قزوینی (P. vera, cv. Ghazvini) در بازه زمانی اواخر زمستان تا اوایل بهار از مرکز تحقیقات کشاورزی استان قزوین تهیه و به آزمایشگاه منتقل گردید. قطعات ساقه دارای 1-2 جوانه حدود 2 سـاعت در زیر آب جاری شستـشو، سـپس بـا الکـل 96 درصد بـه مـدت 4-3 ثانیـه و کلریـد جیـوه 05/0 درصد به مـدت 4-3 دقیقـه ضـدعفونی و در نهایت 3 مرتبه با آب مقطـر اسـتریل شستـشو شدند. سپس هر دو طرف قطعات ساقه بمنظور حذف مناطق آسیب دیده بریده شده و در محیط کشت MS حاوی BAP و IBA بهترتیب با غلظتهای 1/1 و 1/0 میلیگرم در لیتر، 30 گرم در لیتر ساکارز، 7/5 : pHو 7/5گرم در لیتر فیتوآگار (Merck) به عنوان جامدکننده، کشت و در اتاق رشد در دمایC° 2±25 و شرایط نوری 8/16 ساعت (تاریکی/روشنایی) با لامپهای سرد-سفید با شدت روشنایی mol m-2 S-1µ 40 قرار گرفتند. پس از شروع رشد جوانههای جانبی و انتهایی، در دوره رشدی 30 روزه بمنظور تولید ماده گیاهی مورد نیاز، نوساقههای رشد یافته به جداکشتهای حاوی 1 تا 2 جوانه تقسیم و به محیط کشت جدید منتقل گردید (16).
ب) تأثیر محیطکشتهای مختلف روی متغیرهای رشدی: در این آزمایش تأثیر محیط کشتهای MS، DKW، WPM، GNH (41)، GNH-A یاGNH-B(جدول 1) روی متغیرهای رشدی پایه رویشی قزوینی مورد ارزیابی قرار گرفت. به هریک از ترکیبات محیط کشت، BAP و IBA بهترتیب 1/1 و 1/0 میلی گرم درلیتر، 30 گرم در لیتر ساکارز و 7/5 گرم در لیتر آگار (Merck) اضافه و پس از تنظیم 7/5:pH اتوکلاو گردید (18). به ازای هرتیمار 4 ظرف شیشهای حاوی 280 سیسی با دربهای کریستالی در نظر گرفته شده و در هر ظرف 4 جداکشت با 1-2 جوانه جانبی (به عبارتی 16 تکرار بهازای هرتیمار محیط کشت) کشت و به اتاق رشد با شرایط نوری و دمای یاد شده در بالا منتقل گردیدند. پس از 30 روز از شروع آزمایش صفات رشدی از قبیل تعداد جوانه، تعداد نوساقه، طول نوساقه (cm) و وزن تر (g) تولید شده به ازای هر جداکشت، یادداشتبرداری گردید.
جدول 1- ترکیبات معدنی محیطکشتهای مورد استفاده برای ریز ازدیادی پایه رویشی قزوینی
|
Media (mg/l) |
|||||
|
MS Murashige and Skoog, 1962 |
DKW Driver and Kuniyuki, 1984 |
WPM McCown, 1980 |
GNH Nezami et al, 2010 |
GNH-A* |
GNH-B* |
Macroelements |
|
|
|
|
|
|
NH4NO3 |
1650 |
1416 |
400 |
1650 |
800 |
400 |
KNO3 |
1900 |
- |
- |
25 |
25 |
25 |
MgSO4.7H2O |
370 |
740 |
370 |
540 |
540 |
540 |
CaCl2.2H2O |
440 |
147 |
96 |
- |
- |
- |
Ca(NO3)2.4H2O |
- |
1960 |
556 |
800 |
400 |
400 |
KH2PO4 |
170 |
259 |
170 |
300 |
300 |
300 |
NaH2PO4 |
- |
- |
- |
50 |
50 |
50 |
K2SO4 |
- |
1650 |
990 |
- |
- |
1560 |
Microelements |
|
|
|
|
|
|
MnSO4.H2O |
9/16 |
5/33 |
3/22 |
9/16 |
9/16 |
9/16 |
ZnSO4.7H2O |
6/8 |
17 |
6/8 |
6/8 |
6/8 |
6/8 |
H3BO3 |
2/6 |
8/4 |
2/6 |
2/6 |
2/6 |
2/6 |
FeSO4.7H2O |
8/27 |
4/33 |
8/27 |
8/27 |
8/27 |
8/27 |
Na2EDTA |
3/37 |
7/44 |
3/37 |
3/37 |
3/37 |
3/37 |
KI |
83/0 |
- |
- |
83/0 |
83/0 |
83/0 |
CuSO4.5H2O |
025/0 |
25/0 |
25/0 |
025/0 |
025/0 |
025/0 |
CoCl2.6H2O |
025/0 |
- |
- |
025/0 |
025/0 |
025/0 |
Na2MoO4.2H2O |
25/0 |
39/0 |
25/0 |
25/0 |
25/0 |
25/0 |
Vitamins |
|
|
|
|
|
|
Thiamine-HCl |
1/0 |
2 |
1 |
1/0 |
1/0 |
1/0 |
Nicotinic acid |
5/0 |
1 |
5/0 |
5/0 |
5/0 |
5/0 |
Pyridoxine-HCl |
5/0 |
2 |
5/0 |
5/0 |
5/0 |
5/0 |
Glycine |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
myo-Inositol |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
* Nezami-Alanagh و همکاران (42)
ج) تأثیر ال-گلوتامین و BAP روی متغیرهای رشدی: براساس نتایج حاصل از تأثیر محیط کشت، تأثیر مقادیر مختلف BAP (1/1، 8/1 یا 6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) در محیط کشتهای GNH-A و GNH-B روی متغیرهای رشدی جداکشتهای قزوینی مورد ارزیابی قرار گرفت. شرایط آزمایش و نگهداری جداکشت مطابق روش یادشده در قسمت بالا بود.
د) تأثیر نوع اکسین روی ریشهزایی: براساس نتایج گزارش شده توسط سایر محققان (4، 51، 55)، در این آزمایش تأثیر IBA و NAA بطور جداگانه در مقادیر 0/0، 1، 2 یا 3 میلیگرم درلیتر روی القاء و توسعه ریشه نوساقههای پایهرویشی قزوینی در محیطکشت GNH حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و 7/5 گرم در لیتر آگار مطالعه شد. به ازای هر تیمار 4 تکرار با 4 جداکشت در هر تکرار در نظر گرفته شده و پس از 30 روز میزان ریشهزایی، درصد ریشهزایی، تعداد و طول ریشههای ایجاد شده به ازای هر ریزنمونه یادداشتبرداری گردید.
تجزیه و تحلیل آماری: آزمایشها بهصورت فاکتوریل در قالب طرحهای کاملا تصادفی انجام شدند. برای تجزیه و تحلیل دادهها از نرمافزارهای آماری SAS 9.1 استفاده شد. لازم به ذکر است که قبل از تجزیه و تحلیل دادهها، باقیمانده دادههای خام محاسبه شده و بعد از نظر نرمال بودن با آزمون Shapiro- Wilk مورد بررسی قرار گرفته و در صورت نیاز برای دادههای شمارشی (از قبیل تعداد نوساقه تشکیل شده، تعداد جوانه و غیره) از تبدیل ریشه دوم () و تبدیل زاویهای (Arcsin ) برای دادههای درصدی (درصد ریشهزایی) استفاده شد. مقایسه میانگینها توسط آزمون چند دامنه دانکن در سطح (01/0 =α) انجام شد.
نتایج
بیش از 60 درصد جداکشتهای ضدعفونی شده براساس روش یادشده در قسمت مواد و روشها عاری از هرگونه آلودگی باکتریایی و قارچی بود. باوجوداین، ترشح ترکیبات فنولی بهویژه در طول 2 تا 3 ماه اول شروع آزمایش به عنوان یکی از محدودیتهای رشدی پایهرویشی قزوینی بود. بدین منظور انتقال جداکشتها به محیط کشت جدید و شستشوی جداکشتها در زیر لامینایرفلو به مدت 2-3 دقیقه با آب مقطر استریل هر 2-3 روز، تأثیر بسیار زیادی روی بقای جداکشتها و جوانهزنی سریع آنها داشت.
الف) تأثیر محیطکشت روی متغیرهای رشدی: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس بیانگر تأثیر معنیدار محیط کشتهای مختلف روی میزان نوساقهزایی (0003/0=P)، تعداد جوانه (0001/0> P)، رشد طولی (0080/0=P) و وزن تر (0524/0=P) بود (جدول 2).
جدول 2- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر نوع محیطکشت روی برخی صفات رشدی
منبع تغییرات |
میانگین مربعات (MS) |
||||
درجه آزادی |
میزان نوساقهزایی |
تعداد جوانه |
رشد طولی نوساقه cm)) |
وزن تر (g) |
|
محیطکشت |
5 |
** 0863/0 |
**2373/0 |
**5941/1 |
* 0346/0 |
خطا |
74 |
0163/0 |
0318/0 |
4681/0 |
0149/0 |
کل |
79 |
|
|
|
|
*بیانگر اختلاف معنیدار در سطح 05/0=α و ** بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 01/0=α میباشد
جدول3- مقایسه آزمون چند دامنهای دانکن تاثیر نوع محیطکشت روی برخی صفات رشدی
نوع محیطکشت |
میزان نوساقهزایی |
تعداد جوانه |
رشد طولی نوساقه (cm) |
وزن تر (g) |
MS |
bc32/0 ± 83/2 |
c43/2±08/17 |
ab19/0 ± 36/1 |
ab05/0 ± 38/0 |
DKW |
c32/0 ± 5/2 |
c79/1±11/16 |
a24/0 ± 91/1 |
b02/0 ± 29/0 |
WPM |
ab5/0 ± 83/3 |
bc24/2±00/21 |
b11/0 ± 00/1 |
b03/0 ± 29/0 |
GNH |
ab3/0 ± 92/3 |
bc31 /2±30/23 |
a11/0 ± 48/1 |
a03/0 ± 39/0 |
GNH-A |
a46/0 ± 23/4 |
a16/3±46/34 |
ab18/0 ± 43/1 |
ab03/0 ± 34/0 |
GNH-B |
a51/ 0± 66/4 |
b93/2±66/25 |
b1/0 ± 08/1 |
b03/0 ± 27/0 |
حروف مختلف در هر ستون بیانگر اختلاف معنیدار در سطح 01/0=α بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن میباشد.
براساس آزمون مقایسه چند دامنه دانکن، در حالیکه بیشترین میزان نوساقهزایی و تعداد جوانه بهازای جداکشت با اختلاف معنیدار در محیطکشتهای GNH-B و GNH-A بهترتیب 51/ 0± 66/4 و16/3 ± 46/34 بدست آمد؛ رشد طولی نوساقههای رشد یافته در محیطکشتهای DKW و GNH بهترتیب با cm24 /0 ± 91/1 و cm11/0 ± 48/1 از میانگین بیشتری برخوردار بودند. همچنین بیشترین وزن تر در محیطکشت GNH (g03/0 ± 39/0) بدست آمد (جدول 3).
ب) تأثیر ال-گلوتامین و BAP روی متغیرهای رشدی: با توجه به نتایج مطلوب استفاده از محیط کشتهای تغییر یافته GNH-A و GNH-B روی برخی صفات رشدی از قبیل نوساقهزایی و تعداد جوانه، بهمنظور بهبود رشد طولی و وزن تر نوساقههای رشد یافته، تأثیر مقادیر مختلف ال-گلوتامین و BAP روی هر دو محیطکشت مزبور بطور جداگانه بررسی شد. نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس بیانگر تأثیر متقابل معنیدار نوع محیط کشت تغییریافته × BAP روی میزان نوساقهزایی و تعداد جوانه تولید شده (بهترتیب 0192/0=P و0001/0> P)؛ معنیدار بودن اثرات اصلی BAP و ال-گلوتامین روی رشد طولی (بهترتیب با 0001/0> P و 0180/0=P)؛ نوع محیط کشت (0019/0=P)، BAP (0001/0=P) و ال-گلوتامین (0297/0=P) روی وزن تر بود (جدول 4).
بر اساس نتایج حاصل از آزمون مقایسه چند دامنه دانکن (جدول 5)، تأثیر مقدار تنظیمکننده رشدی روی میزان نوساقهزایی بطور معنیداری متأثر از نوع محیط کشت بهکار برده شده بود؛ بهطوریکه بیشترین تعداد نوساقه بهازای ریزنمونه (48/0± 66/6) با اختلاف معنیداری نسبت به سایر تیمارهای هورمونی مورد مطالعه در این آزمایش، در محیط کشت GNH-A حاوی mg/l 6/3 BAP مشاهده گردید. استفاده از BAP (1/1 یا 8/1 mg/l) یا ال-گلوتامین (mg/l800) منجر به افزایش طول نوساقهها تا cm22/1 با اختلاف معنیدار نسبت به سایر تیمارها گردید. صفت وزن تر نیز که براساس آنالیز تجزیه واریانس بطور معنیداری متأثر از اثرات اصلی تیمارهای بکار برده شده در این آزمایش شده بود؛ بهنحویکه بیشترین وزن تر (تا g 01/0± 31/0) بطور جداگانه در محیط کشت GNH-Aهمراه با mg/l 8/1 BAP یا mg/l800 ال-گلوتامین بدست آمد.
جدول 4- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر نوع محیط کشت، ال-گلوتامین و BAP روی برخی صفات رشدی
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات (MS) |
|||
میزان نوساقهزایی |
تعداد جوانه |
رشد طولی نوساقه(cm) |
وزن تر (g) |
||
محیط کشت |
1 |
*0770/0 |
**2356/0 |
ns5332/0 |
**1351/0 |
BAP |
2 |
**2159/0 |
**2013/0 |
**8170/2 |
**2669/0 |
ال-گلوتامین |
3 |
ns 0426/0 |
ns0497/0 |
*6052/0 |
*1248/0 |
محیط کشت BAP × |
2 |
*0854/0 |
**2938/0 |
ns5271/0 |
ns0226/0 |
محیط کشت× ال گلوتامین |
3 |
ns 0441/0 |
*1041/0 |
ns0520/0 |
ns 0705/0 |
× BAP ال-گلوتامین |
6 |
ns 0233/0 |
ns0518/0 |
ns0832/0 |
ns 1404/0 |
ال-گلوتامین× محیطکشت BAP × |
6 |
ns 0271/0 |
ns0436/0 |
ns1761/0 |
ns0545/0 |
خطا |
248 |
0212/0 |
0290/0 |
1769/0 |
0136/0 |
کل |
271 |
|
|
|
|
ns بیانگر اختلاف غیر معنیدار؛ * اختلاف معنیدار در سطح 05/0=α و ** اختلاف معنیدار در سطح 01/0=α براساس آزمون چند دامنهای دانکن میباشد.
ج) تأثیر اکسین روی ریشهزایی پایههای رویشی قزوینی: نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که درصد ریشهزایی بطور معنیداری متأثر از نوع تنظیمکننده رشدی (0004/0=P) و غلظت مورد استفاده (0559/0=P) بود (جدول 6)؛ بهطوریکه بیشترین درصد ریشهزایی (%5 ±20) در محیط کشت GNH حاوی mg/l 2 NAA مشاهده شد (شکل 1الف و ب). براساس جدول تجزیه واریانس تأثیر متقابل نوع تنظیمکننده رشدی × غلظت برای دو صفت تعداد ریشه (0388/0=P) و طول ریشه (0146/0=P) معنیدار بود؛ بهنحویکه غلظت mg/l 2 NAA منجر به حصول 75/0± 93/1 ریشه در هر جداکشت با طول cm26/0± 78/0 گردید (جدول 6 و شکل 1).
جدول 6- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر تنظیمکنندههای رشدیIBA و NAA روی صفات ریشهزایی
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
درصد ریشهزایی (%) |
تعداد ریشه |
طول ریشه (cm) |
||||||||
تنظیم کننده رشد |
1 |
**2770/1 |
**4133/0 |
*9707/2 |
||||||||
غلظت |
3 |
*2483/0 |
*0891/0 |
*8196/0 |
||||||||
غلظت × تنظیم کننده رشد |
3 |
ns2128/0 |
*0856/0 |
*9759/0 |
||||||||
خطا |
120 |
0957/0 |
0297/0 |
2673/0 |
||||||||
کل |
127 |
|
|
|
||||||||
|
(mg/l)NAA |
|
(mg/l)IBA |
|
||||||||
3 |
2 |
1 |
0/0 |
|
3 |
2 |
1 |
0/0 |
|
|||
تعداد ریشه به ازای ریزنمونه# |
ab51/0±93/0 |
a75/0±93/1 |
b24/0±43/0 |
b0/0 |
a06/0±06/0 |
a0/0 |
a0/0 |
a0/0 |
||||
طول ریشه به ازای ریزنمونه |
ab10/0±21/0 |
a26/0±78/0 |
b18/0±34/0 |
b0/0 |
a12/0±12/0 |
a0/0 |
a0/0 |
a0/0 |
||||
ns بیانگر اختلاف غیر معنیدار؛ * اختلاف معنیدار در سطح 05/0=α و ** اختلاف معنیدار در سطح 01/0=α میباشد؛#حروف مختلف در هر سطر بیانگر اختلاف معنیدار در سطح 01/0=α بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن میباشد.
شکل1-مقایسه آزمون چند دامنهای دانکن تاثیر عوامل اصلی نوع (الف) و غلظت تنظیمکننده رشدی (ب) روی درصد ریشهزایی. حروف متفاوت بالای ستونها بیانگر اختلاف معنیدار در سطح 01/0=α میباشد.
بحث و نتیجهگیری
مرحله ضدعفونی و استقرار جداکشت درختان میوه بهویژه پسته باتوجه به پوشیده شدن جوانهها توسط فلسهای متعدد و تولید ترکیبات فنولی مختلف با مشکلات متعددی ازجمله آلودگی باکتریایی، قارچی و مرگ جوانهها بدلیل تولید ترکیبات فنولی سمی همراه است. با توجه به اینکه سن گیاه و همچنین زمان نمونهبرداری بهعنوان یکی از عوامل تأثیرگذار در افزایش بازدهی ضدعفونی محسوب میشود (22)؛ طی نمونهبرداریهای متعدد در بازه زمانی اسفند ماه تا اردیبهشت ماه، استقرار مواد گیاهی مربوط به فرودین ماه به دلیل میزان آلودگی پایین و تولید فنول کمتر، با موفقیت بیشتری همراه بود (نتایج نشان داده نشده است). علاوه بر این تأثیر نوع ماده ضدعفونی در مراحل ضدعفونی و استقرار بخوبی شناخته شده است. کلرید جیوه براساس نفوذپذیری سریع و قدرت بیشتر آن در ضدعفونی جوانههای پسته بازدهی ضدعفونی را بیش از %60 افزایش داد.
استفاده از محیط کشت بهینه بهعنوان یکی از ملزومات اصلی دستیابی به دستورالعملهای موفق در زمینه ریزازدیادی گونههای مختلف در شرایط درونشیشه ازجمله پسته بهشمار میآید. مشکلات متعددی از قبیل شیشهای شدن (Hyperhydricity)، نکروزگی نوک ساقه (shoot-tip necrosis) و تولید کالوس پایه در انتهای نوساقه در نتیجه استفاده از محیط کشتهای رایج از قبیل MS، WPM و DKW گزارش شده است (3، 4، 18، 56). باتوجه به اینکه عموما هریک از محیط کشتهای MS، DKW و WPM بطور اختصاصی برای برخی از گونههای گیاهی بهینهسازی شدهاند، استفاده آنها به شکل رایج در ریزازدیادی گونههای مختلف گیاهی، در موارد متعدد عموما همراه با بروز مشکلاتی از قبیل فقر یا مسمویت عنصر و عناصر خاص (ناشی از کمبود یا بیش از حد آستانه تحمل رشدی گیاه) در شرایط درونشیشه همراه بوده است (8، 9، 28). در مطالعات پیشین استفاده از محیط کشت GNH به دلیل برخی تغییرات در عناصر پرمصرف در مقایسه با MS، منجر به کاهش و یا حذف برخی از نارساییهای رشدی فیزیولوژیکی در پسته گردید (16-17، 34-37). در این پژوهش بر اساس گزارش قبلی (44)، محیط کشتهای تغییر یافته (GNH-A و GNH-B) طراحی و تاثیر آنها همراه با سایر محیط کشتهای MS، DKW، WPM یا GNH روی برخی صفات رویشی پسته مورد بررسی قرار گرفت (جدول 1). نتایج حاصل از مقایسات چند دامنهای دانکن (جدول 3) نشان داد که استفاده از محیطکشت تغییر یافته GNH-A در مقایسه با سایر محیط کشتهای مورد استفاده، منجر به افزایش معنیدار در میزان نوساقهزایی و تعداد جوانه بهازای هر جداکشت گردید.
نظر به اینکه در محیط کشت GNH-A مقدار نمک NH4NO3 در مقایسه با محیط کشت GNH به 2/1 تقلیل یافته است؛ یکی از دلایل افزایش در میزان نوساقهزایی را میتوان به تغییر نسبت یونهای نیترات به آمونیوم مرتبط دانست. نسبت NO3- به NH4+ همراه با مقدار مناسب نیتروژن کل از متغیرهای مؤثر در افزایش میزان ریزازدیادی گونههای گیاهی به شمار میآید (13، 28، 32، 44). همچنین در برخی گزارشها، غلظت NO3- توصیه شده در محیط کشت MS (mM4/39( از عوامل مهم محدود کننده رشدی در ریزازدیادی برخی گونههای گیاهی حساس به ترکیبات محیط کشت ذکر شده است. بهطوریکه کاهش غلظت NO3- به MS2/1 منجر به بهبود صفات رشدی در Prunus sp.، از گونه های حساس به ترکیبات محیط کشت گردید (20، 23، 28، 44، 49). از طرفی، مقدار کم نیتروژن توصیه شده در محیط کشت WMP (mM71/14) منجر به فقر غذایی همراه با بروز برخی نارساییهای رشدی از قبیل علائم کلروزگی با تأثیرات متعاقب منفی روی تعداد نوساقه و رشد کیفی آنها در ریزازدیادی زردآلو، از گونههای حساس جنس Prunus sp. به منابع نیتروژن محیط کشت گردید (10). بررسی و مقایسه دقیقتر تأثیر 40 نوع محیط کشت مختلف توسط شبکه عصبی مصنوعی (Artificial Neural Networks) روی یکی از پایههای رویشی جنس Prunus (GF677)، ضمن مشخص کردن تأثیر یونهای عناصر پر مصرف روی صفات رشدی مورد مطالعه از قبیل میزان نوساقهزایی، تعداد جوانه و وزن تر، کاهش غلظت نمکهای NH4NO3و Ca(NO3)2.4H2O به GNH2/1 در بهبود هرچه بیشتر شاخصهای رشدی پیشبینی گردید (44) که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابفت دارد. اخیرا پوتونگ و رید (2016) میزان نوساقهزایی را در Prunus sp. با ایجاد تغییرات در نسبتهای NH4+:NO3- (mM40:mM10؛ mM60:mM30؛ mM60:mM45 در مقایسه با محیط کشت MS بطور معنیداری افزایش دادند (50). در این مطالعه تغییر نسبت NH4+:NO3- به حدود 1:1 (mM24/10:mM10) در مقایسه با سایر تیمارهای مورد مطالعه تأثیر معنیداری در بهبود میزان نوساقهزایی داشت؛ که احتمالا بیانگر نیازهای متفاوت گونههای گیاهی به مقادیر مختلف عناصر پرمصرف و کممصرف میباشد.
افزودن BAP به محیط کشت در مقادیر mg/l 5/0-0/4 در ریزازدیادی گونههای مختلف Pistacia sp. منجر به افزایش معنیدار در میزان نوساقهزایی گردیده است (12-13، 38-39، 44-48)، باوجوداین نظر به این مهم که میزان تنظیمکننده رشدی مورد نیاز در مرحله ریزازدیادی با توجه به توازن ترکیبات محیط کشت متغیر است (1، 2، 23)، در این مطالعه تأثیر BAP روی تمامی صفات رشدی معنیدار بود بهطوریکه بیشترین میزان نوساقهزایی در غلظت mg/l 6/3 BAP در محیط کشت GNH-A دیده شد. باوجوداین، استفاده از مقادیر بیشتر از mg/l 8/1 این هورمون تأثیر منفی روی برخی صفات رشدی (مانند رشد طولی) داشت. در گزارش قبلی (17) نتایج بدست آمده نشان داد که افزون mg/l 1 BAP در ترکیب با mg/l 2/0-1/0 IBA منجر به افزایش معنیدار روی برخی صفات رشدی از قبیل روند نوساقهزایی و وزن تر گردید؛ که با نتایج ما در این مطالعه مطابقت دارد.
ال-گلوتامین بهعنوان یکی از مهمترین آمینواسیدهای داخل سلولی با تأمین نیتروژن مورد نیاز در متابولیسم سلولی، نیتروژن مورد نیاز سلول را برای بیوسنتز اسیدهای آمینه، اسیدهای نوکلئیک و سایر ترکیبات حاوی نیتروژن را فراهم میسازد (24). ال-گلوتامین اضافه شده به ترکیب محیط کشت در بهبود شاخصهای رشدی سایر گونههای گیاهی در شرایط درونشیشه مؤثر بوده است (5، 24، 52، 53). در این مطالعه براساس نتایج حاصل (جدول 5)، افزودن mg/l800 ال-گلوتامین در بهبود رشد طولی نوساقهها و وزن تر تأثیر معنیداری داشت. با وجود تاثیر معنیدار هر دو نوع تیمار ال-گلوتامین و BAP در بهبود صفات رشد طولی و وزن تر، باتوجه به پایین بودن مقدار این صفات در مقایسه با محیط کشتهای استاندارد مانند GNH (نمودار1 و جدول 3)، به نظر میرسد که مطالعات بیشتری با در نظر گرفتن تأثیر سایر عوامل رشدی از قبیل منابع کربنی و یا سایر تنظیمکنندههای رشدی برای بهبود هرچه بیشتر محیط کشت تغییر یافته GNH-A لازم است.
مرحله ریشهزایی با توجه به نوع ژنوتیپ متأثر از انواع مختلف تنظیمکنندههای رشدی است. بهطوریکه استفاده از NAA در تطابق با نتایج گزارش شده توسط سایرین (39) منجر به افزایش معنیدار بازدهی ریشهزایی گردید. در حالیکه در برخی کولتیوارهای P. vera بازدهی ریشهزایی در حضور IBA بهمراتب بیشتر از NAA گزارش شده است (30، 33، 55، 56)؛ که با نتایج ما مغایرت دارد.
در این پژوهش در راستای بومیسازی ریزازدیادی یکی از پایههای مهم رویشی پسته، ضرورت اعمال برخی تغییرات در ترکیبات محیط کشت، استفاده از BAP و همچنین کارایی استفاده از گلوتامین بهعنوان اسید آمینه تأمین کننده منبع نیتروژن بهمنظور بهبود پارامترهای رشدی تشریح گردید. همچنین در مرحله ریشهزایی، نتایج گرفته شده بیانگر تأثیر بارز NAA در مقایسه با IBA روی افزایش صفات ریشهزایی بود.
سپاسگزاری
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه بینالمللی امام خمینی(ره) و با کد طرح پژوهشی 11606 در آزمایشگاه کشت بافت گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی انجام شده است. بدینوسیله نویسندگان مراتب تشکر و امتنان خود را از حمایتهای انجام شده در طی اجرای پروژه ابراز میدارند.