Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Investigation of the effects of Ag and Cu elicitors on flavone synthase 1 gene expression and some biochemical parameters on Cuminum cyminum L. endemic from Iran

Document Type : Research Paper

Authors

28120

Abstract

In this study, effect of different concentrations of AgNO3 (for 4 hours treatment) and CuSO4 (for 16 hours treatment) elicitors were investigated on gene expression of FNS I and anti¬oxidant system in 21-day Cuminum cyminum seedlings. Semi-quantitative study of FNS I gene expression was shown a significant increase at 25 and 50 µM Ag concentrations rather than the control sample which decreased by the increase elicitor concentration up to 100 µM. On the other hand, by the increase elicitor concentrations, total flavonoid and anthocyanin contents and activity of some antioxidant enzyme as well as total protein content significantly increased. The gene expression were significantly elevated in treated seedlings by Cu elicitor at 4 and 8 µM treatments and its expression completely inhibited at 16 µM concentration. In this condition, total flavonoid and anthocyanin contents showed a similar trend and their contents were significantly reduced at 16 µM compared to the control sample. In contrast, the activity of antioxidant enzymes including catalase and superoxide dismutase, increased by the increase elicitor concentration, while total protein content drastically decreased. Based on the results, it deduced the increase FNS I gene expression and flavonoid and anthocyanin contents, were resulting in oxidative stress following absorption of these elicitors and activation of plant antioxidants system.

Keywords

بررسی تأثیر الیسیتورهای نقره و مس بر بیان ژن فلاون سینتاز 1 و برخی پارامترهای بیوشیمیایی در گیاهچه­های زیره سبز (Cuminum cyminum L.) بومی ایران

کبری یوسفی1، علی ریاحی مدوار2* و امین باقی‌زاده2

1 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، گروه بیوتکنولوژی

2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 24/4/91               تاریخ پذیرش: 13/8/92 

چکیده

در این مطالعه اثر غلظت­های مختلف الیسیتور نقره (بعد از 4 ساعت از اعمال تیمار) و الیسیتور مس (بعد از 16 ساعت از اعمال تیمار) بر بیان ژن فلاون سینتاز1 (FNS I) و سیستم آنتی­اکسیدان گیاهچه­های 21 روزه زیره سبز مورد بررسی قرار گرفت. بررسی نیمه کمی بیان ژن فلاون سینتاز1 بیانگر افزایش معنی­دار آن در حضور غلظت­های 25 و 50 میکرومولار نقره نسبت به نمونه شاهد می­باشد که با افزایش غلظت تا 100 میکرومولار بیان آن کاهش می‌یابد. از طرف دیگر با افزایش غلظت این الیسیتور در محیط، محتوی فلاونوئید کل و آنتوسیانین و فعالیت برخی از آنزیم­های آنتی­اکسیدان و همچنین محتوی پروتئین کل نسبت به گروه شاهد به طور معنی­داری افزایش یافت. در گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتور مس، بیان این ژن در غلظت­های 4 و 8 میکرومولار بطور معنی­داری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش و در غلظت 16 میکرومولار بیان آن کاملاً مهار شد. در این شرایط محتوی فلاونوئید کل و آنتوسیانین نیز روند مشابهی را نشان دادند، به‌طوری‌که محتوای آنها در تیمار 16 میکرومولار نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. در مقابل، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان به‌ویژه کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز با افزایش غلظت این الیسیتور در محیط بطور قابل توجهی نسبت به شاهد افزایش یافته بود، در­حالیکه محتوای پروتئین کل بطور معنی­داری نسبت به گروه شاهد کاهش یافت. از مجموع نتایج چنین اسنتباط می­شود که افزایش بیان ژن FNS I و محتوای فلاونوئید کل و آنتوسیانین، نتیجه اعمال تنش اکسیداتیو حاصل از جذب این عناصر و فعال شدن سیستم آنتی­اکسیدان گیاه می­باشد.

واژه­های کلیدی: آنتوسیانین، آنزیم­های آنتی­اکسیدان، فلاونوئید.

* نویسنده مسئول، تلفن: 03426233204 ، پست الکترونیکی:  ariahi@icst.ac.ir

مقدمه

 

زیره سبز با نام علمی . Cuminum cyminum Lاز خانواده چتریان (Apiaceae) سرشار از متابولیت­های ثانوی است. عصاره زیره سبز دارای اثرات آنتی­اکسیدانی (47)، ضد­باکتریایی (44) و ضد­سرطانی (9 و 40) می­باشد. اسانس این گیاه شامل ترکیباتی نظیر تانن (Tannin)، رزین (Resin)، آلورن (Aluron)، سیمن (Semin)، فلاندرن (Phellandrene) و کارون (Caron) است. ماده اصلی تشکیل دهنده اسانس آلدهید کومینیک (Al. cuminique) یا کومینول (Cuminol) می­باشد (1). متابولیت­های ثانوی گروه متنوعی از مولکولهایی هستند که به سازگار شدن گیاه بخصوص در شرایط تنش­های محیطی کمک می­کنند (38). ازجمله این ترکیبات فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها می­باشند که علاوه بر نقش­های ساختاری در بافت­های محافظ، نقش آنها در جذب حشرات گرده افشان­، عمل به‌عنوان سیگنال­های مولکولی در برهمکنش گیاهان با محیط و به‌عنوان مارکرهای بیولوژیکی در مطالعات کموتاکسی به اثبات رسیده است. بیشتر ژن­های مربوط به آنزیم­های درگیر در مسیر سنتز متابولیت­های ثانوی شناسایی و تعیین توالی شده­اند (20). همزمان با بیوسنتز فلاونوئیدها، ترکیبات متنوع دیگری از قبیل فلاون­ها، ایزوفلاون­ها و آنتوسیانین­ها بواسطه فعالیت آنزیم­های مسیر سنتز می­شوند (21). فلاون ها از مهمترین مشتقات فلاونوئیدها می­باشند که نقش­های ویژه­ای در گیاهان و اهمیت­های زیادی در در­مان و سلامتی انسان دارند (8 و 29 و 32). این ترکیبات در گیاهان برای حفاظت در مقابل نور ماورای بنفش، رنگ­آمیزی گل­ها، برهمکنش درون گونه­ای و دفاع و استحکام گیاه لازم و ضروری هستند (36). فلاون­ها زیرگروهی از فلاونوئیدها هستند که دارای تنوع وسیعی می­باشند (31) و در حفاظت گیاهان در مقابل نور ماورای بنفش (20) و در برهمکنش گیاهان با سایر میکروارگانیسم­ها (13 و 24) و همچنین در درمان بیماری­های انسانی اهمیت دارند. از مهمترین خواص درمانی آنها می­توان به خاصیت آنتی­اکسیدانی، ضد­سرطانی، ضد­قارچی، ضد­التهابی و ضد­گرفتگی رگ­ها اشاره نمود (32). فلاون­ها در مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها از پیش ماده فلاونون­ها سنتز می­شوند.

در گیاهان مختلف مسیر بیوسنتز فلاون­ها تحت تأثیر دو سیستم آنزیمی مستقل؛ فلاون سینتاز1 (Flavone synthase I) و فلاون سینتاز 2 (Flavone synthase II) کاتالیز می­شود (شکل 1) که به طور همزمان در یک گیاه یافت نمی‌شوند. فلاون سینتاز1 یک دی­اکسیژناز محلول است که اولین بار در سال 1981 در گیاه جعفری از خانواده چتریان گزارش گردید (36) و برای اولین بار این آنزیم در خارج از خانواده چتریان در برنج (28) از خانواده گرامینه گزارش شد. درحالیکه در بیشتر گیاهان FNS از نوع 2 بوده که یک باند غشایی سیتوکروم P450 می­باشد (21).

در تنش اکسیداتیو تولید بیش از حد گونه­های فعال اکسیژن (Reactive oxygen species, ROS) باعث آسیب به DNA، پروتئین­های ساختاری و لیپیدها می­شوند و همچنین می­توانند واکنش­های زنجیره­ای از کنترل خارج شده مثل واکنش­های اکسیداسیون و پراکسیداسیون را برانگیزند (6 و 43). از مهمترین عواملی که تنش اکسیداتیو در گیاهان را القا می­نمایند فلزات سنگین از قبیل کبالت، مس، آلومینیوم، نیکل و نقره می­باشند (21). گیاهان از طریق دو مسیر سیستم آنتی­اکسیدان؛ آنزیمی (46) و غیرآنزیمی (21 و 46) سمیت این رادیکال­ها را کاهش می­دهند. در شرایط کنترل شده از این فلزات می­توان به‌عنوان محرک برای تولید متابولیت­های ثانوی که ارزش دارویی بسیاری دارند مورد استفاده قرار داد. در برخی گونه­های گیاهی ثابت شده است، که استرس­های مختلف از قبیل فلزات سنگین بیان برخی ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها را تحت تأثیر قرار می­دهند (4، 33). اما تاکنون، گزارشی مبنی بر بررسی بیان ژن فلاون سینتاز 1 و 2 تحت تأثیر استرس­ها و یا الیسیتورها منتشر نشده است. در این مطالعه تأثیر یون نقره و مس به‌عنوان دو الیسیتور (Elicitor) غیر زنده بر سیستم آنتی­اکسیدان آنزیمی (سوپر­اکسید­دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز) و غیرآنزیمی (فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها) و محتوای پروتئین کل بررسی گردید. علاوه بر آن میزان بیان ژن فلاون سینتاز1 که در تولید فلاون­ها نقش دارد در حضور غلظت­های مختلف این الیسیتورها مورد آنالیز قرار گرفت.

مواد و روشها

بذرهای زیره سبز (شرکت پاکان بذر اصفهان) در گلدان­های پلاستیکی (cm 15 ˟20) محتوی مخلوطی از خاک رس، پرلیت و پیت ماس (1:1:1) کشت و به گلخانه با دمای oC 2±22 و رطوبت نسبی 70% منتقل و هر دو روز یکبار آبیاری شدند. پس از گذشت 21 روز گیاهچه­ها جمع­آوری و پس از شستشو در محیط حاوی الیسیتورها قرار گرفتند.

 

 

شکل 1- شمای کلی مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها که در آن محصول آنزیم FNS (فلاون­ها) در یک کادر مشخص شده است.


تهیه الیسیتورها: برای آماده­سازی الیسیتورهای نقره و مس، غلظت­های 0 (به‌عنوان شاهد)، 25، 50 و 100 میکرومولار نیترات نقره (AgNo3) و غلظت­های (0 (به‌عنوان شاهد)، 4، 8 و 16 میکرومولار) سولفات مس (CuSo4) جداگانه در آب مقطر استریل تهیه شدند. گیاهچه­های 21 روزه زیره از گلدان خارج و پس از شستشو برای حذف خاک اضافی ریشه­ها، کل گیاه در معرض غلظت­های مختلف الیسیتورهای نقره و مس به‌ترتیب به مدت 4 و 16 ساعت در دمای آزمایشگاه و بر روی شیکر با دور  rpm130 قرار گرفتند. پس از گذشت زمان مورد نظر، گیاهان تحت تیمار چندین مرتبه با آب مقطر استریل به‌منظور حذف الیسیتورهای سطحی شستشو و پس از آبگیری تا زمان انجام آزمایش­ها در دمای ºC 80- نگهداری شدند. لازم به ذکر است که انتخاب زمان­های اعمال تیمار بر اساس نتایج به‌دست آمده قبلی در آزمایشگاه­ بوده است. اعمال این الیسیتورها در زمان­های مذکور بر مقدار مواد مؤثره گیاهان مختلف و همچنین بر بیان ژن­های آنزیم­های درگیر در مسیر بیوسنتزی آنها تأثیر مثبت داشتند (2 و 4).

آنالیز مولکولی: به‌منظور بررسی بیان ژن فلاون سینتاز1، استخراج RNA کل از گیاهچه­های فریز شده با استفاده از کیت RNX – Plus (شرکت سیناژن، شماره کاتالوگ: RN7713C) انجام شد. مراحل استخراج مطابق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده انجام شد. لازم به ذکر است که کلیه مراحل کار در شرایط RNase free و بر روی یخ انجام گردید. برای این منظور، حدود mg500 از بافت فریز شده، در حضور نیتروژن مایع ساییده و به میکروتیوب منتقل شد. سپسµL500 از محلول RNX - Plus به آن افزوده و مخلوط کاملاً همگن گردید. مخلوط مذکور به مدت یک ساعت بر روی یخ انکوبه شد، سپس Lµ200 کلروفرم به آن افزوده و بشدت تکان داده ­شد و پس از 5 دقیقه انکوباسیون بر روی یخ، به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 در دمای ºC 4 سانتریفیوژ گردید. سپس محلول رو­شناور بی­رنگ به میکروتیوب جدید منتقل و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد. پس از­ گذشت­ 15 دقیقه انکوباسیون روی یخ، مطابق برنامه قبلی سانتریفیوژ انجام شد. در ادامه، فاز رویی حذف گردید و به رسوب سفید رنگ مقدار    mL 1 اتانول %75 افزوده و این­بار بمدت 8 دقیقه با دور rpm  7500 در دمای ºC 4 سانتریفیوژ انجام شد. فاز رویی دور ریخته شد و رسوب در دمای اتاق انکوبه گردید تا خشک شود. در نهایت به رسوب، Lµ 30 ­آب تیمار شده با DEPC %1/0 اضافه گردید و تا زمان استفاده به فریزر ºC 80- انتقال یافت. در نهایت کیفیت RNA تخلص شده بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. در ادامه، از RNA استخراج شده کتابخانه cDNA ساخته شد.

به‌منظور ساخت cDNA ابتدا هفت میکرولیتر (حدود 2 میکروگرم) از  RNAکل به تیوب­های 2/0 اضافه شد (کلیه مراحل ساخت cDNA روی یخ انجام شد). در ادامه پس از اضافه نمودن 2 میکرولیتر پرایمر عمومی الیگو  dTبه تیوپ­ها به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 65 قرار گرفتند. پس از انتقال تیوپ­ها به روی یخ یک میکرولیتر آنزیم DNA پلی­مراز وابسته به RNA  (RNA Dependent DNA Polymerase, RT) (MMuLV از شرکت فرمنتاز)، مقدار 5/2 میکرولیتر بافر رونوشت RT (10X)، 75/0 میکرولیتر dNTP، 75/0 میکرولیتر RNase inhibitor، و در نهایت آب دیونیزه استریل (RNase free) تا حجم نهایی 25 میکرولیتر به تیوپ­ها اضافه شد. واکنش ساخت cDNA به مدت 80 دقیقه در دمای ºC 42 انجام شد. در انتهای واکنش به‌منظور حذف اثر RT، تیوب­ها به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 70 قرار گرفتند. همچنین به‌منظور حذف آلودگی­های اضافی RNA از آنزیم RNase A (1 میکرولیتر، 20 دقیقه در دمای ºC 37) استفاده شد. تکثیر ژن فلاون سینتاز1 و توبولین (به‌عنوان کنترل داخلی) با استفاده از کتابخانه cDNA و آنزیم Taq پلیمراز در حضور پرایمرهای اختصاصی که توالی آن در جدول 1 آمده است، انجام شد. واکنش تکثیر این ژن­ها شامل واسرشته­سازی اولیه در دمای ºC 94 به مدت 4 دقیقه و 30 سیکل تکثیر شامل (واسرشته سازی در دمای  ºC 94 بمدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها برای تکثیر ژن فلاون سینتاز1 و توبولین بترتیب در دماهای ºC 51 و ºC 57 بمدت یک دقیقه، بسط در دمای ºC 72 بمدت یک دقیقه) و یک مرحله بسط نهایی در دمای ºC 72  به مدت 10 دقیقه انجام شد.

 

جدول 1- توالی پرایمرهای مربوط به ژن فلاون سینتاز1 و توبولین و Tm و درصد GC هر کدام

نام پرایمر

توالی٭

Tm (˚C)

محتوای GC (%)

F- FNS I

5´-ATGGCTCCAACAACAATTACTG-3´

1/64

9/40

R- FNS I

´5-CTAAGCTAAAATTCCATCTGC-3´

2/59

1/38

F-Tubulin

5´-GCTTTCAACACCTTCTTCAGTG-3´

7/63

5/45

R-Tubulin

5´-CTTTCTCAGCTGAGATCACTGG-3´

3/63

50

٭توالی مربوط به ژن فلاون سینتاز1 بر اساس توالی این ژن از گیاه زیره سبز با شماره دسترسی DQ683349.1 ثبت شده در Gene Bank و توالی پرایمرهای مربوط به توبولین بر اساس توالی این ژن از گیاه گندم با شماره دسترسیDQ435671.1  ثبت شده در Gene Bank طراحی و توسط شرکت MWG  ساخته شدند.

 

به‌منظور بررسی میزان بیان ژن فلاون سینتاز1 در نمونه­های تیمار شده در مقایسه با نمونه شاهد، مقدار مساوی از محصول PCR هر کدام از ژن­ها (فلاون سینتاز1 و توبولین) بر روی ژل آگارز 1% بصورت جداگانه بارگذاری شدند. مقایسه بیان این ژن در غلظت­های مختلف، از روش نیمه کمی RT-PCR و از روی شدت باند تکثیر شده که بر روی ژل آگارز یک درصد تفکیک شدند پس از نرمالیز کردن با ژن توبولین تکثیر شده مربوطه، توسط نرم‌افزارGene tools انجام شد (7).

اندازه­گیری محتوی فلاونوئیدی: برای اندازه­گیری محتوای فلاونوئیدی از روش  Krizek(1998) استفاده شد، به این منظور مقدار 1/0 گرم از برگ گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتورهای مختلف را در اتانول اسیدی (شامل اتانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 99 به 1) خوب سائیده و عصاره حاصل به مدت ده دقیقه با دور  rpm 3600 سانتریفیوژ گردید. محلول رویی جدا و به مدت 10 دقیقه در آب گرم ºC 80 قرار گرفت. سپس میزان جذب عصاره  توسط اسپکتروفتومتر (Varian cary 50, Australia) در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر اندازه­گیری شد و ضریب خاموشیmM -1 cm -13300= ε برای محاسبه محتوی فلاونوئید کل مورد استفاده قرار گرفت و بر حسب M/gfwµ گزارش گردید (26).

اندازه­گیری مقدار آنتوسیانین: اندازه‌گیری محتوای آنتوسیانین با استفاده از روش Krizek (1993) انجام شد. به این منظور مقدار 2/0 گرم برگ در متانول اسیدی (شامل متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 99 به 1) سائیده شد و پس از سانتریفیوژ (به مدت ده دقیقه با دور  rpm3600) محلول رویی به مدت یک شب در تاریکی قرار گرفت. میزان جذب نمونه­ها در 550 نانومتر اندازه­گیری شد. ضریب خاموشی mM -1 cm -13300= ε بوده و محتوای آنتوسیانین بر حسب M/gfwµ گزارش گردید (25).

عصاره­گیری و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان: برای سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان مقدار نیم گرم از بافت ­تر در بافر پتاسیم فسفات 50 میلی­مولار (pH برابر 5/7) حاوی پلی ونیل پیرولیدین (PVP) 1%، EDTA 1 میلی­مولار و PMSF 1 مولار سائیده شد. محلول همگن حاصل به مدت 15 دقیقه با دور  rpm18000 در دمای ºC 4 سانتریفیوژ (مدل: NAPCO 2028R) شد (18).

سنجش فعالیت آنزیم سوپر­اکسید­دیسموتاز (SOD): برای سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز از روش Giannopolitis و  Ries (1977) استفاده گردید. یک واحد فعالیت سوپراکسیددیسموتاز به‌عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 100% احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم می­گردد (17).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از محاسبه کاهش جذب H2O2 در nm 240 انجام شد. میزان H2O2 موجود در مخلوط واکنش با استفاده از ضریب خاموشی 0.28 cm-1 mM-1=ε محاسبه شد. فعالیت آنزیم به صورت واحد آنزیمی بر حسب مقدار پروتئین کل (میلی­گرم) موجود در 100 میکرولیتر عصاره در مدت زمان یک دقیقه محاسبه گردید. یک واحد آنزیمی کاتالاز مقدار آنزیمی است که یک میلی­مول آب اکسیژنه را در یک دقیقه تجزیه می­کند (15).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD): سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از اندازه­گیری میزان جذب تتراگایاکل تشکیل شده از گایاکل در مدت زمان 3 دقیقه در طول موج nm470 انجام شد (35). ضریب خاموشی تتراگایاکل 25.5 cm -1 mM-1= ε می­باشد.

سنجش مقدار پروتئین: برای اندازه­گیری مقدار کمی پروتئین­های محلول در گیاهچه­های تیمار شده از روش برادفورد (1976) استفاده شد. غلظت پروتئین برحسب میلی­گرم بر گرم بافت تازه با استفاده از رسم منحنی استاندارد محاسبه گردید (12).

آنالیز آماری: تمامی آزمایش­ها با 3 تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شدند. میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن (Duncan test) و با در نظر گرفتن سطح اطمینان P≤0.05 مورد تجزیه واریانس یک عاملی (One way ANOVA) قرار گرفتند. نتایج بصورت میانگین دادها ± انحراف معیار (SD) گزارش شدند.

نتایج

بررسی بیان ژن فلاون سینتاز1 در حضور الیسیتورهای مختلف: کیفیت RNA استخراج شده با تفکیک باندهای rRNA بر روی ژل آگارز %1 انجام شد. طبق شکل 2، دو باند مربوط به rRNA S28 و S18 نشان‌دهنده کیفیت مناسب  RNAتخلیص شده و دست نخورده بودن آن است.

از RNA استخراج شده با استفاده از پرایمرهای oligo dT و آنزیم RT کتابخانه cDNA مربوط به هر نمونه ساخته شد. از cDNA ساخته شده در حضور پرایمرهای اختصاصی عمل تکثیر انجام و ژن FNS1 و توبولین تکثیر شدند. لازم به ذکر است که دمای مناسب اتصال پرایمرها با استفاده از گرادیان دمایی برای ژن FNS I، oC 51 و برای ژن توبولین oC 57 تعیین شد و تعداد سیکل PCR برای هر دو ژن برابر 30 بود. مطابق شکل 3 (A و C) قطعه تکثیر شده FNS I باندی معادل bp 1091 و برای ژن توبولین (شکل B و D) باندی تقریباً معادل bp 700 بر روی ژل مشاهده شد.

آنالیز نیمه کمی بیان ژن FNS I : همانطور که در شکل 4، A قابل مشاهده است میزان بیان ژن   FNS Iدر حضور غلظت­های 25 و 50 میکرومولار الیسیتور نقره به­طور معنی­داری نسبت به گیاه شاهد افزایش یافته است و با افزایش غلظت تا 100 میکرومولار میزان بیان این ژن نسبت به گیاه شاهد کاهش پیدا کرده است که در سطح 5 درصد معنی­دار می­باشد. از طرف دیگر، میزان افزایش بیان این ژن در گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتور مس در حضور دو غلظت 4 و 8 میکرومولار نسبت به نمونه شاهد معنی­دار است. درحالیکه در تیمار با غلظت 16 میکرومولار بیان این ژن متوقف گردیده و باندی در حضور این تیمار بر روی ژل مشاهده نشد (شکل 4، B).

اندازه­گیری محتوای فلاونوئید کل، آنتوسیانین و پروتئین کل: همانطور که در جدول 2 مشاهده می­شود، محتوای فلاونوئید کل گیاهچه­های تیمار شده با غلظت ­25  میکرومولار نقره مشابه نمونه شاهد می­باشد ولی با افزایش غلظت الیسیتور در محیط، محتوای فلاونوئید کل افزایش می­یابد. به‌طوری‌که این افزایش در غلظت 100 میکرومولار نسبت به نمونه شاهد معنی­دار است. درحالیکه تیمار گیاهچه­ها با الیسیتور مس نشان‌دهنده افزایش محتوای فلاونوئید کل در غلظت­های 4 و 8 میکرومولار نسبت به نمونه شاهد است. با افزایش غلظت الیسیتور در محیط، محتوای فلاونوئید کل کاهش می­یابد، به‌طوری‌که با نمونه شاهد اختلاف معنی­داری نشان نمی­دهد (جدول 3). محتوای آنتوسیانین گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتور نقره (بجز غلظت 25 میکرومولار که به صورت معنی­داری در مقایسه با گیاه شاهد کاهش یافته است) با افزایش غلظت در محیط به­صورت معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت (جدول 2). تولید آنتوسیانین در گیاهچه­های تیمار شده با تمامی غلظت­های مورد استفاده الیسیتور مس به صورت معنی­داری در مقایسه با گروه شاهد افزایش پیدا کرد و بیشترین مقدار این متابولیت در غلظت 8 میکرومولار مشاهده شد (جدول 3).

 

جدول 2- محتوای فلاونوئید کل، آنتوسیانین و پروتئین کل در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتور نقره بعد از 4 ساعت از اعمال تیمار

محتوای پروتئین کل

(mg/g fw)

محتوای آنتوسیانین (µM/g fw)

محتوای فلاونوئید کل (µM/g fw)

غلظت  نقره

 (µM)

d01/0±88/1

c0±204/0

b25/14±09/1337

0

c03/0±0/2

d0±178/0

b32/15±06/1289

25

a02/0±23/2

b0±221/0

ab81/1±26/1363

50

b0±18/2

a0±269/0

a27/12±40/1444

100

تمامی آزمایشات با 3 تکرار مستقل انجام شدند. میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن در سطح اطمینان P≤0.05 مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفتند. در هر ستون حروف متفاوت نشان‌دهنده معنی­دار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.

جدول 3- محتوای فلاونوئید کل، آنتوسیانین و پروتئین کل در گیاهچه­های شاهد و تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتور مس بعد از 16 ساعت از اعمال تیمار

محتوای پروتئین کل

(mg/g fw)

محتوای آنتوسیانین (µM/g fw)

محتوای فلاونوئید کل (µM/g fw)

غلظت مس (µM)

a0±91/1

d0±149/0

b2/6±30/1014

0

b01/0±81/0

b0±268/0

a05/27±20/1239

4

c01/0±71/0

a0±278/0

a29/20±60/1211

8

d0±61/0

c0±170/0

b61/22±30/1012

16

تمامی آزمایشات با 3 تکرار مستقل انجام شدند. میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن در سطح اطمینان P≤0.05 مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفتند. در هر ستون حروف متفاوت نشان‌دهنده معنی­دار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.

 

 

شکل 2-  RNAکل استخراج شده از نمونه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتور نقره (A) و مس (B)   در ژل­ها، دو باند مربوط به S28 و S18، rRNA به وضوح قابل مشاهده می­باشند.

 

 

 

شکل 3- نمونه­ای از ژل آگارز مربوط به تکثیر ژن FNS I (A) و ژن توبولین (B) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف (میکرومولار) الیسیتور نقره و تکثیر ژن FNS I (C) و ژن توبولین (D) در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف (میکرومولار) الیسیتور مس. قطعه تکثیر شده از ژن  FNS 1، باندی معادل bp 1091 و برای ژن توبولین باندی تقریباً معادل bp700 روی ژل در کنار باند مربوط به مارکر وزن مولکولی ظاهر گردید.

 

 

از طرف دیگر، مقدار پروتئین کل گیاهچه­ها در تیمار با تمامی غلظت­های مورد استفاده الیسیتور نقره، نسبت به گروه شاهد افزایش معنی­داری را نشان می­داد. به‌طوری‌که بیشترین افزایش در مقدار پروتئین در تیمار با غلظت 50 میکرومولار مشاهده گردید (جدول 2). درحالیکه در حضور الیسیتور مس این روند کاهشی بود و با افزایش غلظت این الیسیتور در محیط، غلظت پروتئین کل بطور قابل توجهی کاهش یافت (جدول 3).

اثر الیسیتورهای مختلف بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: با توجه به شکل 5، A فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز با افزایش غلظت الیسیتور نقره در محیط نسبت به گروه شاهد افزایش یافت. درحالیکه در غلظت 25 میکرومولار تفاوت معنی­داری در میزان فعالیت این آنزیم در مقایسه با گیاه شاهد مشاهده نشد، در تیمار گیاهچه­ها با غلظت­های 50 و 100 میکرومولار افزایش فعالیت این آنزیم در سطح 5 درصد معنی­دار بود و بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در تیمار با غلظت 50 میکرومولار مشاهده گردید.

فعالیت آنزیم SOD، در گیاهچه­های تیمار شده با تمامی غلظت­های مورد استفاده از الیسیتور مس نیز نسبت به نمونه شاهد بصورت معنی­داری افزایش یافت (شکل 5، B) و بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در غلظت 8 میکرومولار مشاهده گردید.

 

 

 

شکل 4- بررسی نیمه کمی بیان ژن FNS I در گیاهچه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف الیسیتورهای نقره (A) و مس (B)

حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی­دار بودن در سطح 5 درصد است.

 

 

شکل 5- مقایسه اثر غلظت­های مختلف الیسیتورهای نقره (A) و مس (B) بر میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز گیاهچه­های تیمار شده. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی­دار بودن در سطح 5 درصد است.

 

 

شکل 6- مقایسه اثر غلظت­های مختلف الیسیتورهای نقره (A) و مس (B) بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز

حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی­دار بودن در سطح 5 درصد می­باشد.

 

 

شکل 7- مقایسه اثر غلظت­های مختلف الیسیتورهای نقره (A) و مس (B) بر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز

حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی­دار بودن در سطح 5 درصد می­باشد.

اثر الیسیتورهای نقره و مس بر فعالیت آنزیم کاتالاز: همان­طور که در شکل 6،A  مشاهده می­شود، فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار با غلظت 25 میکرومولار الیسیتور نقره بصورت معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش نشان می­دهد ولی با افزایش غلظت الیسیتور در محیط (در تیمار با غلظت­های 50 و 100 میکرومولار) فعالیت آنزیم کاهش یافته است که در سطح 5 درصد نسبت به نمونه شاهد معنی­دار است. کمترین میزان فعالیت آنزیم در غلظت 50 میکرومولار مشاهده گردید اما کاهش فعالیت آنزیم در غلظت 50 میکرومولار و افزایش جزئی آن در غلظت 100 میکرومولار اختلاف معنی­داری با شاهد نداشت.

 در مقابل، الیسیتور مس باعث افزایش منظم فعالیت این آنزیم در هر سه غلظت مورد استفاده گردید. به‌طوری‌که با افزایش غلظت الیسیتور در محیط، فعالیت کاتالاز در کلیه تیمارها افزایش معنی­داری نسبت به گروه شاهد (به غیر از تیمار  4 میکرو­مولار) و نیز نسبت به هم داشتند (شکل 6، B).

اثر الیسیتورهای مختلف بر فعالیت آنزیم پراکسیداز: همانطور که در شکل 7، A قابل مشاهده است غلظت 50 و 100 میکرومولار الیسیتور نقره باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز در مقایسه با نمونه شاهد و تیمار شده با غلظت 25 میکرومولار گردید. بیشترین افزایش فعالیت این آنزیم در غلظت 100 میکرومولار مشاهده شد که تفاوت معنی­داری در مقایسه با سایر غلظت­ها داشت. از طرف دیگر فعالیت این آنزیم تنها در غلظت 16 میکرومولار الیسیتور مس افزایش معنی­داری را نسبت به سایر تیمارها نشان داد اما سایر غلظت­های مورد استفاده تفاوت معنی­داری باهم و با گروه شاهد نداشتند.

بحث و نتیجه‌گیری

زیره سبز از خانواده چتریان و سرشار از متابولیت­های ثانوی فلاونوئیدی از قبیل فلاون­ها می­باشد (3). یکی از عوامل ایجاد تنش محیطی در گیاهان، حضور فلزات سنگین در محیط رویش آنهاست (23 و 46) که سبب تحریک سیستم دفاعی گیاهان می­شوند. اغلب فلزات سنگین با القای تولید ROS ها باعث آسیب به گیاه و در نتیجه سبب کند شدن و یا مهار رشد آنها می­شوند (39). گیاهان با دو مکانیسم دفاعی آنزیمی شامل: سوپر­اکسید­دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و دهیدروآسکوربات ­ردوکتاز (46) و غیر آنزیمی شامل: آسکوربیک اسید، کارتنوئیدها، ویتامین E، پلی­آمین­ها، آلکالوئیدها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها (23 و 46) ROSها را جاروب نموده و مانع آسیب رساندن آنها به پروتئین­ها، غشاء و اسیدهای نوکلئیک می­شوند (48).

مطالعات انجام شده، نشان داد که در حضور فلزات سنگین نه تنها ترکیبات خاص (آنتی­اکسیدان­ها) بلکه ژن­های درگیر در بیان آنزیم­های کاتالیز کننده آنها نیز فعال می­شوند (41 و 42). از این رو در این مطالعه با توجه به اهمیت آنتی­اکسیدانی فلاون­ها، بیان ژن فلاون سینتاز1 در مسیر بیوسنتز این ترکیبات در گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتورهای مس و نقره به روش نیمه کمی بررسی شد. از آنجایی­که پروتئین­ها فراوان­ترین و تخصصی­ترین ماکرومولکول­های زیستی محسوب می‌شوند، اثر الیسیتورهای مذکور بر میزان بیان پروتئین کل نیز مورد سنجش قرار گرفت.

 نقره با چگالی kg/m310490 از گروه فلزات سنگین است (11) و اعمال تنش اکسیداتیو توسط این عناصر پس از جذب توسط گیاهان، ثابت شده است (23 و 46). اهمیت فلاونوئیدها در مقاومت به تنش­های گوناگونی از قبیل گرما، سرما، خشکی، اشعه ماورا بنفش و فلزات سنگین به اثبات رسیده است (45). همچنین، آنتوسیانین­ها که در انتهای مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها ساخته می­شوند در گیاهان نقش حفاظتی در برابر اشعه ماورای بنفش، خشکی، سرما و فلزات سنگین بر عهده دارند (23 و 46). کاهش اثرات تنش توسط فلاونوئیدها را به اتصال ترکیبات فنولیک با یون­های فلزات سنگین مرتبط می­دانند (10). همانطور که در جدول 2 مشاهده می­شود با افزایش غلظت الیسیتور نقره در محیط، محتوای فلاونوئید کل در گیاهچه­های تیمار شده بطور معنی­داری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافته است. علاوه بر آن، محتوای آنتوسیانین نیز (بجز کاهش معنی­دار آن در غلظت 25 میکرومولار) روندی مشابه فلاونوئید کل را نشان می­دهد. فلاونوئیدها، فلاون­ها و آنتوسیانین­ها خاصیت آنتی­اکسیدانی دارند و ثابت شده است که میزان تولید آنها و همچنین بیان ژن مرتبط با سنتز آنها در شرایط اعمال تنش افزایش می­یابد (23 و 46). همانطور که در شکل 4، A مشاهده می­شود بیان ژن FNS I در حضور غلظت­های مختلف این الیسیتور تا 50 میکرومولار بطور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافته است. از این رو پیشنهاد می­شود، افزایش محتوای فلاونوئیدهای کل و آنتوسیانین­ همزمان با افزایش بیان ژن فلاون سینتاز 1، پاسخی برای کاهش اثرات تنش ناشی از جذب این فلز می­باشد. نکته قابل توجه، کاهش بیان ژن FNS 1 در حضور بالاترین غلظت مورد استفاده  (100 میکرومولار) می­باشد، درحالیکه محتوای فلاونوئیدها و آنتوسیانین در حضور این تیمار افزایش یافته است، این نتیجه احتمالاً بیانگر بیان بیشتر ژن­ها و یا فعال­تر شدن آنزیم­های دیگر درگیر در این مسیر بیوسنتزی می­باشد.

برای تأیید اعمال تنش اکسیداتیو در این شرایط، فعالیت برخی از مهمترین آنزیم­های آنتی­اکسیدان از قبیل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز نیز مورد سنجش قرار گرفت. افزایش فعالیت آنزیم   SOD(که نقش کلیدی در کاتالیز واکنش تبدیل سوپراکسید به پراکسید هیدروژن دارد (22)) و همچنین آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز (که نقش مکمل در جاروب کردن و پاکسازی H2O2 دارند (14)) در گیاهچه­های تیمار شده با الیسیتور نقره نسبت به گیاه شاهد بیانگر اعمال تنش توسط این عنصر در گیاه می­باشد. از طرف دیگر افزایش محتوای پروتئین­های محلول در گیاهچه­های تیمار شده  نسبت به گروه شاهد می­تواند به دلیل افزایش مقدار آنزیم­های تعدیل کننده شرایط تنش از قبیل آنزیم­های آنتی­اکسیدان و آنزیم­های درگیر در بیوسنتز ترکیبات آنتی­اکسیدانی ­باشد. بنابراین پیشنهاد می­شود، افزایش محتوای فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها که در یک مسیر آبشاری و توسط تعداد زیادی آنزیم کاتالیز می­شوند می­تواند با افزایش تولید آنزیم­های این مسیر مرتبط باشد. در این رابطه می­توان به افزایش معنی­دار بیان ژن FNS I در گیاهچه­های تحت تیمار این الیسیتور اشاره نمود. البته تا­کنون افزایش بیان برخی از ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها از قبیل تیروزین آمینو ترانسفراز (4) در گیاه بادرنجبویه تحت تیمار با این الیسیتور گزارش شده است. نقره در محیط کشت گیاهی به‌عنوان یک بازدارنده قوی اتیلن مورد استفاده قرار می­گیرد (11). اثرات مهاری اتیلن در غلظت­های بالا، بر مهار سنتز متابولیت­های ثانوی و از طرف دیگر اثرات تحریکی آن بر افزایش متابولیت­های ثانوی در غلظت­های کم به اثبات رسیده است (36). بنابراین می­توان اثرات مثبت نقره بر افزایش محتوای فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها را به اثر بازدارندگی آن بر فعالیت اتیلن نسبت داد (49).

مس یک عنصر کم­مصرف ضروری برای رشد گیاهان است و کمترین فراوانی را به‌عنوان ریزمغذی پس از نیکل و مولیبدن دارد (31). این عنصر به‌عنوان کوفاکتور برخی از آنزیم­ها و پروتئین­ها از قبیل مس/ روی سوپراکسید دیسموتازها، سیتوکروم c اکسیداز، گیرنده اتیلین، آسکوربات اکسیداز و دی­آمین اکسیداز می­باشد. مس در سوخت و ساز قند و ازت و همچنین در بیوسنتز اتیلن به‌عنوان یک هورمون رشد نقش مهمی دارد (30). با وجود اهمیت مس در رشد و نمو گیاهى، زمانیکه مس به مقدار اضافى در اختیار گیاه قرار گیرد باعث ایجاد علائم سمیت در گیاه می­شود (5). رشد گیاهان در حضور غلظت­های بالای مس به طور معمول با کاهش بیومس، کاهش میزان کلروفیل، تغییر و تبدیل ساختار کلروپلاست در برگ­ها همراه می­باشد (37 و 48). از طرف دیگر، در این شرایط پراکسیداسیون لیپیدها، کاهش محتوای لیپیدها و تغییر در ترکیب اسیدهای چرب غشای تیلاکوئید مشاهده می­شود که منجر به تغییر سیالیت غشای تیلاکوئید می­گردد (48) .از آنجایی که مس از گروه فلزات سنگین است جذب بیش از نیاز آن به گیاه نوعی تنش قلمداد می­شود (41) .از این رو افزایش محتوای فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها و همچنین  افزایش بیان آنزیم FNS1 در مسیر بیوسنتزی فلاون­ها تا غلظت 8 میکرومولار می­تواند دلیل دیگری بر فعال شدن مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها در پاسخ به تنش حاصل از این فلز باشد. درحالیکه، با افزایش غلظت الیسیتور تا 16 میکرومولار، بیان این ژن بشدت کاهش یافته و غیرقابل سنجش می­شود و همچنین محتوای فلاونوئید کل و آنتوسیانین کاهش می­یابد. بنظر می­رسد کاهش محتوای فلاونوئید کل در تیمار با این غلظت با کاهش بیان برخی ژن­ها از قبیل FNS I مرتبط است. علاوه بر آن، محتوای پروتئین کل گیاهچه­ها در تیمار با غلظت­های مختلف این الیسیتور به طور معنی­داری نسبت به گروه شاهد کاهش می­یابد و با افزایش غلظت­، این کاهش بارز­تر می­شود. این مشاهدات احتمالا نتیجه تأثیر منفی ­ROSهای تولید شده بر ماکرومولکول­های زیستی است (48). از طرف دیگر بررسی فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، بیانگر فعالیت شدید آنزیم سوپراکسیددیسموتاز می­باشد که در تمامی غلظت­های مورد استفاده به طور معنی­داری نسبت به گروه شاهد افزایش یافته است. افزایش تولید H2O2 در نتیجه افزایش فعالیت این آنزیم، با افزایش فعالیت کاتالاز و پراکسیداز به‌ویژه در تیمار با غلظت 16 میکرومولار همراه است، در حالیکه محتوای فلاونوئید کل و آنتوسیانین کاهش معنی­داری را نسبت به غلظت­های کمتر الیسیتور نشان می­دهند. این نتایج همچنین می­تواند بیانگر نقش مکملی سیستم دفاع آنزیمی و غیر­آنزیمی باشد.

نتیجه­گیری نهایی

از مجموع نتایج چنین استنباط می­شود که حضور یون مس و نقره در محیط باعث تولید گونه­های فعال اکسیژن شده، به‌طوری‌که گیاه با افزایش بیان ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها و افزایش محتوای فلاونوئیدها و آنتوسیانین سعی در کاهش تنش­های حاصل دارد. از طرف دیگر، الیسیتور مس بر خلاف الیسیتور نقره در غلظت­های اعمال شده در زمان تیمار اثرات منفی بر گیاه داشته است که این تئوری با کاهش معنی­دار محتوای پروتئین کل و عدم بیان ژن FNS I (16 میکرومولار) و همچنین فعالیت بالای SOD به وضوح قابل مشاهده است. با توجه به نتایج بدست آمده، این الیسیتورها (به‌ویژه در غلظت­های پایین) می­توانند برای افزایش تولید متابولیت­های ثانوی با ارزش دارویی بالا از قبیل فلاون­ها مورد استفاده قرار گیرند. با توجه به بیان پایین ژن­های درگیر در بیوسنتز متابولیت­های ثانوی می­توان از این الیسیتورها برای افزایش بیان ژن­های درگیر در سنتز آنها استفاده نمود تا پس از تکثیر و کلون نمودن آنها در یک وکتور مناسب، تولید متابولیت­های با ارزش را در گیاهان دیگر (که زمان رشد کوتاهی دارند و یا خوراکی می­باشند) و حتی در  موجودات دیگر تسهیل نمود. بر اساس نتایج، پیشنهاد می­شود که غلظت 25 و 50 میکرومولار الیسیتور نقره و غلظت‌های 4 و 8 میکرومولار الیسیتور مس برای رسیدن به این اهداف مناسب می­باشند.

سپاسگزاری 

این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی کرمان با قرارداد شماره 4036/1 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از مسئولان محترم آن دانشگاه اعلام می­دارند.

  1. زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی، انتشارات دانشگاه تهران. جلد دوم، ص: 766-765.
  2. شهبازی، ع و ریاحی مدوار، ع. 1390. بررسی اثر الیسیتورهای روی و مس بر مقدار فورسکولین و بیان ژن DXR در کشت بافت گیاه حسن یوسف، پایان­نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته.
  3. کافی م. راشد محصل، م. ح. کوچکی، ع. و ملافیلابی، ع. 1381. زیره سبز فناوری تولید و فرآوری. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد.
  4. نصیری بزنجانی، م، ریاحی مدوار، ع و باقی­زاده، ا. 1390. القای تولید ماده موثره (رزمارینیک اسید) در گیاه بادرنجبویه در مرحله گیاهچه و بررسی بیان آنزیم تیروزین آمینو ترانسفراز، پایان­نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته.
    1. Adriano, D.C. 2001. Trace Elements in Terrestrial Environments; Biochemistry, Bioavailability and Risk of Metals. Springer-Verlag. New York.
    2.  Ajith, TA. and Janardhanan, K.K. 2007. Indian medicinal mushroom as a source of antioxidant and antitumor agents. J. Clin. Biochem. Nutr. 40(3), 157-62.
    3.  Al-Bader, M.D. 2006. Estrogen receptors alpha and beta in rat placenta: detection by RT-PCR, real time PCR and western blotting. Reprod. Biol. Endocrinol. 28, 4-13.
    4.  Arts, I.C.W. and Hollman, P.C.H. 2005. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies. Am. J. Clin. Nutr. 81, 317-325.
    5. Aruna, K. and Sivaramakrishnan, V.M. 1992. Anticarcinogenic effects of some Indian plant products. Food Chem. Toxicol. 30(11), 6-953.

 

10.  Babu, T.S., Akhtar, T.A., Lampi, M.A., Tripuranthakam, S., Dixon, D.G. and Greenberg, B.M. (2003). Similar stress responses are elicited by copper and ultraviolet radiation in the aquatic plant Lemna gibba: Implication of reactive oxygen species as common signals. Plant Cell Physiol.  44, 1320-1329.

11.  Bais, H.P., Sudha, G. and Ravishankar G.A. 2000. Effect of Putrescine and silver nitrate on shoot multiplication and in vitro flowering in Cichorium intybus L. cv. Lucknow local. J. Plant Growth Regul. 19, 238-248.

12.  Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-day binding. Anal, Biochem. 72, 248-254.

13.  Brundrett, M.C. 2002. Convolution of roots and mycorrhizas of land plants. New Phytol. 154, 275–304.

14.  Costa, H., Gallego, S.M. and Tomar, M.L. 2002. Effects of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons, Plant sci. 162, 939-945.

15.  Dhindsa, R.S. and Motowe, W. 1981. Drought tolerance in two mosses: correlation with enzymatic defense against lipid peroxidation. J. Exp. Bot. 32, 79-91.

16.  Forkmann, G. 1980. Genetics of flavonoids, in the flavonoids, advances in research  since, Harborne, J.B., Ed., Chapman & Hall, London, 1988: 399.

17.  Giannopolitis, C. and Ries, S. 1977. Superoxid desmutase. I. Occurrence in higher plant. Plant Physiol. 59, 309-314.

18.  Gong, Y., Toivonen, P.M., Lau, O.L. and Wiersma, A.P. 2001. Antioxidant system level in "Braeburn" apple is related in its browning disorder. Bot. Bull. Acad. Sinica. 42, 259-264.

19.  Hansch, R. and Mendel, R.R. 2009. physiological functions of mineral micronutrients (Cu, Zn, Mn, Fe, Cr, Mo, B, Cl). Curr. Opin. plant boil. 12, 259-266.

20.  Harborne, J.B. and Williams, C.A. 2000. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry. 55, 481–504.

21.  Heller, W. and Forkmann, G. 1986. Biosynthesis of flavonoids, in The Flavonoids: Advances in Research, Harborne, J.B., Ed., Chapman & Hall, London, 1994, 499.

22.  Hollosy, F. 2002.Effects of ultraviolet radiation on plant cells, Micron, 33(2), 179-197,

23.  Hsieh, T.H., Lee, J.T., Charng, Y.Y. and Chan, M.T. 2002. How to define resistance to water deficit stress? Plant physiol. 130, 618-626.

24.  Kistner, C. and Parniske, M. 2002. Evolution of signal transduction in intracellular symbiosis, Trends Plant Sci. 7, 511-518.

25.  Krizek, D.T., Kramer, G.F. and Upadyaya, A. 1993. Mirecki, R. M. UV-B response of cucumber seedling grown- under metal halide and high pressure sodium/deluxe lamps. Physiol. Plant. 88, 350-358.

26.  Krizek, D.T., Britz, S.J. and Mirecki, R.M. 1998. Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv, New Red Fire Lettuce. Physiol. Plant. 103,1-7.

27.  Kupper, H., Götz, B., Mijovilovich, A., Frithjof, C. and Wolfram Meyer-Klaucke, 2009. Complication and Toxicity of Copper in Higher Plants. Plant Physiol. 151, 702-714.

28.  Lee, Y.J.  Kim, J.H.  Kim, B.G. Lim, Y. & Ahn, J.H. 2007. Characterization of flavone synthase I from rice, BMB reports. 143-701.

29.  Manach, C., Scalbert, A., Morand, C. and Jimenez, L. 2004. Polyphenols: Food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 79, 727-747.

30.  Marschner, H. 1995. Mineral nutrition of higher plants, Academic Press, London.

31.  Martens, S., Forkmann G., Matern, U. and Lukac,ˇ R. 2001. Cloning of parsley flavone synthase I. Phytochemistry. 58, 43-46.

32.  Middleton, E., Kandaswami, J.C. and Theoharides, T.C. 2000. flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer, Pharmacol. Rev. 6, 73-75.

33.  Morales L.O. Tegelberg R., Brosché M., Keinänen M., Lindfors A., Aphalo P.J., 2010. Effects of solar UV-A and UV-B radiation on gene expression and phenolic accumulation in Betula pendula leaves. Tree Physiol. 30, 923-934.

34.  Pan, Z., Wang, H. and Zhong, J. 2000. Scale up study on suspension cultures of Taxus chinensis cells for production of taxane diterepene, Enzyme Microb. Technol. 27, 714-723.

35.  Plewa, M.J., Smith, S.R. and Wanger, E.D. 1991. Diethyl dithio carbamate suppresses the plant activation of aromatic amines into mutagens by inhibiting tobacco cell peroxidase. Mutat. Res. 247, 57-64.

36.  Prabhat, K. 2007. Metabolic engineering of yeast for the production of plant secondary metabolites, Research Exercise Summary.

37.  Quartacci, M.F., Pinzino, C., Sgherri, C.L.M., Dalla, Vecchia, F. and Navari-Izzo, F. 2000. Growth in excess copper induces changes in the lipid composition and fluid-ity of PSII-enriched membranes in Wheat. Physiol. Plant. 108, 87-93.

38.  Ramawat K.G. and Merillon, J.M. 1999. Biotechnology; Secondary Metabolites. Science Publisher, NH, USA.

39.  Rice-Evans, C.A., Miller, N.J. and Paganga, G. 1997. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends Plant Sci. 2, 152.

40.  Sachin, B.S., Sharma, S.C., Sethi, S., Tasduq, S.A. and Tikoo, M.K. 2007. Herbal modulation of drug bioavailability: enhancement of rifampicin levels in plasma by herbal products and a flavonoid glycoside derived from cyminum. Phytother. Res. 21(2), 157-63.

41.  Sakihama, Y. and Yamasaki, H. 2002. Lipid peroxidation induced by phenolics in conjunction with aluminum ions. Biol. Plant. 45, 249.

42.  Savitha, B.C., Thimmaraju, R., Bhagyalakshmi, N. and Ravishankar, G.A. 2006. Different biotic and abiotic elicitors influence betalain production in hairy root cultures of Beta vulgaris in shake-flask and bioreactor. Process Biochem. 41, 50 – 60.

43.  Shun, Y.M., Wen, Y.H., Yong, C.Y. and Jian, G.S. 2003. Two benzyl dihydroflavones from phellinus igniarius. Chinese Chem. Lett. 14(8), 810-13.

44.  Srivastava, K.C. 1989. Extracts from two frequently consumed spices-cumin

45.  Stapleton, A.E. 1999. Ultraviolet radiation and plants: burning questions, Plant Cell, 4, 1353.

46.  Tang, L., Kwon, S.Y., Kim, S.H., Kim, J.S., Choi, J.S., Cho, K.Y., Sung, C.K., Kwak, S.S. and Lee, H.S. 2006. Enhanced tolerance of transgenic potato plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against oxidative stress and high temperature, Plant Cell Rep. 25(12), 1380-1386.

47.  Thippeswamy, N.B. and Akhilender N.K. 2005. Antioxidant potency of cumin varieties (cuminblack cumin and bitter cumin) on antioxidant systems. Eur. Food  Res. Technol. 220(5-6), 472-476.

48.  Walker, C.D., Webl, Robson  A.D. and Graham  R.D. (Eds.) 1981. Copper in soils and plants. Academic Press. 189-212.

49.  Zhang, Y. 2004. Cancer-preventive isothiocyanates: measurement of human exposure and mechanism of action, Mutat. Res. 555(1-2), 173-190.

Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 28, Issue 1 - Serial Number 1
June 2015
Pages 210-223
  • Receive Date: 14 July 2012
  • Revise Date: 05 October 2013
  • Accept Date: 04 November 2013