نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هییت علمی-دانشگاه آزاد اسلامی

2 کارشناس ارشد باغبانی و دانشجوی دکتری، موسسه‌ی تحقیقاتی علوم کشاورزی و بیوتکنولوژی هیرکان، آمل، ایران

3 کارشناس ارشد باغبانی و دانشجوی دکتری، دانشگاه تبریز، ایران

4 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد رشت، دانشکده‌ی کشاورزی، گروه باغبانی

چکیده

خطر انقراض برخی از گونه‌های ارکید را تهدید می‌کند. در اینجا یک روش کارامد برای تکثیر درون‌شیشه‌ای نوعی ارکید در حال انقراض (Orchis catasetum) با استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و نانوکلات آهن ارایه می‌شود. پروتوکورم‌ها، به‌عنوان ریزنمونه، بر روی محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت‌های مختلف بنزیل آدنین (BA)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول بوتیریک اسید (IBA) و نانوکلات آهن کشت شدند. بیشترین باززایی اجسام شبه-‌پروتوکورم (PLBs) (84/18 عدد در گیاهچه) از ریزنمونه‌های پروتوکورم در محیط کشت حاوی 5/0 میلی-گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA مشاهده شد. بیشترین تعداد ریشه (94/6 عدد در گیاهچه)، طول ریشه (90/178 میلی‌متر در گیاهچه)، تعداد برگ (50/9 عدد در گیاهچه) و ارتفاع گیاهچه (10/124 میلی‌متر در گیاهچه) در ریزنمونه‌های کشت‌شده در محیط MS غنی‌شده با 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA به‌دست آمد. در ارتباط با اثر نانوکلات آهن، بیشترین ارتفاع گیاهچه (79/82 میلی‌متر در گیاهچه)، بیشترین تعداد ریشه (76/4 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (53/87 میلی‌متر در گیاهچه) در ریزنمونه‌های کشت‌شده در محیط MS غنی‌شده با 13/0 میلی‌گرم در لیتر مشاهده گردید. تعداد اجسام شبه‌-پروتوکورم و تعداد برگ در تیمارهای نانوکلات آهن نسبت به شاهد افزایشی را نشان ندادند. برای سازگاری، گیاهچه‌ها به گلدان‌های پرشده با پرلیت، خاک‌اره، یونولیت و پوکه معدنی به نسبت مساوی، منتقل شدند. گیاهچه‌های سازگارشده، در گلدان‌های حاوی پرلیت قرار گرفته و به گلخانه منتقل گردیدند. در شرایط درون‌خاکی، 100 درصد گیاهان زنده ماندند و تغییر مورفولوژیکی نسبت به گیاهان مادری در آنها مشاهده نشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

In vitro micropropagation of an endangered orchid species (Orchis catasetum) through protocorm: the effect of plant growth regulators and iron Nano-chelate

چکیده [English]

Many orchid species are threatened with the danger of extinction. Here, a protocol was developed for high frequency in vitro multiplication of an endangered orchid, Orchis catasetum using plant growth regulators and iron Nano-chelate. Protocorms, as explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium fortified with different concentrations of N6-benzyladenine (BA), α-naphthaleneacetic acid (NAA) and indole-3-butyric acid (IBA) either individually or in combination and iron Nano-chelate. A combination of 0.5 mg l-1 BA and 0.5 mg l-1 NAA was found to be suitable for maximum protocorm-like bodies (PLBs) regeneration (18.84/plantlet) from protocorm explants. The maximum number of root (6.94/plantlet) and leaf (9.50/plantlet), also the highest plant height (124.10 mm/plantlet) and root length (178.90 mm/plantlet) were obtained on MS medium supplemented with 0.5 mg l-1 BA a long with 0.5 mg l-1 NAA. Related to the effect of iron Nano-chelate, maximum plant height (82.79 mm/plantlets), maximum root number (4.76/plantlets) and root length (87.53 mm/plantlets) were observed in explants cultured in MS medium enriched with 0.13 mg l-1. Plantlets were transplanted to pots filled with perlite, wood pieces, ionolite and mineral cartridge shell (1:1:1:1), also perlite individually and transferred to the greenhouse. Upon ex vitro transfer, 100% of plants survived.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Protocorm
  • In vitro propagation
  • Nano-fertilizers
  • plant growth regulators

ریزازدیادی درون­شیشه­ای گونه­ای از ارکید در حال انقراض (Orchis catasetum) توسط پروتوکورم­ها: اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن

بهزاد کاویانی1*، ناصر نگهدار2، احمد باکر3 و نینا مسافر1

1 رشت، دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی 

2 آمل،  موسسه تحقیقاتی علوم کشاورزی و بیوتکنولوژی هیرکان

3 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی 

تاریخ دریافت: 15/2/94                تاریخ پذیرش: 27/2/95

چکیده

خطر انقراض برخی از گونه­های ارکید را تهدید می­کند. در اینجا یک روش کارامد برای تکثیر درون­شیشه­ای نوعی ارکید در حال انقراض (Orchis catasetum) با استفاده از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن ارائه می­شود. پروتوکورم­ها، به­عنوان ریزنمونه، بر روی محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت­های مختلف بنزیل آدنین (BA)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول بوتیریک اسید (IBA) و نانوکلات آهن کشت شدند. بیشترین باززایی اجسام شبه-­پروتوکورم (PLBs) (84/18 عدد در گیاهچه) از ریزنمونه­های پروتوکورم در محیط کشت حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد. بیشترین تعداد ریشه (94/6 عدد در گیاهچه)، طول ریشه (90/178 میلی­متر در گیاهچه)، تعداد برگ (50/9 عدد در گیاهچه) و ارتفاع گیاهچه (10/124 میلی­متر در گیاهچه) در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط MS غنی­شده با 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA به­دست آمد. در ارتباط با اثر نانوکلات آهن، بیشترین ارتفاع گیاهچه (79/82 میلی­متر در گیاهچه)، بیشترین تعداد ریشه (76/4 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (53/87 میلی­متر در گیاهچه) در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط MS غنی­شده با 13/0 میلی­گرم در لیتر مشاهده شد. تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم و تعداد برگ در تیمارهای نانوکلات آهن نسبت به شاهد افزایشی را نشان ندادند. برای سازگاری، گیاهچه­ها به گلدان­های پرشده با پرلیت، خاک­اره، یونولیت و پوکه معدنی به نسبت مساوی منتقل شدند. گیاهچه­های سازگارشده، در گلدان­های حاوی پرلیت قرار گرفته و به گلخانه منتقل گردیدند. در شرایط درون­خاکی، 100 درصد گیاهان زنده ماندند و تغییر مورفولوژیکی نسبت به گیاهان مادری در آنها مشاهده نشد.

واژه­های کلیدی: بنه اولیه، تکثیر درون­شیشه­ای، نانوکودها، تنظیم­کننده­های رشد گیاهی  

* نویسندهمسئول، تلفن تماس: 09111777482، پست الکترونیکی: kaviani@iaurasht.ac.ir

مقدمه

 

ارکید با نام علمی Orchids catasetumاز خانواده Orchidaceae  و راسته  Gynandralesاست. گیاهان این خانواده تک­لپه، علفی و پایا هستند که  به­صورت انگل، ساپروفیت و خاکزی مشاهده می­شوند (6). ارکیدها با بیش از 800 جنس و 25000 گونه در سطح جهان، یکی از متنوع­ترین و تکامل­یافته­ترین خانواده­های گیاهان عالی هستند (6). پراکنش اکولوژیکی این گیاه در مناطق جنوب شرق آسیا و کشورهایی مانند چین، تایوان، هنگ­کنگ، تایلند، فیلیپین، مالزی و سنگاپور است. ارکیدها به­عنوان گیاهان زینتی رشد داده می­شوند و به­دلیل زیبایی و طول عمر بالای پس از برداشت­شان، به­صورت گل­های شاخه­بریده مورد استفاده قرار می­گیرند (6). تکثیر در مقیاس بالای ارکیدها، به­ویژه گونه­های هیبرید و در حال انقراض با استفاده از فنون کشت بافت، باعث شده است تا این گیاهان به­عنوان یکی از 10 گل شاخه­بریده­ برتر جهان مطرح باشند (6). تکثیر ارکید با بذر باعث تولید گیاهان هتروزیگوس می­شود. بنابراین، تکثیر درون­شیشه­ای یک روش متناوب مناسب برای ازدیاد ارکیدها می­باشد. دستورالعمل­های مختلفی برای ریزازدیادی گونه­های مختلف ارکید از طریق کشت درون­شیشه­ای بخش­های مختلف گیاه شامل سرشاخه، انتهای ریشه، ساقه، برگ، گره، جوانه، گل­آذین، ریزوم، جنین­های زیگوتی، کالوس و لایه­ نازک سلولی ارائه شده است (5، 8، 10، 11، 13، 15، 24، 25، 31، 32، 35، 37، 40، 41). ریزازدیادی از طریق اجسام شبه-پروتوکورم (PLBs)، به­دلیل اینکه این اجسام می­توانند بر روی محیط کشت جامد یا مایع به­سرعت تکثیر شوند و تعداد زیادی اجسام شبه-­پروتوکورم دیگر در یک دوره­ زمانی کوتاه تولید شوند، در مقایسه با نمو گیاهچه از بذر یا شاخه­های نابجا، مؤثرتر است (18). پروتوکورم­ها یا بنه­های اولیه غده­هایی هستند که توسط بذرها و از رویش آنها تولید می­شوند. چنانچه از این پروتورکورم­ها یا سایر اندام­های رویشی برای تکثیر درون­شیشه­ای استفاده شود، ابتدا اجسام شبه-­پروتوکورم به­وجود می­آید که برای استفاده­ به­عنوان ریزنمونه بسیار مناسب هستند. مطالعات فراوان آشکار کرده است که بهینه­سازی ترکیب محیط کشت، یک رویکرد مهم برای اصلاح مراحل ریزازدیادی ارکیدها با کشت­کردن اجسام شبه-­پروتوکورم است که همچنین به گونه و رقم بستگی دارد (17، 34). تلاش­های زیادی برای دستیابی به روش مناسب برای ریزازدیادی مؤثر اجسام شبه-­پروتوکورم به­ویژه با تغییر ترکیب تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مانند BA، تیدیازورون (TDZ)، بنزیل­آمینوپورین (BAP)، NAA، 3-ایندول استیک اسید (IAA) و اسید ژیبرلیک (GA3) انجام شده است (19، 22، 23، 26، 28، 29، 30، 36). سیتوکینین­ها مهمترین عوامل اصلاح باززایی گیاهان از اجسام شبه-­پروتوکورم هستند (17، 21، 22).

کاربرد موفقیت­آمیز انواع ذرات نانو در پزشکی، توجه را به­سمت استفاده از فناوری نانو (نانوتکنولوژی) در کشاورزی برای افزایش کمی و کیفی محصولات زراعی و باغی معطوف کرد. این فناوری موجب آزادشدن ترکیبات شیمیایی موجود در این ذرات به­صورت هدفمند شده و بعد جذب گیاه می­شوند و در بدنه­ گیاه نیز به بافت­های مورد نظر می­رسند و باعث کاربرد مؤثر مواد معدنی و افزایش رشد گیاه می­شوند. کاربرد مؤثر مواد غذایی، افزایش رشد کمی و کیفی گیاه را به­دنبال دارد. تغییر شکل مواد در مقیاس نانو، ویژگی­های فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و فعالیت­های کاتالیتیک آنها را تغییر می­دهد. ناحیه سطحی ویژه­ اغلب مواد در مقیاس نانو، فعالیت شیمیایی و زیستی­شان را افزایش می­دهد. بنابراین، خواص جدید در ذرات نانو مانند حلالیت بیشتر، فعالیت شیمیایی بیشتر و توانایی نفوذ به­درون غشای سلول ظاهر می­شود. نانوکلات آهن می­تواند به­عنوان یک منبع غنی و قابل اطمینان آهن بی­والنت برای گیاه، به­دلیل پایداری بالا و رهاسازی تدریجی آهن در طیف وسیعی از اسیدیته (11-3) مورد بررسی بیشتر قرار گیرد. مزیت دیگر نانوکلات آهن، میزان بیشتر آهن فروس نسبت به آهن فریک در سطح کلات است که سنتز بیشتر کلروفیل را در گیاه باعث می­شود. البته کاربرد کودهای نانو در شرایط کشت درون­شیشه‌ای بسیار محدود است. پیشرفت در این زمینه، نیازمند مطالعات بیشتر می­باشد. خطر انقراض نسل، بسیاری از گونه­های ارکید از جمله Orchis catasetum را تهدید می­کند (17، 21، 22). در این پژوهش، تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum تحت شرایط کنترل­شده­ کشت بافت در حضور و غیاب BA، IBA و NAA مورد ارزیابی قرار گرفته است. همچنین به اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن در شرایط درون­شیشه­ای روی برخی صفات مورفولوژیکی و باززایی اجسام شبه­-پروتوکورم پرداخته شده است.

مواد و روشها

پروتوکورم­های سالم و گندزدایی­شده­ ارکید، از یک آزمایشگاه تجاری و تحقیقاتی کشت بافت گیاهی واقع در شهر محلات تهیه شدند و به­عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گرفتند. پروتوکورم­ها در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) همراه با 3 درصد (وزن به حجم) سوکروز و 8/0 درصد آگار-آگار کشت شدند. اسیدیته (pH) محیط­های کشت، قبل از اتوکلاو، با اسید کلریدریک یا هیدروکسید سدیم بر روی 2/0 ± 7/5 تنظیم شد. محیط­های کشت در اتوکلاو با دمای 121 درجه­ سانتی‌گراد و فشار 105 کیلوگرم در سانتی­متر مربع به­مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. تمام کشت­ها در اتاقک رشد با دمای 2 ± 24 درجه سانتی­گراد تحت نور سفید فلورسنت (56 میکرومول بر متر مربع بر ثانیه) با دوره­ نوری 16 ساعت قرار داده شدند.

اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن افزوده­شده به محیط MS بر روی تکثیر پروتوکورم و رشد و نمو بعدی گیاهچه­ها ارزیابی شد. پروتوکورم­ها در محیط MS حاوی BA (0، 2/0، 5/0، 1، 5/1 و 3 میلی­گرم بر لیتر)، IBA (0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر)، NAA (0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر) و نانوکلات آهن (0، 13/0، 34/0 و 70/0 میلی­گرم بر لیتر) کشت شدند. برای هر تیمار، 3 ظرف پتری در نظر گرفته شد و در هر ظرف پتری، 4 پروتوکورم کاشته شد. ریزنمونه­ها ترکیبات فنولیک را به­درون محیط­های کشت ترشح می­کنند، بنابراین، 5/0 میلی­گرم بر لیتر ذغال فعال­شده به محیط­ها افزوده شد. ذغال فعال­شده، ترکیبات فنولیک را جذب می­کند. 60 روز بعد از آغاز کشت، تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم باززایی­شده، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه اندازه­گیری شدند.

واحدهای آزمایشی در یک طرح بلوک کاملا تصادفی (RCBD) آرایش یافتند. هر آزمایش در 3 تکرار انجام شد و هر تکرار شامل 4 نمونه بود (در مجموع 12 نمونه برای هر تیمار). داده­ها توسط تجزیه­ واریانس (ANOVA)، با استفاده از نرم­افزار MSTAT-C آنالیز شدند و میانگین آنها با استفاده از آزمون چند دامنه­ا­ی دانکن (DMRT) در سطح احتمال 99 درصد مورد مقایسه قرار گرفتند.

نتایج

اثر BA و IBA یا NAA بر روی باززایی پروتوکورم و تولید اجسام شبه-پروتوکورم: تعداد اجسام شبه-پروتوکورم تحت تأثیر حضور BA، IBA و NAA در محیط MS قرار دارد. اثر BA، IBA و NAA، به­تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر روی باززایی و رشد پروتوکورم در جدولهای 1 و 2 نشان داده شده است. یک ترکیب از 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (84/18 عدد در گیاهچه) را القا کرد (شکل 1). در میان تمام تیمارهای BA، بالاترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (20/12 عدد در گیاهچه) از پروتوکورم در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. غلظت­های بالاتر BA، باززایی بیشتر اجسام شبه-پروتوکورم را باعث نشدند. کمترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (10/5 و 15/5 عدد در گیاهچه) به­ترتیب در محیط­های غنی­شده با 5/1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 3 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد. ارتباط مثبتی بین افزایش غلظت BA و افزایش تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود ندارد (جدول 1). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف BA همچنین اثر متقابل BA و IBA یا NAA برای تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود دارد. اثر IBA و NAA بر روی تعداد اجسام شبه-پروتوکورم معنی­دار نبود (جدول 2).

اثر BA و IBA یا NAA بر روی ارتفاع گیاهچه: اثر BA، IBA و NAA بر روی ارتفاع گیاهچه معنی­دار نبود (جدول 2). در میان غلظت­های مختلف BA، 2/0 میلی­گرم بر لیتر، بیشترین تأثیر را بر روی افزایش ارتفاع گیاهچه­ها (102 میلی­متر در گیاهچه) داشت (جدول 1). بالاترین ارتفاع گیاهچه­ها (10/124 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA آن به­دست آمد (جدول 1).

 

 

جدول 1- اثر ساده و متقابل BA و IBA یا NAA بر روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

طول ریشه

(میلی­متر)

تعداد ریشه

تعداد برگ

ارتفاع گیاهچه

(میلی­متر)

تعداد اجسام شبه-پروتوکورم

 

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (میلی­گرم در لیتر)

 

 

 

 

 

 

NAA

IBA

BA

88/81d-g

30/4c-f

30/7b-d

50/75b-d

80/10b-d

0

0

0

10/102b-d

30/5b-d

86/8ab

00/102a

20/12c-e

0

0

2/0

13/50fg

08/2i

00/4i

00/40f

80/10c-e

0

0

5/0

50/90d-g

20/4d-g

60/5d-i

50/64c-f

10/8e-g

0

0

1

50/60e-g

10/5c-e

00/7b-f

30/46ef

20/9d-g

0

0

5/1

40/101b-e

70/4c-f

70/5c-i

37/47ef

10/10de

0

0

3

20/88d-g

30/4d-g

80/6ab

02/42f

00/11c-e

0

5/0

0

35/74d-g

80/3e-h

40/4g-i

77/38f

20/12b-d

0

5/0

2/0

12/93c-f

60/5bc

08/8a-c

95/66c-f

50/14bc

0

5/0

5/0

92/48fg

90/2g-i

70/4f-i

25/49d-f

00/9d-g

0

5/0

1

25/46g

60/2hi

12/4i

00/41f

60/9d-g

0

5/0

5/1

67/73d-g

00/4e-h

20/5e-i

75/57c-f

10/10c-e

0

5/0

3

20/90d-g

50/4d-g

88/6ab

00/49d-f

50/12b-d

5/0

0

0

58/56fg

08/3g-i

40/4hi

58/51d-f

00/6gh

5/0

0

2/0

90/178a

94/6a

50/9a

10/124a

84/18a

5/0

0

5/0

20/124bc

95/5ab

00/8a-d

13/84bc

60/15b

5/0

0

1

77/57bc

90/3e-h

20/7b-e

73/64c-f

10/5h

5/0

0

5/1

67/64d-g

40/3f-i

60/5d-i

92/53d-f

15/5h

5/0

0

3

در هر ستون میانگین­هایی که دارای حروف همسان هستند در سطح احتمال 5 درصد آزمون چند دامنه­ای دانکن تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

جدول 2- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

منبع تغییرات

درجه­ آزادی

تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم

ارتفاع گیاهچه

تعداد برگ

تعداد ریشه

طول ریشه

اکسین (A)

3

ns70/7

*69/1101

*84/6

**40/3

*36/2583

سیتوکینین ( (B

5

**30/66

**96/1192

**32/6

ns69/1

**12/3673

A × B

15

**23/475

**60/963

**46/8

**64/5

**77/3519

خطا

48

51/182

18/283

11/2

73/0

27/725

ضریب تغییرات  (%)

-

70/19

21/26

17/22

03/19

78/31

**: معنی­دار در سطح 01/0، *: معنی­دار در سطح 05/0 وns : عدم معنی­داری

 

شکل 1- ریزازدیادی ارکید Orchis catasetum با استفاده از پروتوکورم. 1: پروتوکورم استفاده­شده به­عنوان ریزنمونه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 2: یک پروتوکورم در حال توسعه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 3: گیاهچه­های به­دست­آمده از محیط­های کشت غنی­شده با غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این گیاهچه­ها تفاوت ارتفاع مشخص است؛ 4: سرشاخه­های ریزازدیادی­شده از پروتوکورم کشت­شده بر روی محیط MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، (مقیاس = 1 سانتی­متر). در این شکل، برگ­های توسعه­یافته کاملا مشخص است؛ 5: گیاهچه­های به­دست­آمده از محیط­های کشت غنی­شده با غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این گیاهچه­ها تفاوت ارتفاع و ریشه­ها مشخص است؛ 6: مراحل سازگاری گیاهچه­های تولیدشده در شرایط درون­شیشه­ای به شرایط درون­خاکی (مقیاس = 2 سانتی­متر).


5/0 میلی­گرم در لیتر BA و 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، به­تنهایی برای القای ارتفاع بهینه­ گیاهچه مناسب نبودند، زیرا آنها تنها 40 و 49 میلی­متر طول را در هر گیاهچه تحریک کردند (جدول 1). کمترین ارتفاع گیاهچه­ها (77/38 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر IBA ثبت شد (جدول 1). 

اثر BA و IBA یا NAA بر روی تعداد برگ: ریزنمونه­های کشت­شده در حضور 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین تعداد برگ (50/9 برگ در هر گیاهچه) را تولید کردند، که این تعداد بیش از 2 برابر تعداد برگ­های تولیدشده در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA، به­تنهایی است (جدول 1). در میان تمام تیمارهای BA، بیشترین تعداد برگ (86/8 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. تجزیه­ واریانس داده­ها، اختلاف معنی­داری را در میان غلظت­های مختلف BA (p≤0.01)، IBA و NAA (p≤0.05)، همچنین اثر متقابل BA و IBA یا NAA (p≤0.01) بر روی تعداد برگ نشان داد (جدول 2).

اثر BA و IBA یا NAA بر روی تعداد و طول ریشه: تعداد و طول ریشه، تحت تأثیر حضور BA، IBA و NAA در محیط MS قرار دارند. اثر BA، IBA و NAA، به­تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر بر روی تعداد و طول ریشه در جدول 1 نشان داده شده است. یک ترکیب از 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین تعداد ریشه (94/6 عدد در گیاهچه) و بالاترین طول ریشه (90/178 میلی­متر در گیاهچه) را القا کرد. ترکیبی از 1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، تیمار مناسبی برای القای تعداد ریشه (95/5 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (20/124 میلی­متر در گیاهچه) بود. در میان تمام تیمارهای BA، بیشترین تعداد ریشه (30/5 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (10/102 میلی­متر در گیاهچه) در محیط MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن محاسبه شد (جدول 1؛ شکل 1). غلظت­های بالاتر BA، تعداد و طول بیشتر ریشه را القا نکرد. کمترین تعداد ریشه (08/2 عدد در گیاهچه) در محیط­ غنی­شده با 5/0 میلی­گرم در لیتر BA مشاهده شد. همچنین، کمترین طول ریشه (25/46 میلی­متر در گیاهچه) در محیط­های غنی­شده با 5/1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر IBA محاسبه شد (جدول 1). ارتباط مثبتی بین افزایش غلظت BA و افزایش تعداد و طول ریشه وجود ندارد (جدول 1). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف BA همراه با IBA یا NAA برای تولید ریشه وجود دارد (جدول 2).

اثر نانوکلات آهن بر روی باززایی پروتوکورم: باززایی پروتوکورم­ها تحت تأثیر نانوکلات آهن در محیط MS قرار گرفت. بیشترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (20/10 عدد در گیاهچه) در تیمار شاهد به­دست آمد (جدول 3، شکل 2). در میان تمام تیمارهای نانوکلات آهن، بالاترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (18/10 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. کمترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (61/6 عدد در گیاهچه) در تیمار 70/0 میلی­گرم به­دست آمد (جدول 3). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود دارد (جدول 4).

 

 

شکل 2- اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن بر ریزازدیادی ارکید Orchis catasetum با استفاده از پروتوکورم. 1: اثر نانوکلات آهن بر ارتفاع گیاهچه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 2: ریشه­ توسعه­یافته در محیط حاوی نانوکلات آهن (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 3: اثر نانوکلات آهن بر تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم (مقیاس = 2 سانتی­متر)؛ 4: اثر نانوکلات آهن بر تعداد برگ (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این شکل، برگ­های توسعه­یافته کاملا مشخص است؛ 5: اثر نانوکلات آهن بر تعداد ریشه؛ 6: مراحل سازگاری گیاهچه­های تولیدشده در شرایط درون­شیشه­ای به شرایط درون­خاکی (مقیاس = 2 سانتی­متر).


اثر نانوکلات آهن بر روی ارتفاع گیاهچه: اثر نانوکلات آهن بر روی ارتفاع گیاهچه معنی­دار بود (p≤0.01) (جدول 4). بالاترین ارتفاع گیاهچه­ها (79/82 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن به­دست آمد (جدول 3). کمترین ارتفاع گیاهچه­ها (78/65 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن ثبت شد (جدول 3).

اثر نانوکلات آهن بر روی تعداد برگ: ریزنمونه­های کشت­شده در محیط کشت بدون نانوکلات آهن (شاهد)، بیشترین تعداد برگ (76/6 برگ در هر گیاهچه) را تولید کردند (جدول 3). در میان تمام تیمارهای نانوکلات آهن، بیشترین تعداد برگ (64/6 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. کمترین تعداد برگ (05/4 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن به­دست آمد. تجزیه­ واریانس داده­ها، اختلاف معنی­داری را در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن (p≤0.01) بر روی تعداد برگ نشان داد (جدول 4).

اثر نانوکلات آهن بر روی تعداد و طول ریشه: غلظت 13/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن، بیشترین تعداد ریشه (76/4 عدد در گیاهچه) و بالاترین طول ریشه (53/87 میلی­متر در گیاهچه) را القا کرد (جدول 3). کمترین تعداد ریشه (17/3 عدد در گیاهچه) در محیط­ غنی­شده با 70/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن مشاهده شد. همچنین، کمترین طول ریشه (53/72 میلی­متر در گیاهچه) در محیط­های غنی­شده با 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن محاسبه شد (جدول 3). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن برای تولید ریشه وجود ندارد (جدول 4). این اختلاف در ارتباط با طول ریشه معنی­دار بود .(p≤0.01)

 

جدول 3- اثر ساده­ غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

طول ریشه

(میلی­متر)

تعداد ریشه

تعداد برگ

ارتفاع گیاهچه

(میلی­متر)

تعداد اجسام شبه-پروتوکورم

نانوکلات آهن (میلی­گرم در لیتر)

56/79b

22/4a

76/6a

77/76a

20/10a

0

53/87a

76/4a

64/6a

79/82a

18/10a

13/0

42/72c

07/4a

87/5a

78/65b

33/8b

34/0

67/73bc

17/3a

05/4b

61/66b

61/6c

70/0

در هر ستون میانگین­هایی که دارای حروف همسان هستند در سطح احتمال 5 درصد آزمون چند دامنه­ای دانکن تفاوت معنی­داری با هم ندارند. 

جدول 4- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

منبع تغییرات 

درجه­ آزادی

تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم

ارتفاع گیاهچه

تعداد برگ

تعداد ریشه

طول ریشه

تکرار

4

28/7

13/2

29/1

02/2

55/0

تیمار

3

**44/15

**02/8

**50/13

ns15/1

**36/10

خطا

12

-

-

-

-

-

ضریب تغییرات  (%)

-

09/11

31/10

75/15

92/33

22/8

**: معنی­دار در سطح 01/0، *: معنی­دار در سطح 05/0 وns : عدم معنی­داری


بحث

اجسام شبه-­پروتوکورم (PLBs) می­توانند برای ازدیاد سریع ارکیدها مورد استفاده قرار گیرند. افزودن غلظت­های کم BA و NAA، تکثیر و رشد گیاهچه­های ارکید Orchis catasetum را تحریک کرد. استفاده­ ترکیبی از BA و NAA، برای ریزازدیادی این ارکید در حال انقراض، پیشنهاد می­شود. اگرچه، این مقاله می­تواند غلظت 2/0 میلی­گرم در لیتر BA را به­عنوان یک تنظیم­کننده­ رشد گیاهی منفرد برای تحریک تشکیل سرشاخه و تولید ریشه معرفی کند. اما نتایج مشابهی توسط کالیموتو و همکاران (12) بر روی ارکید  Oncidium sp.به­دست آمد. این محققان نشان دادند که بیشترین تشکیل اجسام شبه-­پروتوکورم و بیشترین تعداد سرشاخه و ریشه در محیط­ غنی­شده با 2/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد. BAP به­تنهایی نسبت به ترکیب آن با NAA بهتر بود. البته، 2 میلی­گرم در لیتر BAP به­تنهایی یا در ترکیب با 5/1 میلی­گرم در لیتر NAA تعداد ریشه­ مشابهی (100 درصد) را بر روی سرشاخه القا کرد. از آنجایی­که بذر ارکید بدون آندوسپرم است، بنابراین به شرایط محیطی و مغذی ویژه­ای برای جوانه­زنی نیاز دارد (4). اجسام شبه-­پروتوکورم، یک اندام ناقص و ابتدایی است که به شاخه­ جدید تمایز می­یابد. سلول­های اجسام شبه­-پروتوکورم بسیار مریستمی هستند، بنابراین می­تواند برای ازدیاد افزایش­یافته و تولید هم­زمان گیاهچه­های ارکید به­کار رود (38). اجسام شبه-­پروتوکورم توسط بسیاری از محققان به­عنوان ریزنمونه برای ریزازدیادی بسیاری از گونه­های کمیاب و در خطر انقراض ارکید به­کار برده می­شوند (7، 9، 20، 28، 31، 33، 39). ارکیدها برای نمو گیاهچه به اکسین­ها و سیتوکینین­ها نیاز دارند (28). نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نقش مهمی در طی ریزازدیادی بسیاری از ارکیدها ایفا می­کنند (3). این مطالعه­ اثر مثبت BA را برای تولید بیشینه­ اجسام شبه-­پروتوکورم نشان داد. BA در ترکیب با NAA مؤثرتر عمل کرد. این یافته­ها با برخی یافته­های دیگر در طی ریزازدیادی ارکیدها مطابقت دارد (28، 31). مطالعه­ لو و همکاران (17) بر روی ریزازدیادی ارکید Dendrobium huoshanense نشان داد که بیشترین تشکیل سرشاخه در محیط کشت حاوی 15-5 میکرومولار iP-2 تشکیل شد. چندین مطالعه، اثر مثبت BAP، NAA، TDZ و کینتین (KIN) را برای باززایی گیاهچه از اجسام شبه-­پروتوکورم نشان داد (6، 16، 21). BAP و NAA بیشترین کاربرد را در ریزازدیادی اغلب ارکیدها دارند (6). این تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نقش مؤثری در ریزازدیادی سایر گیاهان زینتی ایفا می­کنند (1، 2). لو و همکاران (16) نشان دادند که 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP برای القای اجسام شبه­-پروتوکورم (15 عدد در ریزنمونه­ ساقه) طی 6 هفته، بهترین بود. 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN نیز برای تشکیل اجسام شبه-­پروتوکورم مناسب بود. BAP در ترکیب با NAA برای دستیابی به بیشترین تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم طی برخی مطالعات پیشنهاد شده است (14، 27). البته یافته­های ما در تناقض با این نتایج است. اگرچه لو و همکاران (16) نشان دادند که NAA افزوده­شده به محیط حاوی غلظت بهینه­ BAP به­طور معنی­داری پاسخ ریزنمونه­های Dendrobium densiflorum را اصلاح نکرد و حتی تولید اجسام شبه-پروتوکورم در غلظت­های بیش از 1 میلی­گرم در لیتر کاهش یافت. در برخی ارکیدها، IBA ریشه­زایی را القا کرد. در این مطالعه­، NAA برای ریزازدیادی Orchis catasetum، بسیار مؤثرتر از IBA بود. مطالعه­ روی و همکاران (28) بر روی نوعی وانیل (Vanda coerulea)، یک ارکید در خطر انقراض، نشان داد که یک ترکیب سازگار بین 36/5 میکرومولار از NAA و 80/3 میکرومولار BAP موجب تولید حداکثری اجسام شبه-­پروتوکورم شد. 

ریزازدیادی ارکیدهای کمیاب و در خطر انقراض در مقیاس وسیع، به­دلیل ارزش تجاری­ و حفاظت آنها باید توسعه یابد. یک نسبت مناسب از اکسین­ها و سیتوکینین­ها برای تکثیر بهینه­ اجسام شبه-­پروتوکورم مورد نیاز است. کارایی نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی برای گونه­ها و ارقام مختلف ارکید، متفاوت است. BA و NAA در غلظت ویژه برای تولید و رشد اجسام شبه-­پروتوکورم Orchis catasetum مناسب هستند.

با توجه به جدیدبودن فناوری نانو و روند رو به رشد مطالعات در این فناوری، گزارش­های زیادی درباره­ اثر این کود بر روی شاخص­های رشد و نمو گیاهان وجود ندارد. گزارش‌های موجود در ارتباط با کشت خاکی برخی گیاهان و اثر نانوکودها بر روی مورفولوژی و فیزیولوژی آنها می­باشد. مطالعه روی اثر نانوذرات به­ویژه نانوکلات آهن در شرایط کشت بافت بسیار محدود است. مقایسه­ نتایج حاصل از اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن در این مطالعه­ نشان داد که تنظیم­کننده­های رشد گیاهی از پتانسیل بسیار بالاتری برای تغییر مثبت صفات اندازه­گیری­شده در ارکید برخوردار هستند. این بررسی نشان داد که تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم، ارتفاع گیاهچه، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه در گیاهچه­های رشدکرده در محیط­های کشت حاوی تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بسیار بیشتر از گیاهچه­های رشدکرده در محیط­های کشت حاوی نانوکلات آهن بودند. بنابراین استفاده از نانوکلات آهن در ریزازدیادی ارکید Orchis catasetumتوصیه نمی­شود.

1-      قلی­زاده، ف.، غلامی، ل. و کیارستمی، خ.، 1393. بررسی اثر محیط­های کشت پایه و تیمارهای مختلف هورمونی بر ریزازدیادی گل محمدی (Rosa damascene Mill.). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران). 27 (1): 121-129.

2-      کاویانی، ب. و غفاری ایسی­زاد، س.، 1394. اثر غلظت­های مختلف نفتالن­استیک­اسید و کینتین بر روی ریزازدیادی گیاه زینتی لیسیانتوس (Eustoma grandiflorum). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران). 28 (4): مقاله آماده انتشار.

 

3-      Arditti, J. and Ernst, R., 1993. Micropropagation of orchids. John Wiley and Sons. New York.

4-      Arditti, J., Ernest, R., Yam, T.W. and Glabe, C., 1990. The contribution to orchid mycorhizal fungi to seed germination: a speculative review, Lindleyana. 5: 249-255.

5-      Bhadra, S.K. and Hossain, M.M., 2003. In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr., an endangered orchid species. Plant Tissue Cult., 13: 165-171.

6-      Chugh, S., Guha, S. and Rao, U., 2009. Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants. Sci. Hortic., 122: 507-520.

7-      Dev, C.R. and Temjensangba, 2006. In vitro propagation of threatened terrestrial orchid Malaxis khasiana Soland ex. Swartz through immature seed culture. Ind. J. Exp. Biol., 44: 762-766.

8-      Geetha, S. and Shetty, S.A., 2000. In vitro propagation of Vanilla planifolia, a tropical orchid. Curr. Sci., 71: 886-889.

9-      Hossain, M.M., Sharma, M., Teixeira da Silva, J.A. and Phthak, P., 2010. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Ex. Lindl. Sci. Hortic., 123: 479-487.

10-   Janarthanam, B., Seshadri, S., 2008. Plantlet regeneration from leaf derived callus of Vanilla planifolia Andr. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 44: 84-89.

11-   Kalimuthu, K., Senthikumar, R. and Murugalatha, N., 2006. Regeneration and mass multiplication of Vanilla planifolia Andr.-a tropical orchid. Curr. Sci., 91: 1401-1403.

12-   Kalimuthu, K., Senthikumar, R. and Vijayakumar S., 2007. In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp. (Dancing Dolls). Afr. J. Biotech., 6 (10): 1171-1174.

13-   Ket, N.V., Hahn, E.J., Park, S.Y. and Paek, K.Y., 2004. Micropropagation of an endangered orchid Anectochilus formosanus. Biol. Plant, 48: 339-344.

14-   Kim, M.S. and Kim, J.Y., 2003. Micropropagation of Dendrobium hybrids through shoot tip culture. Acta Hortic., 624: 527-533.

15-   Kuo, H.I., Chen, J.T. and Chang, W.C., 2005. Efficient plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Phalaenopsis 'Little Steve'. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 41: 453-456.

16-   Luo, J.P., Wang, Y., Zha, X.Q. and Huang, L., 2008. Micropropagation of Dendrobium densiflorum Lindle. ex Wall. through protocorm-like bodies: effect of plant growth regulators and lanthanoids. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 93: 333-340.

17-   Luo, J.P., Wawrosch, C. and Kopp, B., 2009. Enhanced micropropagation of Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng through protocorm-like bodies: The effect of cytokinins, carbohydrate sources and cold pretreatment. Sci. Hortic., 123: 258-262.

18-   Luo, J.P., Zha, X.Q. and Jiang, S.T., 2003a. Suspension culture of protocorm-like bodies from the endangered medicinal plant Dendrobium huoshanenese. China J. Chinese Mater. Med., 28: 611-614.

19-   Malabadi, R.B., Mulgund, G.S. and Kallappa, N., 2005. Micropropagation of Dendrobium nobile from shoot tip sections. J. Plant Physiol., 162: 473-478.

20-   Nagaraju, V. and Mani, S.K., 2005. Rapid in vitro propagation of orchid Zygopetalum intermedium. J. Plant Biochem. Biotech., 14: 27-32.

21-   Nasiruddin, K.M., Begum, R. and Yasmin, S., 2003. Protocorm-like bodies and plantlet regeneration from Dendrobium formosum leaf callus. Asian J. Plant Sci., 2: 955-957.

22-   Nayak, N.R., Sahoo, S., Patnaik, S. and Rath, S.P., 2002.  Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation of Cymbidium alofolium (L.) SW. and Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae). Sci. Hortic., 94: 107-116.

23-   Nge, K.L., New, N., Chandrkrachang, S. and Stevens, W.F., 2006. Chitosan as a growth stimulator in orchid tissue culture. Plant Sci., 170: 1185-1190.

24-   Park, S.Y., Murthy, H.N. and Paek, K.Y., 2003. Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis. Plant Sci., 164: 919-923.

25-   Park, S.Y., Yeung, E.C., Chakrabarty, D. and Paek, K.Y., 2002b. An efficient direct induction of protocorm-like bodies from leaf sub-epidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin-section culture. Plant Cell Rep., 21: 46-51.

26-   Prakash, L., Lee, C.I., Loh, C.S. and Goh, C.J., 1996. In vitro propagation of commercial orchids: an assessment of current methodologies and development of a novel approach-thin cross section culture. In: Islam, A.S. (Ed.), Plant Tissue Cult., Oxford Publishing Co. Pvt. Ltd., New Delhi.

27-   Puchooa, D., 2004. Comparison of different culture media for the in vitro culture of Dendrobium (Orchidaceae). Ind. J. Agric. Biol., 6: 884-888.

28-   Roy, A.R., Patel, R.S., Sajeev, S. and Deka, C., 2011. Asymbiotic seed germination, mass propagation and seedling development of Vanda coerulea Griff ex. Lindle. (Blue Vanda): An in vitro protocol for an endangered orchid. Sci. Hortic., 128: 325-331.

29-   Roy, J. and Banerjee, N., 2003. Induction of callus and plant regeneration from shoot tip explants of Dendrobium fimbriatum Lindl. var. Oculatum H.K.f. Sci. Hortic., 97: 333-340.

30-   Saiprasad, G.V.S., Raghuveer, P., Khetarpal, S. and Chandra, R. 2004. Effect of various polyamines on production of protocorm-like bodies in orchid- Dendrobium 'Sonia'. Sci. Hortic., 100: 161-168.

31-   Seeni, S. and Latha, P.G., 2000. In vitro multiplication and ecorehabilitation of the endangered Blue Vanda. Plant Cell Tissue Org. Cult., 61: 1-8.

32-   Sheela, V.L., Rajmohan, K., Anita, S. and Sarada, S., 2004. Effect of growth regulators on development and multiplication of protocorm like bodies in Dendrobium cv. Sonia. J. Orchid Soc., India. 18: 21-23.

33-   Sheelavantmath, S.S., Murthy, H.N., Pyati, A.N., Ashok Kumar, H.G. and Ravishanker, B.V., 2000. In vitro propagation of the endangered orchid, Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr. through rhizome section culture. Plant Cell Tissue Org. Cult., 60: 151-154.

34-   Shimura, H. and Koda, Y., 2004. Micropropagation of Cypripedium macranthos var. Rebunerse through protocorm-like bodies derived from mature seed. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 78: 273-276.

35-   Sinha, P., Hakim, M.K. and Alam, M.F., 2007. Efficient micropropagation of Phalaenopsis amabilis (L.) B.L. cv. 'Cool Breeze' using inflorescence axis thin section as explants. Prop. Ornamental Plants. 7: 9-15.

36-   Subramanium, G. and Taha, R.M., 2003. Morphogenesis of Cymbidium atropurpureum in vitro. Malays. J. Sci., 22: 1-5.

37-   Teixeira, da Silva, J.A., 2003. Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology. Afr. J. Biotech., 2: 683-691.

38-   Teixeira, da Silva, J.A., Yam, T., Fukai, S., Nayak, N. and Tanaka, M., 2005. Establishment of optimum nutrient media for in vitro propagation of Cymbidium Sw (Orchidaceae) using protocorm-like body segments. Prop. Ornamental Plants, 5: 129-136.

39-   Teixeira, da Silva, J.A., Singh, N. and Tanaka, M., 2006. Priming biotic factors for optimal protocorm-like body and callus induction in hybrid Cymbidium (Orchidaceae), and assessment of cytogenetic stability in regenerated plants. Plant Cell Tissue Org. Cult., 84: 135-144.

40-   Wang, Y.F., Lu, R.J., Sun, Y.F., Zhou, R.M. and Huang, J.H., 2004. The induction and cultivation of cell-derived regenerates of Dendrobium huoshanenese. Acta Agric. Shanghai, 20: 8-10.