نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشگاه محقق اردبیلی

2 هیات علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات- دانشکده علوم کشاورزی- دانشگاه محقق اردبیلی

3 هیات علمی دانشگاه محقق اردبیلی

چکیده

توتون Nicotiana tabacum L.) از چندین دهه گذشته به عنوان یک گیاه مدل برای کشت بافت و مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این پژوهش، اثر امواج فراصوت بر زنده‌مانی و شکست سلول‌های توتون مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، ریزنمونه‌های برگ گیاه توتون در محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D و یک میلی‌گرم بر لیتر کینتین کشت داده شد تا کالوس تولید کنند. کشت سوسپانسیون سلولی از طریق انتقال کالوس‌های حاصل از ریزنمونه برگ به محیط کشت مایع ایجاد شد. سپس سوسپانسیون سلولی در معرض امواج فراصوت در دما و زمان‌های مختلف قرار گرفته و درصد زنده‌مانی سلول‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی تریپان بلو و تغییرات ساختار و فراساختاری سلول‌ها توسط میکروسکوپ نوری و الکترونی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که با افزایش مدت زمان تیمار با امواج فراصوت و همچنین دمای اعمال تیمار، درصد زنده‌مانی سلول‌ها به طور معنی‌داری کاهش یافت. بیشترین سطح زنده‌مانی سلول‌ها در دمای 40 درجه سانتی‌گراد و دو دقیقه امواج فراصوت (702/76 درصد) و دمای 25 درجه سانتی‌گراد و زمان دو دقیقه امواج فراصوت (67/75 درصد) بوده است. بیشترین شکست سلولی به ترتیب مربوط به دمای 50 درجه سانتی‌گراد و 14 دقیقه امواج فراصوت (733/18 درصد) و دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 20 دقیقه اعمال امواج فراصوت (48/17 درصد) بود. میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) ایجاد حفرات با اندازه مختلف در دیواره سلول بر اثر اعمال امواج فراصوت را نشان داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of ultrasound on cell viability of tobacco cells

نویسنده [English]

  • Nasser Zare 2

2 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Mohaghegh Ardabili

چکیده [English]

Tobacco (Nicotianatabacum L.) is known as a model plant in tissue culture and genetic engineering from the past decades. In this study the effect of ultrasonic waves on viability and disruption of tobacco cells were investigated. For callus induction, tobacco leaf explants cultured on MS medium supplemented with 2,4-D 1.5 mg/l and 1 mg/l Kinetin. The cell suspension culture was initiated by transferring of calli into liquid medium. Then the cell suspensions exposed to ultrasonic wave with different levels of temperature and duration. Cell viability was determined by Trypan blue staining, and structural and ultra-structural disruptions in cell wall were evaluated using optical and scanning electron microscopy (SEM). The results showed that the viability of cells significantly influenced by temperature and duration of ultrasonic wave treatments. The highest cell viability (%76.702) was obtained with 2 min sonication at 25 or 40 °C, while, the highest cell wall disruption were observed at 50° C with 14 min sonication (% 18.733) and at 25° C with 20 min of ultrasonic treatment (% 17.48). Scanning electron microscopy (SEM) was confirmed the formation of different sized pores on cell wall under ultrasound treatment.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cell Viability
  • Nicotiana tabacum L
  • Suspension culture
  • Ultrasonic Waves

تأثیر امواج فراصوت بر زنده­مانی سلول­های توتون

لیلا کوهی، ناصر زارع*، امین امانی و پریسا شیخ‌زاده مصدق

اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 31/2/93                تاریخ پذیرش: 17/12/93 

چکیده

توتون Nicotiana tabacum L.)) از چندین دهه گذشته به‌عنوان یک گیاه مدل برای کشت بافت و مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار می­گیرد. در این پژوهش، اثر امواج فراصوت بر زنده­مانی و شکست سلول­های توتون مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین‌منظور، ریزنمونه­های برگ گیاه توتون در محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم بر لیتر کینتین کشت داده شد، تا کالوس تولید کنند. کشت سوسپانسیون سلولی از طریق انتقال کالوس­های حاصل از ریزنمونه برگ به محیط کشت مایع ایجاد شد. سپس سوسپانسیون سلولی در معرض امواج فراصوت در دما و زمان­های مختلف قرار گرفته و درصد زنده­مانی سلول­ها با استفاده از رنگ­آمیزی تریپان‌بلو و تغییرات ساختار و فراساختاری سلول­ها توسط میکروسکوپ نوری و الکترونی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد با افزایش مدت زمان تیمار با امواج فراصوت و همچنین دمای اعمال تیمار، درصد زنده‌مانی سلول­ها به طور معنی­داری کاهش یافت. بیشترین سطح زنده­مانی سلول­ها در دمای 40 درجه سانتی­گراد و دو دقیقه امواج فراصوت (702/76 درصد) و دمای 25 درجه سانتی­گراد و زمان دو دقیقه امواج فراصوت (67/75 درصد) بوده است. بیشترین شکست سلولی به‌ترتیب مربوط به دمای 50 درجه سانتی­گراد و 14 دقیقه امواج فراصوت (733/18 درصد) و دمای 25 درجه سانتی­گراد و 20 دقیقه اعمال امواج فراصوت (48/17 درصد) بود. میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) ایجاد حفرات با اندازه مختلف در دیواره سلول را بر اثر اعمال امواج فراصوت نشان داد.  

واژه‌های کلیدی: اولتراسوند، کشت سوسپانسیون، میکروسکوپ الکترونی،  Nicotiana tabacum L. 

* نویسنده مسئول، تلفن: 33510140-045 ، پست الکترونیکی : zarenasser@yahoo.com

مقدمه

 

توتون (Nicotiana tabacum L.) یکی از محصولات با ارزش کشاورزی و صنعتی است، که در شرایط مختلف آب و هوایی در بیش از صد کشور دنیا کشت شده و در اقتصاد بعضی از آنها اهمیت بسزایی دارد (34). سطح زیر کشت توتون در دنیا 77/4 میلیون هکتار، تولید سالانه 1/7 میلیون تن (وزن تر) و عملکرد آن در کشورهای در حال توسعه 6/1 تن در هکتار و در کشورهای توسعه یافته 2/2 تن در هکتار است (25). بیش از چند دهه است که از این گیاه به عنوان یک سیستم مدل برای کشت بافت و مهندسی ژنتیک استفاده می­شود. دلایل استفاده از این گیاه به عنوان یک سیستم مدل به دلیل رشد سریع، خودگشن بودن، تولید بذر فراوان و عدم نیاز به هزینه و تیمارهای خاص برای رشد است. همچنین در سال­های اخیر از این گیاه برای بررسی انتقال ژن­ها و مطالعه عوامل مؤثر در انتقال ژن استفاده شده است (1 و 5). این گیاه به دلیل تولید بیوماس بالا کاربردهای بیشتری در زمینه تولید مواد با ارزش مختلف با استفاده از انتقال ژن به گیاه دارد (8). 

امواج فراصوت دسته­ای از موج­های مکانیکی هستند که بسامد آن بیش از 20 هزار هرتز است. در این تقسیم­بندی، بسامد امواج صوتی بین 20 تا 20 هزار هرتز بوده و امواجی که بسامد آنها کمتر از 20 هرتز باشد، امواج فروصوت نامیده می­شوند (29). امروزه امواج فراصوت در زمینه­های مختلف ازجمله پزشکی، صنعتی، شیمی، بیولوژی، کشاورزی و غیره دارای کاربردهای فراوانی می­باشند.

امواج فراصوت با شدت زیاد برای ترکیبات زیستی مخرب بوده‌، غشای سلول­ها را تخریب کرده و مولکول‌های زیستی مانند آنزیم­ها و DNA را غیرفعال می­سازد (11). بررسی­هایی در زمینه استفاده از امواج فراصوت در غیر­فعال­سازی آنزیم­ها گزارش شده­اند (22 و 26). مکانیسم تخریبی این امواج روی آنزیم­ها از طریق ایجاد کاویتاسیون (Cavitation) و انفجار حباب­ها و تشکیل نقاط داغ میکروسکوپی با حرارت حدود 5000 درجه کلوین و فشار 500 بار است. در این شرایط مولکول­های آب سونولیز شده و رادیکال­های آزاد تولید می‌شوند که خاصیت اکسید­کنندگی و واکنش­دهندگی بسیار زیادی با ترکیبات مختلف ازجمله پروتئین­ها و آنزیم­ها را دارند (12 و 33). علاوه بر این، ارتعاش دیواره حباب­ها و انفجار آنها در میدان کاویتاسیون نیز تنش برشی زیادی را  در محیط اطراف ایجاد می­کند که می­تواند حتی پیوند­های کووالانسی را شکسته و مولکول­های پلیمری ا جمله پروتئین­ها و آنزیم­ها را تخریب کند (7 و 13).

از طرف دیگر، نشان داده شده که امواج فراصوت با شدت و انرژی کم، طیفی از تأثیرات زیستی غیرکُشنده داشته که از اهمیت بالقوه­ای در بیوتکنولوژی برخوردار است. یکی از گسترده­ترین آثار غیر­مخرب این امواج روی سلول­های زنده، افزایش نفوذ­پذیری غشا است که جذب ترکیبات خارجی و دفع فراورده­های درون سلولی توسط سلول­ها را افزایش می­دهد. علاوه بر این، از امواج فراصوت به عنوان محرک واکنش­های آنزیمی و به‌ویژه متابولیت­های ثانویه، بیوسنتز در سلول­ها و پروتوپلاست­های گیاهی استفاده شده است (16 و 37). بیشتر محققان به روش ترانسفورماسیون با واسطه اگروباکتریوم و با کمک سونیکاسیون (SAAT) در سلول­ها یا بافت­های گیاهی تمرکز می­کنند (21). اخیرا روش­های اولتراسونیک پتانسیل قابل ملاحظه­ای را برای معرفی ماکرومولکول­ها یا DNA به داخل سلول­ها داشته­اند (38). اگر سونیکیشن برای تسهیل جذب به کار رود، مهم است که شرایط برای جذب بدون ایجاد آسیب به سلول­ها بهینه‌سازی شود. ثابت شده است که تابش اولتراسوند ملایم و خفیف یک روش مؤثر برای ترانسفکشن در سلول­ها و بافت­های حیوانی در شرایط In vitro و In vivo می­باشد (4، 14و 23). لیو و همکاران (2005) ترانسفکشن سلول­های HeLa-S3 را در شرایط In vitro با 10، 20 و 30% در معرض اولتراسوند قرار دادند و دریافتند که بهینه کارایی ترانسفکشن (8/0 درصد) در حدود 8/3 ثانیه است که در معرض مؤثر اولتراسوند قرار می­گیرد (20).

استخراج به کمک امواج فراصوت یکی از مهمترین روش­های استحصال ترکیبات ارزشمند از منابع گیاهی است (35) که در مقیاس بزرگ و کوچک (صنعتی و آزمایشگاه) قابل اجرا می­باشد (36). در مقایسه با سایر روش­های استخراج ازجمله استخراج بر پایه مایکروویو، استفاده از امواج فراصوت ارزان­تر بوده و کاربرد آنها ساده­تر است (6). بنابراین، این تحقیق به منظور مطالعه تأثیر امواج فراصوت بر دیواره سلولی و زنده­مانی سلول­های توتون انجام شد تا بتوان محدوده زمانی مناسب برای استفاده از آن در تقویت انتقال DNA به سلول و همچنین استخراج متابولیت­های ثانویه از سلول­های توتون را انتخاب کرد.

مواد و روشها

آماده­سازی گیاهچه­ها برای تهیه ریزنمونه: بذرهای رقمComestock  توتون پس از شستشو با آب مقطر، به مدت 30 ثانیه در الکل 70% غوطه­ور شده و پس از آبکشی توسط آب مقطر استریل، به مدت 15 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 1% ضدعفونی شدند. بذرها پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل، توسط دستمال کاغذی استریل شده خشک و در ظروف شیشه­ای حاوی محیط کشت MS (24) جامد کشت شدند. کشت­ها در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجه سانتی­گراد و تناوب نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی با نور فلورسنت نگهداری شدند (3).

تهیه و کشت ریزنمونه : به‌منظور تهیه کالوس، از جداکشت برگ گیا­هان رشد کرده در شرایط درون شیشه­ای استفاده شد که روی محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم بر لیتر کینتین در ظروف پتری کشت شدند. کشت­ها در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجه سانتی­گراد نگهداری و هر چهار هفته یکبار زیرکشت برده شدند.

تهیه سوسپانسیون سلولی و تیمار با امواج فراصوت : برای ایجاد کشت سوسپانسیون، کالوس­های ترد و نرم به 20 میلی­لیتر محیط کشت MS مایع حاوی 5/1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم بر لیتر کینتین منتقل شده و روی شیکر با دور  RPM130 و دمای 2±25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. پس از استقرار کشت سوسپانسیون، هر هفت روز یکبار به صورت 1:1 با محیط کشت MS حاوی ترکیبات هورمونی مذکور زیرکشت گردید. همزمان با تکان دادن کشت­ها، به تدریج سلول­های کالوس از هم تفکیک و در داخل محیط کشت رها شده و تکثیر شدند. با افزایش تراکم سلولی و در مرحله تصاعدی رشد، زیرکشت انجام شد. پس از زیرکشت­های متوالی محیطی کاملاً رقیق به دست آمد که حاوی تک سلول­ها و توده­های چند سلولی کوچک­ گیاه توتون بود.

برای تیمار سلول­ها از حمام فراصوت BANDELIN SONOREX DIGITEC با حداکثر خروجی 35 هرتز استفاده شد. این دستگاه دارای فرکانس خودکار و زمان و دمای قابل تنظیم می­باشد که تأثیر هریک از این دو متغیر بر درصد زنده­مانی و شکست سلول مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش تأثیر عامل دما در چهار سطح 25، 40، 50 و 60 درجه سانتی­گراد و عامل مدت زمان تیمار با امواج فراصوت در چهار سطح 2، 8، 14 و 20 دقیقه بر تغییر ساختار دیواره سلولی و زنده­مانی سلول­های توتون مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور میزان دو میلی­لیتر از سوسپانسیون سلولی دارای غلظت یکسان سلولی برای هر نمونه استفاده شد و بعد از تیمار با اولتراسوند تغییر ساختار مورفولوژیکی، درصد زنده­مانی و شکست سلول هریک از تیمارها مورد بررسی قرار گرفت (31). همچنین زنده­مانی سلول­ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و بدون اعمال امواج فراصوت نیز به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت.

درصد زنده­مانی پس از رنگ­آمیزی توسط شمارش سلول­ها و یا روش اسپکتروفتومتری مشخص می‌شود. با توجه به اینکه در این گونه ‌آزمایش‌ها، اسپکتروفتومتری به دلیل شکست سلول و خروج رنگ در اثر شستشو معیار دقیقی از زنده­مانی سلول­ها را نشان نمی­دهد (18)، برای بررسی زنده مانی سلولی از روش رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو استفاده شد. تریپان­بلو ترکیب رنگی است که از غشای آسیب دیده­ سلول عبور کرده و سلول­های مرده را رنگ آمیزی می­کند (شکل 2). به منظور آزمون زنده­مانی، ابتدا محلول تریپان‌بلوی چهار درصد با حل کردن در بافر فسفات و عبور از فیلتر 22/0 میکرومتر تهیه شد. آنگاه 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با 100 میکرولیتر از محلول تریپان­بلو چهار درصد مخلوط شده و به مدت پنج دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد (31). سپس 10 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی فوق بر روی صفحه مشبک لام هموسایتومتر قرار داده شد و سلول­های زنده (به رنگ روشن) و مرده (آبی رنگ) و همچنین تعداد سلول­های دارای شکست­های قابل مشاهده با میکروسکوپ نوری مورد شمارش قرار گرفت.

تهیه نمونه میکروسکوپ الکترونی نگاره به‌منظور مطالعه دیواره سلولی: ابتدا یک میلی­لیتر از سوسپانسیون سلولی توسط بافر فسفات مورد شستشو قرار گرفت، سپس طی مراحل زیر برای مشاهده توسط میکروسکوپ الکترونی آماده شد:

تثبیت سلول­ها به طور شبانه توسط گلوتارآلدئید 3 درصد

در دمای 0 تا 4 درجه انجام شد و بعد شستشوی سلول­ها توسط بافر فسفات سه مرتبه و هر بار 10 دقیقه طول کشید. تثبیت مجدد سلول­ها توسط تتراکسید اسمیم 2 درصد به مدت 4 ساعت و شستشوی مجدد سلول­ها توسط بافر فسفات سه مرتبه هر بار به مدت 10 دقیقه انجام شد. آبگیری سلول­ها به ترتیب توسط اتانول 30 درصد، 50 درصد، 70 درصد، 80 درصد، 90 درصد، 96 درصد، 100 درصد و استون (دو مرتبه) هریک به مدت 10 دقیقه و خشک کردن نقطه بحرانی نمونه، توسط فریزدراینگ انجام گردید.

تجزیه  و  تحلیل  آماری  :  محاسبات  آماری  و  تجزیه

واریانس داده­ها با استفاده از نرم افزارهایSPSS 16.0  و MSTATC انجام شد. مقایسه میانگین­ها نیز با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال 5% انجام گردید.

نتایج

جداکشت­های برگ کشت شده در محیط کشت حاوی تنظیم­کننده­های رشد 2,4-D (5/1 میلی­گرم بر لیتر) و کینتین (یک میلی­گرم بر لیتر) بعد از گذشت یک تا دو هفته متورم شده و شروع به تولید کالوس کردند (شکل 1). 


 

شکل 1- کشت درون­شیشه­ای توتون: الف) گیاهچه حاصل از بذر کشت شده در محیط کشت پایه MS؛ ب) کالوس‌زایی جداکشت برگ روی محیط کشت MS حاوی 5/1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و یک میلی­گرم بر لیتر کینتین

تأثیر امواج فراصوت بر زنده­مانی سلول­ها: نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر دما و مدت زمان تیمار با امواج فراصوت و اثر متقابل دما × زمان در سطح احتمال یک درصد بر زنده­مانی سلول­های توتون معنی­دار بوده است (جدول 1). زنده­مانی سلول­ها در دمای اتاق و بدون اعمال امواج فراصوت 100 درصد بود. بیشترین سطح زنده­مانی سلول­ها در تیمار دمای 40 درجه سانتی­گراد و دو دقیقه امواج فراصوت (702/76 درصد) و تیمار دمای 25 درجه سانتی­گراد و دو دقیقه امواج فراصوت (67/75 درصد) ثبت شد (شکل 3).

 

شکل 2- نمایی از سلول­های روشن (زنده) و آبی (مرده) توتون رنگ شده با تریپان­بلو در زیر میکروسکوپ نوری (فلش‌ها نشان­دهنده سلول­های مرده می­باشند)

جدول1- تجزیه واریانس تأثیر امواج فراصوت بر درصد زنده­مانی و درصد شکست سلول­های سوسپانسیون سلولی توتون

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد زنده­مانی سلولی

درصد شکست سلولی

دما

3

** 50/5788

** 15/116

زمان

3

** 90/8159

** 82/255

دما × زمان

9

** 67/364

** 41/60

خطا

48

81/98

98/16

درصد ضریب تغییرات

 

64/31%

11/60%

 **: معنی‌داری در سطح احتمال 1 درصد

 

         

 

شکل 3- تأثیر دما و مدت زمان­های مختلف تیمار با امواج فراصوت بر درصد زنده­مانی سلول­های کشت سوسپانسیون توتون


تأثیر امواج فراصوت بر شکست دیواره سلولی: تعیین درصد شکست سلول از طریق شمارش سلول­های دارای دیواره سلولی شکسته شده به دلیل متلاشی شدن کامل برخی از سلول­ها و پخش آنها در سوسپانسیون سلولی درصد دقیقی از سلول­های شکسته شده را نشان نمی­دهد. تغییرات مشاهده شده در ساختار سلول توسط میکروسکوپ نوری، بعد از تیمار سلول­ها با امواج فراصوت در شکل 4 آورده شده است. اندازه شکست­های ایجاد شده در سلول­ها متفاوت بود که این تغییرات بستگی به زمان اعمال امواج، اندازه سلول و غیره دارد.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که  اثر  دما  و  مدت  زمان

تیمار با امواج فراصوت و همچنین اثر متقابل دما × زمان بر شکست سلولی در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود (جدول 1). بیشترین درصد شکست سلولی به ترتیب مربوط به تیمار در دمای 50 درجه سانتی­گراد و 14 دقیقه امواج فراصوت (733/18 درصد) و دمای 25 درجه سانتی­گراد و 20 دقیقه اعمال امواج فراصوت (48/17 درصد) بوده است.

با توجه به نمودار اثر متقابل مشاهده می­شود که در دماهای 25 و 50 درجه سانتی‌گراد با افزایش زمان اعمال امواج فراصوت از 2 دقیقه به 20 دقیقه درصد شکست سلول­ها به طور معنی­داری افزایش یافته است (شکل 5) ولی در دماهای 40 و 60 چنین روندی مشاهده نشد.

 

 

شکل 4- شکست­های حاصل از امواج فراصوت در سلول­های توتون

 

 

شکل 5- میانگین درصد شکست سلول­های کشت سوسپانسیون توتون در دماها و زمان­های مختلف امواج فراصوت

 

نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که امواج فراصوت از توانایی ایجاد شکاف­های ریز تا متلاشی کردن کامل سلول برخوردارند. همچنین نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که امواج فراصوت علاوه بر شکست در سلول از توانایی ایجاد حفرات ریز در دیواره سلول نیز برخوردار می­باشد (شکل 6). براساس تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره، اندازه حفرات ایجاد شده از 2/85 نانومتر تا 189/5 میکرومتر متغیر بود (شکل 6).

بحث

در مورد تأثیر امواج فراصوت بر زنده­مانی سلول­ها با توجه به شکل 3 مشاهده می­شود که در دماهای 25 و 40 درجه سانتی­گراد با افزایش مدت زمان تیمار با امواج فراصوت زنده­مانی سلول­ها نیز به طور معنی­داری کاهش یافته است. همچنین در دماهای 50 و 60 درجه سانتی­گراد زنده­مانی سلول­ها به شدت کاهش یافته و در مدت زمان­های 14 و 20 دقیقه تیمار با امواج فراصوت، زنده­مانی سلول­ها به صفر رسیده است (شکل 3). با این حال، به دلیل وجود اثر متقابل معنی­دار بین میزان دما و مدت زمان تیمار با امواج فراصوت، این کاهش زنده­مانی سلول­ها با افزایش مدت زمان اعمال تیمار در همه دماهای تیمار با امواج فراصوت یکسان نبود. به­طوری­که با افزایش مدت زمان اعمال امواج فراصوت از دو دقیقه به 8 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی­گراد، کاهش درصد زنده­مانی سلول­ها معنی­دار نبوده ولی در سایر دماها، این کاهش از نظر آماری معنی­دار بود (شکل 3). ویو و لین (2002) در مطالعه­ای که روی زنده­مانی سلول­های جین­سینگ انجام داده‌اند، بیان کرده‌اند که در قدرت­های بالا و زمان­های طولانی اعمال امواج فراصوت، زنده­مانی سلول­ها به میزان قابل توجهی کاهش یافته است (37).

 

 

شکل 6- تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از سلول توتون: الف) سلول شاهد بدون تیمار با امواج فراصوت، ب) تصویر سلول کامل سونیکه شده با امواج فراصوت، پ و ت) نمای نزدیک از شکاف­های حاصل از امواج فراصوت بر سطح سلول و اندازه شکاف­ها

 

با توجه به غلظت برابر سلول در تمامی تیمارها به دلیل استفاده از یک سوسپانسیون سلولی در این آزمایش، درصد شکست سلولی در هر تیمار از مقایسه تعداد سلول­های سالم در آن تیمار با سلول­های شاهد تعیین شد. براساس نتایج تأثیر امواج فراصوت بر شکست دیواره سلولی مشاهده می‌شود که بیشترین درصد شکست سلولی مربوط به تیمار در دمای 50 درجه سانتی­گراد و 14 دقیقه امواج فراصوت (733/18 درصد) و دمای 25 درجه سانتی­گراد و 20 دقیقه اعمال امواج فراصوت (48/17 درصد) بوده است که این نتیجه می­تواند در استفاده از این تکنیک برای استخراج متابولیت­های ثانویه از سلول­های گیاهی مفید باشد (2). امروزه استخراج با روش فراصوت بدلیل کارایی بالاتر و میزان مصرف انرژی و آب کمتر، به صورت جایگزینی مناسب برای روش­های استخراج قدیمی و به عنوان روشی اثبات شده در فراوری مواد گیاهی، به‌ویژه ترکیبات با وزن مولکولی پایین تبدیل شده است (28). اثر افزایشی امواج فراصوت در میزان استخراج مواد گیاهی مربوط به شکستن سلول­ها و رهایش محتویات آنها به محیط استخراج است (19). امواج فراصوت، مراحل فرایند استخراج یعنی تورم بافت به منظور جذب حلال و نیز خروج ترکیبات از بافت به حلال را از طریق ایجاد تخلخل و منافذ در دیواره سلول­ها و بهبود انتشار و انتقال جرم تسهیل و تسریع می‌کنند (36). از این رو، استفاده از این امواج در استخراج ترکیبات مختلف از بافت­های گیاهی، بازدهی عمل و سرعت فرایند استخراج را افزایش داده و مصرف حلال را کاهش می­دهد (35). در همین رابطه گزارش شده که استخراج روغن از دانه کلزا با کمک امواج فراصوت با سرعت بیشتری انجام می‌شود. از سوی دیگر مشخص شده که نوع حلال بازدهی استخراج با امواج فراصوت را تحت تأثیر قرار می­دهد (30). در مطالعه­ای روی تأثیر استفاده از امواج فراصوت با قدرت بالا بر استخراج روغن از دانه­های آسیاب شده زیتون مشخص شد که در حضور این امواج، دیواره سلول­ها و بافت­های گیاهی تخریب شده و ترکیبات آنتی اکسیدانی (پلی‌فنل­ها و توکوفرول­ها) و رنگدانه­های (کلروفیل و کاروتنوئید) بیشتری به داخل روغن راه یافته و باعث افزایش ارزش تغذیه­ای می­شوند (15).

همانطور که می­دانیم یک دیواره سخت و ضخیم در سلول گیاهی وجود دارد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی (شکل 6 ب و پ) این تحقیق نشان داد که امواج فراصوت منافذی با اندازه‌های متفاوت (با توجه به شدت امواج فراصوت و مدت زمان تیمار) را در دیواره سلول‌های توتون ایجاد می‌کند. بنابراین، استفاده از امواج فراصوت می‌تواند یک روش مناسبی را برای انتقال ژن به داخل پروتوپلاست­های گیاهی و سلول­های طبیعی گیاهی مهیا کند (9 و 10). ثابت شده است که تیمار با امواج فراصوت می­تواند نفوذپذیری موقت غشا پلاسمایی را تغییر داده و جذب را تسهیل کند. در مقایسه با دیگر روش­های مستقیم انتقال DNA، همچون بمباران ذره­ای، الکتروپوریشن و ریزتزریقی، تیمار با امواج فراصوت می­تواند ساده­تر انجام شود (17).

با افزایش دمای حمام اولتراسوند به 50 و 60 درجه سانتی‌گراد در تیمار امواج فراصوت، درصد زنده‌مانی‌ سلول‌های توتون به شدت کاهش یافت (شکل 3). ازجمله فرایند­هایی که ممکن است در کاهش زنده­مانی و افزایش شکست سلول­های تیمار شده با امواج فراصوت مؤثر باشند، می­توان به اثر مکانیکی و سونوشیمیایی صوت اشاره کرد. فرایند مکانیکی فراصوت گرادیانهای فشار بالایی را درون مایع به وجود می­آورد که باعث آسیب رساندن به بافت­های بیولوژیکی و سلول­ها می­گردد (27). طبق مکانیزم اثرات سونوشیمیایی صوت، هر حباب کاویتاسیون تولید شده به وسیله امواج فراصوت به‌منزله میکروراکتور کوچکی عمل می­کند که تولید نقاط داغ موضعی کرده و می­تواند آنزیم­های سلول را دناتوره کند (32 و 38).

نتیجه­گیری کلی

بنابراین، با توجه به اینکه یکی از آثار امواج فراصوت در سلول­ها افزایش نفوذ­پذیری غشا است، بنابراین می‌توان با تعیین دامنه­ای از امواج که توانایی ایجاد حفره­های آنی و یا اعمال شوک با کمترین آسیب به سلول را داشته باشد، برای انتقال ماکرومولکول­ها و افزایش متابولیت­های ثانویه در سلول استفاده کرد. از تیمارهایی که حداکثر شکست سلولی را دارند، می­توان برای استخراج متابولیت از سلول­های گیاهی استفاده کرد.

1. حسامی ر، شریعتی م. 1391. پاسخ شاخص کارایی فتوسنتزی (PIABS) نسبت به کمبود نیترات در گیاهان تنباکو (Nicotiana plumbaginifolia) تراریخته شده با ژن ناقل نیتراتAtNRT2.1  با استفاده از فلئورسنس کلروفیل a. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 4 (27): 569-579.

2. رضاییان م، فرامرزی م ع، نیکنام و، ابراهیم­زاده ح. 1393. بررسی اثر تنش شوری بر رشد، پراکسیداسیون لیپیدها، زیمایه­های پاداکساینده و فیکوبیلی پروتئین­ها در دو گونه نوستوک. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران. 4 (27): 661-673.

3. کوهی ل، زارع ن، اصغری زکریا ر، شیخ­زاده مصدق پ. 1393. نقش تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و جداکشت­های مختلف بر پاسخ کشت بافتی و سوسپانسیون سلولی بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.). مجله اکوفیزیولوژی گیاهان زراعی 2 (30): 203- 214.

 

4. Bao, S., Thrall, B.D., Miller, D.L. 1997. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. ultrasound medicine biology journal. 23:953– 9.

5. Carl, N.M.D. 1999. Rapid flowering Nicotiana tabacum L. Sex Plant Reproduction, 12: 123-124.

6. Chen, L., Jin, H., Ding, L. 2008. Dynamic microwave-assisted extraction of flavonoids from Herba Epimedii. Separation and Purification Technology, 59: 50-56.

7. Dahlem, O., Reisse, J., Halloin, V. 1999. The radially vibrating horn: a scaling-up possibility for sonochemical reactions. Chemical Engineering Science, 54: 2829- 2838.

8. Daniell, H. 2003. Medical molecular farming: expression of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines via chloroplast genome. In: Plant Biotechnology 2002 and Beyond (ed. Vasil, I.K.). 371-376. Kluwer Academic Publishers. Netherlands.

9. Fechheimer, M., Boylan, J.F., Parker, S., Sisken, J.E., Patel, G.L., Zimmer, S.G. 1987. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A. 84: 8463–7.

10. Fechheimer, M., Taylor, D.L. 1987. Introduction of exogenous molecules into the cytoplasm of Dictyostelium discoideum amoebae by controlled sonication. Methods Cell Biology, 28: 179– 90.

11. Frizzel, L.A. 1988. Biological effects of acoustic cavitation. In: Ultrasound, its chemical, physical, biological effects (ed. Suslick, K.) 287-303. VCH Publishers, Weinheim.

12. Gebicki, S., Gebicki, J.M. 1993. Formation of peroxides in amino acids exposed to oxygen free radicals. Biochemical Journal, 289: 743-749.

13. Henglein, R. 1995. Chemical effects of continuous and pulsed ultrasound in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry, 2: S115-S121.

14. Huber, P.E., Pfisterer, P. 2000. In vitro and in vivo transfection of plasmid DNA in the Dunning prostate tumor R3327-AT1 is enhanced by focused ultrasound. Gene Therapy. 7:1516–25.

15. Jiménez, A., Beltran, G. 2007. Highpower ultrasound in olive paste pretreatment. Effect on process yield and virgin olive oil characteristics. Ultrasonics Sonochemistry, 14: 725-731.

16. Joersbo, M., Brunstedt, J. 1992. Sonication: a new method for gene transfer to plants. Physiologiae Plantarum, 85: 230-234.

17. Jun, L. 2008. Preparation of fluorescence starch-nanoparticle and its application as plant transgenic vehicle, J. Centeral South univiversity of Technology, 15: 768-773.

18. Kieffer, H., Triouleyre, C., Bertsch, C., Farine, S., Leva, Y., Walter, B. 2004. Mannose and xylose cannot be used as selectable agents for Vitis vinifera L. transformation. LaboratoireVigne Biotechnologies etEnvironnement, 43: 35-39.

19. Lingyun, W., Jianhua, W., Xiaodong, Z.H., Da, T., Yalin,Y., Chenggang, C., Tianhua, F., Fan, Z.H. 2007. Studies on the extracting technical conditions of inulin From Jerusalem artichoke tubers. Journal of Food Engineering, 79: 1087-1093.

20. Liu, Y., Uno, H., Takatsuki, H., Hirano, M., Sakanishi, A. 2005. In vitro transfection of HeLa-S3 cells and its optimal condition estimated by hemolysis with duty cycle ultrasound. European Biophysics Journal. 34:163– 9.

21. Liu, Y., Yang, H., Sakanishi, A. 2005. Ultrasound: Mechanical gene transfer into plant cells by sonoporation. Biotechnology advances. 24:1-16

22. Manas, P., Munoz, B., Sanz, D., Condon, S. 2006. Inactivation of lysozyme by ultrasonic waves under pressure at different temperatures. Enzyme and Microbial Technology. 39: 1177-1182.

23. Miller, D.L., Bao, S., Gies, R.A., Thrall, B.D. 1999. Ultrasonic enhancement of gene transfection in murine melanoma tumors. Ultrasound in medicine and biology. 25:1425– 1430.

24. Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: 473-497.

25. Nagarajan, K., Prasadrao, J.A.V. 2004. Textbook of field crops production, Published by Directorate of Information and Publication of Agriculture Indian Council of Agricultural Research Krishi Anusandh Bhavan, Pusa, New Delhi. 769-812.

26. Potapovich, M.V., Adzerikho, I.E., Eremin, A.N., Metelista, D.I. 2003. Kinetics of inactivation of catalase in solutions under high-and low-frequency ultrasound. Russian Journal of Physical Chemistry, 77: 299-306.

27. Riesz, P., Kondo, T. 1992. Free radical formation induced by ultrasound and its biological implications. Free Radical Biology &Medicine, 13: 247-70.

28. Rodrigues, S.P., Gustavo, A.S. 2007. Ultrasound extraction of compounds from coconut (Cocos nucifera) shell powder. Journal of Food Engineering, 80: 869-872.

29. Rossing T.D. 2007. Introduction to Acoustics. In: Springer Handbook of Acoustics (ed. Rossing T.D.) 1-6. Springer, New York.

30. Stanisavljevic, I.T., Lazic, M.L. 2007. Ultrasonic extraction of oil from tobacco (Nicotiana tabacum L.) seeds. Ultrasonics Sonochemistry, 14: 646-652.

31. Steward, N., Martin, R., Engasser, J.M., Goergen, J.L. 1999. A new methodology for plant cell viability assessment using intracellular esterase activity. Plant Cell Reports, 19:171–176.

32. Suslick, K.S. 1988. Ultrasound: Its physical, chemical and biological effects, VCH, New York.

33. Suslick, K.S. 1989. The chemical effects of ultrasound. Scientific American. 260, 80-86.

34. Tso, T.C., 2005. Production, physiology and biochemistry of tobacco plant. Institute of international development and education in agricultural and life sciences, New York, USA.

35. Vilkhu, K., Mawson, R. 2008. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry – A review. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 9: 161-169.

36. Vinatoru, M. 2001. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs. Ultrasonics Sonochemistry, 8: 303-313.

37. Wu, J., Lin, L. 2002. Elicitor-like effects of low-energy ultrasound on plant (Panax ginseng) cells: induction of plant defense responses and secondary metabolite production. Applied Microbiology and Biotechnology, 59: 51–57.

38. Wyber, J.A,. Andrews, J,. Demanuele, A. 1997. The use of sonication for the efficient delivery of plasmid DNA into cells. Pharmaceutical Research, 14: 750-756.