مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

اثر اکسید نیتریک بر میزان پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم های آنتی‌اکسیدانی در شرایط تنش سرب در گیاه کلزا (.Brassica napus L)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دبیر زیست آموزش و پرورش

2 استاد دانشگاه آزاد دامغان

چکیده

تنش سرب یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی است که رشد گیاهان را محدود می‌کند. اکسید نیتریک (NO) در انتقال پیام و پاسخ به تنش زیستی و غیرزیستی دخالت می‌کند. در این تحقیق به بررسی اثر اکسید نیتریک در شرایط تنش سرب بر پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در گیاه کلزا رقم 401 Hyola در محیط کشت هیدروپونیک و با استفاده از محلول غذایی هوگلند در ریشه و اندام هوایی پرداختیم. آنالیزهای آماری توسط نرم افزار SPSSو مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن انجام گرفت. سه سطح سرب توسط Pb(NO3)2 [0، 100 و 200 میکرومول بر لیتر] و دو سطح NO توسط نیتروپروساید سدیم [0 و 100 میکرومول بر لیتر] صورت گرفت. در تنش سرب ملایم، میزان پرولین ریشه افزایش معنی داری داشت و NO باعث افزایش سازگاری گیاه با محیط شد. قندهای محلول در ریشه و اندام هوایی افزایش معنی داری نیافتند. فعالیت آنزیم پراکسیداز در تمام تیمارهای ریشه و اندام هوایی کاهش معنی‌داری داشت. فعالیت کاتالاز در شرایط تنش سرب در اندام هوایی به طور معنی‌داری کاهش یافته بود اما فعالیت کاتالاز ریشه تغییر معنی‌داری نداشت. کاهش فعالیت آنزیم های پراکسیداز و کاتالاز می تواند ناشی از فعالیت NO به عنوان یک آنتی‌اکسیدان باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Nitric oxide effect on proline, soluble sugars and activity of antioxidant enzymes in Pb stress terms in Brassica napus L.

نویسندگان [English]

  • Hossein Hamidi 1
  • Nahid Masoudian 2
  • Sakineh Saeedisar 2

1 teacher

2 Dr-Islamic Azad University of Damghan

چکیده [English]

Lead Stress is one of the most important environmental stresses that limit plant growth. Nitric oxide (NO) in signal transduction and biological and abiotic stress response is involved. In this study, the effect of nitric oxide of lead stress on proline, soluble sugars and activities of antioxidant enzymes in 401 Hyola canola plants in hydroponic culture using Hoagland solution was investigated in roots and shoots. Statistical analysis using SPSS and the comparisons were performed using Duncan. Three levels of lead by Pb(NO3)2 [0, 100 and 200 µM] and two levels of NO by sodium nitroprusside [0 and 100 µM] took place. Lead to mild stress, root proline increased significantly and NO increases the plant adaptation to the environment. Soluble sugars in roots and shoots were not significantly increased. Peroxidase enzyme activity was significantly reduced in all treatments, roots and shoots. CAT activity in shoots under stress conditions lead to significantly reduced but Root catalase activity did not change significantly. Peroxidase and catalase enzyme activity loss can be caused by the activity of NO as an antioxidant.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Adaptation
  • Catalase
  • Peroxidase
  • Sodium nitroprusside

اثر اکسید نیتریک بر میزان پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم های آنتی­اکسیدانی در شرایط تنش سرب در گیاه کلزا (Brassica napus L.) 

حسین حمیدی، ناهید مسعودیان* و سکینه سعیدی­سار

دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 19/7/93                تاریخ پذیرش: 23/12/93 

چکیده

تنش سرب یکی از مهمترین تنش­های محیطی است که رشد گیاهان را محدود می­کند. اکسید نیتریک (NO) در انتقال پیام و پاسخ به تنش زیستی و غیرزیستی دخالت می­کند. در این تحقیق به بررسی اثر اکسید نیتریک در شرایط تنش سرب بر پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در گیاه کلزا رقم 401 Hyola در محیط کشت هیدروپونیک و با استفاده از محلول غذایی هوگلند در ریشه و اندام هوایی پرداختیم. آنالیزهای آماری توسط نرم افزار   SPSS و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن انجام گرفت. سه سطح سرب توسط Pb(NO3)2 [0، 100 و 200 میکرومول بر لیتر] و دو سطح NO توسط نیتروپروساید سدیم [0 و 100 میکرومول بر لیتر] صورت گرفت. در تنش سرب ملایم، میزان پرولین ریشه افزایش معنی­داری داشت و NO باعث افزایش سازگاری گیاه با محیط شد. قندهای محلول در ریشه و اندام هوایی افزایش معنی­داری نیافتند. فعالیت آنزیم پراکسیداز در تمام تیمارهای ریشه و اندام هوایی کاهش معنی­داری داشت. فعالیت کاتالاز در شرایط تنش سرب در اندام هوایی بطور معنی­داری کاهش یافته بود اما فعالیت کاتالاز ریشه تغییر معنی­داری نداشت. کاهش فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز می تواند ناشی از فعالیتNO بعنوان یک آنتی­اکسیدان باشد.

واژه های کلیدی: پراکسیداز، سازگاری، کاتالاز، نیتروپروساید سدیم

* نویسنده مسئول، تلفن:09124744137، پست الکترونیکی: n.masoudian@damghaniau.ac.ir

مقدمه 

 

کلزا (Brassica napus L.) یکی از مهمترین گیاهان روغنی بعد از سویاست که کشت و تولید آن در ایران بخصوص در گیلان پس از کشت برنج بعنوان کشت دوم توسعه زیادی یافته­است (2). آلودگی سرب در خاک موجب کاهش درصد جوانه زنی گشته و اثرات مضری بر رشد و متابولیسم گیاه بر جای می­گذارد (23). نشانه­های غیر اختصاصی و قابل مشاهده سمیت سرب شامل ممانعت از رشد ریشه، جلوگیری از رشد گیاه و زرد شدن گیاه است (6). فلزات سنگین احتمالاً با تولید رادیکال­های آزاد و اشکال مختلف اکسیژن فعال موجب تنش اکسیداتیو می­شود (17). این اشکال مختلف می­توانند با لیپیدها واکنش داده و سبب پراکسیداسیون لیپیدها، آسیب‌های غشایی و غیرفعال‌سازی آنزیمی شده بنابراین حیات سلول را به خطر می­اندازند (12).

مکانیسم اکثر گیاهان و جلبکها در پاسخ به فلزات سنگین، تولید پرولین می­باشد (25). پرولین احتمالا" در سلولهای تحت تنش، نقش آنتی­اکسیدانی دارد(31). گیاه با افزایش قند­های محلول در شرایط تنش علاوه بر حفظ پتانسیل اسمزی، قادر خواهد بود تا ذخیره کربوهیدراتی خود را برای متابولیسم پایه سلولی در حد مطلوب نگه دارد (13). کاهش قند­های محلول، تحت تنش سرب از جذب عناصری مثل Mn، Fe و Mg جلوگیری می­کند (28 و 30). گیاهان جهت تنظیم میزان گونه­های اکسیژنی فعال و حفاظت سلولها در شرایط تنشی، دارای چندین آنزیم جاروبگر مثل کاتالاز و پراکسیداز می­باشند (27). تیمار با سرب سبب تغییر در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و آسیب به ساختار ترکیبات آلی می­شود (18). افزایش فعالیت پراکسیداز بعنوان آنزیم اصلی و کلیدی در تنش­های مربوط به فلز سنگین به اثبات رسیده است، تا جایی­که فعالیت این آنزیم را بعنوان مارکر­های استرس در تنش فلزات سنگین می­شناسند (9).

نیتروپروساید سدیم (SNP) یک ترکیب آزاد کننده نیتریک اکسید است که در حالت محلول بشدت به نور حساس می­باشد (34). نیتریک اکسید یک ملکول گازی کوچک و قابل انتشار است که بصورت درون­زا در بسیاری از سیستم­های بیولوژیکی مثل جانوران، گیاهان و باکتری­ها تشکیل می­شود و دارای نقش­های فیزیولوژیکی متعددی می­باشد (11). اثر محافظت­کنندگی NO به توانایی آن در واکنش به بعضی ROS­ ها مانند - O2مربوط است که NO بعنوان شکننده­ی زنجیره عمل کرده وخصوصیات آنتی­اکسیدانی بروز می­دهد (10). گیاهچه­ی کانولا و یا کلزایی که با غلظت­ پایین SNP تیمار شده بودند، طول ریشه و وزن خشک بیشتری داشتند، در حالی که غلظت بالاتر، مقادیر این پارامتر­ها را کاهش داد (35). در دهه اخیر، درباره اثرات مثبت ومنفی NO خارجی بر سمیت فلزات سنگین تعداد در حال افزایشی از مقالات گزارش شده است (20، 22، 29، 35 و 36).

در این تحقیق میزان پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در گیاه کلزا رقم 401Hyola  تحت تنش سرب بررسی شد و اثر تیمار نیتروپروساید سدیم (SNP) بعنوان رها کننده NO در تخفیف صدمات گیاه کلزا در شرایط تنش سرب بررسی گردید و نقش آنتی­اکسیدانی نیتریک اکسید ارزیابی شد.

مواد و روشها

بمنظور کشت حدود  400  بذر  کلزا  رقم  401Hyola   و

بدست آوردن دانه رست، ابتدا بذر­ها با هیپوکلریت سدیم 20 درصد سترون گردیدند و سپس بوسیله آب مقطر استریل شستشو داده شده و پس از آن به درون ظروف پتری دارای یک لایه کاغذ صافی مرطوب منتقل شدند بطوریکه سطح بذر­ها نیز توسط لایه دیگر کاغذ واتمن پوشانده شد. جوانه زنی بذرها در اتاقک رشد و در دمای 28 درجه سانتی گراد در تاریکی انجام گرفت. پس از 7 روز دانه رست­های حاصل به محیط کشت دارای محلول غذایی هوگلند انتقال یافتند. در درون ظروفی با حجم 400 میلی­لیتر که قبلاً با الکل 96% سترون شده بودند، محلول کامل هوگلند ریخته شد. درب ظرف­ها دارای 8 سوراخ بود که دانه رست­ها پس از خروج از پتری دیش­ها و شستشو با آب مقطر استریل با کمک پنبه در این سوراخ­ها طوری قرار گرفتند که ریشه آن­ها بطور کامل داخل محلول غذایی قرار گرفت. هوادهی محلول غذایی پنج بار در روز و هر بار بمدت نیم ساعت انجام گرفت.  pHمحلول­های غذایی بین 5/5 تا 7/5 تنظیم شده بود. پس از گذشت شش روز محلول غذایی تجدید شد، بنحویکه محلول غذایی هوگلند با غلظت­های مختلف سرب از منبع نیترات سرب Pb(NO3)2] 0، 100 و 200 میکرومول بر لیتر] (14) و NO از منبع نیتروپروساید سدیم (SNP) [0 و 100 میکرومول بر لیتر] (8)  تهیه شد و به ظروف پلاستیکی اضافه گردید. آب تعرق شده توسط گیاه بصورت روزانه با آب مقطر جبران گردید. پس از گذشت هفت روز برداشت انجام شد و سپس نمونه­ها به آزمایشگاه منتقل شدند.

سنجش مقدار پرولین: نمونه­های خشک گیاهی توزین شده (یک گرم) را در 10 میلی­لیتر محلول 3 درصد اسید سولفوسالیسیلیک ساییده و سپس نمونه­ها صاف گردید. آن­گاه 2 میلی­لیتر معرف نین هیدرین و 2 میلی­لیتر اسید استیک خالص به نمونه­ها افزوده شد و لوله­ها در بن ماری با دمای 100 درجه سانتی گراد بمدت یک ساعت قرار داده شد، سپس لوله­ها در حمام یخ بمدت نیم ساعت قرار گرفتند. به هر لوله آزمایش 4 میلی­لیتر تولوئن افزوده و آنها را خوب تکان داده و میزان جذب لایه رنگی فوقانی (حاوی تولوئن و پرولین) با دستگاه اسپکتروفوتومتر (U.V) و کوت کوارتز در طول موج 520 نانومتر قرائت شد. برای محاسبه غلظت نمونه­ها (C)محلول­های شاهد از 0، 10، 25، 50، 100، 150 و 200 میکرومول بر لیتر پرولین تهیه و کلیه مراحل کار بر روی یک میلی­لیتر از هر کدام آنها تکرار شد. سپس با استفاده از اعداد جذب(Abs) خوانده شده منحنی استاندارد با r = 0/98 (ضریب همبستگی) و C = Abs 825/302+3/369 بدست آمد که مقدار پرولین نمونه­ها ارزیابی شد. مقدار پرولین بصورت میکرومول در گرم خشک نمونه­­ی گیاهی ارزیابی شد (5).

سنجش قندهای محلول با استفاده از روش فنل–اسید سولفوریک: در ابتدا برگ و ریشه را بمدت 48 ساعت در داخل آون در دمای 110 درجه سانتی گراد قرار داده شد و پس از خشک شدن میزان 02/0 گرم از نمونه­ها را با استفاده از ترازوی دیجیتال وزن کرده و به هر یک از نمونه­ها، 10 میلی­لیتر الکل 70% افزوده شد و در ظروف پلی­اتیلنی بمدت یک هفته در درون یخچال قرار داده شدند. با این عمل، قند­های محلول در اتانول حل گردیده و در بخش بالایی محلول جمع شدند، سپس 1 میلی­لیتر از بخش بالایی محلول برداشته و با آب مقطر حجم آن را به 2 میلی­لیتر رسانده شد. در ادامه نیز 1 میلی­لیتر فنل 5% و 5 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ به محلول فوق اضافه شد. با افزودن اسید سولفوریک محلول زرد رنگی بدست آمد که به مرور زمان تغییر رنگ داد. محلول را بمدت نیم ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده تا خنک شده و به رنگ نهایی برسد.

در پایان نیز جذب نوری محلول در طول موج 485 نانومتر با استفاده از شاهد توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد. برای محاسبه­ی غلظت قند­های محلول نمونه­ها (C) با استفاده از منحنی استاندارد، محلول­هایی به غلظت 0، 10، 20، 50، 100، 200 و 300 میلی­گرم در لیتر گلوکز بعنوان قند شاهد تهیه و کلیه مراحل کار بر روی 2 میلی­لیتر از هر کدام آنها تکرار شد. سپس با استفاده از اعداد جذب(Abs) خوانده شده منحنی استاندارد با r = 0/99 (ضریب همبستگی) و C = (Abs × 107/111) + 2/93605 بدست آمد که مقدار قند نمونه­ها ارزیابی گردید. مقدار قند بصورت میلی­گرم در گرم خشک نمونه­­ی گیاهی بدست آمد (15).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: برای اندازه­ گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه و برگ، ابتدا گیاه از تیمار­های مختلف با 3 تکرار بطور تصادفی انتخاب و بعد از توزین ریشه و برگ برای انجام عملیات زیر آماده شد (21).

برای تهیه­ی محلول عصاره گیری 2/1 گرم تریس، 2 گرم آسکوربیک اسید، 8/3 گرم بوراکس (دی–سدیم تترابورات)، 2 گرم EDTANa2 و 50 گرم پلی اتیلن گلیکول 2000 مخلوط و حجم به 100 میلی­لیتر با آب مقطر رسانده شد (محلول در دمای 4 درجه سانتی­گراد برای 24 ساعت گذاشته شد).

برای استخراج عصاره آنزیمی، 1 گرم از بخش­­های مورد مطالعه­ی گیاه (برگ و ریشه) در 4 میلی­لیتر محلول عصاره گیری بمدت 30 دقیقه ساییده شده و محلول تهیه شده بمدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. سپس محلول بمدت نیم ساعت با دور g 4000 سانتریفیوژ شد. بعد از سانتریفیوژ محلول رویی بعنوان عصاره آنزیمی در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. و برای سنجش فعالیت آنزیمی، 1 میلی­لیتر بافر استات 2/0 مولار، 5 = pH  با 4/0 میلی­لیتر آب اکسیژنه 3% و 2/0 میلی­لیتر بنزیدین محلول در الکل 50 درجه و 01/0 مولار مخلوط شد. به مخلوط حاصل 1/0 میلی­لیتر عصاره آنزیمی اضافه و تغییرات جذب در طول موج nm530 در مقابل شاهد دستگاه خوانده شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد (OD/min/g. F.W) محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت کاتالاز بوسیله روش چنس و مهلی در سال 1995(7) بدست آمد. پنج میلی­لیتر محلول حاوی µM300 بافر فسفات (8/6 = pH) و µM100 پراکسید هیدروژن (H2O2) تهیه شد و 1 میلی­لیتر از عصاره آنزیمی (2 مرتبه رقیق شده) اضافه شد و در 25 درجه سانتی گراد برای 1 دقیقه گذاشته شد. سپس برای متوقف شدن واکنش، 10 میلی­لیتر سولفوریک اسید (2%( اضافه شد و برای تخمین میزان H2O2 باقی مانده، با پتاسیم پرمنگنات (N 01/0) تیتر شد تا وقتی که رنگ صورتی بدست آمد. فعالیت آنزیم تجزیه­ی µM 1 از H2O2 در 1 دقیقه بود.

محاسبات آماری: این مطالعه با توجه به رقم گیاه کلزا بصورت فاکتوریل در قالب تصادفی و با 3 تکرار صورت گرفت و مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS به روش دانکن و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel انجام شد.

نتایج

سرب ملایم و اثر برهم کنش آن با کاربرد اکسید نیتریک تاثیر معنی­داری (05/0≥ P) بر میزان پرولین ریشه داشت (جدول های 1 و 2). مقایسه میانگین داده­های میزان پرولین ریشه ، افزایش معنی­داری را در همه تیمارها نسبت به شاهد  نشان داد و بیشترین میزان پرولین اندام هوایی در تیمار اکسید نیتریک مشاهده شد که با تیمار شاهد اختلاف معنی­داری را نشان داد.

کاربرد سرب ملایم و اکسید نیتریک بر میزان قندهای محلول اندام هوایی اثر معنی داری (05/0≥ P) داشت (جدول 1 و 2). استفاده از تیمار NO تغییر معنی­داری را در میزان قندهای محلول ریشه ایجاد نکرد.

کاربرد سرب و اکسید نیتریک سبب کاهش معنی داری (05/0≥ P) در میزان فعالیت پراکسیداز ریشه و اندام هوایی شد (جدول 1 و 2). بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه و اندام هوایی در تیمار سرب شدید مشاهده شد. کاربرد سرب و اکسید نیتریک باعث کاهش معنی­داری (05/0≥ P) در میزان فعالیت کاتالاز اندام هوایی شد (جدول 1 و 2). تیمار NO باعث تغییر معنی­داری در فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه نشد. پس تیمار NO تنها در بخش اندام هوایی باعث کاهش معنی­دار در شرایط تنش سرب شد.

 

جدول 1- مقایسه میانگین برهمکنش اکسید نیتریک و سرب بر میزان پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم های آنتی­اکسیدانی در گیاه کلزا

تنش سرب (µM)

کاربرد اکسید نیتریک  (µM)

کاتالاز

(µM H2O2destroyed min-1)

پراکسیداز

 (OD g-1 FW min-1)

قندهای محلول

 (mg g-1 DW)

پرولین

(mol g-1 DWµ)

 

 

 

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

شاهد

(0)

بدون اکسید نیتریک (0)

83/64c

17/19c

014/0cd

008/0c

13/0b

11/0c

87/6b

92/3d

با اکسید نیتریک (100)

67/63c

95/18c

015/0c

007/0d

14/0b

11/0c

60/7a

82/5c

تنش ملایم (100)

بدون اکسید نیتریک (0)

33/75b

50/35b

02/0c

010/0b

138/0b

111/0bc

03/7b

80/5c

با اکسید نیتریک (100)

17/64c

83/35b

01/0d

008/0c

143/0a

113/0ab

25/7ab

30/6b

تنش شدید (200)

بدون اکسید نیتریک (0)

67/98a

83/38a

018/0a

013/0a

14/0a

12/0a

45/7a

37/8a

با اکسید نیتریک (100)

83/81b

50/38a

016/0b

011/0b

14/0a

12/0a

52/7a

70/8a
                         

 رقم 401 Hyola      میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون مطابق آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار ندارند.

 

جدول2-  نتایج آزمون F برای میزان پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم های آنتی­اکسیدانی در گیاه کلزا رقم 401 Hyola

 

کاتالاز

پراکسیداز

قندهای محلول

پرولین

 

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

اندام هوایی

ریشه

سرب

درجه آزادی

2

2

2

2

2

2

2

2

میانگین مربعات

389/1799**

667/664**

000/0**

000/0**

000/0**

000/0*

542/0*

937/29**

ضریب تغییرات

197/0

295/0

112/0

217/0

037/0

031/0

058/0

321/0

اکسید نیتریک

درجه آزادی

1

1

1

1

1

1

1

1

میانگین مربعات

083/4ns

141/0ns

000/0ns

000/0ns

000/0ns

000/0ns

613/1**

830/10**

ضریب تغییرات

101/0

057/0

087/0

132/0

017/0

030/0

059/0

217/0

سرب

و

اکسید نیتریک

درجه آزادی

2

2

2

2

2

2

2

2

میانگین مربعات

222/636**

667/658**

000/0**

000/0**

000/0**

000/0**

641/0*

321/34**

ضریب تغییرات

138/0

286/0

102/0

171/0

040/0

034/0

056/0

322/0

ns، * و ** بترتیب عدم وجود اختلاف معنی­دار، معنی­دار در سطح احتمال 5% و1%          


بحث

کاربرد تیمار NO در شرایط غیر تنش موجب افزایش معنی­دار میزان پرولین ریشه و اندام هوایی نسبت به شاهد شد. در شرایط تنش سرب شدید و ملایم، کاربرد تیمار NO موجب افزایش کمی در میزان پرولین اندام هوایی شد که این افزایش نسبت به شاهد (بدون تیمار NO) معنی­دار نبود. در ریشه کاربرد تیمار NO سبب افزایش معنی­دار پرولین در شرایط تنش سرب ملایم شد، اما افزایش میزان پرولین در شرایط تنش سرب شدید معنی­دار نبود. پس میزان افزایش NO تا حد معینی در شرایط تنش سرب باعث افزایش سازگاری گیاه شد. هیر و کرس (1997) با مطالعاتی که انجام دادند، بیان کردند وقتی SNP بعنوان دهنده NO مصرف شود، باعث افزایش بیش از حد پرولین می شود (16) که با نتایج حاضر همخوانی دارد. پیش تیمار گیاهان با SNP باعث افزایش پرولین تحت تنش خشکی گردید که این امر می­تواند بدلیل افزایش سنتز پرولین باشد (3). القای فعالیت آنزیم پیرولین 5- کربوکسیلاز بعنوان آنزیم اصلی در مسیر بیوسنتز پرولین، توسط NO در گیاهچه در حال رشد برنج گزارش شده است (33). در حضور نیکل به­تنهایی، پروتئین محلول، پرولین و فعالیت سوپراکسید-دیسموتاز افزایش یافت، در حالیکه فعالیت پراکسیداز و بخصوص کاتالاز مهار شد (26).

تحت تیمار توام سرب و نیتروپروساید سدیم، میزان قندهای محلول در شرایط تنش سرب ملایم و شدید در ریشه و در شرایط تنش سرب شدید در اندام هوایی نسبت به شاهد (بدون تیمار NO) افزایش معنی­داری نداشت، اما در اندام هوایی میزان قندهای محلول در شرایط تنش سرب ملایم با کاربرد تیمار NO نسبت به شاهد (بدون تیمار NO) افزایش معنی­داری داشت. کاربرد تیمار NO در شرایط غیر تنش سبب افزایش معنی­داری در میزان قندهای محلول ریشه و اندام هوایی نشد. افزایش قندهای محلول در اغلب شرایط تنش­زا بعنوان یک مکانیسم تحمل در برابر تنش است و در واقع باعث تنظیم پتانسیل آب سلول در بخش سیتوزول برای مقابله با غلظت بالای یون‌های جذب شده و تجمع یافته در واکوئل می‌گردد (19). تجمع قندهای محلول در گونه­های دیگر گیاهی نیز مشاهده شده است (1). بنظر می­رسد که NO نقش مستقیمی در بیوسنتز قندها در شرایط تنش ندارد (3). قندهای محلول فقط در شرایط تنش ملایم با کاربرد تیمار NO نسبت به شاهد باعث افزایش تحمل در شرایط تنش شد. پس کاربرد تیمار NO در تنش سرب ملایم از طریق افزایش مواد اسمزی سبب افزایش سازگاری اندام هوایی گیاه کلزا بشرایط تنش شده بود.

تیمار توام سرب و نیتروپروساید سدیم، فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه و اندام هوایی را بطور معنی­داری در شرایط تنش سرب ملایم و شدید کاهش داد. غلظت پایین دهنده  NO(SNP) باعث افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در کلم می­شود، در حالیکه غلظت­های بالا حالت بازدارندگی دارد (37). تیمار گندم با غلظت اندک  SNPمقدار H2O2 را کاهش می دهد، اما فعالیت آنتی­اکسیدانی افزایش می یابد (32). با توجه به کاهش معنی­دار پراکسیداز ریشه در شرایط  کاربرد تیمار NO بنظر می­رسد NO خود بعنوان آنتی­اکسیدان در شرایط تنش و غیر تنش عمل کرده و موجب کاهش فعالیت آنزیم پراکسیداز می­شود.

در تحقیق حاضر در میزان فعالیت کاتالاز اندام هوایی تحت تیمار توام سرب و تیمار NO کاهش معنی­داری مشاهده شد که اختلاف آن با شاهد معنی­دار بود. در سیستم­هاییکه سمیت بیشتر بخاطر ROS اتفاق می­افتد، NO ممکن است بعنوان یک شکننده زنجیر عمل نموده و بدین ترتیب خسارت را بحداقل می­رساند (24). افزودن 50، 100 و 200 میکرومولار SNP به­محلول حاوی سرب محتوای کلروفیل و سرعت فتوسنتز خالص را افزایش داد، و با کاهش خسارت اکسیداتیو ناشی از سرب، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان را بهبود بخشید (4). NOنقش مستقیمی در برطرف کردن H2O2 تحت شرایط تنش خشکی دارد (3). بنظر می­رسد تیمار NO خود بعنوان یک آنتی­اکسیدان عمل نموده و در نتیجه موجب کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز در اندام هوایی در شرایط تنش شده است، اما در ریشه هیچ گونه اثر معنی­داری نداشت.

نتیجه گرفته شد که تیمار NO بیشترین تاثیر را بر میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه و اندام هوایی و کاتالاز در اندام هوایی داشت. پیشنهاد می­شود که برای افزایش مقاومت گیاه کلزا به تنش سرب و سایر تنش­ها مکانیسم مولکولی نیتریک اکسید در ارقام مختلف کلزا با غلظت­های مختلف نیتریک اکسید بررسی شود.

سپاسگزاری

از کلیه استادان و دست اندرکاران دانشگاه آزاد اسلامی دامغان قدردانی می گردد.

1- احمدی موسوی، ع. منوچهری کلانتری، خ. و ترکزاده، م. 1384. اثر نوعی براسینواستروئید(24-epibrassinolide) بر مقدار تجمع مالون دآلدئید، پرولین، قند و رنگیزه­های فتوسنتزی در گیاه کلزا (Brassica napus L.) تحت تنش کم آبی. مجله زیست­شناسی ایران، جلد 18. شماره 4. ص 306-295. 
2- بلوچی، ح. باقری، ف. کایدنظامی، ر. موحدی­دهنوی، م. و یدوی، ع. 1392. اثر پیری تسریع شده بذر بر جوانه­زنی و مؤلفه­های رشد گیاهچه­های سه رقم کلزا (Brassica napus). مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران)، جلد 26. شماره 4. ص 411-397.
3- نصیبی، ف. منوچهری کلانتری، خ. و یعقوبی، م.م. 1390. مقایسه اثر پیش تیمار سدیم نیترو پروساید و آرژینین بر برخی پاسخهای فیزیولوژیکی گیاه گوجه فرنگی (Lycopersicun esculentum) تحت تنش کم آبی. مجله زیست شناسی ایران، جلد 24. شماره 6. ص 847-833.
 
4- Bai, X.Y., Y.J. Dong,  Q.H. Wang,  L.L. Xu, J. Kong, and S. Liu. 2014. Effects of lead and nitric oxide on photosynthesis, antioxidative ability, and mineral element content of perennial ryegrass. Biol. Plant. 1-8.  
5- Bates, L.S., R.P. Waldern, and I.D. Teare. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. plant soil. 39:205-207.
6- Burton, D., and R. Nadiv. 1984. Uptake of  Pb, Cd, Cu and DDT  by vegetables grown in urbon environments. EPHC: 151-161.
7- Chance, B., and C. Maehly. 1995. Assay of catalase and peroxidase. Methods enzymol. 11: 764-775.
8- Chen, J., D.Y. Xiong, W.H. Wang, W.J. Hu, M. Simon, Q. Xiao, J. Chen, T.W. Liu, X. Liu, and H.L. Zheng. 2013. Nitric Oxide Mediates Root K+/Na+ Balance in a Mangrove Plant, Kandelia obovata, by Enhancing the Expression of AKT1-Type K+ Channel and Na+/H+ Antiporter under High Salinity. PLoS ONE. 8(8): 1-11.
9- Choudhary, M., U.K. Jetley, M.A. Khan, S. Zutshi, and T. Fatma. 2007. Effect of heavy metal stress on proline, malondialdehyde, and superoxide dismutase activity in the cyanobacterium Spirulina platensis-S5. Ecotoxicol. Environ. Saf. 66(2): 204-209.
10- Conner, E. M., and M.B. Grisham. 1996. Inflammation, free radicals and antioxidants. Nutrition. 12:274-277.
11- DelRio, L.A., F.J. Corpas, and J.B. Barroso. 2004. Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants. Phytochem. 65: 783-792.
12- Dixi, V., V. Pandey, and R. Shyam. 2001. Differential antioxidative responses to heavy metal in roots and leaves of pea (Pisum sativum L. CV. Azad). J. Exp. Bot. 52: 1101-1109.
13- Dubey, R. S., and A.k. Singh. 1999. Salinity induces accumulation of soluble sugars and alters the activity of sugar metabolizing enzyme in rice plants. Plant Biol. 42 : 233-239.
14- Gohari, M., A.R. Habib-Zadeh, and M.Khayat. 2012. Assessing the intensity of tolerance to lead and its effect on amount of protein and proline in root and aerial parts of two varieties of rape seed (Brassica napus L.). J. Basic Appl. Sci. Res. 2 : 935–938.
15- 1978. Handbook of physiological methods. Cambridge Univ. press, Cambridge.
16- Hare, P.D., and W.A. Cress. 1997. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regul. 21: 79-102.
17- Hendry, G.A.F., A.J.M. Baker, and C.F. Ewart. 1992. Heavy metal tolerance and toxicity, oxygen radical processes and molecular damage in cadmium tolerant clones of Holcus lanatus L. . Acta Botany Neerl. 41 : 271-281.
18- Hu, J. Z., G.X. Shi, Q.S. Xu, X. Wang, Q.H. Yuan, and K.H. Du. 2007. Effect of Pb on the active oxygen scavenging enzyme activities and ultra structure in Potamogeton crispus leaves. Russ. J. Plant Physiol. 54: 414-419.
19- Kameli, A., and D.M. Losel. 1993. Carbohydrates and water stress in wheat plants under water stress. New Phytol. 125 (3):609-614.
20- Kopyra, M., and E.A. Gwozdz. 2003. Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of Lupinus luteus. Plant Physiol. Biochem. 41: 1011-1017.
21- Koroi, S.A. 1989. Gelelektrophers tische and spectral photometrischoe unter uchungen zomeinfifss der temperature auf stracktur and aktritat der amylase and peroxidase isoenzyme. physiol. Veg. 20: 15-23.
22- Laspina, N.V., M.D. Groppa, M.L. Tomaro, and M.P. Benavides. 2005. Nitric oxide protects sunflower leaves against Cd-induced oxidative stress. Plant Sci. 169: 323-330.
23- Li, W., M.A. Khan, and S. Yamaguchi. 2007. Effects of  heavy metals on seed germination and early seedling  growth of Arabidopsis thaliana. Plant Growth Regul. 46: 45-65.
24-  Lipton, S.A., Ch. Yun-Beom, Z.H. Pan, S.Z. Lei, H.S. Vincent Chen, N.J. Sucher, J. Loscalzo, D.J. Singel, and J.S. Stamler. 1993. A redox based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitroso-compounds. Nature, 364: 626-632.
25- Mehta, S.K., and J.P. Gaur. 1999. Heavy-metalinduced proline accumulation and its role in ameliorating metal toxicity in Chlorella vulgaris. New Phytol. 143: 253-259.
26- Mihailovic, N., and G. Drazic. 2011. Incomplete alleviation of nickel toxicity in bean by nitric oxide supplementation. Plant Soil Environ. 57: 396–401.
27- Nector, G., and C.H. Foyer. 1998. Ascorbat and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 249-279.
28- Oliver, D., and R. Nadiv. 2003. Uptake of Cu, Pb, Cd, and DDT by vegetables grown in urbon environments. EPHC; 151-161.
29- Phang, I.C., D.W.M. Leung, H.H. Taylor, and D.J. Burritt. 2011. The protective effect of sodium nitroprusside (SNP) treatment on Arabidopsis thaliana seedlings exposed to toxic level of Pb is not linked to avoidance of Pb uptake. Ecotoxicol. Environ. Saf. 74: 1310–1315.
30- Sharma, P., and R.S. Dubey. 2004. Ascorbate peroxidase from rice seedling. Plant Sci. 167:541-550.
31- Siripornadulsil, S., S. Traina, D.S. Verma, and R.T. Sayre. 2002. Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae. Plant Cell. 14:2837-2847.
32- Tian, X. and Y. Lei, 2006. Nitric oxide treatment alleviates drought stress in wheat seedlings. Biol. Plant. 50, 775-778.
33- Uchida, A., A.T. Jagendorf, T. Hibino, T. Takabe, and T. Takabe. 2002. Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice. Plant Sci. 163: 515-523.
34- Wieczorek, J.F., G. Milczarek, M. Arasimowicz, and A. Ciszewski. 2006. Do nitric oxide donors mimic endogenous No-related response in plants? Planta. 224: 1363-1372.
35- Xiong, J., G. Fu, L. Tao, and C. Zhu, 2010. Roles of nitric oxide in alleviating heavy metal toxicity in plants. Arch. Biochem. Biophys. 497: 13–20.
36- Xiong, J., L. An, H. Lu, and C. Zhu, 2009. Exogenous nitric oxide enhances cadmium tolerance of rice by increasing pectin and hemicellulose contents in root cell wall. Planta. 230: 755–765.
37- Zanardo, D.I.L., F.M.L. Zanardo, M.D.L.L. Ferrarese, J.R. Magalhaes, and O.F. Filho. 2005. Nitric oxide affecting seed germination and peroxidase activity in canola (Brassica napus L.). Physiol. Mol. Biol. Plants. 11: 81-86.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 29، شماره 4
اسفند 1395
صفحه 775-782
  • تاریخ دریافت: 19 مهر 1393
  • تاریخ بازنگری: 14 بهمن 1393
  • تاریخ پذیرش: 23 اسفند 1393