نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه سیستان و بلوچستان
چکیده
تجمعات پروتئینی از عوامل مختلفی ناشی شده و منجر به بیماری های گوناگون در انسان ها و سایر موجودات زنده می گردد. یافتن راهکاری مناسب جهت جلوگیری از ایجاد اینگونه تجمعات می تواند بسیار حائز اهمیت باشد. گیاه چای ترش منبع غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی است که می تواند از بدن در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد محافظت کند. در این پژوهش اثر عصاره ی آبی گیاه چای ترش بر روی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین درحضور دی تیو تریتول(DTT) به عنوان عامل القا کننده ی تجمع مورد بررسی قرار گرفت. خاصیت چاپرونی عصاره بر روی تجمع پروتئین توسط روش های طیف سنجی نور مرئی، فلورسانس تیوفلاوین تی(ThT)، اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، 1-آنیلیلینو8-نفتالن سولفونات (ANS) و دورنگ نمایی دورانی (Circular dichroism) بررسی شد. نتایج بدست آمده از طیف سنجی نور مرئی و اتصال تیوفلاوین تی نشان داد که عصاره ی چای ترش از ایجاد تجمع و تشکیل آمیلوئید در پروتئین جلوگیری کرده و این تاثیر با افزایش غلظت عصاره شدت می یابد. طبق نتایج بدست آمده از آزمایشات فلورسانس، عصاره با نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته در پروتئین احیا شده برهمکنش کرده و از تجمع جلوگیری می کند. نتایج حاصل از دورنگ نمایی حلقوی نشان داد که دی تیو تریتول تغییراتی در ساختمان دوم پروتئین ایجاد می کند که در حضور عصاره تغییرات کمتری مشاهده می شود. نتایج این پژوهش چای را به عنوان عاملی بالقوه جهت جلوگیری از تجمع پروتئین های مختلف دخیل در بیماری های گوناگون ناشی از تجمع پیشنهاد می کند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Investigation the protective ability of H. sabdariffa aqueous extract on the aggregatin of α-lactalbmin
نویسندگان [English]
University of Sistan and Baluchestan
چکیده [English]
protein aggregates generated by different reason, cause many diseases in humans and other organisms. Finding proper ways to stabilize or prevent of protein aggregation could be important. H. sabdariffa is a good source of natural antioxidants which may protect the body from damage effeccted by free radicals. This study examined the effect of aqueous extract of H. sabdariffa on the aggregation of reduced α-lactalbumin. The chaperone properties of H. sabdariffa extract on protein aggregation were determined by measuring light scattering absorption, thioflavin T binding assay, fluorescence, and circular dichroism (CD) spectroscopy. Visible absorption spectroscopy and ThT fluorescence results shows that H. sabdariffa extract prevent protein aggregation and amyloid formation in a concentration-dependent manner. According to the results of Fluorescence Spectroscopy, H. sabdariffa extract interact with hydrophobic area of protein and inhibit aggregation. CD spectroscopy results shows that DTT caused changes in secondary structure of protein and in the presence of extract, fewer changes observed. Our finding suggests the possibility of using H. sabdariffa extract as a potential agent for inhibition of protein aggregation in various disease
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر حفاظتی عصارهی آبی گیاه چای ترش بر جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین
شهره رحیمی، آرزو قهقایی*
زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده علوم
تاریخ دریافت: 6/5/95 تاریخ پذیرش: 24/9/95
چکیده
تجمع پروتئینی از عوامل مختلفی ناشی شده و منجر به بیماریهای گوناگون در انسان ها و سایر موجودات زنده میگردد. یافتن راهکاری مناسب جهت جلوگیری از ایجاد اینگونه تجمعات میتواند بسیار حائز اهمیت باشد. گیاه چای ترش منبع غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی است که میتواند از بدن در برابر آسیبهای ناشی از رادیکالهای آزاد محافظت کند. در این پژوهش اثر عصاره ی آبی گیاه چای ترش بر روی تجمعات پروتئین آلفا-لاکتآلبومین درحضور دیتیوتریتول(DTT) به عنوان عامل القا کنندهی تجمع مورد بررسی قرار گرفت. خاصیت چاپرونی عصاره بر روی تجمع پروتئین توسط روشهای طیف سنجی نور مرئی، فلورسانس تیوفلاوینتی (ThT)، اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی، 1-آنیلیلینو8-نفتالن سولفونات (ANS) و دورنگ نمایی دورانی (Circular dichroism) بررسی شد. نتایج بدست آمده از طیف سنجی نور مرئی و اتصال تیوفلاوین تی نشان داد که عصارهی چای ترش از ایجاد تجمع و تشکیل آمیلوئید در پروتئین جلوگیری کرده و این تاثیر با افزایش غلظت عصاره افزایش مییابد. طبق نتایج بدست آمده از آزمایشات فلورسانس، عصاره با نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته در پروتئین احیا شده برهمکنش کرده و از تجمع جلوگیری میکند. نتایج حاصل از دورنگنماییحلقوی نشان داد که دیتیوتریتول تغییراتی در ساختمان دوم پروتئین ایجاد میکند که در حضور عصاره تغییرات کمتری مشاهده میشود. نتایج این پژوهش چای ترش را به عنوان عاملی بالقوه جهت جلوگیری از تجمع پروتئینهای مختلف دخیل در بیماریهای گوناگون ناشی از تجمع پیشنهاد میکند.
واژههای کلیدی: تجمع پروتئین، آلفا-لاکتآلبومین، چای ترش
* نویسنده مسئول، تلفن: 05433446565، پست الکترونیکی: arezou@chem.usb.ac.ir
مقدمه
عدم تاخوردگی صحیح پروتئینها یا باقی نماندن آنها در حالت درست تا شده، با اختلالات زیادی در عملکرد سلولها همراه است که منجر به بیماریهای مختلف میشود (9). پروتئینهای تجمع یافته مولکولهایی با ساختار اشتباه تاخورده هستند که از ناتوانی پروتئین در تا خوردگی صحیح به صورت کنفورماسیون عملکردی فعال ویا عدم توانایی باقی مانده در آن کنفورماسیون، ناشی میشوند (19). بسته به شرایط استرس مانند دما، pH و حضور عامل کاهنده، تجمعات نامظم (آمورف) یا منظم
(فیبریلهای آمیلوئیدی) ایجاد میگردد (5).
چای ترش گیاهی یک ساله است که ارتفاع آن گاهی به 4- چهارمتر میرسد. این گیاه در سراسر جهان، در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر یافت میشود و در نواحی تولید کننده به نام روسل معروف میباشد (22) چای ترش بومی ایران نمیباشد و کشت این گیاه در ایران تنها در استان سیستان و بلوچستان گزارش شدهاست (2). کاسبرگ خشک گیاه چای ترش حاوی فلاونوئید، آنتوسیانین و مقدار بالایی اسید مانند اگزالیک اسید، سوکسینیک اسید و اسیدهای آلی است. به علاوه مقدار اسید آسکوربیک چای ترش در مقایسه با خانوادهی مرکبات بیشتر میباشد. در آزمایشات انجام شده حضور آهن، فسفر، کلسیم، منگنز، آلومینیوم، سدیم، پتاسیم، موسیلاژ، گوسیپتین، هیبیستین، پروتئین و مواد معدنی در آن مشاهده شده است (4و23).
چای ترش منبع غنی از آنتیاکسیدانهای طبیعی است که میتوانند از بدن در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی محافظت کنند. اثرات محافظتی احتمالا از طریق مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانین ها اعمال میشود (17). در بین قسمتهای مختلف چای ترش، عصارهی آبی کاسبرگ آن بیشترین فعالیت آنتی اکیسدانی را دارا است (23). این نتایج ناشی از این است که کاسهی گل منبع غنی ویتامین C(mg 141 در g100)، آنتوسیانینها (mg 5/2 در g 100(، بتاکاروتن (mg 88/1 در g 100(، لیکوپن (gµ 164 در g100(، پلی فنولها و دیگر آنتیاکسیدانهای محلول در آب است (15).
به دنبال به اثبات رسیدن خاصیت آنتی اکسیدانی بالای عصارهی گیاه، این احتمال داده شد که ترکیبات آنتیاکسیدانی موجود در این گیاه بر روی تجمع پروتئین و تشکیل آمیلوئید تأثیرگذار باشند. بنابراین برآن شدیم که تاثیر عصارهی این گیاه را بر روی تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین بررسی نماییم.
آلفا-لاکتآلبومین یک مونومر کوچک با وزن مولکولی 18/14 کیلو دالتون و حاوی 123 اسید آمینه است (18). این پروتئین دارای 8 باقیمانده سیستئین است که 4- چهار پل دی سولفیدی تشکیل میدهند (6). آلفا-لاکتآلبومین که بخشی از کمپلکس لاکتوز سنتاز است، دارای جایگاهی برای اتصال کلسیم است که به نظر میرسد در تغییر ساختار پروتئین از حالت طبیعی به فرم غیر طبیعی شده نقش داشته باشد (20). این پروتئین همچنین دارای ناحیهی اتصال روی است. این نواحی اتصال ممکن است نقشی را در کمپلکس لاکتوز سنتاز ایفا کنند (18). آلفا-لاکتآلبومین تحت شرایط مختلف محیطی شاملpH پایین و غلظت پایین نمک در غیاب کلسیم، حالت مولتن گلبول تشکیل می دهد (10و11) که باند های دی سولفیدی را مستعد احیا و منجر شدن به فیبریل های آمیلوئیدی می کند (8 و13). این فرم از آلفا-لاکتآلبومین ساختار دومی مشابه حالت طبیعی دارد اما ساختار سوم کمی را نشان میدهد (7). از آنجاییکه آلفا-لاکتآلبومین به بهترین شکل حالت مولتن گولبول را نشان میدهد، این پروتئین میتواند به عنوان مدلی مناسب برای مشاهده ی دقیق چاپرونهای مولکولی و حالت مولتن گلوبل بکار گرفته شود (16).
مواد و روشها
مواد مورد استفاده
مواد شیمیایی و پروتئینها: پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (KD14) از شرکت سیگما تهیه شد.
مواد شیمیایی شامل: دیتیوتریتول (DTT)، سدیم آزید (3NaN)، سدیم فسفات (4HPO 2Na)، 1-آنیلینو-8-نفتالن
سولفونیک اسید (ANS) و تیوفلاوین T (ThT) نیز از شرکت سیگمادرامریکا تهیه شدند.
مواد گیاهی
گیاه چای ترش از زاهدان واقع در استان سیستان و بلوچستان جمع آوری شد.
عصاره گیری از گیاه: عصارهگیری به این صورت انجام شد که میزان 15 گرم از پودر گیاه به cc 150 آب دو بار تقطیر اضافه شده، به مدت 24 ساعت توسط همزن مغناطیسی کاملا مخلوط شد. عصارهی حاصل سپس با استفاده از کاغذ صافی صاف شده، به مدت 20 دقیقه با دور 12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به پلیت شیشهای منتقل شده و به مدت 3-4 روز در داخل انکوباتور خشک شد. نمونه پس از خشک شدن کامل، به صورت پودر جهت انجام آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.
استفاده از تکنیک اسپکتروسکوپی جذب نوری: توانایی عصارهی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع و تهنشینی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با استفاده از طیف سنجی نور مرئی مورد بررسی قرار گرفت. آلفا-لاکتآلبومین در غلظت mg/ml5/2 در بافر فسفات mM50 ( pH 4/7(، حاوی سدیم آزید (NaN3) % 05/0 که سدیم کلرید(NaCl) mM 100 نیز به آن افزوده شده بود، تهیه گردید. یک نمونه به عنوان شاهد، بدون عصاره در نظر گرفتهشده و نمونههای دیگر در معرض غلظتهای متفاوت عصارهی چای ترش (با نسبتهای1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) قرار گرفتند. به تمامی غلظتهای آماده شده مقدار یکسان DTT mM20 افزوده شد. در اثر افزوده شدن DTT، غیرطبیعی شدن و تجمع آغاز شده، آزمایش در طول موج nm340 و دمایC˚ 37 درجه توسط دستگاه الایزا (کمپانی Biotek) صورت گرفت و جذب به مدت 180 دقیقه در فاصلههای زمانی هر 3 دقیقه توسط دستگاه خوانده شد.
بررسی تشکیل آمیلوئید با استفاده از رنگ تیو فلاوینتی (ThT): تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی به وسیله آلفا-لاکتآلبومین ( mg/ml5/2 ) در حضور عامل احیا کننده پیوندهای دیسولفیدی DTT ( mM20) و عصارهی چای ترش در غلظتهای مختلف (با نسبتهای1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره). بررسی شد. نمونههای مورد نظر حاوی بافر فسفات mM50، DTT mM20، pH 4/7 به مدت 30 ساعت درون دستگاه انکوباتور A-Q German در دمای ˚C 37 انکوبه شدند. بمنظور تسهیل درتشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی، نمونههای درون انکوباتور با استفاده از دستگاه شیکر با دور rpm 210 تکان داده شدند. سپس نمونههای انکوبه شده طی فاصلههای زمانی متفاوت برداشته میشوند تا روند تشکیل آمیلوئید با گذشت زمان سنجیده شود. نمونههای برداشته شده بمنظور سنجش نشر آنها توسط فلورسانس ThT (Mµ4/0 در بافر فسفات Mm500 ، سدیم آزید (NaN3)% 05/0 ، pH(4/7) به دستگاه فلوریمتر منتقل میشوند. با استفاده از نرم افزار (varian USA) Carry Eclipse spectro-fluorimeter و تنظیمات آن نشر نمونهها خوانده میشود. به گونهای که با تنظیمات نرم افزار، طول موج برانگیختگی نمونهها برابرnm 446 و طول موج نشر آنها برابر nm 600-480 تنظیم شد.
استفاده از تکنیک اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی Intrinsic fluorescence: شدت فلورسانس ذاتی برای آلفا-لاکتآلبومین (Mµ 10( و غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش (1 : 25/0 ،1 : 5/0 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) اندازهگیری شد. نمونهها در بافر فسفات mM50 (Na2HPO4) حاوی سدیمآزید) (NaN3% 05/0 و4/7pH= آماده شدند. بعد از اضافه کردن DTT، نمونهها به مدت 3 ساعت در دمایC ˚ 37 انکوبه شدند سپس طیف فلورسانس با استفاده از دستگاه Carry Eclipse spectrofluorimeter (varian USA) بدست آمد. طول موج برانگیختگی برای ریشههای تریپتوفان nm 295 باعرض عبوری nm 5/2 در دستگاه تنظیم شد. همچنین طیف نشری حاصل در طول موج 400-300 با عرض عبوری nm5 ثبت شد.
استفاده از نشانگر فلورسنت متصل شونده به 1-آنیلو نفتالن سولفونات (ANS): سنجش اتصال ANS برای ارزیابی تغییرات هیدروفوبیستی حاصل از فعل و انفعال بین پروتئین و عصارهی چای ترش مورد استفاده قرار گرفت. نمونهها حاوی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (mM10)، غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش (1 : 25/0 ،1 : 5/0 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره) همراه با DTT mM 20 در بافر فسفاتmM 50 حاوی سدیم آزید (NaN3) %05/0و pH برابر با 4/7 انکوبه شدند. فلورسانس ANS بوسیله دستگاه varian spectrofluorimeter قابل مشاهده است. طول موج تحریکی برابر nm400 قرار میگیرد و طول موج نشر در یک دامنه nm600-400 تنظیم میشود. عرض عبوری برای این نور تحریکی برابر با 5/2 قرار داده میشود. بعد از قرار گرفتن کووت حاوی نمونهها در دستگاه فلوریمتر، طی فاصلههای زمانی مداوم، 1میکرولیتر از محلول استوک ANS به نمونهها اضافه شده و با هر بار اضافه کردن این مقدار از رنگ ANS، نشر خوانده میشود. این عمل تا زمانی ادامه پیدا میکند که شدت فلورسانس به حالت یکنواخت رسیده باشد و دیگر افزایشی در شدت فلورسانس مشاهده نشود.
استفاده از روش اسپکتروسکپی دورنگ نمایی حلقوی (CD): در این روش ساختار دوم و سوم پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصارهی گیاه چای ترش با استفاده از دورنگ نمایی حلقوی Far-uv CD (طول موجهای 260–190 نانومتر) مورد آزمایش قرار گرفت. نمونهها، آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 2/0) در حضور عصارهی چای ترش (در نسبتهای وزنی1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره). بافر استفاده شده، بافر فسفات mM10 pH برابر با 4/7. از DTT به عنوان احیا کنندهی پیوندهای دیسولفیدی استفاده شد. اندازهگیریها در کووتهای با طول مسیر cm1در Cᵒ 37 با استفاده از اسپکتروپلاریمتر varian مدل Aviv انجام شد.
نتایج
بررسی اثر عصارهی چای ترش بر تشکیل تجمع در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با استفاده از طیف سنجی نور مرئی: قابلیت عصارهی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط اسپکتروسکوپی نور مرئی اندازهگیری شد. فرآیند غیر طبیعی شدن و تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین به دنبال احیا شدن چهار-4 پیوند دیسولفیدی موجود درساختمان آن که بین ریشههای سیستئین در نواحی مختلف تشکیل شدهاند، توسط DTT بوقوع میپیوندد (14).
همان طور که در شکل1 نشان داده شده است، شدت جذب پروتئین آلفا-لاکتآلبومین با گذشت زمان در حضور دیتیوتریتول افزایش مییابد که نشان دهندهی تشکیل تجمع در این مولکول پروتئینی است. ضمن اضافه کردن غلظتهای مختلف از عصارهی چای ترش مشخص شد که با افزودن عصاره به پروتئین، از سرعت غیر طبیعی شدن و تشکیل تجمعات در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در یک نسبت وابسته به غلظت کاسته شده و زمان مورد نیاز برای شکلگیری این ساختارها افزایش مییابد. چنانکه میزان جلوگیری از تجمعات پروتئینی در حضور غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش در جدول 1 آورده شده است، در نسبت 25/0 : 1 وزنی/وزنی آلفا-لاکتآلبومین / عصاره ، به میزان 12/31 درصد از تشکیل تجمعات جلوگیری شد و با افزایش نسبت عصاره به پروتئین به میزان 1 : 1وزنی/وزنی، این درصد محافظت به 32 /83 درصد افزایش پیدا کرد. میزان درصد حفاظت (جلوگیری از تجمع) در غلظتهای مختلف عصاره، نشاندهندهی تاثیر گذاری ترکیبات آنتیاکسیدانی موجود در عصارهی چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است.
شکل1- میزان جذب نوری در nm340 درمدت زمان 180 دقیقه برای پروتئین آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 2) درعدم حضور و حضور عصارهی گیاه چای ترش (در نسبتهای وزنی : وزنی 1 : 25/0 ،1 : 5/0 و1 : 1 پروتئین : عصاره). پروتئین در بافر فسفات mM 50 در pH 4/7 و NaN3 %05/0 و دمای ᵒC 37 در حضور DTT mM20 تهیه گردید. همچنین NaCl mM 100نیز به بافر افزوده شد. این آزمایش 3 بار تکرار گردیده است
جدول 1- درصد بازداری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش
در صد بازداری (درصد) |
ترکیبات نمونه |
12/31 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 25/0 ) |
64/36 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 5/0 ) |
32/83 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 1 ) |
بررسی تشکیل فیبریل آمیلوئید α-لاکتآلبومین در حضور غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش به وسیله اتصال تیوفلاوینتی (ThT): تشکیل فیبریل آلفالاکتآلبومین احیا شده توسط DTT در عدم حضور و حضور نسبتهای مختلف عصاره گیاه چای ترش مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی توسط تکنیک اتصال ThT به فیبریلهای آمیلوئیدی انجام گرفت که نمودار آن به صورت مقیاسی از فلورسانس ThT نسبت به زمان در شکل2 آمده است. همانطور که در شکل مشاهده میشود یک افزایش در شدت فلورسانس وابسته به زمان در نمونهی آلفالاکتآلومین احیا شده توسط DTTمشاهده میشود، در حضور عصارهی چای ترش از شدت فلورسانس کاسته شده و با افزایش غلظت عصاره این کاهش شدت فلورسانس بیشتر میشود که نشان دهندهی اثر محافظتی عصاره گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است.
این اثر با محاسبه ثابت سرعت نیز تایید میشود. چنانچه جدول2 نشان میدهد، در عدم حضور عصاره ثابت سرعت تشکیل آمیلوئید در آلفا-لاکتآلبومین برابر باmin-1 1- 10× (003/ 0± 345/0) بود و با افزودن عصاره با نسبت 25/0 : 1 وزنی : وزنی عصاره نسبت به پروتئین، مقدار ثابت سرعت به min-1 1- 10× ( 005/0± 321/0) کاهش یافت. با افزودن غلظت عصاره به نسبت 5/0 : 1 و 1 : 1 عصاره نسبت به پروتئین، این مقدار بترتیب به min-1 1- 10× (014/0 ± 295/0) و min-1 1- 10 ( 002/0 ± 200/0) رسید. که نشان میدهد عصارهی چای ترش سرعت تشکیل آمیلوئید را در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین احیا شده کاهش میدهد.
شکل2- تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی آلفا-لاکتآلبومین (mg/ml 5/2) در حضور عصارهی چای ترش (با نسبتهای وزنی 25/0 : 1، 5/0 : 1 و 1: 1 عصاره : پروتئین)، و ThT µM4. بافر استفاده شده بافر فسفاتmM 50 حاوی سدیم آزید NaN3 %05/0و pH برابر 4/7 است. از mM DTT 20 به عنوان احیا کنندهی پیوندهای دیسولفیدی استفاده شده است. این آزمایش 2 بار تکرار گردیده است.
بررسی فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصارهی گیاه چای ترش: فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین از چهار-4 ریشهی تریپتوفان موجود در آن ناشی میشود و بر حسب اینکه پروتئین در چه شرایطی قرار بگیرد، متفاوت است. در این آزمایش فلورسانس ذاتی آلفا- لاکتآلبومین در حضور عامل احیا کنندۀ پیوندهای دیسولفیدی دیتیوتریتول (DTT) و غلظتهای مختلف عصارهی گیاه چای ترش مورد بررسی قرار گرفت.
نمودار ستونی مربوط به مقایسه ماکزیمم شدت فلورسانس پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حضور عصارهی چای ترش در نسبت های مختلف در شکل 3 قابل مشاهده است.
جدول 2- خلاصهای از ثابتهای سرعت آلفا-لاکتآلبومین در حضور غلظتهای مختلف عصاره چای ترش با استفاده از بررسی تیوفلاوینT. ثابتهای سرعت با استفاده از نرم افزار سیگما پلات محاسبه شده است. انحراف استاندارد از محاسبات به دست آمده از سیگما پلات محاسبه شده است.
ثابت سرعت × 1-10 (min-1) |
ترکیبات نمونه |
003/ 0± 345/0 |
آلفا-لاکتآلبومین |
005/0± 321/0 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 25/0) |
014/0 ± 295/0 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 5/0 ) |
002/0 ± 200/0 |
آلفا-لاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 1 ) |
چنانچه در شکل ملاحظه میشود، مطابق با جدول3، پروتئین آلفا-لاکتآلبومین فلورسانسی در حدود 100 نشان میدهد. در حضور عصاره با نسبت 25/0 : 1 وزنی/ وزنی عصاره : پروتئین، کاهش 05/3 در صدی در شدت فلورسانس مشاهده شد و با افزایش نسبت عصاره به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی/ وزنی عصاره : پروتئین این کاهش بترتیب به 19درصد و 79/30 درصد رسید.
به لحاظ آماری از آنجاییکه t محاسبه شده بوسیلهی نرمافزار SPSS بین ستونهای مربوط به پروتئین در عدم حضور عصاره و در حضور عصاره با نسبت 1 : 25/0، برابر 03/0، بین ستون های مربوط به نسبتهای 1 : 25/0 و 1 : 5/0 برابر 0016/0، و در ستون های مربوط به نسبتهای 1 : 5/0 و 1:1 برابر 02/0، در سطح اطمینان 95% نمودار کوچکتر از مقدار بحرانی جدولT میباشد که معنا دار بودن تفاوت مشاهده شده را نشان میدهد.
شکل3- ماکزیمم شدت فلورسانس ذاتی α- لاکتآلبومین ( µM 10) در حضور عصاره گیاه چای ترش(با نسبتهای وزنی25/0 : 1، 5/0 : 1 و 1 : 1). نمونهها در بافر mM 50 فسفات، NaN3 %05/0 و pH برابر 4/7 تهیه شدند و از DTT mM20به عنوان احیا کنندهی پیوندهای دیسولفیدی استفاده شده است. نمونهها به مدت 3 ساعت در دمای C˚37 انکوبه شدهاند.
جدول3- درصد بازداری از تجمع پروتئین آلفا-لاکتآلبومین توسط غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش.
درصد بازداری |
ترکیبات نمونه |
05/3 |
آلفالاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 25/0) |
19 |
آلفالاکتآلبومین + عصارهی چای ترش (1 : 5/0) |
79/30 |
آلفالاکتآلبومین + عصارهی چای ترش ( 1:1 ) |
بررسی اتصال 8 – آنیلینو -1- نفتالن- سولفونیک اسید (ANS) به آلفا-لاکتآلبومین در حضور و عدم حضور عصارهی چای ترش: تکنیک اتصال ANS جهت بررسی تغییرات نواحی هیدروفوب در معرض قرار گرفته ی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در عدم حضور و حضور غلظتهای مختلف عصاره ی چای ترش استفاده شد. پروتئین آلفا-لاکتآلبومین احیا شده اتصال ANS بالایی نشان میدهد درحالیکه نتایج نشان داد که افزایش عصارهی گیاه چای ترش باعث کاهش فلورسانس ANS پروتئین شده و با افزایش میزان غلظت عصاره روند کاهش فلورسانس ANS ادامه مییابد. چنانچه در شکل4 مشاهده میشود، افزودن عصاره با نسبت 25/0 : 1 موجب کاهش 23/19 درصدی در شدت فلورسانس شده و با افزایش نسبت عصاره به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی/ وزنی ، بترتیب کاهش 76/29 و 18/35 درصدی در شدت فلورسانس مشاهده میشود. این کاهش در شدت فلورسانس نشان دهندهی تاثیر عصاره در جلوگیری از برهمکنش بین نواحی هیدروفوب پروتئین و ANS است. به لحاظ آماری از آنجاییکه مقادیر t محاسبه شده بوسیله نرمافزار SPSS بین ستونهای مربوط به پروتئین در عدم حضور عصاره و در حضور عصاره با نسبت 1 : 25/0 برابر 03/1، بین ستونهای مربوط به نسبتهای1 : 25/0 و 1 : 5/0 برابر 37/0، و بین ستونهای مربوط به نسبتهای 1 : 5/0 و 1:1 برابر 45/0، در سطح اطمینان 95درصد نمودار کوچکتر از مقدار بحرانی جدولT میباشد که معنا دار بودن تفاوت مشاهده شده را نشان میدهد.
شکل4- نمودار ستونی نشر فلورسانس آلفا-لاکتآلبومین (µM 10)در حضور نسبتهای وزنی مختلف عصارهی چای ترش(25/0 : 1، 5/0 : 1و 1 : 1عصاره : پروتئین). رنگ ANS µM 4 استفاده شده است. بافر فسفات حاوی سدیم آزید NaN3 %05/0 و pH برابر 4/7 است. از DTT به عنوان احیا کنندهی پیوندهای دیسولفیدی استفاده شده است
ارزیابی طیفCD Far-uv از آلفا - لاکتآلبومین در حضور غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش: چنانچه قبلا ثابت شده است طیف CD- Farپروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حالت طبیعی دارای دو پیک منفی در ناحیه ی 208 و 222 نانومتر است که نشان دهندهی وجود هلیکس آلفا است (21). شکل5 نشان میدهد که با اضافه کردن دیتیوتریتول و احیای باندهای دیسولفیدی، باندهای منفی مربوط به هلیکس آلفا کاهش یافته و یک پیک منفی در ناحیهی 218 نانومتر ایجاد شده است که نشان دهندۀ وجود صفحات بتا است. بنابراین یک تغییر ساختار از هلیکس آلفا به ساختار دارای صفحه بتا در حالت احیا شده آلفا-لاکتآلبومین مشاهده میشود. گزارش شدهاست که تغیر کنفورماسیونی از هلیکس آلفا به صفحات بتا منجر به ایجاد ساختارهای آمیلوئیدی میشود (12). با اضافه کردن عصارهی گیاه چای ترش افزایش پیکهای منفی در 208 و 222 نانومتر مشاهده شد و با افزایش غلظت عصاره به 5/0 : 1 و 1 : 1 وزنی : وزنی پروتئین : عصاره، افزایش سیگنال منفی در 222-220 نانومتر مشاهده شد که نشان دهندهی پایداری افزایش یافته نواحی آلفا هلیکس و بیانگر اثر حفاظتی عصاره گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین است. چنانکه در جدول 4 مشاهده می شود، محتوای کنفورماسیون هلیکس آلفا از 8/22 درصد به 2/25 درصد افزایش یافت در حالیکه محتوای صفحات بتا از2/46 درصد به 2/31 درصد کاهش پیدا کرد.
شکل5- طیف CD Far- پروتئین آلفا-لاکتآلبومین در حالت ذاتی، حالت کاهش یافته در حضورDTT و در حضور غلظتهای مختلف عصارهی چای ترش(با نسبتهای وزنی25/0 : 1، 5/0 : 1و 1 : 1 عصاره : پروتئین). غلظت پروتئین mg/ml 2/0 در بافر فسفات mM 10و 7 pH و دمایC˚ 37 در اسپکتروپلاریمتر JASCOJ180 با سلی به طول مسیر cm1
بحث
به دلیل عوارض جانبی بسیار پایین تر گیاهان دارویی اخیرا توجه زیادی بر روی آنها به عنوان عوامل محافظتی معطوف شده است. در این پژوهش برای اولین باراست که اثرات گیاه چای ترش بر روی تجمع پروتئن بررسی میشود.
جدول 4- ساختار دوم پیش بینی شده از طیف Far-UV آلفا-لاکتآلبومین در حضور عصاره ی چای ترش با استفاده از برنامه ی JASCO
% کلاف بختانه |
% پیچ های بتا |
%صفحات بتا |
% مارپیچ آلفا |
نمونه |
6/28 |
1/9 |
2/37 |
1/30 |
آلفا لاکتآلبومین |
6/29 |
4/15 |
2/46 |
8/22 |
آلفالاکتآلبومین + DTT |
4/32 |
2/11 |
2/31 |
2/25 |
آلفالاکتآلبومین+DTT+عصاره |
نتایج حاصل از بررسی میزان اسپکتروسکوپی نور مرئی نشان داد که میزان جذب نوری پروتئین در عدم حضور عصاره در مقایسه با نمونه دارای عصاره بسیار بیشتر میباشد. بالا بودن میزان جذب نوری میتواند ناشی از تجمع پروتئین باشد. با افزوده شدن عصارهی گیاه میزان جذب کاهش یافت که احتمالا ناشی از اتصال ترکیبات آنتیاکسیدانی گیاه (احتمالا از طریق مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانینها) به سطوح هیدروفوبیک پروتئین در جهت ممانعت از تجمع آن باشد. چنانچه پیش از این تاثیر ترکیبات فلاونوئیدی و آسکوربیکاسید در افزایش توانایی آنتیاکسیدانی بر علیه تنشهای اکسیدتیو مختلف نشان داده شده است (1و3).
به دنبال آن جهت بررسی تأثیر عصاره در جلوگیری از تشکیل فیریلهای آمیلوئیدی در آلفا-لاکتآلبومین، از روش فلورسانس ThT استفاده شد.
دادههای حاصل از آزمایش فلورسانس ThT بر روی تشکیل آمیلوئید در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین نشان میدهندکه افزایش شدت فلورسانس پروتئین احیا شده با DTT در pH طبیعی )4/7(، نتیجهی تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی میباشد. با توجه به ثابتهای سرعت به دست آمده مشاهده شد که عصارهی چای ترش سرعت تشکیل آمیلوئید در آلفا-لاکتآلبومین را کاهش میدهد. این احتمال داده شد که این اثر از طریق واکنش عصاره با نواحی هیدروفوب پروتئین آلفا-لاکتآلبومین اعمال شود. به دنبال این فرضیه مطالعات فلورسانس در حضور عصارهی چای ترش بر روی پروتئین آلفا-لاکتآلبومین انجام شد.
آزمایشهای انجام شده به وسیلهی فلورسانس ذاتی آلفا-لاکتآلبومین نشان میدهد که در حضور دیتیوتریتول ساختار پروتئین باز شده و اسیدهای آمینه آروماتیک که به علت داشتن گروههای هیدروفوب در محلول در داخل پروتئین قرار گرفته بودند به سطح پروتئین منتقل میشوند و به این دلیل است که افزایش در شدت فلورسانس مشاهده میشود (12). نتایج فلورسانس ذاتی بر روی پروتئین احیا شده در حضور و عدم حضور عصارهی گیاه چای ترش نشان داد ترکیبات آنتی اکسیدانی موجود در عصارهی گیاه چای ترش میتواند با تاثیر گذاری بر محیط اطراف ریشههای تریپتوفان مانع از در معرض قرارگیری آنها در حلال شده و در نتیجه شدت فلورسانس ذاتی در نمونههای دارای عصاره کاهش مییابد و افزایش میزان عصاره گیاه باعث کاهش بیشتر فلورسانس ذاتی میشود.
در تایید نتایج فلورسانس ذاتی مطالعات ANS نیز نشان میدهد که آلفالاکتآلومین با اضافه شدن DTT فلورسانس رو به افزایش دارد و تا زمانی که سطوح هیدروفوب این پروتئین از این کروموفور اشباع نشده باشند، این افزایش فلورسانس ادامه مییابد. در حالیکه در حضور عصارهی گیاه چای ترش مشاهده شد که سطوح هیدروفوب در معرض قرار گرفته کاهش یافتند و با افزایش میزان عصاره این کاهش بیشتر شد که این کاهش احتمالا میتواند نتیجهی تاثیر ترکیبات آنتی اکسیدانی از طریق اتصال و محافظت از مناطق هیدروفوب در مقابل حلال بوده و این عامل یعنی کاهش سطوح هیدروفوب در معرض میتواند از تشکیل تجمعات پروتئینی جلوگیری کند.
موافق با نتایج فلورسانس، نتایج اسپکتروسکوپی CD در far-uv نشان داد که در حضور DTT ساختار های دوم هلیکس آلفا به میزان زیادی کاهش و صفحات بتا افزایش یافتند. در حضور عصاره ی چای ترش اما تغییر کمی در ساختار دوم پروتئین نسبت به حالت طبیعی مشاهده شد که بیانگر اثر حفاظتی عصارهی گیاه چای ترش در جلوگیری از تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی در پروتئین بوده و تاثیر مثبت عصاره در جلوگیری از تغییرات ساختار دوم آلفا-لاکتآلبومین را نشان میدهد.
با توجه به اثر ترکیبات آنتی اکسیدانی موجود در عصارهی گیاه چای ترش در جلوگیری از تجمع پروتئین و تشکیل آمیلوئید، میتوان به جداسازی و شناسایی ترکیبات موجود در عصاره این گیاه و بررسی اثر هر کدام از این ترکیبات بر روی تجمع پروتئینها پرداخت. همچنین میتوان این اثرات را بر روی پروتئینهای دخیل در بیماریهای تجمعی و یا بر روی مدلهای آزمایشگاهی بررسی نمود.
جمع بندی
به طور خلاصه این نتایج ثابت میکند که عصارهی گیاه چای ترش دارای اثر محافظتی در جلوگیری از تجمع و تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی در پروتئین آلفا-لاکتآلبومین بوده و با افزایش غلظت عصاره این اثرات بیشتر میشود. این اثر محافظتی احتمالا از ترکیبات آنتیاکسیدانی موجود در گیاه (مقادیر بالای آسکوربیک اسید، بتا کاروتن و ترکیبات فنولی و به خصوص آنتوسیانینها) ناشی میشود. و میتوان احتمال داد که عصاره با اتصال به نواحی آبگریز پروتئین، مانع از ایجاد برهمکنشهای هیدروفوب-هیدروفوب پروتئین و تجمع آن میشود.