نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه گلستان

2 دانشگاه پیام نور بجنورد

چکیده

افدرین مهمترین الکالویید گیاه افدرا (Ephedra major) است که در درمان بیماری آسم مورد استفاده قرار می‌گیرد. هدف از تحقیق حاضر بررسی امکان کشت بافت این گیاه به منظور تولید کالوس و افدرین است. در این تحقیق اثر غلظت‌های مختلف 2,4-D وKin (0، 5/0، 1 و 2 میلی‌گرم در لیتر) بر روی تولید کالوس قطعات جداکشت ساقه مورد بررسی قرار گرفته است. آزمایش در قالب طرح تصادفی انجام شد.به این منظور بذرها پس از جمع‌آوری از ارتفاعات بجنورد در گلدان‌های حاوی خاک جنگل کشت شدند. قطعات جدا‌کشت ساقه از گیاهچه‌های 5 ماهه جدا و پس از ضدعفونی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت‌های مختلف 2,4-D و Kin کشت شدند. نتایج نشان داد قطعات جدا‌کشت ساقه در محیط کشت حاوی 5/0 و 5/0 میلی‎گرم در لیتر 2,4-Dو Kin بیشترین درصد کالوس‌زایی و آلکالوئید کل را نشان دادند. اندازه‌گیری افدرین به روشHPLC نشان داد که بیشترین میزان افدرین (053/0 میلی‎گرم بر گرم وزن خشک) در کالوس‌های تولید‌شده در محیط کشت حاصل از تیمار 2 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر از هورمون‌های 2,4-D و Kin تولید شد.در مجموع نتایج حاضر نشان داد که در شرایط کشت بافت می‌توان از کالوس حاصل از قطعات جدا کشت افدرین تولید کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Optimization of callus induction and ephedrine production in Ephedra major

نویسندگان [English]

  • morteza Mofid Bojnoordi 1
  • Mahnaz Aghdasi 1
  • manijeh Mianabadi 1
  • Mohabat Nadaf 2

1 Golestan University

2 Bojnoord Payame Noor University

چکیده [English]

Ephedrin is the most important alkaloid in Ephedrawhich used as anti-asthmatic medicine. The aim of current study was optimization of callus induction for ephedrine production in tissue culture condition. In the current work the effect of different concentration of 2,4-D and Kin (0, 0.5, 1 and 2 mg/l) was investigated on callus induction of stem explants. The experiment was performed in complete randomized test. For this purpose, seeds were collected from Bojnoordelevations and then planted in forest soil. After 5 months, stem explants were transferred to MS medium supplemented with 2,4-D and Kin. The results showed that the highest percentage of callus formation and total alkaloid amount were observed at 0.5 and 0.5 mg/L 2,4-D and Kin. Meanwhile, Ephedrine measurement by HPLC methods showed that the highest amount of ephedrine (0.053 mg/g Dry weight) was observed in callus which induced in MS medium supplemented with 2 and 0.5 mg/l of 2,4-D and Kin.In conclusion, the current result showed that the callus which is produced by the explant can be used to make ephedrine in tissue culture condition.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Total Alkaloids
  • Callus
  • Ephedrine
  • Ephedra major

بهینه­سازی تشکیل کالوس و تولید افدرین در گیاه افدرا (Ephedra major) 

مرتضی مفید بجنوردی1، مهناز اقدسی1*، منیژه میان آبادی1 و محبت نداف2

1 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی 

2 بجنورد، دانشگاه پیام نور بجنورد، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 30/11/92              تاریخ پذیرش: 12/2/93 

چکیده

افدرین مهمترین الکالویید گیاه افدرا (Ephedra major) است که در درمان بیماری آسم مورد استفاده قرار می­گیرد. هدف از تحقیق حاضر بررسی امکان کشت بافت این گیاه به‌منظور تولید کالوس و افدرین است. در این تحقیق اثر غلظت­های مختلف 2,4-D و Kin (0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) بر روی تولید کالوس قطعات جداکشت ساقه مورد بررسی قرار گرفته است. آزمایش در قالب طرح تصادفی انجام شد. به این منظور بذرها پس از جمع­آوری از ارتفاعات بجنورد در گلدان­های حاوی خاک جنگل کشت شدند. قطعات جدا­کشت ساقه از گیاهچه­های 5 ماهه جدا و پس از ضدعفونی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت­های مختلف 2,4-D و Kin کشت شدند. نتایج نشان داد که قطعات جدا­کشت ساقه در محیط کشت حاوی  5/0 و 5/0 میلی‎گرم در لیتر 2,4-D و Kin بیشترین درصد کالوس‌زایی و آلکالوئید کل را نشان دادند. اندازه­گیری افدرین به روشHPLC  نشان داد که بیشترین میزان افدرین (053/0 میلی‎گرم بر گرم وزن خشک) در کالوس­های تولید­شده در محیط کشت حاصل از تیمار 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر از هورمون­های 2,4-D و Kin تولید شد. در مجموع نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در شرایط کشت بافت می­توان از کالوس حاصل از قطعات جدا کشت افدرین تولید کرد.

واژه‏های کلیدی: آلکالوئید کل، افدرین، کالوس، 2,4-D،Kin ، افدرا

* نویسنده مسئول، تلفن: 01732322810 ، پست الکترونیکی: m.aghdasi@gu.ac.ir

مقدمه

 

گیاه افدرا با نام علمی Ephedramajor متعلق به تیره ارمک یا افدراسه است. این تیره دارای یک جنس و بیش از 50 گونه است (17). جنس افدرا در ایران 11 گونه و بیش از 10 واریته دارد (1 و 9). گونه Ephedr amajor اغلب در کوهستان­های مناطق ایرانی و تورانی و در ارتفاع 1500 تا 3000 متر در مناطق مازندران، جنگل گلستان، آذربایجان، اردبیل، همدان، فارس، هرمزگان، کرمان، خراسان، سمنان، تهران، ارتفاعات فیروزکوه، دماوند و چالوس رویش دارد (4).

افدرا گیاهی درختچه­ای، دو پایه، بندرت یک‏پایه، با شاخه‏های ایستاده، یا کم‏و‎بیش افتان یا خیزان بر سطح خاک است. انشعابات ساقه‎ها معمولا دارای شاخک‏های فراوان سبز و فتوسنتزکننده هستند. ارتفاع گیاه 20 تا 180 سانتی­متر است. برگها بسیار کوچک و در هر بند 2 تا 3 عدد، گاهی 4 عدد، معمولا تحلیل‏یافته و به صورت فلس‏های غشایی هستند (8). افدرا به دو روش رویشی (ریزوم) و زایشی (بذر) تکثیر می‏شود (3). این گیاه در طب سنتی چین در درمان بیماری­هایی مانند سرماخوردگی، ورم مخاط بینی در اثر حساسیت، آسم، آنفولانزا، برونشیت، گرفتگی بینی، تب‎یونجه، آرتریت، کهیر، عدم تعریق، سردرد، صرع، شب‏ادراری، ضعف عضلات، حساسیت‏های پوستی، دردهای استخوان و مفاصل و کاهش فشارخون توصیه می‎شود (7).

مهمترین  متابولیت  ثانویه  این  گیاه  افدرین نام دارد که از

گروه الکالوئیدها بوده و 90 -30 درصد آلکالوئید کل را تشکیل می­دهد. گونه­های مختلف افدرا دارای 4/3 – 01/0 درصد آلکالوئیدهای افدرین هستند که در بخش‏های هوایی گیاه تجمع پیدا می‏کنند. میزان و نوع آلکالوئیدهای افدرین بر حسب گونه، واریته، بخش‏های‏ مختلف گیاه، فصل برداشت و ناحیه جغرافیایی و ارتفاعی که گیاه رشد می­کند، متفاوت است (2و 7). ایزومرهای دیگری نیز از افدرین در گیاه افدرا گزارش شده­است که می­توان به نورافدرین، متیل‏افدرین، نورسودوافدرین، سودوافدرین و متیل‏سودوافدرین اشاره کرد. مکانیسم‏های بیوشیمیایی پیچیده‎ای که منجر به تشکیل و تجمع آلکالوئیدهای افدرین در افدرا و دیگر گیاهان می‏شود تا حدود زیادی ناشناخته است. مطالعات اولیه نشان داده که این ماده از اسید امینه فنیل‏آلانین مشتق می‏شود (10 و13).

در حال حاضر سه روش مختلف برای تولید تجاری افدرین و آلکالوئیدهای مربوطه وجود دارد. 1- روش‏های سنتی که شامل استخراج افدرین از ساقه افدرا می‏باشد. 2- سنتز شیمیایی روش دیگری در تولید این ماده است. اما این روش منجر به تولید مخلوط راسمیک آلکالوئیدها می‏گردد. 3- تولید انتخابی انانتیومر -(1R, 2S)افدرین از ترکیبی به نام فنیل‏استیل‏کربینول یا R-PAC است. امروزه تولید تجاری افدرین و سودوافدرین بر این روش نیمه‏سنتزی تکیه دارد. در این روش مخمرهای ساکارومیس سروزیه (Saccharomyce scerevisiae) و کاندیدا یوتیلیس (Candida utilis) و همچنین باکتری زیموموناس موبیلیس (Zymomonas mobilis) از بنزآلدئید طی فرایند تخمیر میکروبی، R-PAC  تولید می­کنند (10). کشت بافت نیز روش دیگری است که امروزه برای تولید متابولیت­های ثانویه از آن استفاده می­شود. تاکنون گزارش­های اندکی در مورد کشت­بافت گونه­های مختلف افدرا منتشر شده است. O'Dowd و همکاران با بررسی تولید کالوس در 7 گونه مختلف افدرا در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ(MS)  حاوی غلظت­های مختلف تنظیم­کنندگان رشد گیاهی کینتین (kin)، 2و4- دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) و نفتالن استیک اسید (NAA) نشان دادند که بیشترین میزان افدرین در سوسپانسیون سلولی حاوی 2,4D و Kin مشاهده شده است (12). Parsaeimehr و همکاران نیز تولید کالوس و میزان افدرین و سودوافدرین را در شرایط کشت بافت در سه گونه E.  strobiliacea, E. procera و E. Pachyclada  مورد بررسی قرار دادند (14). همچنین گزارش­ها نشان داده که با افزودن پیش­ماده فنیل­آلانین به محیط کشت MS می­توان تولید افدرین را در کالوس
 E. alata  سه برابر افزایش داد (13). گزارش دیگری نیز مبنی بر تولید کالوس و گیاهچه از گونه gerardiana E. منتشر شده است (6 و 8).

با توجه به اهمیت افدرین در صنایع داروسازی (5) در این تحقیق سعی شده است تا با بهینه سازی شرایط کشت بافت گونه  Ephedra majorتولید این ماده با ارزش در شرایط کشت بافت برای اولین بار در ایران مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روشها

جمع آوری بذر و تولید گیاهچه: بذر گیاه افدرا از رویشگاه خود واقع در 45 کیلومتری جنوب شرقی بجنورد به ترتیب با طول و عرض جغرافیایی "44 '19 °37 و "30 '38 °57 در اواخر مردادماه جمع‌آوری شد. سپس بذرها در گلدان­های پلاستیکی حاوی خاک جنگل در عمق 2-1 سانتی­متری کاشته شدند. سپس گلدان­ها در اتاق کشت با دمای 2± 25 درجه سانتی­گراد و دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی نگه­داری شدند.

تولید کالوس: قطعات جداکشت از ساقه‏های سبز گیاهچه­های 5 ماهه جدا و به مدت 1 دقیقه با آب شستشو داده شده و در مرحله بعد با الکل 70 درصد به مدت 50 ثانیه و آب‏ژاول 20 درصد به مدت 5 دقیقه ضد‌عفونی شدند. سپس قطعات جداکشت5 بار با آب مقطر استریل در زیر هود لامینار شستشو شده و در محیط­کشت موراشیگ و اسکوگ یا MS (12) حاوی ویتامین تیامین­کلراید، اسید­نیکوتینیک، پیرودوکسین­کلراید و میو­اینوزیتول، غلظت‏های مختلف2-4-D و Kin ، ساکارز (3%) و آگار (1%) با pH=5.8 کشت شدند. شرایط اتاق­کشت با دمای2± 25 درجه سانتی­گراد و دوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در نظر گرفته شد. برای هر تیمار هورمونی 5 پتری­دیش حاوی محیط­کشت و در هر ظرف 5 قطعه جداکشت قرار داده شد. عملیات واکشت هر 20 روز یکبار انجام شد. بعد از 80 روز کالوس­ها برداشت­شده و درصد کال­زایی، شکل و اندازه ظاهری، وزن خشک و تر، نوپدیدی و رنگ کالوس­ها مورد مطالعه قرار گرفتند.

شرایط کشت: آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. اثرات اصلی شامل دو نوع تیمار هورمونی (Kin و (2,4D و چندین سطح هورمونی (0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) بود.

اندازه‌گیری وزن تر و خشک کالوس: برای تعیین وزن تر، کالوس­ها با ترازو A-Japon)&(GX- K توزین شدند. برای تعیین وزن خشک، کالوس­ها در آون در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 3 روز خشک شده و با ترازو توزین شدند.

عصاره‏گیری: در این روش 1 گرم کالوس با 10 میلی‏لیتر متانول 50 درصد به مدت 20 دقیقه شیکر و در دمای اتاق عصاره‏گیری و بعد در 1500 دور به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. روش استخراج سه مرتبه تکرار و درنهایت حجم عصاره‏ها با متانول 50 درصد به 50 میلی‏لیتر رسید. سپس عصاره‏ها با فیلتر (45/0 میکرون) صاف شدند. 

سنجش آلکالویید کل: سنجش آلکالویید کل به روش اسپکتروفتومتری انجام شد (15). در این روش 5/5 میلی لیتر از عصاره متانولی بدست آمده در 1 میلی لیتر اسیدهیدروکلریک غلیظ حل و پس از 30 دقیقه صاف شد. سپس عصاره صاف شده سه بار با 10 میلی لیتر کلروفرم شستشو داده شده و فاز آبی جدا شده و با سود 1/0 نرمال خنثی شد (pH=7). در مرحله بعد عصاره با 5 میلی­لیتر معرف بروموکرزول گرین و 5 میلی­لیتر بافر فسفات pH= 4.7 مخلوط و فاز کلروفرمی زردرنگ حاوی آلکالوییدها در لوله ­آزمایش جمع­آوری و حجم آن با کلروفرم به 10 میلی­لیتر رسانده شد. مقدار جذب عصاره در طول موج nm470 نانومتر خوانده شده و با استفاده از منحنی استاندارد میزان آلکالویید کل عصاره­ها تعیین گردید. برای رسم منحنی استاندارد، 1 میلی گرم افدرین خالص در 10 میلی لیتر آب مقطر حل شد. منحنی استاندارد براساس مقادیر مختلف افدرین رسم شد.

سنجش افدرین به روش HPLC : عصاره­گیری: یک گرم از نمونه گیاهی با 10 میلی لیتر متانول 50 درصد به مدت 20 دقیقه توسط شیکر و در دمای اتاق عصاره­گیری و بعد در 1500 دور برای 5 دقیقه سانتریفوژ شد. روش استخراج سه مرتبه تکرار و درنهایت حجم عصاره­ها با متانول 50 درصد به 50 میلی لیتر رسانده شد. عصاره­ها با فیلتر 45/0 میکرون فیلتر و به دستگاه HPLC تزریق شدند.

به منظور سنجش افدرین از دستگاه HPLC با آشکارساز UV/VIS، پمپ Merck Hitachi7100–L با نرم‌افزار EZ chrome (Hitachi- Japon) به روش ایزوکراتیک استفاده شد (16). فاز متحرک شامل محلول 1/0% اسیدفسفریک، محلول 25 میلی مولار سدیم دودسیل سولفات(SDS) و استونیتریلv/v40% بود. فاز تهیه شده به مدت 15 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک در دمای 20 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد تا حباب‌های هوا از آن خارج شود. سپس فاز تهیه شده در دستگاه فیلتراسیون (Altech-Germany) با فیلتر 45/0 میکرون صاف شد. مقدار جریان 8/0 میلی­لیتر سی بر دقیقه و طول موج nm210 بود. مدت زمان خروج نمونه­ها از ستون 45 دقیقه بود. به منظور رسم منحنی استاندارد، محلول­هایی با غلظت‌های 0، 0004/0، 0008/0، 001/0 و 0014/0 میلی‌لیتر از افدرین  (Sterop- USA) تهیه و به دستگاه HPLC تزریق شد. منحنی استاندارد براساس مقادیر مختلف افدرین رسم گردید.

تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده توسط نرم‌افزار SPSS انجام شد. از آزمون دانکن برای مشخص نمودن اختلاف معنی‌دار بین نتایج استفاده شد. رسم نمودارها و جدولها توسط نرم‌افزار اکسل انجام گردید. 

نتایج

سنجش میزان افدرین در اندام­های ساقه و ریشه گیاهچه­های افدرا: اندازه­گیری افدرین با استفاده از روش HPLC نشان داد که در اندام ریشه افدرین وجود نداشته و تنها در اندام ساقه افدرین وجود داشت. نتایج حاصل نشان داد که میزان افدرین در ساقه 04/0 میلی‎گرم بر گرم وزن خشک است (شکل 1). بنابراین با توجه به عدم وجود افدرین در اندام ریشه، تنها از قطعات جداکشت ساقه برای تولید کالوس در مرحله بعد استفاده شد. 


 

شکل 1- الف) کروماتوگرام عصاره متانولی گیاه افدرا (Ephedra major)، ب) منحنی استاندارد افدرین و ج) میزان افدرین در ساقه و ریشه گیاهچه افدرا


اثر غلظت‏های مختلف 2,4-D و Kin بر تولید کالوس: از 14 تیمار هورمونی استفاده شده در 11 تیمار حداقل در یک قطعه جداکشت کالوس‏زایی مشاهده شد و در 3 تیمار (0 و 0، 5/0 و 0، 1 و 5/0 میلی گرم در لیتر Kin  و 2,4D) هیچ کالوسی تولید نشد. رنگ کالوس­های تولید شده در تیمارهای مختلف متفاوت بوده و از سبز روشن، سبز تیره تا نارنجی و قهوه­ای متفاوت بوده است. شکل کالوس­های تولید شده نیز در برخی تیمارها نرم و در برخی دیگر سفت بوده است (شکل 2). بیشترین درصد کالوس‎زایی (6/99%) در تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر از  2,4-D و Kin مشاهده شده است. پس از آن  در تیمارهای 1و 2  میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin نیز درصد بالایی از کالوس­زایی (4/89%) مشاهده شده است. کمترین درصد کالوس‎زایی در تیمار 2 و 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin دیده شده است (جدول 1). نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که  تفاوت  معنی­داری  در  سطح 1 درصد  بین تیمار

هورمونی و درصد کالوس­زایی وجود دارد (جدول 2).

نتایج نشان داد که در تیمار 1 و 0 و نیز 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin بیشترین میزان وزن تر کالوس­ها دیده شد. کمترین وزن تر کالوس­ها نیز  در تیمارهای حاوی 1 و 5/0 (07/0 گرم) و 1 و 2 (09/0 گرم) میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin تولید شده است. بیشترین وزن خشک کالوس در تیمار 1 و 0 و نیز 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D وKin دیده شد (شکل3). نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‏های حاصل از سنجش وزن ­تر و وزن خشک کالوس نشان داد که بین داده‏ها در سطح کمتر از یک درصد تفاوت معنی‏داری وجود داشت (جدول3).

در برخی از تیمارهای بکار رفته نیز باززایی ساقه مشاهده شده است. نوساقه‏های ایجاد شده ابتدا سبزرنگ بوده اما بعد از یک ماه به رنگ ارغوانی درآمده و با واکشت‏های‏ متوالی رشد چندانی نداشتند (شکل 4-الف و ب). بیشترین درصد باززایی نوساقه در محیط کشت حاوی 2 و 2 و نیز 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin  مشاهده شد. در­حالی­که در محیط­های کشت حاوی 0 و 0،0 و 5/0، 5/0و 0، 2 و0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin باززایی انجام نشد. از طرفی دیگر در غلظت‏ 1 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin ریشه‏زایی نیز مشاهده شد (شکل 4-ج). همچنین در تیمار 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D ریشه به طور مستقیم از قطعه جداکشت ساقه (بدون تشکیل کالوس) ایجاد شد.

 

جدول 1- اثر غلظت­های مختلف 2,4-D و Kin بر تولید کالوس و باززایی قطعات جداکشت ساقه گیاه Ephedra major

Kin

(mg/L)

2,4 D

( mg/L)

درصد کالوس‏زایی (%)

کیفیت

کالوس

میانگین وزن تر کالوس (gr)

میانگین وزن خشک‎ کالوس (gr) 

درصد ‎باززایی ساقه (%)

0

0

0

0

5/0

5/0

5/0

5/0

1

1

1

2

2

2

0

5/0

1

2

0

5/0

1

2

5/0

1

2

5/0

1

2

0

32

75

76

0

100

22

64

0

68

15

22

89

25

--------

سبز روشن

سبز روشن یا تیره، نرم

سبز تیره، نرم

-------

سبز روشن یا تیره، نرم

سبز روشن، سفت

نارنجی، نرم

-------

قهوه­ای، سفت

سبز روشن، نرم

سبز روشن، نرم

سبز روشن، نرم

سبز روشن، نرم

---

ناچیز

74/0

12/0

---

24/0

07/0

80/0

---

22/0

09/0

24/0

09/0

16/0

---

ناچیز

086/0

025/0

---

050/0

ناچیز

063/0

---

034/0

023/0

022/0

025/0

026/0

0

0

27

0

0

62

23

16

89

34

9

26

59

98

 

جدول2- تجزیه واریانس داده­های مربوط به اثر ترکیب­های مختلف هورمونی بر درصد کالوس‏زایی و باززایی قطعات جدا­کشت ساقه
 Ephedra major

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات  درصد باززایی

میانگین مربعات درصد کالوس‏زایی

ترکیبهای مختلف هورمونی

13

**303/5474

**874/6155

خطا

56

4/37

130/18

**: تفاوت معنی‏دار در سطح کمتر از 1 درصد

 

 

شکل2- الف) گیاهچه پنج ماهه افدرا، کالوس‏زایی قطعات جداکشت ساقه گیاه افدرا در محیط کشت پایه MS ............. ب) 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin، ج) 5/0 و 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin، د)1 و 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin و ه)1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D

 

 

الف)

ب)

شکل 3- اثر غلظت‏های مختلف2,4-D  و Kin بر الف) وزن تر و ب) وزن خشک کالوس

هر ستون نشان‌دهنده میانگین داده‌ها ± انحراف معیار است. ستون­های دارای حداقل یک حرف مشترک در سطح اطمینان 5 درصد اختلاف معنی­داری ندارند.

جدول3- تجزیه واریانس داده­های مربوط به اثر تیمار هورمونی بر وزن تر و وزن خشک کالوس حاصل از قطعات جدا کشت Ephedra major

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات وزن تر کالوس

میانگین مربعات  وزن خشک کالوس

ترکیبهای مختلف هورمونی

9

**711/0

**006/0

خطا

90

006/0

000/0

      **: معنی‏دار در سطح کمتر از 1 درصد

 

شکل4- باززایی در قطعات جدا کشت ساقه. (الف): ساقه­زایی در کالوس­های رشد کرده در محیط کشت MS حاوی 1 و 2 میلی­گرم در لیتر2,4-D  و Kin، ب) ‏ساقه­زایی در کالوس­های رشد کرده در محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر2,4-D  و Kin، ج) ریشه­زایی در کالوس­های رشد­کرده در محیط کشت MS حاوی 1 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin 


سنجش  آلکالوئید کل و  افدرین در کالوس­های تولید شده: سنجش میزان الکالویید کل و افدرین تنها در کالوس­هایی که بیشترین میزان وزن خشک را داشتند، انجام شد. بیشترین میزان آلکالوئید کل (42/0 میلی‎گرم بر گرم وزن خشک) در تیمار 5/0 میلی­گرم در لیتر از هر یک از هورمون­های 2,4-D و Kin دیده شده است (شکل 5-الف). بیشترین میزان افدرین (053/0 میلی‎گرم بر گرم وزن خشک) نیز در کالوس­های حاصل از تیمار 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر از هورمون­های 2,4-D و Kin تولید شد (شکل 5-ب). در تیمار 1 میلی­گرم در لیتر از هورمون­های 2,4-D و Kin میزان افدرین کالوس­ها بسیار ناچیز بوده است. تجزیه واریانس داده‏های حاصل از سنجش افدرین و آلکالوئید کل کالوس در این چهار تیمار نشان داد که بین داده‏ها در سطح کمتر از یک درصد تفاوت معنی‏داری وجود دارد (جدول 4).


 

الف)

 

ب)

شکل5- میزان آلکالوئید کل (الف) و افدرین (ب) در کالوس‎های حاصل از کشت قطعه جدا ساقه در محیط کشت MS حاوی غلظت‏های مختلف 2,4-D و Kin

جدول 4- تجزیه واریانس داده­های میزان آلکالوئید کل و افدرین در نمونه‏های کالوس حاصل از قطعه جدا­کشت ساقه Ephedra major

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات میزان آلکالوئید کل

میانگین مربعات میزان افدرین

تیمار هورمونی

3

*034/0

*002/0

خطا

11

003/0

000/0

        *: معنی‏دار در سطح کمتر از 1 درصد


بحث

از 14 تیمار هورمونی استفاده شده در 11 تیمار هورمونی حداقل در یک نوع قطعه جداکشت کالوس‏زایی مشاهده شد. بررسی صفات ظاهری کالوس‎های تولید­شده نشان داد که رنگ کالوس‏ با توجه به غلظت هورمونی مورد استفاده نارنجی، نارنجی مایل به سبز، نارنجی مایل به کرم، سبز روشن و سبز تیره است. داده‏های حاصل از جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر غلظت‎های مختلف 2,4-D و Kin بر کالوس‎زایی قطعات جداکشت در سطح کمتر از 1 درصد معنی‏دار است. در حالی­که در تیمار شاهد، کالوس‏زایی مشاهده نشد. این نتیجه نیاز قطعات جداکشت به هورمون اگزوژن برای تولید کالوس را نشان می‏دهد. ترکیب هورمونی 5/0 میلی­گرم در لیتر از هورمون­های 2,4-D و Kin با بیشترین درصد کالوس‏زایی (6/99%) بهترین ترکیب برای کالوس‏زایی شناخته شد. این نتیجه با گزارش­های منتشر شده در مورد سایر گونه­ها متفاوت است. به عنوان مثال نشان داده شده که بیشترین درصد کالوس‏زایی (100%) در گونه Ephedra alata در غلظت 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin دیده می­شود (11).

نتایج مربوط به بررسی کالوس­زایی 7 گونه افدرا نشان داده است که در غلظت­های مختلف 2,4-D و Kin کالوس­های تولید شده سبز روشن بوده و ساختاری نرم دارند (12). اما در این پژوهش رنگ کالوس­ها در تیمارهای مختلف از نارنجی تا قهوه‌ای متفاوت بوده و نیز در برخی موارد کالوس­ها ساختاری نرم و در برخی دیگر فشرده و سفت دارند. نکته قابل ذکر آن است که در بیشتر تیمارها کالوس­ها در ابتدا به رنگ سبز روشن بوده و با گذشت زمان و واکشت­های متوالی کالوس­ها به رنگ نارنجی و قهوه‌ای درآمدند.

بررسی میزان افدرین در کالوس­ها نشان داد که تیمار حاوی 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-DوKin دارای بیشترین میزان افدرین است که نسبت به میزان افدرین در گیاه مادر افزایش نشان می‎دهد. در حالی­که بررسی­های انجام شده بر روی 7 گونه مختلف افدرا نشان داده که میزان افدرین در کالوس­های تولید­شده در شرایط کشت­بافت کمتر از میزان افدرین در گیاه مادر است (10). همچنین این محققان نشان دادند که با واکشت‎های متوالی میزان افدرین کاهش می‎یابد. بنابراین در پژوهش حاضر با توجه به زمان طولانی برداشت کالوس و واکشت­های متعدد (80 روز) ممکن است میزان افدرین کاهش یافته باشد. اما برخی گزارش­ها نیز نشان داده­اند که بیشترین میزان افدرین در کالوس گیاه Ephedra alata در محیط کشت MS حاوی1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D وKin  مشاهده شد. این محققان اشاره کرده‌اند که میزان افدرین در کالوس این گونه از افدرا نسبت به گیاهان وحشی 8/4 برابر افزایش یافته است (10). مقایسه نتایج حاضر با یافته‎های دیگر محققان نشان می‌دهد که گونه‎های مختلف افدرا در شرایط کشت­بافت پاسخ­های متفاوتی می‎دهند. همچنین بررسی کالوس‎زایی Ephedra procera در غلظت­های مختلف Kin و NAA نشان داده که استفاده از غلظت 2 و 1 میلی­گرم در لیتر NAA و Kin سبب تحریک ریشه­زایی در 18 درصد قطعات جداکشت می­شود و نکته قابل توجه در این تحقیق آن بود که میزان افدرین در کالوس­های ریشه‏دار شده نسبت به کالوس­های فاقد ریشه افزایش قابل توجهی نشان داد (14). از طرفی دیگر نتایج حاضر نشان داد که بیشترین میزان افدرین در کالوس­های نارنجی رنگ در تیمار 2 و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و Kin مشاهده می­شود. رنگ سبز روشن کمترین میزان افدرین را در خود داشته و در کالوس­های قهوه‎ای با ساختار شکننده نیز میزان افدرین بسیار اندک بود. این امر نشان­دهنده آن است که میزان رشد و سازمان‎بندی سلول­ها در شرایط ­کشت بافت می‎تواند تولید متابولیت­های ثانویه را تحت تأثیر قرار دهد (12).

نتیجه­گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داده که محیط کشت MS به همراه تیمارهای مناسب هورمون­های 2,4-D و Kin شرایط مناسبی برای تحریک کالوس­زایی از قطعات جدا کشت ساقه گیاه افدرا است. همچنین این نتایج نشان داده که امکان تولید این ماده با ارزش دارویی در شرایط کشت بافت وجود داشته اما مطالعات بیشتری باید در این خصوص انجام شود.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه گلستان به دلیل حمایت مالی انجام این طرح نهایت تشکر و قدردانی را دارند.

1-      ارزانی، ح.، مظفری، م.، مقدم، م.ر.، دادخواه، م. 1379. بررسی بوم‏شناختی گونه‏های Ephedra spp در منطقه بیارجمند شاهرود. مجله منابع طبیعی ایران. جلد53. شماره 2. 111-99.

2-      اسدی، م.، 1376، فلور ایران، شماره 22: تیره ارمک. مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع.

3-      باهر، ز.، احمدی، ل.، باباخانلو، پ.، 1379. بررسی مقایسه‎ای مقادیر آلکالوئیدهای افدرین و پزدوافدرین در گونه‎های افدرای ایران. تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران. (6): 65-48.

4-      قهرمان،ا،1373 .کورموفیتهای ایران(سیستماتیک گیاهی)،جلداول مرکزنشردانشگاهی تهران.

 

5-       Abourashed, E.A., Abir, T., El-Alfy, A.T., Khan, I.A., Walker, L. 2003.Ephedra in Perspective – a Current Review.Phytotherapy Research. 17: 703-712.

6-       Dhiman, M., Sharma, V. 2010.Regeneration of Plants from Somatic Embryos Derived from Stem Culture in Ephedra foliate.Plant Tissue Cult.& Biotech. Dhaka, Bangladesh. pp. 19‐25.

7-       Fukushima, K. 2004. Bioactivity of Ephedra: integrating cytotoxicity assessment with real- time biosensing. The Faculty of the Graduate School of the University of Maryland, College Park, in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science.

8-       Garla, M., Pratush, A., Kumar, S., Singh, S., Shivani, S. 2011. In-vitro callus induction and shoot regeneration in Ephedra – A medicinal Plant. Annals of Biological Research. 2 (6):645-651.

9-       Hagel, J.M., Krizevski, R., Marsolais, F., Lewinsohn, E., Facchini, P.J. 2012.Biosynthesis of amphetamine analogs in plants.Trends in Plant Science. 17: 404-412.

10-   Hejazi, G.A.E., El-lamey, T.M. 2011. Callus induction and extraction of ephedrine from Ephedra alataDecne. Culture.American-Eurassian JournalAgriculture and Invironmental Science. 11: 19-25.

11-   O’Dowd, N.A., Mccauley, P G., David, H.S, Richardson & Graham, Wilson. 1993 Callus production, suspension culture and in vitroalkaloid yields of Ephedra. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 34: 149-155.

12-   Murashige, T.,Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. PhysiologiaPlantarum. 15: 473- 497.

13-   Okada, T., Mikage, M., Sekita, S. 2008. Molecular characterization of the phenylalanine ammonia lyase from Ephedra sinica. Biological & Pharmaceutical Bulletin.31: 2194-2199.

14-   Parsaeimehr, A., Sargsyan, E., Javidnia, K. 2010. A Comparative Study of the Antibacterial, Antifungal and Antioxidant Activity and Total Content of Phenolic Compounds of Cell Cultures and Wild Plants of Three Endemic Species ofEphedra.Molecules. 15, 1668-1678.

15-   Shamsa, F., Monsef, H., Ghamooshi, R., Verdian-rizi, M. 2008.Spectrophotometric determination of total alkaloids in some Iranian medicinal plants. The Thai Journal of Pharmaceutical Sciences. 32: 17-20.

16-   Sheu, S.J., Huang, M.H. 2001.Determination of Ephedra alkaloids by high performance liquid chromatography.Chromatographia. 54: 117-119.

17-   Yang, Y., Geng, B.Y., Dilcher, D.L., Chen, Z.D., Lott, T.A. 2005.Morphology and affinities of an Early Cretaceous Ephedra (Ephedraceae) from china.American Journal of Botany. 92(2): 231-241.