نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 هیات علمی / 1 گروه زیست شناسی˓ دانشکده علوم پایه˓ واحد علوم و تحقیقات تهران˓دانشگاه آزاد اسلامی˓ تهران˓ ایران
2 استاد / 2 گروه زیست شناسی گیاهی˓ دانشکده علوم پایه˓ دانشگاه آزاد اسلامی˓ مرو دشت˓ ایران
3 هیات علمی / 3 گروه علوم گیاهی˓ دانشکده علوم زیستی˓ دانشگاه خوارزمی˓ تهران˓ ایران
چکیده
خشکی با اثرات تنش اسمزی˓ رشد گیاهان و تولید محصولات کشاورزی را کاهش میدهد. نیتریک اکسید یک رادیکال گازی پایدار است که بعنوان یک مولکول پیامرسان در گیاهان عمل میکند و در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی˓ نموی و همچنین پاسخهای گیاهان به تنشهای محیطی شرکت میکند. در پژوهش حاضر از نیتروپروساید سدیم (SNP) بعنوان رها کننده NO استفاده گردید. گیاهچههای کلزا به مدت 21 روز در معرض مقادیر رطوبتی خاک شامل 100%˓ 60% و 30% ظرفیت زراعی (FC ) در ترکیب با SNP (0˓25˓50˓ 75 و100 میکرومولار) و بدون SNP قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تنش خشکی به تنهایی سبب کاهش وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه می گردد. مقادیر پرولین˓ قندهای محلول˓ آنتوسیانین˓ فلاونوئیدها و فنل کل در گیاهان تحت تنش خشکی افزایش معنی داری نشان دادند. در بین غلظتهای مختلف SNP تیمار 25 میکرومولار˓ عملکرد رشد و مقادیر پرولین˓ قندهای محلول˓ آنتوسیانین˓ فلاونوئیدها و فنل کل را تحت تنش خشکی افزایش داد. غلظتهای زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب آسیبهای اکسیداتیو در گیاهچه-های کلزا گردید.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effect of sodium nitroprusside (SNP) on some physiological parameters in oilseed rape (Brassica napus L.) seedlings under drought stress
نویسندگان [English]
1 Teacher / 1 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Professor / 2 Department of Plant Biology, College of Basic Sciences, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran
3 Teacher / 3Department of Plant Science, Faculty of Biological Sciences Kharazmi University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Drought with its osmotic stress effects inhibits plants growth and limits agricultural crops production. Nitric oxide (NO) is a stable free radical gas which acts as a signaling molecule in plants and participates in various plants physiological and developmental processes and also in plants responses to environmental stresses. In this study sodium nitroprusside (SNP) was used as NO donor. Oilseed rape seedlings were subjected to various soil moisture contents including, 100%, 60% and 30% field capacity (FC) with and without SNP (0, 25, 50, 75 and 100 µM) for a period of 21 days. Results showed that drought stress alone reduces both shoots and roots dry weight. The amounts of proline, soluble sugars, anthocyanin, flavonoids and total phenols were significantly higher in seedlings subjected to drought stress. Of the various concentrations of SNP used, treatments containing 25 µM, increased both growth and the amounts of proline, soluble sugars, anthocyanin, flavonoids and total phenols under drought stress. Higher concentrations (75 and 100 µM) of SNP caused oxidative damages to the seedlings.
کلیدواژهها [English]
اثر سدیم نیتروپروساید ( (SNPبر برخی عوامل فیزیولوژیکی گیاه کلزا
(Brassica napus L. ) تحت تنش خشکی
معصومه نیکروش،1 بهمن خلدبرین2*، طاهر نژادستاری1 و فرزانه نجفی3
1 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
2 شیراز، دانشگاه شیراز، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
3 تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 9/7/94 تاریخ پذیرش: 7/2/95
چکیده
خشکی با اثرات تنش اسمزی، رشد گیاهان و تولید محصولات کشاورزی را کاهش میدهد. نیتریک اکسید یک رادیکال گازی پایدار است که بهعنوان یک مولکول پیامرسان در گیاهان عمل میکند و در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی، نموی و همچنین پاسخهای گیاهان به تنشهای محیطی شرکت میکند. در این پژوهش از نیتروپروساید سدیم (SNP) بهعنوان رهاکننده NO استفاده شد. گیاهچههای کلزا به مدت 21 روز در معرض مقادیر رطوبتی خاک شامل 100%، 60% و 30% ظرفیت زراعی (FC ) در ترکیب با SNP (0، 25، 50، 75 و100 میکرومولار) و بدون SNP قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تنش خشکی به تنهایی سبب کاهش وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه میگردد. مقادیر پرولین، قندهای محلول، آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنل کل در گیاهان تحت تنش خشکی افزایش معنیداری نشان دادند. در بین غلظتهای مختلف SNP تیمار 25 میکرومولار، عملکرد رشد و مقادیر پرولین، قندهای محلول، آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنل کل را تحت تنش خشکی افزایش داد. غلظتهای زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب آسیبهای اکسیداتیو در گیاهچههای کلزا شد.
واژههای کلیدی: تنش خشکی، کلزا، نیتریک اکسید
* نویسنده مسئول، تلفن: 3228916-071، پست الکترونیکی:bkholdeb@biology.susc.ac.ir
مقدمه
تنشهای محیطی ازجمله خشکی عوامل محدود کننده محصولات زراعی هستند. بیش از 45 درصد زمینهای کشاورزی بطور دائم در معرض خشکی قرار دارند و 38 درصد جمعیت دنیا در آن مناطق ساکن هستند (17). کمبود آب بهعنوان عدم وجود رطوبت کافی برای رشد طبیعی و تکمیل چرخه زندگی گیاهان تعریف می شود (40). محدودیت آب و افزایش رو به رشد تقاضا برای مواد غذایی اثرات خشکی را تشدید میکنند (17).
در تنش خشکی به علت بسته شدن روزنهها، غلظت CO2
در بافت مزوفیل برگ کاهش مییابد، بنابراین محصول واکنشهای نوری فتوسنتز ازجمله NADPH مصرف نمیشود. از آنجایی که در این شرایط NADPH اکسید نمیشود، از اینرو مقدارNADP+ برای دریافت الکترون کاهش مییابد. در این صورت اکسیژن بهعنوان پذیرنده الکترون از زنجیره انتقال الکترون در فتوسنتز عمل میکند و گونههای فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکال سوپراکسید (O2-)، پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدرروکسیل (OH.) تولید میشوند. گونههای فعال اکسیژن به شدت واکنشپذیر هستند و بعکس اکسیژن اتمسفری میتوانند ترکیبات سلولی مانند پروتئینها، لیپیدها، DNA و RNA را اکسید کنند. اکسید شدن نامحدود ترکیبات سلولی سرانجام منجر به مرگ سلول و گیاه میشود (31).
مهمترین عوامل فیزیولوژیکی برای تحمل به خشکی، تنظیم اسمزی، تولید آنتی اکسیدانها و ربایندههای ROS هستند. هنگام تنش خشکی، تنظیم اسمزی میتواند سبب کاهش آسیب به سلول شود. تجمع مواد آلی قابل حل در سیتوپلاسم، پتانسیل اسمزی سلول را منفیتر کرده و با افزایش شیب جریان آب به سمت سلول به حفظ تورژسانس سلول کمک میکند (51). ترکیبات دارای فعالیت اسمزی شامل قندهای محلول، قندهای الکلی، پرولین و اسیدهای آلی میباشند (48). پرولین مهمترین نوع اسمولیت است و تجمع آن در سازگاری به خشکی در بسیاری از گیاهان گزارش شده است (28). پرولین علاوه بر تنظیم اسمزی بهعنوان محافظ در برابر تنشهای اکسیداتیو عمل میکند و با ماکرومولکولها اثر متقابل داشته و سبب حفظ شکل و ساختار آنها در زمان تنش میشود (28). تجمع قندها در زمان تنش سبب تنظیم فشار اسمزی، کاهش اتلاف آب سلولی و نگهداری تورژسانس میشود (46).
عدم تحرک در گیاهان سبب توسعه سازوکارهایی در آنها شده است تا بتوانند در مقابل شرایط نامطلوب محیطی مقاومت نمایند. از جمله این سازوکارها سنتز متابولیتهای ثانویه مانند ترکیبات فنلی است (5). ترکیبات فنلی در میان مواد دارای ظرفیت آنتیاکسیدانی، یکی از مهمترین گروهها هستند. ترکیبات فنلی در سلسله گیاهی با داشتن حداقل یک حلقه آروماتیک و وجود یک یا بیشتر از یک گروه هیدروکسیل متصل به آن مشخص می شوند و بر پایه تعداد و ترتیب اتمهای کربن آنها به فلاوونوئیدها (فلاوونولها، فلاوونها، آنتوسیانینها) و غیر فلاوونوئیدها (اسیدهای فنولیک، هیدروکسی سیناماتها، استیلبنها) تقسیم میشوند که معمولا به قندها و اسیدهای آلی متصل میگردند (13). در گونههای Brassica بیشتر پلی فنلها از نوع فلاوونوئیدها (فلاونولها و آنتوسیانینها) و اسیدهای هیدروکسی سینامیک هستند (10). ترکیبات فنلی می توانند سبب برداشتن گروههای ROS شوند (2) و مانع فعالیت آنزیمهای مسئول واکنشهای اکسیژناسیون میشوند (15). فلاونوئیدها از انتشار ROS ممانعت میکنند و میتوانند با پاک سازی آنها از تنشهای اکسیداتیو جلوگیری کنند (5). آنتوسیانینها رنگیزههای محافظتی هستند که به عنوان گیرندههای رادیکالهای آزاد عمل میکنند و موجب محافظت گیاهان در برابر تنشهای اکسیداتیو میشوند (35). افزایش آنتوسیانین در شرایط تنش به علت نقش حفاظت نوری آنها در حذف مستقیم ROS در هنگام تنش اکسیداتیو میباشد (54).
نیتریک اکسید (NO ) یکی از مولکولهایی است که اخیرا توسط محققان گیاهی مورد توجه بسیاری قرار گرفته است (16).NO یک رادیکال گازی و قابل انتشار است که بصورت درونزا در گیاهان تولید میشود (3). NO نه تنها در مناطق آبدوست سلول مانند سیتوپلاسم حرکت میکند، بلکه آزادانه از داخل فاز لیپیدی غشاءها نیز انتشار مییابد (3). گزارشهای زیادی مبنی بر نقشهای متنوع نیتریک اکسید مانند القاء جوانه زنی بذر، تنظیم متابولیسم در پیری و پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی وجود دارد (29).
نیتریک اکسید در بیشتر تنشها در گیاهان حضور دارد. کاربرد نیتروپروساید سدیم (SNP) بهعنوان رها کننده NO مقاومت گیاه به تنش خشکی را از طریق بستن روزنهها و در نتیجه کاهش تعرق افزایش میدهد (19 ). NO بهعنوان پیامبر ثانویه در سلولهای گیاهی عمل میکند و بیان ژن را نیز القاء مینماید (24). کاربرد SNP فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان و میزان آب نسبی (RWC ) را در برگهای گندم که در معرض تنش خشکی قرار گرفته بودند افزایش داده است (50). همچنین کاربرد SNP بهعنوان رها کننده NO سبب افزایش پرولین در گیاهچههای خیار تحت تنش شوری شده است (16).
کلزا Brassica napus L.)) یکی از مهمترین محصولات زراعی اقتصادی است که بهدلیل داشتن دانههای روغنی سهم مهمی در تأمین روغن خوراکی در ایران دارد. خشکی یکی از عوامل محیطی است که در کشت این گیاه روغنی مشکلاتی ایجاد کرده است. این بررسی با هدف مطالعه تأثیر تیمار NO بر برخی عوامل فیزیولوژیکی گیاه کلزا در رابطه با تحمل آن به تنش خشکی انجام شده است.
مواد و روشها
گیاه مورد مطالعه در این تحقیق، کلزا L.) (Brassica napus رقم Okapy میباشد. بذر مورد نظر از اتحادیه دانههای روغنی استان فارس تهیه شد. با استفاده از ترازوی دیجیتالی در هر گلدان دو کیلوگرم خاک زراعی ریخته شد. سپس بذرها به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 2% ضد عفونی شدند و چند بار با آب معمولی و یکبار با آب مقطر آبکشی گردیدند. بذرها در گلدان ها به فاصله 5/2 سانتیمتری از هم کاشته شدند. گلدانها در گلخانه با دمای2±22 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. تنش آبی و تیمارهای نیتریک اکسید 4 هفته بعد از شرایط مطلوب آبیاری در مرحله چهار برگی گیاهان شروع شد. برای اعمال تنش خشکی و تیمار SNP گیاهان به 3 گروه تقسیم شدند. گیاهان گروه اول به مدت سه هفته در شرایط آبیاری 100،60 و30 درصد ظرفیت زراعی قرار گرفتند. اعمال تنش خشکی به روش وزنی انجام شد که قبل از آن باید ظرفیت زراعی را محاسبه کرد. برای به دست آوردن ظرفیت زراعی ابتدا سه گلدان از خاک خشک پر گردید و وزن اولیه آنها یادداشت شد. سپس تا حد خروج آب، گلدانها آبیاری شدند. روی گلدانها با پلاستیک پوشانده شد تا تبخیر انجام نشود. پس از 48 ساعت و خروج کامل آب از گلدانها تحت نیروی ثقل، وزن ثانویه گلدانها تعیین شد. با محاسبه اختلاف وزن اولیه و ثانویه گلدانها، ظرفیت زراعی محاسبه گردید. برگهای گیاهان گروه دوم بصورت یک روز در میان و به مدت سه هفته با غلظتهای 0، 25، 50، 75 و 100 میکرومولار نیتروپروساید سدیم محلولپاشی شدند و همزمان تحت رژیمهای آبیاری 100، 60 و 30 درصد ظرفیت زراعی قرار گرفتند. برگهای گیاهان گروه سوم بصورت یک روز در میان و به مدت 3 هفته با غلظتهای 0،25، 50، 75 و 100 میکرومولار نیتروپروساید سدیم محلولپاشی شدند. در همه تیمارها از Tween-20 01/0 درصد به عنوان روکنشگر (Surfactant ) استفاده گردید. در مورد گیاهان شاهد، برگهای گیاهان با آب مقطر حاوی Tween-20 01/0 درصد محلولپاشی شدند. پس از 21 روز اعمال تنش خشکی، گیاهان برداشت شدند. ریشهها و اندامهای هوایی از هم جدا شده، نمونههای مورد استفاده برای تعیین وزن خشک در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت در آون خشک شدند. برای مطالعه پاسخ های فیزیولوژیکی، تعدادی از نمونه ها پس برداشت در نیتروژن مایع منجمد شدند و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند.
سنجش میزان پرولین: مقدار پرولین بر اساس روش Bates و همکاران (1973) (6) با استفاده از نین هیدرین تعیین شد. در این روش نمونهها با اسیدسولفوسالیسیلیک 3% هموژنه گردید و بعد به مدت 10 دقیقه در 3000g سانتریفوژ شدند. بعد از اضافه کردن اسید استیک و معرف نین هیدرین، محتوای لولههای آزمایش به مدت یک ساعت در حمام آبگرم (78 درجه سانتیگراد) قرار گرفتند و بعد جذب نوری نمونهها به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. مقدار پرولین با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید.
سنجش میزان قندهای محلول: مقدار قندهای محلول با روش نلسون(1944) اندازه گیری شد(42). 200 میلی گرم بافت مورد آزمایش به مدت 48 ساعت در ظروف محتوای 10 میلی لیتر اسیدسولفوسالیسیلیک 3% قرار گرفت. سپس به 1/0 میلی لیتر از نمونهها 9/0 میلی لیتر آب مقطر و یک میلی لیتر محلول مس قلیایی اضافه شد. پس از قرار گرفتن نمونهها به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم (C˚78)، یک میلی لیتر آرسنومولیبدات و 7 میلی لیتر آب مقطر به هر لوله اضافه و مخلوط گردید. بعد از 10 دقیقه جذب نوری مخلوط واکنش به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومترخوانده شد. مقدار قندهای محلول با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز محاسبه و بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر بیان گردید.
سنجش میزان آنتوسیانین: غلظت آنتوسیانین به روش Wagner (1979 ) تعیین شد (52). ابتدا 1/0 گرم بافت تر در هاون با 10 میلی لیتر متانول اسیدی (99 به 1 به ترتیب متانول و اسید کلریدریک) ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 24 ساعت در تاریکی در دمای اتاق نگهداری شد و بعد به مدت 10 دقیقه با دور g4000 سانتریفوژ گردید. جذب روشناور در طول موج 550 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین از رابطه A=ƐBC استفاده گردید. در این فرمول A میزان جذب در طول موج 550 نانومتر، ضریب خاموشی برابر mMCm-1 3300،B قطر کووت (Cm1) و C غلظت کمپلکس برحسب mM میباشد.
سنجش میزان فلاونوئیدها: اندازه گیری فلاونوئیدها با اسپکتروفتومتر و با استفاده از روشKrizek و همکاران (1998) انجام شد (30). 1/0 بافت تازه در هاون چینی با 10 میلی لیتر اتانول اسیدی (الکل اتیلیک و اسید استیک گلاسیال به نسبت حجمی 1:99) ساییده شد. پس از سانتریفوژ، عصاره با دور g8000 به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. میزان فلاونوئیدها با استفاده از فرمول زیر بر حسب درصد محاسبه شد.
Fla= ABS (300nm) 14V700"> × 100
V: حجم عصاره ، ABS: جذب نوری ، Fla: فلاونوئید
سنجش فنل کل: 1/0 گرم از بافت تازه برگ در 10 میلی لیتر اتانول 80 درصد قرار داده شدند و به مدت 15 دقیقه درحمام آب گرم جوشانده شد. پس از سانتریفوژ، نمونهها در دور g3000 به مدت 15 دقیقه، محلول رویی با الکل 80 درصد به حجم 10 میلی لیتر رسانده شد. سپس 5 میلی لیتر از این محلول با 5 میلی لیتر فولین و 10 میلی لیتر کربنات سدیم اشباع مخلوط و نمونهها به مدت 15 دقیقه با دور g4000 سانتریفوژ شد. جذب محلول رویی در طول موج 640 نانومتر در مقابل شاهد خوانده شد. برای تعیین غلظت ترکیبات فنلی از منحنی استاندارد اسید گالیک با غلظتهای مختلف استفاده و مقدار این ترکیبات برحسب میلی گرم در گرم وزن تر نمونه ها محاسبه گردید (41).
تحلیل آماری: در این مطالعه، آزمایشها براساس طرح فاکتوریل در قالب بلوکهای کاملا تصادفی و سنجشها در سه تکرار انجام شد. دادههای حاصل از اندازه گیریها به وسیله نرم افزارآماری SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مقایسه میانگین دادهها در سطح خطای 5 درصد (P≤0.05) با آزمون Duncanو رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.
نتایج
اثر غلظتهای مختلف SNP بر وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه گیاه کلزا تحت تنش خشکی: تنش خشکی سبب کاهش وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه گیاهان کلزا گردید (شکل های 1و2). محلول پاشی SNP با غظت 25 میکرومولار وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه گیاهان کلزا را تحت تنش خشکی (FC60% و FC30%) افزایش داد. غلظتهای زیاد SNP (75 و 100 میکرومولار) و تنش خشکی (FC60% و FC30%) باعث کاهش وزن خشک ریشه و اندامهای هوایی گردید. در شرایط مطلوب آبیاری فقط غلظت 100 میکرومولارSNP ، سبب کاهش معنی دار در رشد اندام های هوایی کلزا شد (شکل های 1 و 2).
شکل 1- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر وزن خشک اندامهای هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.
شکل 2- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر وزن خشک ریشه گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن p<0/05) ( مقایسه شدند.
اثر غلظتهای مختلف SNP بر میزان پرولین برگ و ریشه گیاه کلزا تحت تنش خشکی: نتایج بهدست آمده از اندازهگیری اسیدآمینه پرولین در برگ و ریشه گیاهان کلزا به ترتیب در شکل های 3و4 نشان داده شده است.
شکل 3- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر محتوای پرولین اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (p < 0/05) مقایسه شدند.
شکل 4- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر محتوای پرولین ریشه گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.
تنش خشکی (FC60% و FC30%) سبب افزایش قابل توجهی در محتوای پرولین برگ و ریشه در مقایسه با گیاه شاهد (FC 100%) شد. تیمار گیاهان با سدیم نیتروپروساید (25 میکرومولار) باعث افزایش محتوای پرولین در شرایط تنش خشکی ( FC60% و FC30%) گردید. غلظت های 75 و 100 میکرو مولار سدیم نیترو پروساید سبب کاهش محتوای پرولین در برگ و ریشه گیاهان کلزا در شرایط تنش خشکی شد. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار پرولین برگ و ریشه در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشت.
اثر غلظتهای مختلف SNP بر میزان قندهای محلول برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: دادههای حاصل از سنجش مقدار قندهای محلول در شکل 5 نشان میدهد که با افزایش خشکی میزان قندهای محلول افزایش مییابد و در ظرفیت زراعی 30 % به حداکثر میرسد. بهطوریکه مقدار آن از 43/35 میکرو گرم بر گرم وزن تر در شاهد به 13/73 میکرو گرم بر گرم وزن تر در ظرفیت زراعی 30% افزایش می یابد. تیمار گیاهان با 25 میکرومولار SNP سبب افزایش محتوای قندهای محلول تحت تنش خشکی گردید. غلظت های بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) سبب کاهش محتوای قندهای محلول گیاهان در تنش خشکی شده است. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار قندهای محلول اندامهای هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.
اثر غلظتهای مختلف SNP بر میزان آنتوسیانین برگ گیاه کلزا تحت تنش شوری: محتوای آنتوسیانین در برگهای گیاهان تحت تنش خشکی در شکل 6 نشان داده شده است. با افزایش تنش خشکی میزان آنتوسیانین به طور معنی داری افزایش یافته که این افزایش در 60%و 30% ظرفیت مزرعه به ترتیب27 و58 درصد نسبت به شاهد (ظرفیت زراعی100%) میباشد. محلولپاشی برگ ها با SNP (25µM) به طور معنی داری میزان آنتوسیانین را تحت تنش خشکی افزایش داده است. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار آنتوسیانین اندامهای هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشت.
شکل 5- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان قندهای محلول اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0.05) مقایسه شدند.
اثر غلظتهای مختلف SNP بر میزان فلاونوئیدهای برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: تحت تنش خشکی افزایش معنی داری در مقدار فلاونوئیدهای گیاهان کلزا مشاهده شد (شکل 7). این افزایش در 60% و 30% ظرفیت مزرعه بهترتیب 35 درصد و77 درصد در مقایسه با شاهد (ظرفیت زراعی 100%) بوده است. کاربرد SNP (25 میکرومولار) سبب افرایش فلاونوئیدها تحت تنش خشکی گردید (شکل 7). تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار فلاونوئید اندامهای هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.
شکل 6- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان آنتوسیانین اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.
شکل 7- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر میزان فلاونویید اندام هوایی گیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدهاند.
اثر غلظتهای مختلف SNP بر میزان ترکیبات فنلی برگ گیاه کلزا تحت تنش خشکی: افزایش ترکیبات فنلی تحت تنش خشکی (FC30% و FC60%) در مقایسه با شاهد در شکل 8 نشان داده شده است. محلول پاشی برگها با SNP (25 میکرومولار) تحت تنش خشکی، محتوای فنل کل را به طور معنی داری افزایش داده است. غلظتهای بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) محتوای ترکیبات فنلی برگها را کاهش داد. تیمارهای مختلف سدیم نیتروپروساید به تنهایی اثری بر مقدار ترکیبات فنلی اندامهای هوایی در شرایط آبیاری مطلوب ( FC100% ) نداشته است.
شکل 8- اثر تیمارهای مختلف نیتروپروساید سدیم بر مقدار فنل کل اندام هوایی کیاه کلزا تحت تنش کم آبی دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (P < 0/05) مقایسه شدند.
بحث
با توجه به نتایج بهدست آمده مصرف نیترو پروساید سدیم (25 میکرومولار) سبب بهبود رشد گیاهان کلزا تحت تنش خشکی شده است. رادیکالهای آزاد اکسیژن در شرایط تنش سبب شکستن رنگیزهها و پروتئینهای دستگاه فتوسنتزی میشوند. احتمالا نیتریک اکسید با اثرات ربایندگی گونههای واکنش کننده اکسیژن (ROS ) تولید شده در تنش موجب بهبود وضعیت کلروفیل سلول های گیاهی میشود (33) و با افزایش فتوسنتز مقدار ماده خشک گیاه نیز افزایش می یابد. از طرف دیگر، غلظتهای زیاد SNP با تولید گونههای فعال نیتروژن اثرات بازدارندگی ROS را شدیدتر کرده و احتمالا به دستگاه فتوسنتزی گیاه آسیب رسانده و منجر به کاهش رشد گیاه می شود (27).
نتایج بهدست آمده در این پژوهش نشان داد که تنش خشکی سبب افزایش میزان پرولین در برگ و ریشه کلزا شده است. تنظیم اسمزی مهمترین سازوکاری است که جذب آب از خاک را توسط گیاه بهبود میبخشد و سبب برقراری تورژسانس سلول در شرایط تنش خشکی میگردد (17). یک چنین فرایند تنظیم اسمزی، از طریق ترکیبات سازگار با متابولیسم مانند پرولین، قندهای محلول، گلیسین بتایین و اسیدهای آلی در گیاهان اعمال میگردد (37). در بسیاری از گیاهان پرولین بهعنوان یک اسیدآمینه چندمنظوره در پاسخ به تنش غیرزیستی تجمع مییابد. پرولین بهعنوان یک اسمولیت، سازگاری مناسبی با آنزیمها و ماکرومولکولهای سلول دارد و از ساختار پروتئینها و غشاء سلولها محافظت میکند (49). پرولین همچنین بهعنوان رباینده رادیکال هیدروکسیل عمل میکند (12). تیمار گیاهان با سدیم نیتروپروساید (25 میکرومولار) باعث افزایش مقدار پرولین تحت تنش خشکی شده است که میتواند به دلیل افزایش سنتز این اسید آمینه باشد (شکل 1و2). پیرولین 5- کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) آنزیم کلیدی در بیوسنتز پرولین است که فعالیت آن با تیمار سدیم نیتروپروساید افزایش مییابد. نتایج این پژوهش با مطالعات دیگران در مورد افزایش فعالیت این آنزیم توسط نیتریک اکسید تحت تنش خشکی مطابقت دارد (34). در غلظتهای زیادSNP همانطور که اشاره شد با تولید گونههای فعال نیتروژن (پراکسینیتریت) تنش نیتروزاتیو ایجاد می شود که اثرت آسیبرسانی ROS را تشدید می کند (27).
افزایش محتوای قندهای محلول تحت تنش خشکی احتمالا به علت افزایش فعالیت آنزیم آمیلاز، هیدرولیز نشاسته به قندهای سادهتر و کاهش انتقال قندها از برگ به سایر قسمتهای گیاه میباشد(54). تحت تنش خشکی قندهای محلول بهعنوان عوامل اسمزی و محافظت کننده اسمزی عمل می کنند (7). قند های محلول با کاهش پتانسیل اسمزی سلول به تداوم جذب آب و حفظ تورژسانس کمک میکنند. نقش محافظت اسمزی قندها در پایداری غشاءها و پروتئینها از طریق تشکیل باندهای هیدروژنی با دنبالههای قطبی پلی پپتیدها (14) و گروههای فسفات فسفولیپیدهای غشاء گزارش شده است (47). همچنین قندهای محلول در گیاهان می توانند فعالیت آنتیاکسیدانی داشته باشند (32). در این پژوهش محلول پاشی برگها به وسیله SNP (25µM) در گیاهان کلزا تحت شرایط خشکی مقدار قندهای محلول را در مقایسه با گیاهان شاهد (خشکی تنها) افزایش داده است (شکل5). بررسیهای پژوهشگران دیگر نشان داده است که کاربرد SNP تحت تنش خشکی محتوای قندهای محلول را در گیاهان کتان (39) افزایش می دهد. در تحقیقات Liao و همکاران (2012) مشخص شد که تیمار SNP انجام فتوسنتز در برگها را بهبود میبخشد و اثرات منفی خشکی بر تجمع کربوهیدراتها و ترکیبات نیتروژنی را در Tagetes erecta کاهش میدهد (36).
آنتوسیانینها رنگدانههای محلول در آب و از خانواده فلاونوئیدها هستند که از مسیر شیکمیک اسید ساخته میشوند (26). آنتوسیانین ها دارای خاصیت آنتی اکسیدانی هستند، و بهعنوان گیرنده رادیکال های آزاد عمل میکنند و گیاهان را در برابر تنشهای اکسیداتیو محافظت میکنند (35). بررسیهای پیشین نشان داده است که در برگهای گیاه Brachystegia spiciformis تجمع آنتوسیانین سبب کاهش پتانسیل اسمزی برگها و در نتیجه کاهش پتانسیل آب برگ و کاهش هدایت روزنه ای میشود( 11). در سیب زمینی همانند کلزا با افزایش تنش خشکی میزان تولید فلاونوئیدها افزایش یافته است(53). همچنین انباشتگی آنتوسیانین در برگ گیاه Craterostigma در شرایط آبگیری گزازش شده است(25). این نتایج نشان دهنده افزایش مسیر تولید فلاونوئید است که منجر به تولید آنتوسیانین می شود (53). محلولپاشی برگها با SNP (25µM) بطور معنیداری میزان آنتوسیانین را تحت تنش خشکی افزایش داده است. در این راستا، Ganjewala و همکاران (2008) گزارش کردند که تیمار SNP مقدار آنتوسیانین را در برگهای نخود افزایش میدهد که احتمالا از طریق بازدارندگی مصرف قندهای تولید شده در فتوسنتز و تبدیل آنها به آنتوسیانینها می باشد (18). مولکول زیستی NO ممکن است القاء کننده بیوسنتز متابولیتهای ثانویه مانند آنتوسیانین باشد که بهعنوان پالایندهROS برای کاهش تنش اکسیداتیو عمل میکنند (22).
بررسیهای پیشین در گیاه کلزا (Brassica napus) در شرایط تنش خشکی نشان داده است که محتوای فلاونوئیدها به عنوان متابولیت های ثانویه افزایش مییابد (44). با ایجاد تنش اکسیداتیو بیان ژنهای آنتی اکسیدان (50) و مسیر فنیل پروپانوئید به ویژه بیوسنتز فلاونوئیدها افزایش مییابد (38). فلاونوئیدها آنتی اکسیدانهایی هستند که میتوانند بطور مستقیم از طریق انتقال یک پروتون موجود در حلقه خود سبب پاک سازی رادیکالهای آزاد شوند(9). همچنین فلاونوئیدها با کلاته کردن کاتیونهای Fe2+ وFe3+ می توانند پراکسیداسیون لیپیدهای وابسته به این دو شکل عنصر آهن را متوقف کنند (4). بررسیهای پژوهشگران نشان داده است که فلاونوئیدها با کاهش سیالیت غشاءها، آنها را نسبت به عوامل اکسیداتیو مقاوم کرده و از انتشار رادیکالهای آزاد از خلال آنها جلوگیری میکنند (23). همچنین فلاونوئیدها با بازدارندگی آنزیمهای سیکلواکسیژناز، لیپواکسیژناز، مونواکسیژناز میکروزومی و گزانتین اکسیداز از تشکیل رادیکال آزاد اکسیژن ممانعت میکنند (8). کاربرد SNP (25 میکرومولار) سبب افزایش فلاونوئیدها تحت تنش خشکی گردید (شکل 7). تنش خشکی سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز میشود که آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها و آنتوسیانین هاست (21). احتمالا NO نیز به همین روش بر مقدار این ترکیبات آنتی اکسیدانی میافزاید. البته غلظتهای بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) تحت تنش خشکی سبب کاهش محتوای فلاونوئید شده است ( شکل 7) که احتمالا به علت اختلال در سیستم دفاعی گیاه در این شرایط است و نیاز به بررسی بیشتر دارد.
افزایش مقدار فنل احتمالا ناشی از فعالیت مسیر هگزوز مونو فسفات و مسیر استات و رها شدن فنلها توسط آنزیمهای هیدرولیزکننده می باشد(45). پژوهشهایSakihama و همکاران (2002) نشان داده است که ترکیبات فنلی با دادن الکترون به آنزیمهای نوع پراکسیداز و سم زدایی آب اکسیژنه تولید شده می توانند در سلول به عنوان آنتی اکسیدان عمل کنند (43). محلول پاشیSNP (25 میکرومولار) تحت تنش خشکی محتوای فنل کل را به طور معنی داری افزایش داده است( شکل 8) که این نتایج با تحقیق نصیبی و همکاران (1390) مطابقت دارد (1). غلظتهای بالای SNP (75 و 100 میکرومولار) محتوای ترکیبات فنلی برگها را کاهش داد. پیش ماده اصلی برای سنتز فنل در بافتهای گیاهی کربوهیدراتها مخصوصا کربوهیدراتهای محلول هستند که منجر به تشکیل مواد ضروری مورد احتیاج برای سنتز پلیفنلها می شود(20)، بنابراین کاهش ترکیبات فنلی مشاهده شده در غلطت های 75 و 100 میکرومولار SNP تحت تنش خشکی ممکن است ناشی از کاهش در محتوای قندهای محلول در این شرایط باشد.
کاهش عملکرد گیاه کلزا در غلظت های زیاد SNP و تحت تنش خشکی در کلیه پارامتر های بررسی شده در این پژوهش مشهود است. نیتریک اکسید عملکرد دو گانه دارد و می تواند به عنوان اکسیدانت قوی و نیز به صورت آنتی اکسیدانت مؤثر عمل کند. نقش دوگانه نیتریک اکسید به غلظت آن و وضعیت محیط به عنوان عامل تنش بستگی دارد (24).
نتیجهگیری کلی
بررسیهای انجام شده در این پژوهش نشان داد که نیتریکاکسید در غلظتهای پایین میتواند آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی را در گیاهان کلزا کاهش دهد. نیتریک اکسید از طریق مقابله با ROS سبب بهبود عملکرد رشد، افزایش اسمولیتها و پارامترهای دفاعی گیاه در مقابل تنش خشکی میشود و این امر به مقاومت گیاه در مقابل تنش خشکی کمک میکند. کاربرد غلظتهای زیاد SNP در گیاه کلزا نقش همکاری (synergism ) با ROS داشته و آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی را تشدید میکند. محلول پاشی گیاهان با ترکیبات تولید کننده نیتریک اکسید مانند سدیم نیتروپروساید در هنگام تنش کم آبی می توانند با بستن روزنه ها از هدر رفتن بیشتر آب در تعرق توسط گیاه جلوگیری کنند و همزمان با فعال کردن سیستم دفاعی آنتی اکسیدان گیاه، از تنشهای اکسیداتیو بر روی گیاهان ممانعت کنند.