نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه سیستان و بلوچستان

چکیده

تجمعات پروتئینی از عوامل مختلفی ناشی شده و منجر به بیماری های گوناگون در انسان ها و سایر موجودات زنده می گردد. یافتن راهکاری مناسب جهت جلوگیری از ایجاد اینگونه تجمعات می تواند بسیار حائز اهمیت باشد. گیاه چای ترش منبع غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی است که می تواند از بدن در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد محافظت کند. در این پژوهش اثر عصاره ی آبی گیاه چای ترش بر روی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین درحضور دی تیو تریتول(DTT) به عنوان عامل القا کننده ی تجمع مورد بررسی قرار گرفت. خاصیت چاپرونی عصاره بر روی تجمع پروتئین توسط روش های طیف سنجی نور مرئی، فلورسانس تیوفلاوین تی(ThT)، اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، 1-آنیلیلینو8-نفتالن سولفونات (ANS) و دورنگ نمایی دورانی (Circular dichroism) بررسی شد. نتایج بدست آمده از طیف سنجی نور مرئی و اتصال تیوفلاوین تی نشان داد که عصاره ی چای ترش از ایجاد تجمع و تشکیل آمیلوئید در پروتئین جلوگیری کرده و این تاثیر با افزایش غلظت عصاره شدت می یابد. طبق نتایج بدست آمده از آزمایشات فلورسانس، عصاره با نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته در پروتئین احیا شده برهمکنش کرده و از تجمع جلوگیری می کند. نتایج حاصل از دورنگ نمایی حلقوی نشان داد که دی تیو تریتول تغییراتی در ساختمان دوم پروتئین ایجاد می کند که در حضور عصاره تغییرات کمتری مشاهده می شود. نتایج این پژوهش چای را به عنوان عاملی بالقوه جهت جلوگیری از تجمع پروتئین های مختلف دخیل در بیماری های گوناگون ناشی از تجمع پیشنهاد می کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigation the protective ability of H. sabdariffa aqueous extract on the aggregatin of α-lactalbmin

نویسندگان [English]

  • shohreh rahimi
  • Arezou Ghahghaei

University of Sistan and Baluchestan

چکیده [English]

protein aggregates generated by different reason, cause many diseases in humans and other organisms. Finding proper ways to stabilize or prevent of protein aggregation could be important. H. sabdariffa is a good source of natural antioxidants which may protect the body from damage effeccted by free radicals. This study examined the effect of aqueous extract of H. sabdariffa on the aggregation of reduced α-lactalbumin. The chaperone properties of H. sabdariffa extract on protein aggregation were determined by measuring light scattering absorption, thioflavin T binding assay, fluorescence, and circular dichroism (CD) spectroscopy. Visible absorption spectroscopy and ThT fluorescence results shows that H. sabdariffa extract prevent protein aggregation and amyloid formation in a concentration-dependent manner. According to the results of Fluorescence Spectroscopy, H. sabdariffa extract interact with hydrophobic area of protein and inhibit aggregation. CD spectroscopy results shows that DTT caused changes in secondary structure of protein and in the presence of extract, fewer changes observed. Our finding suggests the possibility of using H. sabdariffa extract as a potential agent for inhibition of protein aggregation in various disease

کلیدواژه‌ها [English]

  • H. sabdariffa
  • α-lactalbumin
  • protein aggregation

بررسی اثر حفاظتی عصاره‏ی آبی گیاه چای ترش بر جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین

شهره رحیمی، آرزو قهقایی*

زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده علوم

تاریخ دریافت: 6/5/95                  تاریخ پذیرش: 24/9/95

چکیده 

تجمع پروتئینی از عوامل مختلفی ناشی شده و منجر به بیماری‏های گوناگون در انسان ها و سایر موجودات زنده می‏گردد. یافتن راهکاری مناسب جهت جلوگیری از ایجاد اینگونه تجمعات می‏تواند بسیار حائز اهمیت باشد.  گیاه چای ترش منبع غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی است که می‏تواند از بدن در برابر آسیب‏های ناشی از رادیکال‏های آزاد محافظت کند. در این پژوهش اثر عصاره ی آبی گیاه چای ترش بر روی تجمعات پروتئین آلفا-لاکتآلبومین درحضور دی‏تیو‏تریتول(DTT) به عنوان عامل القا کننده‏ی تجمع مورد بررسی قرار گرفت. خاصیت چاپرونی عصاره بر روی تجمع پروتئین توسط روش‏های طیف سنجی نور مرئی، فلورسانس تیوفلاوین‏تی (ThT)، اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، 1-آنیلیلینو8-نفتالن سولفونات (ANS) و دورنگ نمایی دورانی (Circular dichroism) بررسی شد. نتایج بدست آمده از طیف سنجی نور مرئی و اتصال تیوفلاوین تی نشان داد که عصاره‏ی چای ترش از ایجاد تجمع و تشکیل آمیلوئید در پروتئین جلوگیری کرده و این تاثیر با افزایش غلظت عصاره افزایش می‏یابد. طبق نتایج بدست آمده از آزمایشات فلورسانس، عصاره با نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته در پروتئین احیا شده برهمکنش کرده و از تجمع جلوگیری می‏کند. نتایج حاصل از دورنگ‏نمایی‏حلقوی نشان داد که دی‏تیو‏تریتول تغییراتی در ساختمان دوم پروتئین ایجاد می‏کند که در حضور عصاره تغییرات کمتری مشاهده می‏شود. نتایج این پژوهش چای ترش را به عنوان عاملی بالقوه جهت جلوگیری از تجمع پروتئین‏های مختلف دخیل در بیماری‏های گوناگون ناشی از تجمع  پیشنهاد می‏کند. 

واژه‏های کلیدی: تجمع ‏پروتئین، آلفا-لاکتآلبومین، چای ترش

* نویسنده مسئول، تلفن: 05433446565، پست الکترونیکی: arezou@chem.usb.ac.ir

مقدمه

 

عدم تا‏خوردگی صحیح پروتئین‏ها یا باقی نماندن آنها در حالت درست تا شده، با اختلالات زیادی در عملکرد سلول‏ها همراه است که منجر به بیماری‏های مختلف می‏شود (9). پروتئین‏های تجمع یافته مولکول‏هایی با ساختار اشتباه تاخورده هستند که از ناتوانی پروتئین در تا خوردگی صحیح به صورت کنفورماسیون عملکردی فعال ویا عدم توانایی  باقی مانده در آن کنفورماسیون، ناشی می‏شوند (19). بسته به شرایط استرس مانند دما، pH و حضور عامل کاهنده،  تجمعات  نامظم  (آمورف)  یا  منظم

(فیبریل‏های آمیلوئیدی) ایجاد می‏گردد (5).

چای ترش گیاهی یک ساله است که ارتفاع آن گاهی به 4- چهارمتر می­رسد. این گیاه در سراسر جهان، در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر یافت می­شود و در نواحی تولید کننده به نام روسل معروف می­باشد (22) چای ترش بومی ایران نمی­باشد و کشت این گیاه در ایران تنها در استان سیستان و بلوچستان گزارش شده­است (2). کاسبرگ خشک گیاه چای ترش حاوی فلاونوئید، آنتوسیانین و مقدار بالایی اسید مانند اگزالیک اسید، سوکسینیک اسید و اسیدهای آلی است. به علاوه مقدار اسید آسکوربیک چای ترش در مقایسه با خانواده‏ی مرکبات بیشتر می­باشد. در آزمایشات انجام شده حضور آهن، فسفر، کلسیم، منگنز، آلومینیوم، سدیم، پتاسیم، موسیلاژ، گوسیپتین، هیبیستین، پروتئین و مواد معدنی در آن مشاهده شده است (4و23).

چای ترش منبع غنی از آنتی­اکسیدان­های طبیعی است که می­توانند از بدن در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی محافظت کنند. اثرات محافظتی احتمالا از طریق مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانین ها اعمال می­شود (17). در بین قسمتهای مختلف چای ترش، عصاره­ی آبی کاسبرگ آن بیشترین فعالیت آنتی اکیسدانی را دارا است (23). این نتایج ناشی از این است که کاسه­ی گل منبع غنی ویتامین  C(mg 141 در g100)، آنتوسیانین­ها (mg 5/2 در g 100(، بتاکاروتن (mg 88/1 در g 100(، لیکوپن (gµ 164 در g100(، پلی فنول­ها و دیگر آنتی­اکسیدان­های محلول در آب است (15).

به دنبال به اثبات رسیدن خاصیت آنتی اکسیدانی بالای عصاره­ی گیاه، این احتمال داده شد که ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در این گیاه بر روی تجمع پروتئین و تشکیل آمیلوئید تأثیر‏گذار باشند. بنابر­این برآن شدیم که تاثیر عصاره­ی این گیاه را بر روی تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین بررسی نماییم.

آلفا-لاکتآلبومین یک مونومر کوچک با وزن مولکولی 18/14 کیلو دالتون و حاوی 123 اسید آمینه است (18). این پروتئین دارای 8 باقیمانده سیستئین است که 4- چهار پل دی سولفیدی تشکیل می‏دهند (6). آلفا-لاکتآلبومین که بخشی از کمپلکس لاکتوز سنتاز است، دارای جایگاهی برای اتصال کلسیم است که به نظر می‏رسد در تغییر ساختار پروتئین از حالت طبیعی به فرم غیر طبیعی شده نقش داشته باشد (20). این پروتئین همچنین دارای ناحیه‏ی اتصال روی است. این نواحی اتصال ممکن است نقشی را در کمپلکس لاکتوز سنتاز ایفا کنند (18). آلفا-لاکتآلبومین تحت شرایط مختلف محیطی شاملpH پایین و غلظت پایین نمک در غیاب کلسیم، حالت مولتن گلبول تشکیل می دهد (10و11) که باند های دی سولفیدی را مستعد احیا و منجر شدن به فیبریل های آمیلوئیدی می کند (8 و13). این فرم از آلفا-لاکتآلبومین ساختار دومی مشابه حالت طبیعی دارد اما ساختار سوم کمی را نشان میدهد (7). از آنجایی‏که آلفا-لاکتآلبومین به بهترین شکل حالت مولتن گولبول را نشان میدهد، این پروتئین می‏تواند به عنوان مدلی مناسب برای مشاهده ی دقیق چاپرون‏های مولکولی و حالت مولتن گلوبل بکار گرفته شود (16).

مواد و روشها

مواد مورد استفاده 

مواد شیمیایی و پروتئین­ها: پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (KD14) از شرکت سیگما تهیه شد.

مواد شیمیایی شامل: دی­تیوتریتول (DTT)، سدیم آزید (3NaN)، سدیم فسفات (4HPO 2Na)، 1-آنیلینو-8-نفتالن

سولفونیک اسید (ANS) و تیوفلاوین T (ThT)  نیز از شرکت سیگمادرامریکا تهیه شدند.

مواد گیاهی

گیاه چای ترش از زاهدان واقع در استان سیستان و بلوچستان جمع آوری شد.

عصاره گیری از گیاه: عصاره­گیری به این صورت انجام شد که میزان 15 گرم از پودر گیاه به cc 150 آب دو بار تقطیر  اضافه شده، به مدت 24 ساعت توسط همزن مغناطیسی کاملا مخلوط شد. عصاره‏­ی حاصل سپس با استفاده از کاغذ صافی صاف شده، به مدت 20 دقیقه با دور 12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به پلیت شیشه­ای منتقل شده و به مدت 3-4 روز در داخل انکوباتور خشک شد. نمونه پس از خشک شدن کامل، به صورت پودر جهت انجام آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.

استفاده از تکنیک اسپکتروسکوپی جذب نوری: توانایی عصاره­ی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع و ته­نشینی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با استفاده از طیف سنجی نور مرئی مورد بررسی قرار گرفت. آلفا-لاکتآلبومین در غلظت  mg/ml5/2 در بافر فسفات  mM50 ( pH 4/7(، حاوی سدیم آزید (NaN3) % 05/0 که سدیم کلرید(NaCl) mM 100 نیز به آن افزوده شده بود، تهیه گردید. یک نمونه به عنوان شاهد، بدون عصاره­ در نظر گرفته‏شده و نمونه­های دیگر در معرض غلظت­های متفاوت عصاره­ی چای ترش (با نسبت­­های1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) قرار گرفتند. به تمامی غلظت­های آماده شده مقدار یکسان DTT  mM20 افزوده شد. در اثر افزوده شدن DTT، غیرطبیعی شدن و تجمع آغاز شده، آزمایش در طول موج nm340 و دمایC˚ 37 درجه توسط دستگاه الایزا (کمپانی Biotek) صورت گرفت و جذب به مدت 180 دقیقه در فاصله­های زمانی هر 3 دقیقه توسط دستگاه خوانده شد.

بررسی تشکیل آمیلوئید با استفاده از رنگ تیو فلاوین­تی (ThT): تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی به وسیله آلفا-لاکتآلبومین ( mg/ml5/2 ) در حضور عامل احیا کننده پیوند­های دی­سولفیدی DTT ( mM20) و عصاره­ی چای ترش در غلظت‏های مختلف (با نسبت­­های1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره). بررسی شد. نمونه­های مورد نظر حاوی بافر فسفات  mM50، DTT  mM20، pH  4/7 به مدت 30 ساعت درون دستگاه انکوباتور A-Q German در دمای ˚C 37 انکوبه شدند. بمنظور تسهیل درتشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی، نمونه­های درون انکوباتور با استفاده از دستگاه شیکر با دور rpm 210 تکان داده شدند. سپس نمونه­های انکوبه شده طی فاصله­های زمانی متفاوت برداشته می­شوند تا روند تشکیل آمیلوئید با گذشت زمان سنجیده شود. نمونه­های برداشته شده بمنظور سنجش نشر آن­ها توسط فلورسانس ThT (Mµ4/0 در بافر فسفات  Mm500 ، سدیم آزید (NaN3)% 05/0 ، pH(4/7) به دستگاه فلوریمتر منتقل می­شوند. با استفاده از نرم افزار (varian USA) Carry  Eclipse  spectro-fluorimeter و تنظیمات آن نشر نمونه­ها خوانده می­شود. به گونه­ای که با تنظیمات نرم افزار، طول موج برانگیختگی نمونه­ها برابرnm 446 و طول موج نشر آن­ها برابر nm 600-480 تنظیم شد.

استفاده از تکنیک اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی Intrinsic fluorescence: شدت فلورسانس ذاتی برای آلفا-لاکتآلبومین (Mµ 10( و غلظت‏های مختلف عصاره­ی چای ترش (1 : 25/0 ،1 : 5/0 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) اندازه­گیری شد. نمونه­ها در بافر فسفات mM50 (Na2HPO4) حاوی سدیم­آزید)  (NaN3% 05/0 و4/7pH= آماده شدند. بعد از اضافه کردن DTT، نمونه­ها به مدت 3 ساعت در دمایC  ˚ 37 انکوبه شدند سپس طیف فلورسانس با استفاده از دستگاه Carry Eclipse spectrofluorimeter (varian USA) بدست آمد. طول موج برانگیختگی برای ریشه­های تریپتوفان nm 295 باعرض عبوری nm 5/2 در دستگاه تنظیم شد. همچنین طیف نشری حاصل در طول موج 400-300 با عرض عبوری nm5 ثبت شد.

استفاده از نشانگر فلورسنت متصل شونده به  1-آنیلو نفتالن سولفونات (ANS): سنجش اتصال ANS برای ارزیابی تغییرات هیدروفوبیستی حاصل از فعل و انفعال بین پروتئین و عصاره‏ی چای ترش مورد استفاده قرار گرفت. نمونه­ها حاوی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (mM10)، غلظت‏های مختلف عصاره­ی چای ترش (1 : 25/0 ،1 : 5/0 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) همراه با DTT mM  20 در بافر فسفاتmM  50 حاوی سدیم آزید (NaN3) %05/0و pH برابر با 4/7 انکوبه شدند. فلورسانس ANS بوسیله‏ دستگاه varian spectrofluorimeter قابل مشاهده است. طول موج تحریکی برابر nm400 قرار می‏گیرد و طول موج نشر در یک دامنه nm600-400 تنظیم می­شود. عرض عبوری برای این نور تحریکی برابر با 5/2 قرار داده می­شود. بعد از قرار گرفتن کووت حاوی نمونه­ها در دستگاه فلوریمتر، طی فاصله­ها­ی زمانی مداوم، 1میکرولیتر از محلول استوک ANS به نمونه­ها اضافه شده و با هر بار اضافه کردن این مقدار از رنگ ANS، نشر خوانده می­شود. این عمل تا زمانی ادامه پیدا می­کند که شدت فلورسانس به حالت یکنواخت رسیده باشد و دیگر افزایشی در شدت فلورسانس مشاهده نشود.

استفاده از روش اسپکتروسکپی دورنگ نمایی حلقوی (CD): در این روش ساختار دوم و سوم پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصاره­ی گیاه چای ترش با استفاده از دو­رنگ نمایی حلقوی Far-uv CD (طول موج­های 260–190 نانومتر) مورد آزمایش قرار گرفت. نمونه­ها، آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 2/0) در حضور عصاره­ی چای ترش (در نسبت­های وزنی1 : 25/0 ،1 : 5/0  و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره).  بافر استفاده شده،  بافر فسفات mM10 pH برابر با 4/7. از DTT  به عنوان احیا کننده­ی پیوند­ها­ی دی­سولفیدی استفاده شد. اندازه­گیری­ها در کووت­های با طول مسیر cm1در  Cᵒ  37 با استفاده از اسپکتروپلاریمتر varian مدل Aviv انجام شد.

نتایج

بررسی اثر عصاره­ی چای ترش بر تشکیل تجمع در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با استفاده از طیف سنجی نور مرئی: قابلیت عصاره­ی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط اسپکتروسکوپی نور مرئی اندازه­گیری شد. فرآیند غیر طبیعی شدن و تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین به دنبال احیا شدن چهار-4 پیوند دی­سولفیدی موجود درساختمان آن که بین ریشه‏های سیستئین در نواحی مختلف تشکیل شده­اند، توسط DTT بوقوع می­پیوندد (14).

همان طور که در شکل1 نشان داده شده است، شدت جذب پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با گذشت زمان در حضور دی­تیو­تریتول افزایش می­یابد که نشان دهنده­ی تشکیل تجمع در این مولکول پروتئینی است. ضمن اضافه کردن غلظت­های مختلف از عصاره­ی چای ترش مشخص شد که با افزودن عصاره به پروتئین، از سرعت غیر طبیعی شدن و تشکیل تجمعات در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در یک نسبت وابسته به غلظت کاسته شده و زمان مورد نیاز برای شکل­گیری این ساختارها افزایش می­یابد. چنانکه  میزان جلوگیری از تجمعات پروتئینی در حضور غلظت­های مختلف عصاره­ی چای ترش در جدول 1 آورده شده است، در نسبت 25/0 : 1 وزنی/وزنی آلفا-لاکتآلبومین / عصاره ، به میزان 12/31 درصد از تشکیل تجمعات جلوگیری شد و با افزایش نسبت عصاره به پروتئین به میزان  1 : 1وزنی/وزنی، این درصد محافظت به 32 /83 درصد افزایش پیدا کرد. میزان درصد حفاظت (جلوگیری از تجمع) در غلظت­های مختلف عصاره­، نشان­دهنده­ی تاثیر گذاری ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در عصاره­ی چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است.

 

شکل1- میزان جذب نوری در  nm340 درمدت زمان 180 دقیقه برای پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 2) درعدم حضور و حضور عصاره­ی گیاه چای ترش (در نسبت­های وزنی : وزنی 1 : 25/0 ،1 : 5/0  و1 : 1 پروتئین : عصاره). پروتئین در بافر فسفات mM 50 در pH 4/7 و NaN3 %05/0 و دمای ᵒC 37 در حضور DTT   mM20 تهیه گردید. همچنین NaCl   mM 100نیز به بافر افزوده شد. این آزمایش 3 بار تکرار گردیده است

 

جدول 1- درصد بازداری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط غلظت­های مختلف عصاره­ی چای ترش

در صد بازداری (درصد)

ترکیبات نمونه

12/31

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 25/0 )

64/36

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 5/0  )

32/83

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 1  )

 

بررسی تشکیل فیبریل آمیلوئید α-لاکتآلبومین در حضور غلظت­های مختلف عصاره­ی چای ترش به وسیله اتصال تیوفلاوین­تی (ThT): تشکیل فیبریل آلفالاکتآلبومین احیا شده توسط DTT در عدم حضور و حضور نسبت­های مختلف عصاره گیاه چای ترش مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی توسط تکنیک اتصال ThT به فیبریل­های آمیلوئیدی انجام گرفت که نمودار آن به صورت مقیاسی از فلورسانس ThT نسبت به زمان در شکل2 آمده است. همانطور که در شکل مشاهده می­شود یک افزایش در شدت فلورسانس وابسته به زمان در نمونه­ی آلفالاکتآلومین احیا شده توسط  DTTمشاهده می­شود، در حضور عصاره­ی چای ترش از شدت فلورسانس کاسته شده و با افزایش غلظت عصاره این کاهش شدت فلورسانس بیشتر می­شود که نشان دهنده­ی اثر محافظتی عصاره گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است.

این اثر با محاسبه ثابت سرعت نیز تایید می­شود. چنانچه جدول2 نشان می­دهد، در عدم حضور عصاره ثابت سرعت تشکیل آمیلوئید در آلفا-لاکتآلبومین برابر باmin-1 1- 10× (003/ 0±  345/0) بود و با افزودن عصاره با نسبت 25/0 : 1 وزنی : وزنی عصاره نسبت به پروتئین، مقدار ثابت سرعت به min-1  1- 10× ( 005/0± 321/0) کاهش یافت. با افزودن غلظت عصاره به نسبت 5/0 : 1 و 1 : 1 عصاره نسبت به پروتئین، این مقدار بترتیب به  min-1 1- 10× (014/0 ±  295/0) و  min-1  1- 10 ( 002/0 ± 200/0) رسید. که نشان می­دهد عصاره­ی چای ترش سرعت تشکیل آمیلوئید را در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین احیا شده کاهش می­دهد.

 

شکل2- تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 5/2) در حضور عصاره­ی چای ترش (با نسبت­های وزنی 25/0 : 1، 5/0 : 1 و 1: 1 عصاره : پروتئین)، و ThT µM4. بافر استفاده شده بافر فسفاتmM  50 حاوی سدیم آزید NaN3  %05/0و  pH برابر 4/7 است. از mM  DTT   20 به عنوان احیا کننده­ی پیوندهای دی­سولفیدی استفاده شده است. این آزمایش 2 بار تکرار گردیده است.

بررسی فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصاره­ی گیاه چای ترش: فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین از چهار-4 ریشه‏ی تریپتوفان موجود در آن ناشی می‏شود و بر حسب اینکه پروتئین در چه شرایطی قرار بگیرد، متفاوت است. در این آزمایش فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین در حضور عامل احیا کنندۀ پیوندهای دی­سولفیدی  دی­تیو­تریتول (DTT) و غلظت­های مختلف عصاره­ی گیاه چای ترش  مورد بررسی قرار گرفت.

نمودار ستونی مربوط به مقایسه ماکزیمم شدت فلورسانس پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حضور  عصاره­ی چای ترش در نسبت­ های مختلف در شکل 3 قابل مشاهده است.

 

جدول 2- خلاصه­ای از ثابت­های سرعت آلفا-لاکتآلبومین در حضور غلظت­های مختلف عصاره چای ترش با استفاده از بررسی تیوفلاوینT. ثابت­های سرعت با استفاده از نرم افزار سیگما پلات محاسبه شده است. انحراف استاندارد از محاسبات به دست آمده از سیگما پلات محاسبه شده است.

ثابت سرعت ×  1-10 (min-1)

ترکیبات نمونه

003/ 0±  345/0

آلفا-لاکتآلبومین

005/0± 321/0

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 25/0)

014/0 ±  295/0

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 5/0 )

002/0 ± 200/0

آلفا-لاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 1 )


چنانچه در شکل ملاحظه می­شود، مطابق با جدول3، پروتئین آلفا-لاکتآلبومین فلورسانسی در حدود 100 نشان می­دهد. در حضور عصاره با نسبت 25/0 : 1 وزنی/ وزنی عصاره : پروتئین، کاهش 05/3 در صدی در شدت فلورسانس مشاهده شد و با افزایش نسبت عصاره به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی/ وزنی عصاره : پروتئین این کاهش بترتیب به 19درصد و 79/30 درصد رسید.

به لحاظ آماری از آنجاییکه t محاسبه شده بوسیله­ی نرم­افزار SPSS بین ستون­های مربوط به پروتئین در عدم حضور عصاره و در حضور عصاره با نسبت 1 : 25/0، برابر 03/0، بین ستون ها­ی مربوط به نسبت­ها­ی 1 : 25/0 و 1 : 5/0 برابر 0016/0، و در ستون ­ها­ی مربوط به نسبت­های 1 : 5/0 و 1:1 برابر 02/0، در سطح اطمینان 95% نمودار کوچکتر از مقدار بحرانی جدولT می­باشد که معنا دار بودن تفاوت مشاهده شده را نشان می­دهد.

 

شکل3- ماکزیمم شدت فلورسانس ذاتی α- لاکتآلبومین ( µM 10) در حضور عصاره گیاه چای ترش(با نسبت­های وزنی25/0 : 1، 5/0 : 1 و 1 : 1). نمونه­ها در بافر  mM 50 فسفات، NaN3  %05/0  و pH برابر 4/7 تهیه شدند و از DTT  mM20به عنوان احیا کننده­ی پیوند­های دی­سولفیدی استفاده شده است. نمونه­ها به مدت 3 ساعت در دمای  C˚37 انکوبه شده­اند.

جدول3- درصد بازداری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط غلظت­های مختلف عصاره­ی چای ترش.

درصد بازداری

ترکیبات نمونه

05/3

آلفالاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 25/0)

19

آلفالاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش (1 : 5/0)

79/30

آلفالاکتآلبومین + عصاره­ی چای ترش ( 1:1 )

بررسی اتصال 8 آنیلینو -1- نفتالن- سولفونیک اسید (ANS) به آلفا-لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصاره­ی چای ترش: تکنیک اتصال ANS جهت بررسی تغییرات  نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته ی  پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در عدم حضور و حضور غلظت‏های مختلف عصاره ی چای ترش استفاده شد. پروتئین آلفا-لاکتآلبومین احیا شده اتصال ANS بالایی نشان می‏دهد درحالیکه نتایج نشان داد که افزایش عصاره­ی گیاه چای ترش باعث کاهش فلورسانس ANS پروتئین شده و با افزایش میزان غلظت عصاره روند کاهش فلورسانس ANS ادامه می­یابد. چنانچه در شکل4 مشاهده می­شود، افزودن عصاره با نسبت 25/0 : 1 موجب کاهش 23/19 درصدی در شدت فلورسانس شده و با افزایش نسبت عصاره به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی/ وزنی ، بترتیب کاهش  76/29 و 18/35 درصدی در شدت فلورسانس مشاهده می­شود. این کاهش در شدت فلورسانس نشان دهنده‏ی تاثیر عصاره در جلوگیری از برهمکنش بین نواحی هیدروفوب پروتئین و ANS است. به لحاظ آماری از آنجاییکه مقادیر t محاسبه شده بوسیله نرم­افزار SPSS بین ستون­های مربوط به پروتئین در عدم حضور عصاره و در حضور عصاره با نسبت 1 : 25/0 برابر 03/1، بین ستون­ها­ی مربوط به نسبت­ها­ی1 : 25/0 و 1 : 5/0 برابر 37/0، و بین ستون­های مربوط به نسبت­ها­ی 1 : 5/0 و 1:1 برابر 45/0، در سطح اطمینان 95درصد نمودار کوچکتر از مقدار بحرانی جدولT می­باشد که معنا دار بودن تفاوت مشاهده شده را نشان می­دهد.

 

شکل4- نمودار ستونی نشر فلورسانس آلفا-لاکتآلبومین (µM 10)در حضور نسبت­های وزنی مختلف عصاره­ی چای ترش(25/0 : 1، 5/0 : 1و 1 : 1عصاره : پروتئین). رنگ ANS  µM  4 استفاده شده است.  بافر فسفات حاوی سدیم آزید  NaN3  %05/0 و pH  برابر 4/7 است. از DTT  به عنوان احیا کننده­ی پیوند­های دی­سولفیدی استفاده شده است

ارزیابی طیفCD  Far-uv از آلفا - لاکتآلبومین در حضور غلظت­های مختلف عصاره­ی چای ترش: چنانچه قبلا ثابت شده است طیف CD- Farپروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حالت طبیعی دارای دو پیک منفی در ناحیه ی 208 و 222 نانومتر است که نشان دهنده­ی وجود هلیکس آلفا است (21). شکل5 نشان می­دهد که با اضافه کردن دی­تیو­تریتول و احیای باندهای دی­سولفیدی، باندهای منفی مربوط به هلیکس آلفا کاهش یافته و یک پیک منفی در ناحیه­ی 218 نانومتر ایجاد شده است که نشان دهندۀ وجود صفحات بتا است. بنابر­این یک تغییر ساختار از هلیکس آلفا به ساختار دارای صفحه بتا در حالت احیا شده آلفا-لاکتآلبومین مشاهده می­شود. گزارش شده­است که تغیر کنفورماسیونی از هلیکس آلفا به صفحات بتا منجر به ایجاد ساختارهای آمیلوئیدی می­شود (12). با اضافه کردن عصاره­ی گیاه چای ترش افزایش پیک­های منفی در 208 و 222 نانومتر مشاهده شد و با افزایش غلظت عصاره  به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره،  افزایش سیگنال منفی در 222-220 نانومتر مشاهده شد که نشان دهنده­ی پایداری افزایش یافته نواحی آلفا هلیکس و بیانگر اثر حفاظتی عصاره گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است. چنانکه در جدول 4 مشاهده می شود، محتوای کنفورماسیون هلیکس آلفا از  8/22 درصد  به  2/25 درصد افزایش یافت در حالیکه محتوای صفحات بتا از2/46 درصد به  2/31 درصد کاهش پیدا کرد.

 

شکل5- طیف CD Far- پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حالت ذاتی، حالت کاهش یافته در حضورDTT و در حضور غلظت­ها­ی مختلف عصاره­ی چای ترش(با نسبت­ها‏ی وزنی25/0 : 1، 5/0 : 1و 1 : 1 عصاره : پروتئین). غلظت پروتئین mg/ml  2/0 در بافر فسفات mM 10و  7  pH  و دمایC˚ 37 در اسپکتروپلاریمتر JASCOJ180 با سلی به طول مسیر cm1

بحث

به دلیل عوارض جانبی بسیار پایین تر گیاهان دارویی اخیرا توجه زیادی بر روی آنها به عنوان عوامل محافظتی معطوف شده است. در این پژوهش برای اولین باراست که اثرات گیاه چای ترش بر روی تجمع پروتئن بررسی می‍شود.

 

جدول 4- ساختار دوم پیش بینی شده از طیف Far-UV آلفا-لاکتآلبومین در حضور عصاره ی چای ترش با استفاده از برنامه ی JASCO

% کلاف بختانه

% پیچ های بتا

%صفحات بتا

% مارپیچ آلفا

نمونه

6/28

1/9

2/37

1/30

آلفا لاکتآلبومین

6/29

4/15

2/46

8/22

آلفالاکتآلبومین + DTT

4/32

2/11

2/31

2/25

آلفالاکتآلبومین+DTT+عصاره

 


نتایج حاصل از بررسی میزان اسپکتروسکوپی نور مرئی نشان داد که میزان جذب نوری پروتئین در عدم حضور عصاره در مقایسه با نمونه دارای عصاره بسیار بیشتر می­باشد. بالا بودن میزان جذب نوری می­تواند ناشی از تجمع پروتئین باشد. با افزوده شدن عصاره­ی گیاه میزان جذب کاهش یافت که احتمالا ناشی از اتصال ترکیبات آنتی­اکسیدانی گیاه (احتمالا از طریق مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانین­ها) به سطوح هیدروفوبیک پروتئین در جهت ممانعت از تجمع آن باشد. چنانچه پیش از این تاثیر ترکیبات فلاونوئیدی و آسکوربیک‏اسید در افزایش توانایی آنتی‏اکسیدانی بر علیه تنش‏های اکسیدتیو مختلف نشان داده  شده است (1و3).

به دنبال آن جهت بررسی تأثیر عصاره در جلوگیری از تشکیل فیریل­های آمیلوئیدی در آلفا-لاکتآلبومین، از روش فلورسانس ThT استفاده شد.

داده­های حاصل از آزمایش فلورسانس ThT بر روی تشکیل آمیلوئید در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین نشان می­دهندکه افزایش شدت فلورسانس پروتئین احیا شده با DTT در pH طبیعی )4/7(، نتیجه­ی تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی می­باشد. با توجه به ثابت­های سرعت به دست آمده مشاهده شد که عصاره­ی چای ترش سرعت تشکیل آمیلوئید در آلفا-لاکتآلبومین را کاهش می­دهد. این احتمال داده شد که این اثر از طریق واکنش عصاره با نواحی هیدروفوب پروتئین آلفا-لاکتآلبومین اعمال شود. به دنبال این فرضیه مطالعات فلورسانس در حضور عصاره­ی چای ترش بر روی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین انجام شد.

 آزمایش­های انجام شده به وسیله­ی فلورسانس ذاتی آلفا-لاکتآلبومین نشان می­دهد که در حضور دی­تیوتریتول ساختار پروتئین باز شده و اسیدهای آمینه آروماتیک که به علت داشتن گروه­های هیدروفوب در محلول در داخل پروتئین قرار گرفته بودند به سطح پروتئین منتقل می­شوند و به این دلیل است که افزایش در شدت فلورسانس مشاهده می­شود (12). نتایج فلورسانس ذاتی بر روی پروتئین احیا شده در حضور و عدم حضور عصاره­ی گیاه چای ترش نشان داد ترکیبات آنتی اکسیدانی موجود در عصاره­ی گیاه چای ترش می­تواند با تاثیر گذاری بر محیط اطراف ریشه­های تریپتوفان مانع از در معرض قرارگیری آنها در حلال شده و در نتیجه شدت فلورسانس ذاتی در نمونه­های دارای عصاره کاهش می­یابد و افزایش میزان عصاره گیاه باعث کاهش بیشتر فلورسانس ذاتی می­شود.

 در تایید نتایج فلورسانس ذاتی مطالعات ANS نیز نشان می­دهد که آلفالاکتآلومین با اضافه شدن DTT فلورسانس رو به افزایش دارد و تا زمانی که سطوح هیدروفوب این پروتئین از این کروموفور اشباع نشده باشند، این افزایش فلورسانس ادامه می­یابد. در حالیکه در حضور عصاره­ی گیاه چای ترش مشاهده شد که سطوح هیدروفوب در معرض قرار گرفته کاهش یافتند و با افزایش میزان عصاره این کاهش بیشتر شد که این کاهش احتمالا می­تواند نتیجه­ی تاثیر ترکیبات آنتی اکسیدانی از طریق اتصال و محافظت از مناطق هیدروفوب در مقابل حلال بوده و این عامل یعنی کاهش سطوح هیدروفوب در معرض می­تواند از تشکیل تجمعات پروتئینی جلوگیری کند.

موافق با نتایج فلورسانس، نتایج اسپکتروسکوپی CD در far-uv نشان داد که در حضور DTT ساختار های دوم هلیکس آلفا به میزان زیادی کاهش و صفحات بتا افزایش یافتند. در حضور عصاره ی چای ترش اما تغییر کمی در ساختار دوم پروتئین نسبت به حالت طبیعی مشاهده شد که بیانگر اثر حفاظتی عصاره­ی گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی در پروتئین بوده و تاثیر مثبت عصاره در جلوگیری از تغییرات ساختار دوم آلفا-لاکتآلبومین را نشان می­دهد.

با توجه به اثر ترکیبات آنتی اکسیدانی موجود در عصاره­ی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین و تشکیل آمیلوئید، می­توان به جداسازی و شناسایی ترکیبات موجود در عصاره این گیاه و بررسی اثر هر کدام از این ترکیبات بر روی تجمع پروتئین­ها پرداخت. همچنین  می­توان این اثرات را بر روی پروتئین­های دخیل در بیماری­های تجمعی و یا بر روی مدل­های آزمایشگاهی بررسی نمود.

جمع بندی

به طور خلاصه این نتایج ثابت می­کند که عصاره­ی گیاه چای ترش دارای اثر محافظتی در جلوگیری از تجمع و تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین بوده و با افزایش غلظت عصاره این اثرات بیشتر می­شود. این اثر محافظتی احتمالا از ترکیبات آنتی­اکسیدانی موجود در گیاه (مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانین­ها)  ناشی می­شود. و می­توان احتمال داد که عصاره با اتصال به نواحی آبگریز پروتئین، مانع از ایجاد برهم­کنش­های هیدروفوب-هیدروفوب پروتئین و تجمع آن می­شود. 

1- آزاده نجار خدابخش، نادر چاپارزاده. 1394. نقش آسکوربیک اسید در تقلیل اثرات اکسیداتیو شوری روی گیاه شاهی. مجله‏ی پژوهش‏های گیاهی(مجله‏ِی زیست شناسی ایران). 28(1).

2- صندوق داران، م. 1379. گزارش پیرامون کشت آزمایشی گیاهان چاه ترش در چاه نیمه زابل، معاونت آموزش و تحقیقات مرکز تحقیقات منابع طبیعی و امور دام استان سیستان و بلوچستان.

3- نرگس خانپور اردستانی، مظفر شریفی، مهرداد بهمنش. 1393. اثر متیل جاسمونات بر آنزیم‏های آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در کشت سلول Scrophularia straita Boiss. مجله‏ی پژوهش‏های گیاهی(مجله‏ِی زیست شناسی ایران). 27 (5).

 

4- Augustine, M.,  Olusola,  Adesayo,  L.,  Olusola, Bada,  Fredrick, O. 2012. Comparative  Study  on the Effect  of  Hibiscus  sabdariffa  Calyx  Anthocyanins  and Ascorbate on 2,4-Dinitrophenylhydrazine-induced Damage in Rabbits, American Journalof Biochemistry, 2(2), PP. 1-6.

5- Booth DR, Sunde M, Bellotti V,  Robinson CV, Hutchinson WL,Fraser PE, Hawkins PN, Dobson CM, Radford SE, Blake CCF,Pepys MB. 1997. Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis. Nature 385:787–793.

6- Brew, K., et al. 1967. Comparison of the amino acid sequence of bovine α-lactalbumin and hens egg white lysozyme. J.Biol.Chem.,242(16),37473749.

7- Carver JA, Guerreiro KN, Nicholls A, Truscott RJW. 1995. Small stress proteins. Biochim Biophys Acta 1252:251–260.

8- Carver JA, Lindner RA, Lyon C, Canet D, Hernandez H, DobsonCM, Redfield C. 2002. . Biochim Biophys Acta, The interaction of the molecular chaperone. J Mol Biol 318:815–827.

9- Christopher M. Dobson. 2004. Experimental investigation of protein folding and misfolding. Methods.;34;4–14.

10- Creighton, T. E. & Ewbank, J. J. 1994. Disulfide rearranged molten globule state of α-lactalbumin.Biochemistry,33, 1534-1538.

11- Dolgikh, D. A., Gilmanshin, R. I., Brazhnikov, E. V.,Bychkova, V. E., Semisotnov, G. V., Venyaminov,S. Y. & Ptitsyn, O. B. 1981. α-Lactalbumin: compact state with Øuctuating tertiary structure. FEBS Letters,136,(2), 311-315.

12- Ghahghaei,A., Divsalar, A.,  Faridi, N. 2010. The Effects of Molecular Crowding on the Amyloid Fibril Formation of a-Lactalbumin and the Chaperone Action of a-Casein,Protein J, 29:257–264.

13- Goers J, Permyakov SE, Uversky VN, Fink LA. 2002. AL Conformational prerequisites for α-lactalbumin fibrillation  Biochem41:12546–12551.

14- Hatter, D.M., Linder, R.A.and Howlett,J.G. 2001.  The molecular  chaperone, α-crystallin,  inhibits    amyloid  formation  by  apolipoprotein  CII. Biol.chem  .276, pp. 33755-33761.

15- Norhaizan, M., Fong, S. H.,  Ismail, A.,  Yee, C. L. 2010.  Antioxidant activity in different parts of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) extracts and potential exploitation of the seeds, Food Chemistry 122, pp. 1055–1060.

16- Okazaki,A.,lkura,T.,Nikaido,K.,and Kuwajima,K.. 1994. The chaperonin CroEL does not recognizeapo-a-lactalhumin in the molten Globule state.Nature Struct. Biol. 1,439-446.

17- Pau-Ling, T., Salmah, Y., Suhaila, M. 2002.  Antioxidative properties of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) in linoleic acid model system. Nutrition & Food Science ISSN, pp. 0034-6659.

18- Ren, J., et al. 1993.  αlactalbumin possesses a distinct zinc binding site. J. Biol. Chem., 268(26),19292-19298.

19- Rochet, J.C, Lansbury, P.J. 2000. Amyloid fibrillogenesis: Themes and variations. Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 60–68.

20- Veprintsev, D. B., et al. 1997. Cooperative thermal transitions of bovine and human apo-α-lactalbumins: evidence for a new intermediate state. FEBS Lett., 412(3), 625-628.

21- Wijesinha-Bettoni, R., Gao, C.,  JenKins, A.J., Mackie, R.A., Wilde, J.P., Mills, C.N.E., Smith, L.2007.  Heat Treatment of bovine α-Lactalbumin Results  in  Partially  Folded,  Disulfide  Bond  Shuffled  States  with Enhanced Surface Activity. Biochemistry, Vol. 46, pp. 9774-9784.

22- Yadong, Qi, Chin, L. Malekian, F.Berhane, M.Gager, J. 2005. Biological Characteristics,  Nutritional  and  Medicinal  Value  of  Roselle,  Hibiscus  Sabdariffa, CIRCULAR Urban Forestry Natural Resources and Environment 604,.

23- Yurdiansyah, A., Suhartanti, D., Dahlan , A, 2012. Test Activities Antifungal Methanol Extract Red Flowers Rosella Calyx (Hibiscus sabdariffa L.) on Candida albicans, As In Vitro, and Screening  Phytochemicals. IC-GWBT2012,  PP.  23-24.