نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه تبریز
چکیده
کلزا به عنوان یکی از محصولات تولید کننده دانههای روغنی از اهمیت ویژهای برای تولید روغن خوراکی گیاهی برخوردار است ولی تحت تنش شوری به میزان قابل ملاحظهای تحت تاثیر اثرات منفی تنش قرار میگیرد. به منظور مطالعه اثرات تنش شوری روی برخی صفات رشدی و تغییرات الگوی پروتئوم بذر تحت تنش شوری شدید، رقم حساس ساری گل در شرایط گلخانهای کشت و تحت تنش شوری در سه سطح 0، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم قرار گرفت. کشت بذور در سیسنم هیدروپونیک از نوع بستر جاری صورت گرفت. برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذور، از تکنیک الکتروفورز ژل دوبعدی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که با افزایش سطح تنش وزن تر، وزن خشک بخش هوایی، ارتفاع بوته، عملکرد دانه و وزن صد دانه به طوری معنی داری کاهش پیدا میکنند و میزان پرولین در برگ نیز افزایش پیدا میکند. مقایسه الگوی پروتئوم بذور نشان داد که تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار) 29 لکه پروتئینی دچارتغییرات بیان میشوند. شناسایی این لکهها مشخص کرد که این پروتئینها در شش گروه عملکردی شامل: متابولیسم کربن، دفاع-سمزدایی، پروتئین ذخیرهای، فتوسنتز، متابولیسم نیتروژن و سنتز-تجزیه در گیر هستند. بیشتر لکههای دارای تغییرات بیان مربوط به گروه متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بودند. تنش شوری بطور معنیداری باعث کاهش خصوصیات رشدی ساری گل و تغییر الگوی پروتئومی و سطح بیان بذور گردید. بیش از 65 درصد لکههای پروتئینی در بذر ساری گل کاهش بیان معنیدار پیدا نشان دادند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Proteomic profiling analysis of rapeseed under salinity stress
نویسنده [English]
چکیده [English]
Rapeseed as one of the crops which is being cultivated in order to produce edible oil, have essential importance, however, it is severely influenced by salt stress. In the aim of studying effects of salinity on the growth characteristics and proteome profiling changes, Sarigol (salt-sensitive) was cultured under greenhouse conditions and salinity stress exerted at three levels, including 0, 175 and 350 mM NaCl. Seeds were sown in the current hydroponic system. To study the changes of proteome profile, 2-dimentional gel electrophoresis technique was used. The results indicated that fresh weight, shoot dry weight, shoot height, grain yield, and 100-grain weight significantly decreased with increasing intensity of salinity stress and proline concentration increased in leaves as well. Comparing the proteome profile of seed demonstrated that 29 spots with differentially expression changes occurred under 350 mM NaCl. Differentially expression spots were identified and grouped in six functional categorize, including carbon metabolism, defense/detoxification, storage proteins, photosynthetic, nitrogen metabolism, and synthesis/degradation. The majority of identified proteins involved in carbon metabolism and defense/detoxification. Salt stress decreased significantly the growth characters of Sarigol and altered proteome profile and protein expression of seeds. More than 60% of spots indicated significant down-regulation.
کلیدواژهها [English]
تجزیه پروتئوم بذر کلزا تحت تنش شوری
علی بندهحق*، شیدا علیپور قربانی،محمود تورچیو رضا شکری قرهلو
تبریز، دانشگاه تبریز، دانشگاه تبریز، گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
تاریخ دریافت: 30/11/94 تاریخ پذیرش: 1/3/96
چکیده
کلزا بهعنوان یکی از محصولات تولید کننده دانههای روغنی از اهمیت ویژهای برای تولید روغن خوراکی گیاهی برخوردار است ولی تحت تنش شوری به میزان قابل ملاحظهای تحت تأثیر اثرات منفی تنش قرار میگیرد. بهمنظور مطالعه اثرات تنش شوری روی برخی صفات رشدی و تغییرات الگوی پروتئوم بذر تحت تنش شوری شدید، رقم حساس ساری گل در شرایط گلخانهای کشت و تحت تنش شوری در سه سطح 0، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم قرار گرفت. کشت بذرها در سیسنم هیدروپونیک از نوع بستر جاری انجام شد. برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذرها، از تکنیک الکتروفورز ژل دوبعدی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که با افزایش سطح تنش وزن تر، وزن خشک بخش هوایی، ارتفاع بوته، عملکرد دانه و وزن صد دانه بهطوری معنیداری کاهش پیدا کرد و میزان پرولین در برگ نیز افزایش پیدا نمود. مقایسه الگوی پروتئوم بذرها نشان داد که تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار) 29 لکه پروتئینی دچار تغییرات بیان میشوند. شناسایی این لکهها مشخص کرد که این پروتئینها در شش گروه عملکردی شامل متابولیسم کربن، دفاع-سمزدایی، پروتئین ذخیرهای، فتوسنتز، متابولیسم نیتروژن و سنتز-تجزیه درگیر هستند. بیشتر لکههای دارای تغییرات بیان مربوط به گروه متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بودند. تنش شوری بطور معنیداری باعث کاهش خصوصیات رشدی ساری گل و تغییر الگوی پروتئومی و سطح بیان بذرها گردید. بیش از 65 درصد لکههای پروتئینی در بذر ساری گل کاهش بیان معنیدار پیدا نشان دادند.
واژههای کلیدی: بذر، تنش شوری، پروتئومیکس، ساری گل
* نویسنده مسئول، تلفن: 04133392031 ، پست الکترونیکی: bandehhagh@yahoo.com
مقدمه
شوری از عوامل مهم کاهش رشد و عملکرد بسیاری از محصولات زراعی در مناطق خشک و نیمه خشک دنیا به شمار میرود و اثرات زیانباری روی عملکرد گیاهان دارد. کره زمین یک سیاره شور است و اکثریت آب آن محتوی حدود 30 گرم بر لیتر کلرید سدیم میباشد. این آبهای شور زمینهایی که محصولات کشاورزی در آن کشت میشوند را تحت تأثیر قرار میدهند و خطری جدی برای توسعه کشت محصولات کشاورزی هستند (31).
مکانیسمهای مولکولی دخیل در مقاومت گیاهان به شوری بسیار پیچیده است و ژنهای زیادی در آن دخیل میباشند. برای مطالعه مکانیسمهای تحمل به تنش شوری، شناسایی عوامل، مسیرهای بیولوژیکی، پروتئین های دخیل و آگاهی به عملکرد مولکولی آنها در سلول، لازم است که مطالعات مولکولی در دو جهت ژنومیک ساختاری و عملکردی در گیاه کلزا تحت شرایط مختلف تنش شوری انجام شود (35). اطلاعات حاصل از مطالعات ژنومیکس ساختاری اگرچه برای شناسایی ژن راهکار مناسبی است ولی برای پیش بینی و تعیین ساختار و عمل پروتئینها کافی نمیباشد، زیرا تغییرات پس از ترجمه لازمه فعال شدن بسیاری از پروتئینهاست (21). بیشتر این تغییرات را نمیتوان از روی توالی DNA و یا mRNA پیش بینی کرد. رهیافت پروتئومیک امکان مطالعه بیان ژنهای پاسخ دهنده به تنش شوری و شناسایی مسیرهای مولکولی یا انتقال پیام را فراهم میکند (35). در سالهای اخیر، مطالعات زیادی در راستای مطالعه پروتئوم بافتهای مختلف کلزا با هدف شناسایی پروتئینهای پاسخ دهنده به تنش انجام شده است. بنده حق و همکاران (2011) در مطالعهای که روی ارقام حساس و متحمل کلزا تحت تنش شوری انجام دادهاند، گزارش کردهاند که پروتئینهای درگیر در تنش اکسیداتیو، انتقال الکترون، ترجمه و فتوسنتز به طور معنی داری تغییر بیان پیدا میکنند.
دانه کلزا دارای 40 درصد روغن و 17 تا 26 درصد پروتئین میباشد که بخش اعظم پروتئینهای آن را ناپین (Napin)، کروسیفرین (Cruciferin) و الئوسین (Oleosin) تشکیل میدهد. به همین دلیل دانههای کلزا برای استفاده در صنایع غدایی دارای پتانسیل خوبی است (25). از این رو توسعه کشت کلزا برای تولید دانههای روغنی مرغوب برای مصارف خوراکی به دلیل صفات مطلوب آن مورد توجه قرار گرفته است. در ایران کشت کلزا عمدتا به مناطق نیمه خشک اختصاص یافته است که عمدتا دارای خاکهای سدیمی و شور هستند. این موضوع پتانسیل تولید گیاه را با محدودیت رو به رو میکند (1). پروتئوم بذر به طور مستقیم متأثر از تنش شوری نیست ولی بازتابی از پاسخ سایر اندامها همانند برگ و ریشه در فرایند تنش و تحمل آن است که در نهایت بر ترکیب پروتئینی بذر اثر میگذارد. با وجود اینکه پروتئینهای شناسایی شده از مطالعه پروتئوم بذرها، کاندیداهایی برای افزایش تحمل گیاهان به تنش شوری نیستند اما منعکس کننده تأثیرات تنش شوری روی فرایندهای بیولوژیکی بذر هستند (44). در گزارش عیوضلو و همکاران (1392) که در رابطه با تجزیه پروتئوم بذر کلزای رقم Hyola308(مقاوم به شوری) تحت تنش شوری انجام شده است، 28 لکه پروتئینی دارای تغییرات بیان ملاحظه شده است که در این بین سهم عمده پروتئینهای شناسایی شده متعلق به گروه پروتئینهای درگیر در دفاع، سم زدایی و پروتئینهای ذخیره ای بوده است.
برای آگاهی از مکانیسمهای ملکولی واکنش به تنش شوری، شناسایی پروتئینهای دخیل در فریندهای مولکولی یکی راهکارهای موجود و مؤثر است. در راستای این هدف، این مطالعه به منظور بررسی تأثیر تنش شوری روی خصوصیات مورفولوژیکی و شناسایی لکههای پروتئینی با تغییرات بیان معنیدار در بذرهای کلزا اجر گردید.
مواد و روشها
مواد گیاهی و مشخصات سیستم کشت: این آزمایش به منظور بررسی اثر تنش شوری روی صفات مورفولوژیک و الگوی بیان پروتئینهای بذر رقم حساس کلزا (ساری گل) تحت سطوح 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا گردید. بذرهای رقم حساس ساری گل بعد از استریل شدن با استفاده از هیپوکلرید سدیم در پلت های اتوکلاو شده برای جوانه زنی قرار گرفتند. سپس گیاهچههای حاصل در سیستم هیدروپونیک نشاکاری شدند. بعد از یک هفته تنش شوری در سه سطح صفر، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم پس از استقرار کامل گیاهچهها اعمال و تا زمان برداشت گیاهان ادامه یافت. سیستم هیدروپونیک از نوع بستر جاری و کشت درون ماسه بود. از محلول غذایی هوگلند تغییر یافته (6) برای تغذیه گیاهان استفاده گردید. pH محلول غذایی در محدوده 6.0±5.5 تنظیم شد.
اندازهگیری صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی: صفات رشدی شامل وزن تر و خشک بوتهها، ارتفاع بوتهها، عملکرد و وزن صد دانه و میزان پرولین آزاد گیاهان در زمانی که 90 درصد نیامها زرد شده بودند، اندازهگیری گردید. برای محاسبه عملکرد دانه تعداد خورجین و تعداد دانه در هربوته شمارش شدند و بعد وزن صد دانه اندازه گیری شد. برای شمارش بذرها از دستگاه بذر شمار Contador – Pfeuffer Germany استفاده شد. برای اندازه گیری غلظت پرولین در نمونههای (تر) برگ از روش بیتس و همکاران (1973) استفاده شد. مقدار 1/0 گرم از نمونه تر برگ را با 10 میلی لیتر اسید سولفوریک 3% در لوله آزمایشهای مخصوص هر تیمار مخلوط کرده و درب لوله آزمایشها را با فویل بسته و به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای محیط قرار داده شدند. سپس 2 میلی لیتر از عصاره به دست آمده را همراه با 4 میلی لیتر معرف نین هیدرین و دو میلی لیتر اسید استیک گلاسیال در لوله آزمایش ریخته و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم با درجه حرارت 100 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از خارج کردن از حمام و سرد شدن لولهها، 4 میلی لیتر تولوئن به آن اضافه کرده و 20 ثانیه خوب تکان داده تا کاملاً مخلوط شود. در لوله آزمایش دو فاز تشکیل میشود، فاز آلی صورتی رنگ در بالا و فاز آبی بیرنگ و شفاف که در قسمت پایین قرار دارد. فاز آلی برای رنگ سنجی در دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 520 نانومتر استفاده شد. برای رسم منحنی استاندارد از پرولین خالص با غلظت های 0، 50، 100، 200، 250 میکرومولار استفاده و تمام مراحل کار روی آن انجام گردید. در پایان بر اساس منحنی استاندارد رسم شده مقدار پرولین محاسبه گردید.
الکتروفورز ژل دو بعدی: بذر گیاهان شاهد و گیاهان تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار نمک کلرید سدیم) برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم به فریزر oc80- منتقل شدند. از روش پیشنهادی فینی (2002) برای استخراج پروتئینها استفاده شد. تعیین غلظت پروتئینهای استخراج شده برای بار گذاری مقدار صحیحی از محلول پروتئینی در بعد اول به روش برادفورد (1976) انجام شد. الکتروفورز بعد اول با دستگاه (Bio Rad) Protein IEF focusing Cell اجرا گردید. در این بعد پروتئینها بر اساس نقطه ایزوالکتریک در شیب pH 3 تا 10تفکیک گردیدند. سپس بعد دوم برای جداسازی پروتئینیها براساس وزن مولکولی با استفاده از ژل پلی آریلامید واسرشته انجام شد و از مارکرهای پروتئینی برای تعیین وزن مولکولی لکهها استفاده شد. ظاهرسازی لکههای پروتئینی با نیترات نقره بر اساس روش بلوم 1987 با اندکی تغییرات انجام شد. اسکن ژلها با دنسیومتر 800)-(Bio Rad, GS با وضوح بالا ( 6000 dpi) و شناسایی لکههای پروتئینی و کمی کردن آنها با استفاده از نرمافزار Melanie 4.0 انجام گردید. تجزیه دادههای کمی (درصد حجمی لکههای پروتئینی) حاصل از نقاط تکرار پذیر با استفاده از آزمون t در نرمافزار MSTATC انجام شد. فاکتور القا بیش از 2 و کمتر از 0.5 به ترتیب برای تعیین افزایش یا کاهش بیان لکهها پروتئینی در نظر گرفته شد. برای بدست آوردن فاکتور القا لکههای پروتئینی، حجم هر لکه در ژل حاصل از گیاهان تحت تنش شوری، تقسیم بر حجم لکه مربوطه در ژل بدست آمده از گیاهان شاهد (بدون تنش شوری) شد. عدد حاصل برای تعیین معنیدار بودن و یا نبودن و نیز تعیین افزایش یا کاهش بیان یافتن هر لکه مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی، لکههای دارای تغییرات بیان مورد شناسایی قرار گرفتند. نرم افزار آنلاین (http://web.expasy.org/tagident/) Expasy-TagIden برای جستجوی داده پایگاههای پروتئینی به کار برده شد. این نرم افزار با استفاده از وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک به صورت احتمالی پروتئینها را شناسایی میکند.
نتایج
آنالیز دادههای حاصل از اندازه گیریهای مورفولوژیکی نشان داد که اثر تنش شوری روی صفات مورد مطالعه به جز وزن خشک ریشه معنی دار است. عملکرد دانه و وزن صد دانه در سطح 5 درصد و بقیه صفات در سطح 1 درصد معنی دار شدند (جدول 1). مقایسه میانگین دادهها نشان داد که با افزایش شدت تنش شوری کاهش در صفات بیشتر اتفاق میافتد. وزن خشک بخش هوایی در مقایسه با شاهد در بین صفات مورد مطالعه بیشتر کاهش پیدا کرد. همچنین میانگین وزن صد دانه تحت تنش 175 میلی مولار کاهش معنی داری نداشت ولی تحت تنش 350 میلی مولار به طور معنی داری کاهش پیدا کرد.
جدول 1 تجزیه واریانس تاثیر تنش شوری روی صفات رشدی رقم حساس ساری گل
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||||||
|
|
وزن تر بوته |
وزن خشک بخش هوایی |
وزن خشک ریشه |
ارتفاع بوته |
عملکرد دانه |
وزن صد دانه |
پرولین |
تنش |
2 |
162091/55**"> |
1641/814**"> |
226/0 |
16731/207**"> |
1678/276*"> |
160/014*"> |
161212/845**"> |
خطا |
4 |
280/41 |
710/0 |
106/0 |
355/14 |
981/8 |
001/0 |
821/60 |
CV (%) |
|
56/15 |
67/11 |
42/39 |
34 |
75/46 |
15/11 |
91/40 |
*و ** به ترتیب معنی داری در سطح 1 و 5 درصد. CV نشانگر ضریب تغییرات.
در بین صفات مورد مطالعه میانگین وزن صد دانه کمتر تحت تأثیر اثرات منفی تنش شوری قرار گرفت. میزان پرولین آزاد نیز با افزایش سطح تنش شوری کاهش معنی داری پیدا کرد (شکل 1).
تجزیه پروتئوم بذر تحت تنش شدید شوری: برای بررسی تغییرات بیان لکههای پروتئینی از نرم افزار Melanie 4.0 استفاده شد و فاکتور القای بیش از 2 برای تعیین افزایش بیان و کمتر از 0.5 برای مشخص کردن لکههای دارای کاهش بیان در نظر گرفته شد. از بین 513 لکه پروتئینی شناسایی شده توسط نرم افزار، 29 لکه پروتئینی دارای تغییرات بیان معنی دار تحت تنش شدید شوری بودند (شکل 2). با استفاده از نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی لکهها، شناسایی احتمالی لکهها انجام گردید و طبقه بندی لکهها در گروههای عملکردی بر اساس واکنشی که در آن شرکت میکنند انجام شد (15). بر این اساس لکهها در شش گروه عملکردی شامل متابولیسم کربن، دفاع-سمزدایی، پروتئین ذخیرهای، فتوسنتزی، متابولیسم نیتروژن و سه لکه به سنتز-تجزیه مربوط بود و یک لکه ناشناخته ماند (جدول2 و شکل 3).
پروتئینهای درگیر در متابولیسم کربن: بررسی نتایج حاصل نشان داد که بیشتر پروتئینهای دارای تغییرات بیان در پروتئوم بذر کلزا در متابولیسم کربن دخیل هستند. برخی از این لکهها افزایش و برخی کاهش بیان داشتند. لکههای پروتئینی 2، 5، 6 و 9 افزایش بیان، در حالیکه لکههای پروتئینی 11، 12، 18، 21،23، 26، 28 و 29 کاهش بیان نشان دادند (شکل3 و جدول2).
پروتئینهای درگیر در دفاع و سمزدایی: پروتئینهای درگیر در دفاع و سم زدایی همانند پروتئینهای دخیل در متابولسیم کربن برخی افزایش و برخی کاهش بیان پیدا کرده بودند. پروتئینهای که کاهش بیان داشتند بیشتر از پروتئینهای دارای افزایش بیان بودند. دو پروتئین 7 و 8 افزایش بیان داشتند، در حالیکه پروتئینهای 13، 14، 17، 19، 24 و 25 کاهش بیان را نشان دادند (شکل2 و جدول2).
پروتئینهای ذخیرهای: دو لکه پروتئینی مربوط به گروه پروتئینهای ذخیرهای (لکه 3 و 4) تحت تنش شدید افزایش بیان نشان دادند (شکل2 و جدول2).
پروتئینهای دخیل در فتوسنتز:دو پروتئین درگیر در فتوسنتز (لکه 10 و 15) شامل لکه شماره 10 و شماره 15 بهترتیب افزایش و کاهش بیان داشتند (جدول2 و شکل3).
پروتئینهای دخیل در متابولیسم نیتروژن: لکه پروتئینی شماره 27 در این گروه قرار دارد و تحت تنش شوری کاهش بیان نشان داد (شکل2 و جدول2).
شکل 1 - مقایسه میانگین صفات مورد مطالعه. حروف مشابه عدم معنی داری و حروف غیر مشابه معنی داری را نشان میدهند
شکل 2 - لکههای دارای تغییرات بیان معنی دار بر اساس فاکتور القاء، لکههای با فاکتور القا بیش از 2 و کمتر از 0.5 به ترتیب به عنوان افزایش و کاهش بیان در نظر گرفته شدند.
شکل 3 - گروه بندی پروتئینهای با تغییرات بیان معنی دار تحت تنش شوری شدید (350 میلی مولار نمک کلرید سدیم)
شکل 4- الگوی پروتئوم بذر گیاه شاهد (سمت راست) و تنش شوری با 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم (سمت چپ). فلشها لکههای دارای تغییرات بیان را روی ژل گیاه تحت تنش شوری نشان میدهند.
|
|
|
جدول2- مشخصات پروتئینهای دارای تغییرات بیان در بذر تحت تنش شوری شدید |
|
|
|
||||||||||||||
عملکرد |
فاکتور القا |
تئوریMW(kDa)/pI |
مشاهده شده MW(kDa) /pI |
NCBIدر شماره دسترسی |
پروتئین همولوگ |
شماره لکه |
|
|||||||||||||
سنتز/ تجزیه |
32/7 |
52/5-18 |
1/6-5/19 |
24954801 |
Type I small heat shock |
1 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
98/5 |
67/6-0/36 |
92/6-8/34 |
120680 |
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
|
2 |
|
|||||||||||||
پروتئین ذخیرهای |
54/6 |
36/7-1/57 |
21/7-9/56 |
215398472 |
Globulin 3 B |
3 |
|
|||||||||||||
پروتئین ذخیرهای |
98/3 |
78/7-7/66 |
1/8-1/67 |
215398470 |
globulin 3 |
4 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
54/6 |
96/5-8/47 |
6/5-3/43 |
9408184 |
16F0F1"> ATPase alpha subunit |
5 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
10/8 |
83/7-4/25 |
51/7-2/24 |
7579064 |
Cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase |
6
|
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
87/6 |
98/4-7/59 |
2/5-1/59 |
9858781 |
BAC19.13 |
7 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
32/7 |
62/5-9/18 |
3/5-5/17 |
123957 |
Alpha-amylase/ trypsin inhibitor 16CM3"> |
8 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
49/6 |
15/8-7/44 |
9/7-1/43 |
319739540 |
aestivum stearoyl- ACP desaturase |
9 |
|
|||||||||||||
فتوسنتز |
12/8 |
06/9-2/27 |
92/8-1/28 |
2570499 |
23 kDa polypeptide of photosystem II |
10 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
28/0 |
2/5-8/51 |
9/4-3/41 |
6136111 |
UDP- glucose pyrophosphorylase |
11 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
27/0 |
53/5-3/52 |
1/6-9/49 |
340287 |
small subunit ADP glucose pyrophosphorylase |
12 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
26/0 |
62/5-43 |
9/4-3/41 |
75313848 |
Serpin- 16Z1"> C |
13 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
09/0 |
44/5-3/43 |
5/6-9/42 |
224589266 |
Serpin 1 |
14 |
|
|||||||||||||
فتوسنتز |
37/0 |
22/6-4/53 |
5/6-1/55 |
14017580 |
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit |
15 |
|
|||||||||||||
ناشناخته |
35/0 |
81/5-1/86 |
2/6-1/88 |
326510251 |
Predicted protein |
16 |
|
|||||||||||||
عملکرد |
فاکتور القا |
تئوری MW(kDa) /pI |
مشاهده شده MW(kDa) /pI |
NCBIدر شماره دسترسی |
پروتئین همولوگ |
شماره لکه |
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
41/0 |
17/6-77 |
3/6-6/75 |
48093951 |
late embryogenesis abundant protein |
17 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
31/0 |
02/6-48 |
6/6-3/47 |
92875135 |
isocitrate dehydrogenase |
18 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
17/0 |
01/5-33 |
6/5-6/33 |
170692 |
Group 3 late embryogenesis abundant protein |
19 |
|
|||||||||||||
سنتز/ تجزیه |
14/0 |
10-5/80 |
9/4-6/78 |
32765549 |
Cytosolic heat shock protein 90 |
20 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
18/0 |
56/6-2/39 |
9/5-6/37 |
218157 |
cytoplasmic aldolase |
21 |
|
|||||||||||||
سنتز/ تجزیه |
14/0 |
4/9-1/26 |
1/9-2/27 |
37788308 |
Cyclophilin-like protein |
22 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
30/0 |
6/8-1/31 |
9/8-3/32 |
32400764 |
beta amylase |
23 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
18/0 |
1/5-28 |
8/6-5/26 |
15808779 |
Ascorbate peroxidase |
24 |
|
|||||||||||||
دفاع/ سمزدایی |
24/0 |
84/5-30 |
2/6-1/31 |
3688398 |
Ascorbate peroxidase |
25 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
12/0 |
4/6-2/22 |
9/5-3/20 |
2204226 |
alpha-galacrosidase |
26 |
|
|||||||||||||
متابولیسم نیتروژن |
15/0 |
93/5-4/53 |
3/6-6/54 |
1703227 |
Alanine aminotransferase 2 |
27 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
21/0 |
19/6-57 |
1/7-1/56 |
995746 |
ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit |
28 |
|
|||||||||||||
متابولیسم کربن |
22/0 |
89/5-4/58 |
2/6-1/57 |
32812836 |
ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit |
29 |
|
|||||||||||||
پروتئینهای درگیر در سنتز و تجزیه:لکههای شماره 1، 20 و 22 جزء پروتئینهای درگیر در سنتز و تجزیه قرار گرفتند. از بین آنها پروتئین شماره 1 افزایش بیان و پروتئینهای شماره 20 و 22 کاهش بیان نشان دادند (شکل 2).
بحث
تنش شوری به طور قابل ملاحظهای وزن تر و خشک برگ، وزن هزار دانه و عملکرد دانه را کاهش میدهد (32). شوری تأثیرات منفی روی صفات مورفولوژیکی گیاهان دارد و موجب کاهش معنیدار در صفات رشدی مانند سطح برگ، وزن تر و خشک ساقه و کاهش ارتفاع بوته میشود. تجمع یونهای سمی و عدم توانایی گیاه در جذب کافی آب تحت تنش شوری میتواند از دلایل مهم کاهش صفات رشدی گیاهان زراعی تحت تنش شوری باشد (30). پرولین یکی از وسیعترین و گستردهترین اسمولیتها است که تجمع آن در شرایط تنش با عمل تنظیم اسمزی همبستگی زیادی دارد. در گیاهان پرولین از مسیر اسید گلوتامیک یا اورنتین ساخته میشود (45). افزایش تجمع پرولین در گیاه میتواند به تعدیل پتانسیل اسمزی سلول و جذب آب راحت تر از سلولهای مجاور کمک کند. ارقام مقاوم به تنش اسمزی نسبت به ارقام حساس پرولین بیشتری را در برگها تولید میکنند (36).
لکه شماره 2 یکی از آنزیمهای مهم در چرخه کالوین و فتوسنتز گیاه میباشد. توانایی تولید بیشتر این آنزیم توسط گیاه میتواند در حفظ و پایداری چرخه کالوین مؤثر واقع شود. گزارشهای مختلفی در رابطه با نقش بازدارندگی 16 H2O2 "> و برخی از اکسیدانهای دیگر روی فعالیت کاتالازی این آنزیم وجود دارد (46). پروتئین Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) یا لکه شماره 2 نقش مهمی تحت تنش اکسیداتیو ایفا میکند. تحت تنش اکسیداتیو، سلول به مقدار زیادی کوفاکتور NADPH نیاز پیدا میکند. در این زمان پروتئین GAPDH با غیر فعال شدن باعث فعال شدن مسیر پنتوز فسفات میگردد. مسیر پنتوز فسفات با تولید NADPH کوفاکتور لازم را برای سیستمهای آنتی اکسیدانی ازجمله چرخه گلوتاتیون فراهم میکند که نقش مهمی در مقابله با گونههای فعال اکسیژن ایفا میکند (4و34). لکه شماره 5 یکی از زیر واحدهای پایه در کمپلکس 16F0-F1"> میتوکندریایی میباشد. این کمپلکس سنتز/هیدرولیز ATP را انجام میدهد (17و33). افزایش بیان این آنزیم را در واریتههای گندم نان آلوده به آلومینیوم گزارش دادند. لکه شماره 6 در گیاهان عالی به صورت سه ایزوفرم مجزا دیده میشود. بررسی این آنزیم بیشتر در اندامهای فتوسنتز کننده و کمتر در بافتهای هتروتروفیک گیاهان انجام شده است (13). آنزیم GAPDH سیتوزولی (لکه شماره 6) به خوبی میتواند یک تنظیم کننده کلیدی در گلیکولیز باشد (9و26). لکه شماره 11 یک پروتئین هترامر (Heterotetrameric) متشکل از دو زیر واحد بزرگ و دو زیر واحد کوچک در گیاهان عالی است و نقش مهمی در تنظیم سنتز نشاسته دارد (19).
در گیاه گوجه فرنگی پروتئین UDP- glucose pyrophosphorylase دخیل در متابولسیم ساکارز و پلی ساکاریدها است که در شرایط تنش شوری در رقم مقاوم بیان کمتری داشته است اما در رقم حساس تحت تنش کلرید سدیم در ریشه افزایش بیان نشان داده است (28). تجزیه و تحلیل پروتئوم ریشه سویا تحت تنش خشکی نشان داده است که دو آنزیم کلیدی دخیل در متابولیسم کربوهیدرات، UDP- glucose pyrophosphorylase و2,3- bisphosphoglycerate تحت تنش خشکی کاهش بیان داشتند (5). پروتئین Beta amylase (لکه شماره 23) قبل از جوانه زنی بذر بصورت غیر فعال قرار دارد. بعد از شروع مرحله جوانه زنی این آنزیم فعال شده و باعث هیدرولیز پیوند (1->4)-alpha-D-glucosidic موجود در نشاسته شده و تولید بتا-مالتوز میکند (22).
بازدارندههای پروتئازی (Protease inhibitors)(لکه شماره 7 و8) گروهی از پروتئینها هستند که نه تنها در بیشتر فعالیتهای بیوشیمیایی سلول شرکت میکنند بلکه در فرایندهای دفاعی گیاه در برابر تنشهای محیطی، بهویژه پاتوژنها نیز نقش مهمی دارند. ازجمله مهمترین این بازدارندهها میتوان به بازدارندههای Serine protease inhibitor ، Alpha amylase trypsin inhibitor اشاره کرد (12). افزایش بیان بازدارنده تریپسین (Tripsin inhibitor) در برنج تحت تنش شوری (23) و در جو تحت تنش خشکی (41) گزارش شده است. پروتئینهای LEA که در این آزمایش (لکه شماره 17 و 19) کاهش بیان داشتند، در دانههای در حال بلوغ، سنتز و ذخیره میشوند. پروتئینهای LEA تحت شرایط تنش در حفاظت از ساختار سلولی، محافظت از غشاها و پروتئینها و بازگرداندن پروتئینهای دناتوره شده به فرم طبیعی نقش دارند (11). آسکوربات پراکسیدازها (APX) جزء مهمترین و مؤثرترین آنزیمهای درگیر در فرایند حذف پراکسید هیدروژن در کلروپلاست و سیتوسول سلولهای گیاهی میباشد و به صورت ایزوآنزیمهای مختلف یافت میشود. این ایزوآنزیمها باعث میشوند آسکوربات به عنوان دهنده الکترون عمل کرده و با احیای 16H2O2"> ، دو مولکول آب به همراه مونو دهیدروآسکوربات (Monodehydroascorbate) تولید شود و بدین ترتیب 16H2O2"> از محیط حذف و اثر سمی آن خنثی شود (38). در این تحقیق هر دو ایزوفرم APX (لکه شماره 24 و 25) کاهش بیان نشان دادند.
آلبومینها و گلوبولینها مهمترین پروتئینهای ذخیرهای در بذر هستند و نقش عملکردی نیز در دانه دارند (37). بررسیهای انجام شده در مورد گلوبولینهای رویان نشان داده است که Triticin و پروتئینهای شبیه به Avenin در زمان نمو دانه در آندوسپرم گندم تحت تنش شوری و خشکی به عنوان پروتئینهای ذخیرهای عمل میکنند که میتوانند در افزایش کیفیت بذر مهم باشند (10). افزایش بیان پروتئینهای ذخیرهای تحت تنش شوری میتواند باعث افزایش ارزش غذایی دانه شود.
لکه شماره 10 جزئی از کمپلکس فتوسیستم II است و برای فعالیت کامل فتوسیستم II ضروری بوده و آن را تنظیم میکند (18). روبیسکو آنزیم کلیدی واکنشهای تثبیت کربن در استرومای کلروپلاست است. آنزیم روبیسکو دارای دو عملکرد است و در دو مسیر متابولیکی متضاد یعنی تثبیت کربن (در چرخه کالوین) و در فرایند تنفس نوری شرکت میکند (43). روبیسکو بهعنوان فراوانترین پروتئین بر روی زمین شناخته شده است. این آنزیم که در کلروپلاست قرار دارد حداقل 15 درصد تا 50 درصد پروتئین کلروپلاست را تشکیل میدهد. روبیسکو نقش مهمی را در سوخت و ساز گیاهان بر عهده دارد (2). حاج حیدری و همکاران (2005) در مطالعه پروتئوم برگهای چغندر در شرایط تنش خشکی به افزایش بیان این آنزیم و همبستگی آن با مکانیسمی که قدرت فتوسنتزی گیاه را افزایش میدهد، اشاره کردهاند.
آلانین آمینوترانسفراز یک آنزیم وابسته بهPyridoxal phosphate است و در تمام قسمتهای گیاه یافت میشود. این آنزیم نه تنها در برگ و ریشه بلکه در بافتهای دیگری مانند آندوسپرم (24) و گل (20) یافت میشود. افزایش بیان این آنزیم در برخی از گونههای گیاهی در شرایط تنش شوری و فلزات سنگین مشاهده شده است (40). سطوح بالای فعالیت این آنزیم تبدیل سریع آلانین انباشته شده به پیروات را در طول بازیابی رشد گیاه قادر میسازد (29). آمینوترانسفرازها نقشهای مهم و متفاوتی در گیاهان دارند، ازجمله در سنتز و کاتابولیسم اسیدهای آمینه ، بیوسنتز ویتامینها، مسیرهای کربن و نیتروژن و پاسخ به تنشهای گیاهی دخالت دارند (27).
تنش شوری به طور غیرمستقیم باعث القاء تنش گرمایی میشود. به طوری که 16H2O2"> درون سلول، به عنوان مولکول پیام رسان برای بسته شدن روزنهها عمل میکند و منجر به کاهش تبخیر و تعرق گیاه میشود. این امر موجب افزایش دمای گیاه شده و گیاه را با تنش گرمایی مواجه میکند. به دنبال تنش گرمایی اعمال شده به گیاه، پروتئینهای شوک حرارتی (HSP) در گیاه تجمع بیشتری پیدا میکنند. این پروتئینها در سازگاری گیاهان به تنش گرمایی و تحمل آن نقش مهمی دارند و در تمامی اندامهای گیاهان و جانوران، تحت شرایط گرما، سرما و خشکی تولید میشوند. پروتئینهای شوک حرارتی (لکه شماره 1)، علاوه بر اینکه در زمان مواجه گیاه با تنش دمایی بالا بیان میشوند، همچنین در پاسخ به دامنه وسیعی از تنشها مانند تنشهای آبی، شوری، اسمزی، سرما و اکسیداتیو نیز بیان میشوند. در هویج، تحت تنش سرما افزایش بیان HSPهای کوچک به افزایش تحمل گیاه ربط داده شده است (39). پروتئین Cyclophilin-like protein زیر مجموعهای از پروتئین Hsp 90 میباشد. سوبسترای شناخته شده Hsp 90، شامل پروتئینهای مسیر پیام رسانی مانند کینازها میباشد که نشان دهنده نقش این مولکول در پیام رسانی است. بیان Hsp 90 در آرابیدوپسیس در پاسخ به گرما، سرما، تنش شوری، فلزات سنگین و فیتوهورمونها مشاهده شده است (42). لکههای شماره 20 و 22 از این دسته بودند.
نتیجه گیری
تنش شوری در هر دو سطح اثر معنی داری روی صفات مورد مطالعه بهجز وزن خشک ریشه گذاشت. در بین صفات مورد مطالعه وزن خشک بخش هوایی بیشتر از سایر صفات کاهش پیدا کرد. همچنین میزان تجمع پرولین برگ تحت هر دو سطح تنش شوری افزایش معنی داری داشت. مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذر مشخص کرد که از بین 532 لکه تکرارپذیر، 29 لکه دارای تغییر بیان معنی دار بودند. از این تعداد 19 لکه کاهش بیان و بقیه افزایش بیان پیدا کردند. لکههای دخیل در متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بیشترین سهم را در بین لکههای تغییر بیان یافته داشتند. همچنین ملاحظه شد که پروتئینهای ذخیره ای تحت تنش افزایش بیان پیدا میکنند. این اثر تنش شوری میتواند در افزایش کیفیت بذر تأثیر داشته باشد.