نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

2 هیات علمی دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

3 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

چکیده

فیتوهورمون‌های اکسین و سیتوکینین در کنترل فرایند‌های متعدد و حیاتی از جمله رشد گیاه، نمو و تنظیم پاسخ به محرک‌های محیطی نقش موثری دارند. مشخص شده است که هر یک از هورمون‌های اکسین و سیتوکینین می‌تواند با تنظیم سطح دیگر بر فرآیند‌هایی همچون اندام‌زایی موثر ‌باشد. جداکشت‌های برگ در محیط MS حاوی 2 میلی گرم در لیتر هورمون BAP (بنزیل آمینو پورین) و محیط کشت MS حاوی 1 میلی گرم در لیتر هورمون NAA و 5/0 میلی گرم در لیتر هورمونKinetin به ترتیب به عنوان محیط ‌های القای باززایی و تولید کالوس قرار گرفتند. میزان هورمون‌های اکسین و سیتوکینین به ترتیب در ماه اول، دوم و سوم پس از باززایی در نوساقه‌‌ها و کالوس‌های نسل 1 اندازه‌گیری شد. نسبت‌ اکسین به سیتوکینین در بازه‌ زمانی سه ماه تغییر یافته بود که حاکی از اثرات سریع و ممانعت کننده اکسین در مراحل اولیه رشد بر سنتز و مقدار سیتوکینین بود. در حالی که اثرات ممانعت کننده‌ی سیتوکینین روی اکسین کند و احتمالا" از طریق تنظیم و تغییر دیگر فرایند‌های نموی صورت پذیرفت. همچنین میزان اکسین و سیتوکینین درکالوس‌ پایین‌تر از مقدار آن ‌در گیاه شاهد بود که با توجه به عدم تمایز یافتگی سلول‌های کالوس و وجود تنها یک منبع هورمونی قابل دسترس برای آن‌ها در مقایسه با شاهد توجیه کننده کاهش هورمونی مشاهده شده می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The studuy of Auxin and Cytokinin changes and somaclonal variation in regenerated plant and callus of tobacco (Nicotiana rustica L.)

نویسندگان [English]

  • Mohammad Amin Toghyani 1
  • ali aakbar Ehsanpour 2
  • mansoor shariati 2
  • rahman emamzadeh 3

1 Biology Dept., Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, I.R. of Iran

2 Biology Dept., Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, I.R. of Iran

3 Biology Dept., Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, I.R. of Iran

چکیده [English]

Auxin and cytokinin are two phytohormones which are effective for various vital processes such as plant growth, development and coordinating the responses to the environmental stimuli. It has been argued that these two phytohormones can affect the process of organogenesis by balancing each other's level. The MS medium including 2 mg/lit of BAP hormone and the MS culture medium including 1 mg/lit of NAA hormone and 0.05 mg/lit of Kenitine hormone were respectively used as media for regeneration and callus formation of the tobacco explants. The amounts of Auxin and cytokinin were estimated in the first, second and third months after regeneration in the new shoots and the first generation callus respectively. The results of the above analyses revealed the proportion of Auxin to cytokinin in the time span of three months and this proportion confirmed the quick and preventing effects of auxin in early stages of growth on synthesis and amount of cytokinin. However, the preventing effects of cytokinin on auxin are slow and are probably through managing and changing other developmental processes. In addition, the amount of auxin and cytokinin in callus was lower compared with the amount of it in the control plant. This can be due to the fact that the cells of the callus are not distinctive and are different from the cells of the leafs which have compartment and different sources for the synthesis of hormone, in fact, the only available hormonl source for calluses is the one provided in the culture medium.

کلیدواژه‌ها [English]

  • : Auxin
  • Cytokinin
  • Plant regeneration
  • Callus
  • Nicotiana rustica

مطالعه تغییرات میزان هورمون‌های اکسین و سیتوکینین و تغییرات سوماکلونال در گیاهان باززایی شده و کالوس توتون (Nicotiana rustica L.) 

محمد امین طغیانی،  علی اکبر احسان‌پور*، منصور شریعتی و رحمان امام زاده

اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی 

تاریخ دریافت: 26/3/93                تاریخ پذیرش: 3/10/93

چکیده

فیتوهورمون­های اکسین و سیتوکینین در کنترل فرایند­های متعدد و حیاتی ازجمله رشد، نمو و تنظیم پاسخ به محرک­های محیطی گیاه نقش مؤثری دارند. مشخص شده است که هریک از هورمون­های اکسین و سیتوکینین می‌تواند با تنظیم میزان سطح دیگری، بر فرایند­هایی همانند اندام­زایی مؤثر ­باشد. در این مطالعه جداکشت­های برگ توتون در محیط MS حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر هورمون BAP (بنزیل آمینو پورین) و محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر هورمون NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر هورمونKinetin  به‌ترتیب به‌عنوان محیط‌های القای باززایی و تولید کالوس قرار گرفتند. میزان هورمون­های اکسین و سیتوکینین به‌ترتیب در ماه اول، دوم و سوم پس از باززایی در نوساقه­­ها و کالوس­های نسل 1 اندازه­گیری شد. نسبت­ اکسین به سیتوکینین در بازه­ زمانی سه ماه تغییر یافته بود که حاکی از اثرات سریع و ممانعت کننده اکسین در مراحل اولیه رشد بر سنتز و مقدار سیتوکینین بود. در حالی که اثرات ممانعت کننده­ سیتوکینین روی اکسین کند و احتمالا" از طریق تنظیم و تغییر دیگر فرایند­های نموی انجام شد. همچنین میزان اکسین و سیتوکینین در کالوس­ پایین­تر از مقدار آن ­در گیاه شاهد بود که با توجه به عدم تمایزیافتگی سلول­های کالوس و وجود تنها یک منبع هورمونی قابل دسترس برای آنها در مقایسه با شاهد توجیه کننده کاهش هورمونی مشاهده شده می­باشد. 

واژه­های کلیدی: اکسین، ، باززایی گیاه، تنباکو، سیتوکینین کالوس.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09131135520 ، پست الکترونیکی: ehsanpou@sci.ui.ac.ir  

مقدمه

 

حفظ حد مطلوب و بهینه اکسین در سلول و انتقال قطبی آن در گیاه برای شکل گیری الگوهای نموی، حیاتی و ضروری می باشد. همچنین همانند اکسین، سیتوکینین­ها نیز تنظیم کننده­های مهمی در رشد و نمو گیاهان به شمار می­آیند (14). به طور مشخص اکسین­ها و سیتوکینین­ها دارای وظایف مشخص و مهمی در رشد و نمو گیاه هستند و از آنجا که هر دو هورمون به عنوان تنظیم کننده رشد، قابلیت سنتز در بیشتر قسمت­های گیاه و داشتن وظیفه سیگنالینگ در فرایند نمو دارند، بنابراین از این جهت میانکنش اکسین و سیتو کینین در فرایند­های توسعه­ای و نمو بسیار مورد اهمیت است. به عنوان مثال برای شکل­گیری و حفظ مریستم­ها که بنیان کل پیکره گیاه را تشکیل می‌دهند، تعامل اکسین­ها و سیتوکینین­ها لازم است (14). به طور مثال شکل­گیری قسمت­های هوایی و بخش­های زیرزمینی گیاه به ترتیب از مریستم­های ساقه و مریستم­ها به وجود می­­آیند (16). اکسین­ها و سیتوکینین­ها در کنترل فرایند­های نموی همانند ایجاد چیرگی راسی در ریشه و ساقه، با یکدیگر تقابل و بر هم کنش­ دارند. تحقیقات اخیر در زمینه بیوشیمیایی و ژنتیکی تصدیق کرده­ است که میانکنش­های تداخلی و بر هم‌کنش­های سیگنالینگ بین اکسین و سیتوکینین برای تمایز یابی و حفظ مریستم گیاه لازم و ضروری می باشد (14). آزمایش های رایج دیگر نیز به خوبی نشان داده است که تعادل هورمونی بین اکسین و سیتوکینین عامل اصلی در کنترل اندام­زایی (Organogenesis) می­باشد (13). قرار دادن جدا کشت­های کالوس در معرض نسبت بالای اکسین به سیتوکینین منجر به شکل گیری ریشه و بعکس آن یعنی نسبت بالای سیتوکینین به اکسین باعث القای تشکیل نوساقه می­شود. پژوهش­های دیگر به وضوح بیانگر این امر است که هر یک از هورمون­های اکسین و سیتوکینین می­تواند سطح دیگری را تنظیم کند (7 و 12). بر اساس یافته‌های مشاهده شده از فنوتیپ­های موتانت و گیاهان تراریخت توتون که تولید بیش از معمول سیتوکینین در آنها القاء شده بود، مقدار IAA کاهش یافته بود. همچنین سنتز IAA زیاد در تنباکو ترانس ژن شده منجر به کاهش مخزن سیتوکینین گیاه می­شود (1، 4 و 7). با توجه به مشاهدات انجام شده وجود تعامل و یا تقابل در میان کنش این دو هورمون گیاهی با هم محتمل است و این فرضیه را بوجود می­آورد که شبکه­ای پیچیده­ از پیام­های میانکنشی بین اکسین و سیتوکینین وجود دارد (5 و12). این پژوهش سعی در مطالعه مقدماتی تغییرات این دو هورمون و تغییرات احتمالی سوماکلونال در هنگام باززایی، تشکیل کالوس و اثرات احتمالی هورمون­های محیط کشت روی غلظت­های داخلی اکسین و سیتوکینین در نوساقه­های باززایی شده دارد.

مواد و روشها

گیاه توتون (Nicotiana  rustica L.) گیاهی است علفی که به دلیل رشد سریع، تولید بذر فراوان و عدم نیاز به هزینه و تیمار‌های خاص برای رشد، مدلی مناسب برای مطالعات کشت بافت و فیزیولوژی گیاهیست. برای انجام تمام آزمایشهای مربوطه در این تحقیق از محیط کشت پایه MS استفاده شد (10) و 3 درصد حجم به وزن ساکارز و به طور جداگانه BAP به مقدار 2 میلی گرم در لیتر (برای القای باززایی) و NAA به مقدار 1 میلی گرم در لیتر به همراه 5/0 میلی گرم در لیتر Kinetin (برای القای تشکیل کالوس) افزوده شد و پس از مخلوط کردن، حجم نهایی با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد. سپس به کمک NaOH (N 1/0) و HCl (N 1/0) pH محیط کشت روی 8/5 تنظیم گردید و در آخر آگار (حدود 10 گرم) به محیط کشت اضافه گردید. این محیط کشت به شیشه­های 250 میلی لیتری منتقل و اتوکلاوه شد و بعد از خنک شدن آماده مصرف شد.

برای ایجاد سیستم باززایی (Regeneration) از جدا کشت­های (explant) برگ توتون که در ابعاد تقریبی 1 سانتی­متر مربع، تحت شرایط استریل برش زده شده بودند، استفاده شد. این جدا کشت­ها در محیط کشت­های MS حاوی 2 میلی گرم در لیتر هورمون BAP (بنزیل آمینو پورین) قرار گرفتند و به اتاق کشت منتقل شدند. شیشه‌ها در شرایط نور دوره‌ای 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت تقریبی 30 میکرومول فوتون بر ثانیه متر مربع نگهداری شدند. همچنین به منظور القای تشکیل کالوس جدا­کشت­های برگ توتون در محیط کشت MS حاوی 1 میلی گرم در لیتر هورمون NAA و 5/0 میلی گرم در لیتر هورمون Kinetin قرار گرفت. پس از قرار گرفتن جدا کشت­ها روی محیط کشت، نمونه­ها به اتاق کشت منتقل و در شرایط نور دوره‌ای 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت تقریبی 30 میکرومول فوتون برثانیه مترمربع نگهداری شدند.

سنجش سیتوکینین و اکسین: برای خالص سازی سیتوکین (زآتین) از روش اصلاح شده Unyayar و همکاران (1996) استفاده شد. همچنین برای تعیین سطح مقدار هورمون سیتوکنین آزاد سنجش از طریق اسپکتروفتومری مورد استفاده قرار گرفت. بدین‌منظور 5/0 گرم وزن تر گیاه توتون را توزین و با 15 میلی لیتر از محلول استخراج شامل متانول، کلروفروم، آمونیوم هیدروکسید (3: 5:12) مخلوط و در هاون ساییده شد. سپس به محلول همگن حاصل 6 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد و در ادامه فاز کلروفرم دور و فاز آبی برای تبخیر متانول روی هیتر منتقل شد. در ادامه فاز آبی روی pH 7 تنظیم گردید. سپس مقدار 4 میلی لیتر اتیلن استات به فاز آبی اضافه شد. فاز اتیلن استات به یک پتری دیش با قطر 15 سانتی متر منتقل و روی هیتر قرار داده شد تا به طور کامل تبخیر گردد. این کار سه مرتبه تکرار شد. سپس محتوای باقیمانده روی پتری را با 1 میلی لیتر  NaOHیک نرمال شستشو و در نهایت NaOH را جمع و به اپندورف انتقال داده شد. برای سنجش با اسپکتروفوتومتر طول موج 260 نانومتر تنظیم گردید. برای محاسبه مقدار هورمون­ها از منحنی استاندارد تهیه شده برای سیتوکینین استفاده و مقادیر بدست آمده برای سیتوکینین بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر ثبت شد.

برای استخراج اکسین (IAA) از روش اصلاح شده Mandal و همکاران استفاده شد (9). برای اندازه­گیری اکسین اندامهای هوایی، مقدار 25/0 گرم بافت تر نمونه­ها توزین و در 1 میلی­لیتر اتانول 80 درصد درون ‌هاون چینی ساییده تا محلولی همگن بدست آمد. محلول حاصل به درون اپندورف 5/1 میلی لیتری ریخته شد (بدلیل فتواکسیده شدن اکسین استخراج باید به دور از نور انجام بگیرد). محلول مذکور به مدت 24 ساعت در یک محیط تاریک آنکوبه گردید. بعد از طی این زمان محلول به مدت 25 دقیقه در دمای 77 درجه سانتی گراد درون بن­ماری قرار گرفت و در ادامه محلول به مدت 10 دقیقه در دور rpm 3000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی بعد از سانتریفیوژ جدا سازی شد و به درون لوله آزمایش انتقال یافت و درب لوله‌ها با ورقه آلومینیو‌می ‌پوشیده شد. سپس 8/0 میلی لیتر عصاره استخراج شده از ریشه یا اندام‌های هوایی در مرحله قبل درون یک لوله آزمایش ریخته شد. سپس 6/1 میلی لیتر معرف سالکوفسکی به هر لوله آزمایش اضافه گردید. لوله‌های آزمایش برای کامل شدن واکنش به مدت 15 دقیقه در بن ماری در دمای 50-40 درجه سانتی گراد قرار گرفت. با کامل شدن واکنش اکسیداسیون کمپلکس صورتی رنگی که نتیجه اکسید شدن IAA توسط کلرید فریک در حضور اسید پرکلریک است، تشکیل ‌شد.

پس از آماده شدن محلول‌ها جذب نمونه­ها در طول موج nm530 توسط دستگاه اسپکتروفتومتری تعیین شد. محلول بلانک  ml6/1 معرف سالکوفسکی با ml 8/0 الکل استفاده گردید. در نهایت مقدار اکسین بر حسب میکروگرم در گرم بافت گیاهی گزارش شد.

آنالیز­های PCR : به منظور بررسی احتمال وقوع تنوعات سوماکلونال از آزمایش PCR  با 10 پرایمر استفاده شد، که 5 عدد از پرایمرها RAPD و با ترتیب OPA18 ، OPA20، OPAA06 ، FPK101، FPK105 و 5 عدد دیگر مربوط به پرایمرهای ISSR  بود که شامل (AC)8CG ، (CAA)5 ، (AC)8TA ، (GATA)4 و (GACA)4 می­­شد. برای هر یک از نمونه­ها PCR در دو تکرار انجام شد. به منظور استخراج DNA ازCTAB  استفاده شد (6)، ابتدا 5/0 گرم از بافت گیاه با استفاده از دانه‌های کوچک شیشه­ای (Glass beed) در یک  تیوب 1 میلی لیتری سانتریفیوژ گردید. سپس به هر یک از تیوپ­ها 250 میکرو لیتر بافر  (16 ml EDTA 0.25M ,56 ml NaCl 5M ,20 ml Tris-Hcl ,4 g CTAB 2% ) DNA و 250 میکرولیتر از محلول ایزوآمیل الکل/کلروفوم و نمونه ها به مدت 12 دقیقه در دورrpm  13000 سانتریفیوژ شد و بعد حدود 140 میکرولیتر از محلول ایزوپروپانل سرد به آن افزوده و به مدت 7 دقیقه در دورrpm  13000 سانتریفیوژ گردید. رسوب حاصل با 1 میلی لیتر اتانول 70% شستشو داده شد و به مدت 5 دقیقه در دورrpm  13000 سانتریفوژ شد. رسوب DNA خشک گردید و بعد حدود 100 میکرولیتر آب مقطر استریل به آن اضافه شد.

واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام گردید و شامل مواد زیر بود:  0.2 µL Taq DNA polymerase و 2 µL dNTp 20 Mm و 2 µL PCR Buffer (lx) و 3 µL genomic  DNA و 1.5 µL primer(10 p moL) و 1.5 µL primer (10 p moL) و 0.8 µL Mgcl2 mM. شرایط انجام PCR در جدول شماره 1 آورده شده است و در نهایت محصول PCR با ژل 1 درصد آگارز با ولتاژ 100-80 ولت الکتروفورز گردید. در پایان الکتروفورز، باندهای DNA با استفاده از نور UV در دستگاه Gel Documentation مشاهده شد. آزمایش‌های PCR با استفاده از پرایمرهای نام برده شده در جدول شماره 2 با دو تکرار انجام گردید.

 

جدول1- مراحل انجام PCR

4 دقیقه

Cº94

دناتوره

1 دقیقه

Cº94

دناتوره

40 ثانیه

Cº35

اتصال

40 ثانیه

Cº72

طویل شدن

 

35

تعداد سیکل

 

 

جدول 2- کد و توالی پرایمرهای مورد استفاده در ISSR-PCR و RAPD-PCR

Primer Sequence 5 t o 3

RAPD     Primer code

Primer Sequence 5 to 3

ISSR  primer code

5–AGGTGAACCGT–3

OPA 18

5 –CAACAACAACAACAA–3

(CAA)5

5 – GTTGCGATCC – 3

OPA 20

5–CACACACACACACACTA– 3

(AC)8TA

5–GTGGGTGCCA–3

OPAA 06

5–GATAGATAGATAGATA-3

(GATA)4

5–ACACGGACGTCA–3

FPK101

5–GACAGACAGACAGACA–3

(GACA)4

5–ACTTGGCGGCCT–3

FPK105

5–ACACACACACACACACCG–3

(AC)8CG

 

 

اندازه­گیری تمامی شاخص­ها بر اساس یک طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید و برای تجزیه و تحلیل داده­ها از نرم افزار SPSS و آزمون ANOVA و پست هاک دانکن استفاده شد.

نتایج

در این مرحله از آزمایش‌ها همان طور که در قسمت مواد و روش­ها بدان اشاره شد، جداکشت­های برگ توتون در محیط MS حاوی BAP و محیط MS همرا Kinetin و NAA قرار گرفت. پس از گذشت 15 روز آثاری از ظهور کالوس­­های کوچک در لبه زخمی قطعات برگی مشاهده شد. از این کالوس­ها، نو­ساقه­هایی ظاهر شده که با رشد و ایجاد جوانه­های جانبی و برگ، در نهایت یک گیاه کامل باززایی و سیستم باززایی کامل شد. سپس در یک بازه زمانی 3 ماهه به ترتیب در ماه اول، دوم و سوم میزان محتوای هورمون­های سیتوکینین و اکسین در نو­ساقه­های باززایی شده اندازه‌گیری شد.

همچنین پس از گذشت یک هفته، در محیط کشت حاوی Kinetin و NAA در کناره لبه­ برگ­ها در تمام نمونه­ها (100%) کالوس­های کوچکی ­ظاهر شد که در ادامه تبدیل به یک توده بزرگ سفید رنگ کالوس گردید. واکشت­ کالوس­ها سه هفته بعد از قرار دادن جداکشت­ها روی محیط کشت انجام شد. بدین صورت که کالوس­های ایجاد شده روی پلیت­های استریل در زیر هود لامینار به قطعات کوچکتر تقسیم شده و به محیط تازه منتقل و در شرایط مشابه تولید کالوس نگهداری شدند. این کالوس­های نسل اول، 1 ماه پس از رشدشان از محیط کشت خارج و برای بررسی محتوای اکسین و سیتوکینین مورد استفاده قرار گرفتند.

بررسی محتوای هورمون­های رشد در اندام­های هوایی در گیاهان باززایی شده

بررسی محتوای هورمون سیتوکینین در اندام­ هوایی گیاهان باززایی شده: مقدار بالاترین درصد باززایی یعنی 100% در محیط MS حاوی 2 میلی گرم در لیتر BAP مشاهده شد. میزان محتوای سیتوکینین اندازه­گیری شده در اندام­های هوایی (مجموعه جوانه برگ و ساقه) نو­ساقه­های باززایی شده در یک بازه زمانی سه ماهه، افزایش معنی­داری را در سطوح سیتوکینین نشان داد (شکل A1). میزان سیتوکینین نو­ساقه­های 3 ماهه نسبت به نوساقه­های 2 و 1 ماهه، افزایش یافته بود. در نوساقه­های 60 روزه، سطح هورمون سیتوکینین در آنها نسبت به گیاهچه­های 30 روزه افزایش معنی­داری را نشان می­داد. همچنین بررسی انجام شده نشان داد که کمترین مقدار سیتوکینین در نوساقه­های 30 روزه وجود دارد.

بررسی محتوای هورمون اکسین در اندام­ هوایی گیاهان باززایی شده: اندازه­گیری میزان اکسین در نو­ساقه­های باززایی شده در طول سه ماه­، نشان از کاهش معنی­دار اکسین دارد (شکل B1). نوساقه­هایی که 30 روز از باززایی آنها گذشته بود نسبت به نوساقه­هایی با عمر 2 و 3 ماه، میزان محتوای اکسین آنها بالاتر بود. نو­ساقه­های 60 روزه نسبت به 90 روزه هم، افزایش میزان اکسین را نشان دادند اما نسبت به نوساقه­های 30 روزه، میزان اکسین کمتری داشتند. همانطور که ذکر شد نوساقه­هایی با عمر 3 ماه کمترین مقدار اکسین را نسبت به دو بازه زمانی دیگر نشان دادند.

بررسی محتوای هورمون­های رشد در کالوس­های تولید شده از برگ تنباکو

بررسی محتوای هورمون اکسین در کالوس: از آنجا که برای القای تولید کالوس نیاز به هورمون در محیط کشت است، ازاین‌رو تنها امکان مقایسه کالوس­­ها با برگ گیاه رشد یافته در محیط بدون هورمون (محیط  MS) به عنوان شاهد وجود داشت. علاوه بر این بدلیل عدم امکان بررسی تغییرات هورمون در بازه زمانی (نیاز به واکشت کالوس مرتب) امکان اندازه گیری تغییرات هورمون در بازه زمانی مناسب نیز بسیار کم است.

مقایسه میزان محتوای هورمون سیتوکینین و اکسین در کالوس­های تولید شده با گیاهان شاهد (برگ)، نشان داد که اختلافی معنی­داری در میزان سیتوکینین و اکسین این دو تیمار وجود دارد (شکل A2 و B2). البته مقدار اکسین اندازه‌گیری شده در کالوس­هایی که یک ماه از واکشت آنها می­گذشت، کاهش معنی­داری را نسبت به شاهد رشد یافته در محیط پایه MS نشان داد.

نوساقه­های باززایی شده و کالوس­های تولید شده در شکل 3 نشان داده شده است.

 

       
 

A

 
 

B

 

 

 


 

شکل1- محتوای هورمون سیتوکینین (A) و اکسین (B) در اندام­های هوایی در گیاهان باززایی شده

 داده­ها میانگین 3 تکرار ±SD  و حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار  (P≤ 0.05) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

 
   

 

 


 

شکل 2- بررسی محتوای هورمون سیتوکینین (A) و اکسین (B) در کالوس و گیاه شاهد

 داده­ها میانگین 3 تکرار ±SD  و حروف نامشابه نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار  (P≤ 0.05) بر اساس آزمون دانکن می­باشد.

 

شکل 3- رشد کالوس­ و مراحل باززایی نوساقه­های توتون

 

در این تحقیق به منظور بررسی این احتمال که، در گیاهان باززایی شده تنوعات سوماکلونال به وقوع پیوسته و موجب ایجاد تغییرات ژنتیکی شده باشد، الگوی ژنی­ گیاهان باززایی شده با استفاده از ده نوع پرایمر تصادفی در دو تکرار مورد بررسی قرار گرفت و با گیاهان غیر باززایی شده مقایسه شد (شکل4). نتایج نشان داد که الگوی باند­های حاصل از PCR نوساقه­های باززایی شده با شاهد (گیاه رشد کرده در محیطMS ) تفاوت سه باند را در محدوده350و 550 و 900 bp تنها با استفاده از پرایمر FPK101 نشان داد که این امر بیانگر وقوع احتمالی تغییر در الگوی DNA بین گیاه شاهد و گیاه باززایی شده می باشد. قابل ذکر است از کلیه پرایمر های استفاده شده در این پژوهش تنها FPK101 توانست تغییراتی را در الگوی DNA گیاه شاهد در مقایسه با گیاه باززایی شده نشان دهد. مقایسه الگوی DNA در کالوس و گیاه شاهد نیز تغییری را نشان نداد.

 

شکل 4-  نتایج آنالیز  RAPD-PCR، باندهای تکثیر شده در گیاهان شاهد و باززایی شده (M: مارکر، C: شاهد، R: باززایی شده) با استفاده از  پرایمر FPK101

فلش تغییر باند حدود 350، 700 و 950 bp  را در گیاه شاهد در مقایسه با گیاه باززایی شده نشان می­دهد.

بحث

اکسین­ها و سیتوکینین­ها در کنترل بسیاری از فرایند­های اصلی در نمو همانند ایجاد چیرگی راسی در ریشه و ساقه، با یکدیگر تقابل و بر هم کنش­ دارند. پژوهش­های انجام شده در این زمینه بوضوح بیانگر این امر است که هر یک از هورمون­های اکسین و سیتوکینین می­تواند سطح دیگر را تنظیم کند.

نتایج به دست آمده از اندازه­گیری محتوای اکسین و سیتوکینین در گیاهان باززایی شده در طول یک بازه زمانی سه ماهه احتمالا نشان دهنده اثرات متقابل این دو هورمون بر هم می­باشد. بدیهی است تغییرات مشاهده شده در گیاه می‌تواند منشأهای دیگری مانند فرایندهای متابولیسمی و فیزیولوژیکی نظیر فتوسنتز نیز باشد. مقدار سیتوکینین اندازه­گیری شده در ماه اول نسبت به اکسین اندازه­گیری شده در همان ماه، ناچیز و کم بوده و با گذشت زمان در ماه‌های دوم و سوم میزان سیتوکینین افزایش و کاهش اکسین اتفاق افتاد، به طوری که در ماه سوم نسبت اکسین به سیتوکینین به طور معنی­داری کاهش یافته بود. در این باره مشخص شده است که سطوح سیتوکینین فعال می تواند از طریق کاهش سنتز، تبدیل به فرم پیوسته و یا آنزیم­های اکسیداتیو تقلیل یابد و القای آنزیم سیتوکینین اکسیداز توسط اکسین در جدا کشت­های تنباکو توسط اکسین به خوبی در پژوهش Kaminek و نشان داده شده است (8 و 15). از طرفی دیگر سیتوکینین­ها می­توانند با تبدیل به فرم پیوسته نیز غیر فعال شوند. این پیوستگی می­تواند بوسیله IAA و یا فرم­های متصل شده­ IAA القا شود (3). این گزارش‌ها می­تواند نسبت هورمون اکسین و سیتوکینین را در ماه اول تفسیر کند. با توجه به اینکه نوساقه­ها در ماه اول فاقد ریشه بوده و ریشه­ها از مکان­های اصلی سنتز سیتوکینین هستند، از این رو ممکن است نسبت بالای اکسین به سیتوکینین به دلیل عدم تمایز کامل ریشه باشد. 

در مورد اثر سیتوکینین بر روی اکسین، گزارش شده است که سیتوکینین می­تواند هم اثر ممانعتی و هم اثر افزایشی بر مقدار اکسین داشته باشد (1، 2 و 3) و به نظر می­رسد که سیتوکینین از طریق ممانعت فعالیت آنزیم­های شرکت‌کننده در تشکیل فرم پیوسته اکسین، باعث افزایش میزان اکسین فعال و آزاد ­شود (17). این گزارش با نتایج بدست آمده از این تحقیق مطابقت داشته و می­تواند به این علت باشد که چون در محیط کشت سیتوکینین وجود دارد، توجیحی باشد برای افزایش محتوای اکسین در ماه اول. از طرف دیگر مطالعات انجام شده توسط Eklof   و همکاران (2000) نشان داد که در گیاهان تراریخت با خصوصیت افزایش سنتز سیتوکینین، محتوای اکسین در کل پیکره کاهش می یابد که این یافته با نتایج پژوهش حاصل در تضاد است. این تضاد موجود در نتایج، پیچیدگی موجود در میانکنش بین این دو هورمون را نشان می­دهد و به نظر می­رسد سیتوکینین القای سنتز IAA را فقط در برگ­های جوان و در حال توسعه افزایش می­دهد و به نظر می­رسد تنها راه پاسخ گویی به اثر متضاد سیتوکینین روی اکسین مطالعه محتوای هورمونی بلافاصله بعد از تغییر در محتوای یکی از این دو هورمون ­باشد.

بر اساس یافته­های Nordstrom و همکاران، (2004) اکسین از طریق مسیر مستقل از ایزوپنتیل ­آدنوزین-5- منو فسفات (اولین حد واسط تولید شده در مسیر بیوسنتز سیتوکینین)، یک اثر تعدیل کننده منفی روی میزان سیتوکینین دارد اما اثرات سیتوکینین بر میزان محتوای اکسین در کل پیکره گیاه آهسته می­باشد. این امر نشان می‌دهد که به احتمال زیاد سیتوکینین از طریق تغییر تعدادی از فرایند­های رشد و نمو می­تواند بر محتوای اکسین تأثیرگذار باشد. با توجه به این یافته­ها می­توان نتایج حاصل از  این پژوهش را بدین گونه تفسیر کرد که احتمالا" در مراحل اولیه ایجاد نو­ساقه­ها، اکسین موجب کاهش تولید و یا القای متصل شدن سیتوکینین در برگ­های راسی شده است. با این حال با گذشت مدت زمان باززایی و با توجه به اینکه در محیط کشت فقط سیتوکینین وجود داشت، احتمالا" به مرور زمان سیتوکینین جذب شده به همراه سیتوکینین تولید شده در خود نو­ساقه­ها و ریشه­های ایجاد شده، باعث ایجاد اثرات کاهشی در محتوای اکسین شده و مقدار اکسین آزاد را در ماه سوم کاهش داده است.

در این تحقیق همچنین میزان محتوای هورمون­های اکسین و سیتوکینین در کالوس­های حاصل از جداکشت­های برگ ­تنباکو نیز سنجش و با محتوای هورمونی برگ­های راسی توتون که در محیط MS رشد یافته بودند (به عنوان شاهد)، مقایسه شد. نتایج به دست آمده حاکی از آن بود که محتوای هورمونی انداز­ه­گیری شده در کالوس­ها پایین­تر از مقدار آن در گیاهان شاهد است. این امر می­تواند به این دلیل باشد که سلول­های کالوس به‌علت اینکه فاقد تمایز می­باشند، با ماهیت سلول­های برگ که دارای کلروپلاست و سیستم هدایت آوندی بوده و قسمت­های هوایی را مرتبط با سیستم ریشه­ای می­کند، متفاوت می­باشد. بعلاوه گیاهان شاهد دارای چند منبع متفاوت برای سنتز هورمون می­باشد، در حالی که کالوس­ها فاقد اندامک­ و اندام­هایی هستند که عنوان مکان­های اصلی سنتز هورمون اکسین و سیتوکینین می­باشند و اساسا" تنها منبع دسترسی کالوس­ها به هورمون، همان نسبت­های هورمونی­ موجود در محیط کشت است که در مقایسه با منابع سنتز کننده هورمون­ها و عدم وجود سیستم جذب کننده و هدایتی، مقدار هورمون­های مذکور را در کالوس کمتر می­کند (11).

تغییرات ژنتیکی بین نسل­های گیاهان جدید می­تواند منجر به ایجاد تغییر در بیان ژن­ها و احتمالا ژن­هایی که در سنتز و متابولیسم هورمون­های اکسین و سیتوکینین دخالت دارند، شده باشد، در نتیجه باعث تغییر در میزان نسبت هورمون­های اندازه­گیری شده بشود. در این مطالعه اگرچه تغییر یک باند DNA در گیاه باززایی شده پس از تکثیر توسط پرایمر FPK101 مشاهده شد ولی اینکه چنین تغییری مربوط به ژن های مسیر سنتز سیتوکینین و یا اکسین است بدون انجام آزمایشهای دقیق تکمیلی غیرممکن است.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان بدلیل حمایت از انجام این پژوهش تشکر می‌کنند.

  1. Binns, A. N., Labriola, J. and  Black R. C. 1987.  Initiation of auxin autonomy in Nicotiana glutinosa cells by the cytokinin-biosynthesis gene from Agrobacterium tumefaciens. Planta.171(4), 539-548.
  2. Bourquin, M. and Pilet, P. E. 1990. Effect of zeatin on the growth and indolyl‐3‐acetic acid and abscisic acid levels in maize roots. Physiologia Plantarum. 80(3), 342-349.
  3. Brzobohatý ,  B.,  Moore,  I. and Palme,  K. 1994. Cytokinin metabolism: implications for regulation of plant growth and development. In Signals and Signal Transduction Pathways in Plants, pp.  247-261. Springer.
  4. Catterou, M.,  Dubois,  F.,  Smets,  R., Vaniet,  S.,  Kichey, T., Van Onckelen, H., Sangwan‐Norreel B. S. and Sangwan, R. S. 2002. hoc: an Arabidopsis mutant overproducing Cytokinins and expressing high in vitro organogenic capacity. The Plant Journal. 30(3), 273-287.
  5. Coenen, C. and  Lomax, T.  L. 1997. Auxin—cytokinin interactions in higher plants: old problems and new tools. Trends in plant Science. 2(9), 351-356.
  6. Ehsanpour, A. A. and Twell, D. 2005. Analysis of SFL1 and SFL2 promotor region in Arabidopsis thaliana using gateway cloning system. Journal of Science. 16, 303-309.
  7. Eklöf,  S.,  Åstot,  C., Sitbon , F.,  Moritz,  T., Olsson,  O. and  Sandberg , G. 2000. Transgenic tobacco plants co‐expressing Agrobacterium iaa and ipt genes have wild‐type hormone levels but display both auxin‐and cytokinin‐overproducing phenotypes. The Plant Journal. 23(2), 279-284.
  8. Kaminek , M., Motyka, V. and  Vaňková,  R. 1997. Regulation of cytokinin content in plant cells. Physiologia Plantarum. 101(4), 689-700.
  9. Mandal,  S.  M., Mondal,  K. C., Dey, S. and Pati, B. R. 2007. Optimization of Cultural and Nutritional Conditions for Indole 3-acetic Acid (IAA) Production by a Rhizobium sp. Isolated from Root Nodules of Vigna mungo (L.) Hepper. Research Journal of Microbiology. 2(239-246).
  10. Murashige , T. and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15(3), 473-497.
  11. Nordström,  A., Tarkowski,  P., Tarkowska , D., Norbaek,  R.,  Åstot,  C.,  Dolezal, K. and Sandberg, G. 2004. Auxin regulation of cytokinin biosynthesis in Arabidopsis thaliana: a factor of potential importance for auxin–cytokinin-regulated development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.101(21), 8039-8044.
  12. Palni , L., Burch,  L. and Horgan,  R. 1988. The effect of auxin concentration on cytokinin stability and metabolism. Planta. 174(2), 231-234.
  13. Skoog F. and Miller C. 1957. The biological action of growth substances. Proceedings of the Symp. Experimental Biology. 11(2), 118-131.
  14. Su, Y. H., Liu, Y. B. and Zhang, X. S. 2011. Auxin–cytokinin interaction regulates meristem development. Molecular plant. 4(4), 616-625.
  15. Zhang, R., Zhang, X., Wang, J., Letham, D., McKinney, S. and Higgins, T. 1995. The effect of auxin on cytokinin levels and metabolism in transgenic tobacco tissue expressing an ipt gene. Planta. 196(1), 84-94.
  16. Zhao, Z., Andersen, s., Ljung, K., Dolezal, K., Miotk, A., Schultheiss, S. J. and Lohmann, J. U. 2010. Hormonal control of the shoot stem-cell niche. Nature. 465, 1089-1092.
  17. Yip W.K. and Yang S. F. 1986. Effect of thidiazuron, a cytokinin-active urea derivative, in cytokinin-dependent ethylene production systems. Plant physiology. 80(2), 515-519.