نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

کتان سفید Linum album یکی از گیاهان دارویی بومی ایران حاوی ماده موثرة پودوفیلوتوکسین (PTOX) می‌باشد. این ماده ارزشمند دارویی به عنوان پیش ماده، برای سنتز داروهای ضدتوموری مهم مانندEtoposide ، Teniposide وEtopophos استفاده می‌شود. کشت بافت گیاهی روشی مناسب برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی می‌باشد. در این تحقیق، القا کالوس به منظور باززایی در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفته است. جدا کشت نوساقه در محیط کشت MS حاوی ترکیب هورمون‏های KIN با غلظت‏‌های (4/0- 2/0- 0) میلی گرم در لیتر وNAA با غلظت‌های‏ (5/2- 2- 5/1- 1- 8/0- 4/0- 0) میلی گرم در لیتر در تاریکی قرار گرفت. بیشترین وزن کالوس در محیط کشت MS حاوی ترکیب هورمونی 2 میلی گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی گرم در لیتر KIN به دست آمد. کالوس‏ها به محیط کشت MS حاوی غلظت‌های 1 تا 5/2‏ میلی گرم در لیتر BAP تنها یا در ترکیب با 2/0 میلی گرم در لیتر NAA برای باززایی نوساقه انتقال یافتند که بهترین تیمار برای باززایی نوساقه، تیمار هورمونی 2 میلی گرم در لیتر BAP بود. بیشترین درصد ریشه زایی نوساقه در محیط کشت MS2/1 حاوی 1 میلی گرم در لیتر NAA مشاهده گردید

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

In vitro Regeneration of White Flax (Linum album Kotschy ex Boiss) Medicinal Plant

نویسندگان [English]

  • neda javadian
  • mohsen sharifi
  • AHMAD moieni

modares university

چکیده [English]

Linum album of the member Linaceae is a herbaceous Iranian endemic medicinal plant, having podophyllotoxin (PTOX) metabolite. This important pharmaceutical compound used as a precursor for the synthesis of important antitumor drugs like Etoposide, Teniposide and Etopophos. Plant tissues culture is a appropriate method of increasimg secondary metabolits production. In this research, callus induction were investigated to regeneration under in vitro condition. Calli were initiated from shoot segment of young plant on Murashige and Skoog (MS) culture medium supplemented with (0- 0.4- 0.8- 1- 1.5- 2- 2.5 mg l-1) naphthalene acetic acid (NAA) and (0- 0.2- 0.4 mg l-1 ) kinetin (KIN) in the dark. The heaviest callus were obtained in 2 mg l-1 NAA with 0.4 mg l-1 KIN. Then, calli were transferred to MS medium supplemented with 6-benzyladenine (1-2.5 mg l-1 BA) either alone or in combination with 0.2 mg l-1 NAA for shoot regeneration. The 2.0 mg l-1 BA was identified more effective on shoot regeneration. For induction root from shoots, the optimal result obtained from half-strength MS medium supplemented with 1 mg l-1 NAA.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Linum album
  • Medicinal plant
  • In vitro culture
  • callus induction
  • Regeneration

باززایی درون شیشه‌ای گیاه دارویی کتان سفید (Linum album Kotschy ex Boiss)

ندا جوادیان1، قاسم کریم­زاده1*، محسن شریفی2 و احمد معینی1

1 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح­نباتات و بیوتکنولوژی

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست­شناسی گیاهی

تاریخ دریافت: 15/9/92                تاریخ پذیرش: 25/12/92

چکیده

کتان سفید ( Linum album )یکی از گیاهان دارویی بومی ایران است که حاوی ماده موثرة پودوفیلوتوکسین (PTOX) می­باشد. این ماده ارزشمند دارویی به­عنوان پیش­ماده، برای سنتز داروهای ضدتوموری مهم مانندEtoposide ، Teniposide وEtopophos  استفاده می­شود. کشت بافت گیاهی روشی مناسب برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی می باشد. در این تحقیق، القا کالوس بمنظور باززایی در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفته است. جدا­کشت نوساقه در محیط کشت MS حاوی ترکیب هورمون‏هایKIN  با غلظت‏­های (4/0- 2/0- 0) میلی­گرم در لیتر وNAA  با غلظت­های‏ (5/2- 2- 5/1- 1- 8/0- 4/0- 0) میلی­گرم در لیتر در تاریکی قرار گرفت. بیشترین وزن کالوس در محیط کشت MS حاوی ترکیب هورمونی 2 میلی­گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN به­دست آمد. کالوس‏ها به محیط کشت MS حاوی غلظت­های 1 تا 5/2‏ میلی­گرم در لیتر BAP تنها یا در ترکیب با 2/0 میلی­گرم در لیتر NAA برای باززایی نوساقه انتقال یافتند که بهترین تیمار برای باززایی نوساقه، تیمار هورمونی 2 میلی­گرم در لیتر BAP بود. بیشترین درصد ریشه­زایی نوساقه در محیط کشت MS2/1 حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد.

واژه‌های کلیدی: کتان سفید، Linum album، گیاه دارویی، کشت درون شیشه‏ای، القا کالوس، باززایی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884479 پست الکترونیکی: karimzadeh_g@modares.ac.ir

مقدمه

 

کتان سفید (Linum album) گیاهی علفی چند ساله با خاصیت دارویی از خانواده کتان (Linaceace) و گونه بومی و انحصاری ایران است که دارای مقادیر قابل­توجهی پودوفیلوتوکسین (Podophyllotoxin; PTOX) می‌باشد (17 ، 25 .(این ماده محصول طبیعی مهم دارویی است که به گروه شیمیایی لیگنان‌ها تعلق دارد که گروه بزرگی از متابولیت‏های ثانویه گیاهان را تشکیل می‌دهند. مسیر بیوسنتزی PTOX و لیگنان‌های مشابه هنوز به­طور­کامل مشخص نشده است اما مطالعات دقیقی به­علت اهمیت بالینی آنها انجام شده است که نشان می­دهد این ماده دارای خاصیت ضد­تومور سرطانی و ضد­باکتریایی می­باشد. به­دلیل اثرات جانبی مضر برای انسان، استفاده پزشکی آن محدود است ولی مشتقات نیمه­سنتزی آن مانند
Etoposide ، Teniposide وEtopophos  در درمان سرطان کاربرد فراوان دارد (20). تولید صنعتی این ترکیب به­دلیل ساختار شیمیایی پیچیده، از لحاظ اقتصادی امکان­پذیر نیست (25). بنابراین، فناوری کشت بافت و سلول به­دلیل امکان استفاده از عوامل مختلف در محیط کشت (منبع کربن، تنظیم­کننده رشد گیاهی و ...) روشی موثر در افزایش این ترکیب با­ارزش در گیاه در ­نظر گرفته می‏شود (10). به­علاوه، روش‌های تکثیر درون شیشه ابزار قدرتمندی برای حفظ ژرم­پلاسم و تکثیر انبوه به­شمار می­رود (19). در کشت بافت L. album تولید کالوس بمنظور ایجاد سوسپانسیون سلولی از جدا­کشت نوساقه در محیط کشت MS حاوی ترکیب هورمونی 2 میلی­گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN گزارش شده است (25). همچنین Smollny و همکارانش (1998) محیط کشت MS حاوی هورمون 4/0 میلی­گرم در لیتر NAA را بهترین غلظت برای تولید ماده  PTOXدر سوسپانسیون سلولی در گیاه L. album معرفی کردند (21). تاکنون باززایی در این گیاه گزارش نشده است اما باززایی تحت تیمارهای هورمونی از جدا­کشت‏های مختلف در دیگر ژنوتیپ‏های کتان زراعی (Linum usitatissimum) بررسی شده است. در تحقیقی، Chen و Dribnenki (2002) اثر ژنوتیپ و ترکیبات محیط کشت روی باززایی نوساقه از کشت بساک را بررسی کردند .نتایج حاصل نشان داد که ژنوتیپ و نوع محیط کشت بر باززایی نوساقه تأثیر معنی­داری داشت (7). تحقیقاتی را  Burbulisو همکارانش (2009) بر روی ژنوتیپ‏های مختلف کتان زراعی انجام دادند که بیشترین (94 درصد) پتانسیل باززایی نوساقه از هیپوکوتیل در ژنوتیپBarabara  و Mikael در محیط کشت MS  حاوی 2 میلی­گرم در لیتر TDZ و 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA به­دست آمد، در­حالی­که برای واریتهSzaphir  در محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی­گرم در لیترNAA  مقدار باززایی نوساقه 100 درصد بود (6). در مطالعه دیگری روی برخی از ژنوتیپ‏های این گونه بالاترین باززایی نوساقه از لپه‏ها در محیط کشت MS حاوی هومورن 1 میلی­گرم در لیتر BAP گزارش کردند (5). همچنین Jain و Rashid (2001) محیط کشت MS حاوی هورمون 1/0 میکرو­مولار TDZ را بهترین محیط برای تولید نوساقه از هیپوکوتیل در ژنوتیپ Neelam کتان زراعی معرفی کردند (12). برای تحقیق بیشتر روی ترکیبات بیوشیمیایی و دارویی در L. album، سیستم باززایی درون شیشه‌ای مؤثری مورد نیاز است، زیرا گیاهان رشد­یافته در شرایط درون شیشه‌ای ممکن است در معرض تغییرات فصلی و سوماتیکی، هجوم باکتری‌ها، قارچ‌ها و حشرات، همچنین آلودگی‌های محیطی قرار بگیرند که می تواند مقدار ماده با­ارزش دارویی گیاه را تحت تأثیر قرار دهد (11). علاوه بر این، مهندسی مسیرهای متابولیسمی می­تواند باعث افزایش تولید متابولیت‏های مهم گیاهی شود (25). پیش­نیاز اصلی و مهم در این موارد، وجود یک سیستم بهینه کالوس­زایی و باززایی در گیاه مورد نظر است. بنابراین، تحقیق حاضر با هدف باززایی گیاه کتان سفید از کالوس انجام شد.

مواد و روشها

بذرهای گیاه دارویی کتان سفید (L. album) از منطقه طالقان با عرض جغرافیایی 36 درجه و 7 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 50 درجه و 35 دقیقه شرقی و ارتفاع 1870 متری از سطح دریا در مردادماه سال 1390 جمع­آوری شدند. بذرها به­مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت­سدیم 2% (w/v)، 10 دقیقه در محلول آب­اکسیژنه 11% (v/v)، سپس به­مدت 1 دقیقه در اتانول 70%(v/v)  ضدعفونی شدند. بذرها بعد از هر مرحله 3 بار (هر بار 5 دقیقه) با آب­مقطر استریل شستشو داده شدند. بمنظور شکستن خواب بذرها از اسیدجیبرلیک ( ppm500) و سرما ( °C4 به­مدت 12 ساعت) استفاده شد و روی محیط کشت MS (16) حاوی 3% ساکارز و 8/0% آگار- آگار کشت گردید و در دمای °C 2± 25 و دوره نوری 8/16 ساعت تاریکی/ روشنایی قرار گرفتند. 8 هفته بعد از کشت بذر‌ها، نوساقه‌ها به قطعات 5 میلی‏متری جدا و به­عنوان جداکشت استفاده شدند. جداکشت­ها بمنظور تولید کالوس در محیط کشت MS حاوی هورمون‏های KIN با 3 غلظت‏ (4/0- 2/0- 0) میلی­گرم در لیتر وNAA  با غلظت‏های (5/2- 2- 5/1- 1- 8/0- 4/0-0) میلی­گرم در لیتر در تاریکی قرار گرفتند. جداکشت‌ها بعد از 1 ماه در محیط‏های با همان ترکیب هورمونی واکشت شدند. سپس کالوس‏های حاصل برای باززایی نوساقه در محیط کشت MS حاوی 4 غلظت‏ مختلف (5/2 - 2- 5/1- 1) میلی­گرم در لیترBAP  یا در ترکیب با 2/0 میلی­گرم در لیتر NAA قرار گرفتند. بمنظور ریشه­دار کردن، نوساقه‏ها در محیط کشت MS2/1 حاوی هورمون‏های IAA، IBA یاNAA  با 4 غلظت‏ (2 - 5/1- 1- 5/0) میلی­گرم در لیتر قرار گرفتند. در هر مرحله محیط کشتMS  بدون­هورمون به­عنوان شاهد در نظر گرفته شد.

طرح آزمایشی برای تعیین غلظت‏های مناسب هورمون برای القای کالوس به­صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی و در مرحله باززایی نوساقه و ریشه­زایی آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و کلیه تیمارهای هورمونی در 3 تکرار انجام شدند. برای انجام تجزیه واریانس القای کالوس و صفات مختلف ریشه به تمام داده‌ها به­دلیل داشتن داده صفر، 5/0 اضافه شده و نرمال کردن دادها بترتیب با استفاده از روش NSCOR و square root انجام شد. اما داده­های حاصل از باززایی نوساقه نرمال بودند. مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون چند­دامنه‏ای دانکن محاسبه گردید و برای تجزیه و تحلیل داده­های آزمایش از نرم‏افزارهای SPSS19 و Minitab 16 استفاده شد.

نتایج 

کالوس‏ها بعد از 1 ماه در اطراف جدا­کشت‌ها مشاهده شدند (که نرم، ترد و سفید بودند). جداکشت­ها در محیطهای با همان ترکیب هومورمونی واکشت1 شدند. پس از 2 ماه درصد کالوس‏زایی و وزن‏­تر کالوس اندازه‏گیری گردید. در تمام محیط‏های کشت MS با غلظت‌های مختلف NAA و KIN بجز محیط کشت حاوی تنها KIN و بدون­هورمون، 100 درصد کالوس­زایی مشاهده شد اما بین این تیمارها از نظر مقدار تولید کالوس تفاوت وجود داشت. تجزیه واریانس داده­ها برای وزن­تر کالوس (جدول 1) نشان داد که اثرات ساده هورمون‌های NAA و KIN و همچنین اثر متقابل آنها بترتیب در سطوح احتمال 1 و 1/0 درصد تفاوت معنی‌داری نشان دادند.

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس برای صفت وزن کالوس حاصل از نوساقه در غلظت‏های مختلف KIN و NAA در محیط کشت MS در کتان سفید
(L. album)

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

وزن تر کالوس (گرم) 

غلظت KIN

2

***758/1

غلظت NAA

6

***538/7

 NAA× KIN

12

**294/0

خطا

42

095/0

ضریب تغییرات (%)

 

3/15

**، *** وجود اختلاف معنی‌دار بترتیب در سطوح احتمال 1 و 1/0 درصد

 

 

مقایسه میانگین‌های اثر متقابل نشان داد که بیشترین مقدار وزن کالوس در محیط کشت حاوی 2 میلی­گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN به­دست آمد (جدول 2) که در مقایسه با شاهد‌ها تفاوت قابل ملاحظه­ای نشان دادند.

میانگین وزن کالوس در محیط کشت NAA بدون KIN کمترین مقدار را دارد و با افزایش مقدار هورمون KIN در ترکیب با غلظت­های مختلف NAA میانگین وزن­تر کالوس به­طور معنی­داری افزایش یافت (نتایج ارائه نشده).

جدول 2- مقایسه میانگین محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف KIN و NAA برای صفت وزن کالوس حاصل از نوساقه در کتان سفید (L. album)

غلظت تیمارهای هورمونی (میلی­گرم در لیتر)

وزن کالوس (گرم)

KIN

NAA

0/0

0/0

 k       000/0 ± 00/0

0/0

4/0

 jk       034/0 ± 75/0

0/0

8/0

 ghi    089/0 ± 19/1

0/0

0/1

 fghi   046/0 ± 22/1  

0/0

5/1

bc      080/0 ± 71/1

0/0

0/2

 def    093/0 ± 42/1

0/0

5/2

 defg  123/0 ± 37/1

2/0

0/0

 k       000/0 ± 00/0

2/0

4/0

 ij       093/0 ± 11/1

2/0

8/0

 efghi 077/0 ± 28/1

2/0

0/1

 efghi 026/0 ± 30/1

2/0

5/1

 bc     113/0 ± 73/1

2/0

0/2

 b       075/0 ± 96/1

2/0

5/2

 efghi011/0 ± 31/1

4/0

0/0

 k       000/0 ± 00/0

4/0

4/0

 hij    067/0 ± 17/1

4/0

8/0

 defgh077/0 ± 35/1

4/0

0/1

 de     017/0 ± 39/1

4/0

5/1

 bc     084/0 ± 82/1

4/0

0/2

 a       075/0 ± 38/2

4/0

5/2

 cd     058/0 ± 57/1

میانگین‌‌های با حروف لاتین مشابه تفاوت معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد با یکدیگر ندارند.

کالوس‏ها برای باززایی نوساقه به محیط کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف ترکیب هورمونی BAP+NAA و BAP قرار گرفتند. باززایی نوساقه از کالوس‏ها در محیط کشت حاوی ترکیب هورمون­های BAP با NAA مشاهده نشد. جدول تجزیه واریانس برای 2 صفت تعداد نوساقه و طول نوساقه (جدول 3) نشان می‏دهد از نظر این 2 صفت اختلاف معنی‏داری بین محیط‏های حاوی غلظت­های مختلف ‏ BAP بترتیب در سطح احتمال 1 و 1/0 درصد وجود داشت.

نتایج مقایسه میانگین‌ها برای غلظت‏های مختلف BAP نشان داد که با افزایش مقدار هورمون تا مقدار 2 میلی­گرم در لیتر تعداد نوساقه افزایش می­یابد و بیشترین تعداد نوساقه از کالوس در محیط کشت حاوی 2 میلی­گرم در لیتر BAP به­دست آمد. همچنین بلندترین نوساقه­ها در 2 و 5/2 میلی­گرم در لیتر BAP رشد کردند (جدول 4).

نوساقه‏های باززایی شده بمنظور طویل شدن، در محیط کشت MS حاوی 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN به مدت 1 ماه قرار داده شدند. نوساقه‌ها در اندازه 4-3 سانتی­متر به محیط کشت MS2/1 حاوی غلظت‏های مختلف IAA ، IBA یا NAA برای ریشه­دار کردن منتقل شدند. در محیط‏های کشت حاوی IAA،IBA  القای ریشه مشاهده نشد. نتایج تجریه واریانس نشان داد (جدول 5) که بین غلظت‏های مختلف NAA بر درصد القا، تعداد و طول ریشه در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی­داری وجود دارد.

 

 

جدول 3- تجزیه واریانس برای صفات مورد مطالعه در باززایی نوساقه بر کالوس در غلظت‏های مختلف BAP در محیط کشت MS در کتان سفید (L. album)

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

تعداد نوساقه

طول نوساقه (سانتی­متر)

BAP

3

 **556/12

***239/1

خطا

8

        000/1

064/0

ضریب تغییرات (%)

 

1/26

5/15

**، ***: وجود اختلاف معنی­دار به‌ترتیب در سطوح احتمال 1 و 1/0 درصد

جدول 4- مقایسه میانگین‌های دو صفت تعداد و طول نوساقه باززایی شده از کالوس در محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف BAP در کتان سفید (L. album)

غلظتBAP  (میلی­گرم در لیتر) 

تعداد نوساقه

طول نوساقه (سانتی­متر) 

0/1

33/1 ± 33/0 c

87/0 ± 16/0 c

5/1

67/3 ± 33/0 b

36/1 ± 16/0 b

0/2

33/6 ± 88/0 a

03/2 ± 15/0 a

5/2

00/4 ± 57/0 b

28/2 ± 10/0 a

در هر ستون، میانگین‌های با حروف لاتین مشابه تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند.

 

جدول 5- تجزیه واریانس برای صفات مورد مطالعه در باززایی ریشه بر نوساقه در غلظت‏های مختلف NAA در محیط کشت MS2/1 در کتان سفید (L. album)

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد القا ریشه

تعداد ریشه

طول ریشه (میلی‌متر)

NAA

3

*258/15

*550/0

ns381/0

خطا

8

556/2

074/0

093/0

ضریب تغییرات (%)

 

5/38

1/21

4/22

ns، *: به‌ترتیب وجود اختلاف غیر معنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد

 

 

بر اساس نتایج مقایسه میانگین‏های صفات مختلف تولید ریشه، بیشترین درصد القا و تعداد ریشه در تیمار 1 میلی­گرم در لیتر NAA به­دست آمد و بین سایر غلظت­های مختلف NAA از نظر این 2 صفت اختلاف معنی‏داری وجود نداشت. طول ریشه در غلظت­های مختلف NAA اختلاف معنی­داری با­ یکدیگر نداشتند و ریشه طویل­تر در محیط حاوی 1 میلی­گرم در لیتر هورمون NAA تولید شد. همچنین غلظت­های بیشتر اکسین موجب القای کالوس ناخواسته در ساقه گردید (جدول 6، شکل 1).

 

 

جدول 6- مقایسه میانگین‌های دو صفت درصد القا ریشه و تعداد ریشه باززایی شده بر نوساقه در محیط کشت MS 2/1 حاوی غلظت‌های مختلف NAA در کتان سفید (L. album) 

غلظتNAA  (میلی‌گرم در لیتر) 

درصد القا ریشه

تعداد ریشه 

5/0

11/11 ± 68/0 b

67/0  ± 15/0 b

0/1

00/50 ± 15/1 a

00/3  ± 17/0 a

5/1

22/22 ± 55/0 b

33/1  ± 12/0 b

0/2

55/5   ± 13/1 b

33/0  ± 17/0 b

در هر ستون، میانگین‌های با حروف لاتین مشابه تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند.

 

 





 


بحث

در این تحقیق برای تولید کالوس در گیاه دارویی کتان سفید از ترکیب 2 هورمون  NAAو KIN استفاده شد. همان­طور که مشخص گردید بیشترین وزن کالوس‏ در محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN در تاریکی انجام ‏شد که با مقدار ترکیب هورمون‏های استفاده شده توسط Yousefzadi و همکاران (2010) در محیط کشت MS برای القای کالوس از نوساقه در این گیاه مطابقت دارد (25).

 

شکل 1- کالوس­زایی و باززایی درون شیشه­ای درL. album . الف) کالوس­های حاصل از ریزنمونه قطعات نوساقه در محیط کشتMS  حاوی 2  میلی­گرم در لیتر NAA و 4/0 میلی­گرم در لیتر KIN در تاریکی، ب) باززایی نوساقه از کالوس در محیط کشت حاوی 2  میلی­گرم در لیتر BAP، پ و ت) باززایی ریشه بر نوساقه‏ها در محیط کشت MS2/1 حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA.

نتایج تحقیقات Fakhari و همکاران (2013) نشان داد که وزن کالوس کتان سفید در محیط کشت MS حاوی ترکیب مختلفKIN  با 3 غلظت‏ (4/0- 2/0-0 میلی­گرم در لیتر) وNAA  با 2 غلظت‏ (1- 4/0 میلی­گرم در لیتر) اختلاف معنی­داری نداشتند (9)، در­حالی­که نتایج مطالعه حاضر نشان داد که ترکیب هورمونیNAA  بدون KIN کمترین مقدار وزن کالوس را تولید کرد. در مطالعه­ای دیگر،Behar  و همکاران (2011) تنها KIN در غلظت‌های 1، 75/0، 5/0، 25/0، 0 میلی­گرم در لیتر برای تولید کالوس و باززایی نوساقه از جدا­کشت نوساقه کتان زراعی استفاده کردند که در تمام محیط‏ها کالوس و نوساقه مشاهده شد (4) که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت ندارد. زیرا وجود اکسین (NAA) در محیط­ کشت برای القای کالوس در تحقیق حاضر ضروریست؛ به­طوری­که در محیط‏های فاقد هورمون یا KIN تنها کالوس مشاهده نشد. اکسین همراه با سیتوکینین در محیط کشت برای القای کالوس در ­برخی گیاهان مانندPhyllanthus Acidus  (8)، Brassica napus (22) و Gossypium hirsutum  (16) ضروری می­باشد. این تحقیق، نخستین گزارش از باززایی کتان سفید
(L. album) در شرایط درون شیشه می­باشد اما باززایی در گونه‌های دیگر این جنس مانند گونه کتان زراعی بررسی شده است. برای باززایی نوساقه در این گیاه از هورمون BAP استفاده شد. گزارش‌های متعددی وجود دارد که نشان می‏دهد BAP یکی از هورمون‏های مؤثر در باززایی درون شیشه­ای کتان زراعی می‏باشد (14 ، 26). براساس نتایج به­دست آمده، بالاترین میزان باززایی نوساقه در محیط کشت MS حاوی 2 میلی‏گرم در لیتر BAP می­باشد و در محیط کشت حاوی BAP در ترکیب 2/0 میلی‏گرم در لیتر NAA باززایی نوساقه مشاهده نشد. این نتایج با برخی از مطالعات در مورد مقدار کم 02/0 میلی‏گرم در لیتر یا نبود NAA همراه با  BAPدر محیط کشت MS باززایی ساقه از لپه و هیپوکوتیل ارقام مختلف کتان زراعی مطابقت دارد (5، 24). از طرفی Kalyaeva و همکاران (15) نشان دادند که کاهش مقدار اکسین و نبود آن در محیط کشت باعث کاهش معنی­داری در باززایی ساقه از جداکشت هیپوکوتیل برخی از ژنوتیپ‏های کتان زراعی می‏شود. همچنین استفاده از هورمون‏های سیتوکینین متفاوت (TDZ و 2iP) در محیط کشت برای دستیابی به بیشترین تعداد تولید ساقه در ژنوتیپ‏های کتان زراعی در سایر تحقیقات گزارش شده است (6 ، 24). احتمالا این نتایج متفاوت در القا کالوس و باززایی نوساقه می­تواند به­دلیل تغییر در تعادل تنظیم­کننده‏های رشدی درونی در اندام‏های مختلف گیاه ‏باشد که نشان می‏دهد کالوس­زایی و باززایی نوساقه این گیاه به عواملی مانند ژنوتیپ منبع گیاهی مورد استفاده و نوع جداکشت آن وابسته است (1، 2، 13). در مطالعه حاضر، همچنین بیشترین درصد (50 درصد) ریشه­زایی در محیط کشت MS 2/1 حاوی 1 میلی­گرم در لیترNAA  مشاهده شد. در مطالعه­‌ای دیگر Vrbova و همکاران (2013) محیط کشت MS حاوی 005/0 میلی­گرم در لیترNAA  را برای ریشه­دار کردن نوساقه حاصل از هیپوکوتیل برخی ارقام کتان زراعی استفاده کردند (23). در گزارش دیگری در واریته Neela کتان زراعی برای ریشه­دار کردن نوساقه حاصل از شاخساره و گره‌های جانبی ساقه ازIBA  و NAA به­طور جداگانه از 4 غلظت‏ 2- 5/1- 1- 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA  استفاده شد و بیشترین ریشه‏زایی در محیط کشت  MS2/1 حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA  به­دست آمد (3). مطالعه حاضر، نخستین گزارش از باززایی کالوس حاصل از نوساقه در شرایط درون شیشه‏ای گیاه دارویی کتان سفید (L. album) بومی ایران می‏باشد. از نتایج این تحقیق می­توان در استفاده از روش­های بیوتکنولوژی برای بهبود ژنتیکی و مهندسی مسیرهای متابولیکی این گونه گیاهی بهره جست.

سپاسگزاری

از مسئولان محترم دانشگاه تربیت مدرس بدلیل حمایت مالی از این تحقیق تشکر و قدردانی می­شود.

1- رهنما، ح.، منتصر کوهساری، ش.، نادری مشکین، ح. و فهیمی، ح. 1391. باززایی با فراوانی بالا از قطعات جداکشت میانگره، برگ و ریزغده گیاه سیب زمینی (Solanum tuberosum L.). مجله زیست شناسی ایران، 25: 129-120.

2- هاتف سلمانیان، ع. و کهریزی، د. 1386. مطالعه تأثیر ژنوتیپ ونوع ریزنمونه بر روی باززایی نوساقه گیاهچه­های کلزا (Brassica napus L.). مجله زیست شناسی ایران، 20: 179-171.

 

3-Akter, F., Parvez, M. S., Islam, M. S., Mondol, P. C. and Alam, M. F. 2008. Effects of different hormones in vitro regeneration of linseed (Linum usitatissimum L.). Plant Environment and Development, 2(2): 135-138.

4-Behar, N., Kumar, P. and Chandel, G. 2011. Effect of explant type, genotype and plant growth regulators on morphogenetic potential of flax (Linum usitatissimum L.). Journal of Cell and Plant Sciences, 2(1): 13-18.

5-Belonogova, M. A. and Raldugina, G. N. 2006. Shoot regeneration from cotyledon explants of fibre flax (Linum usitatissimum) and their subsequent rooting. Russian Journal of Plant Physiology, 53(4): 501–506.

6-Burbulis, N., Blinstrubiene, A. and Kupriene, R. 2009. Regeneration of adventitious shoots of linseed (Linum usitatissimum L.) from hypocotyls explants. Zemdirbyste-Agriculture, 96(3): 168-175.

7-Chen, Y. and Dribnenki, P. 2002. Effect of genotype and medium composition on flax Linum usitatissimum L. anther culture. Plant Cell Reports, 21(3): 204-207.

8-Duangporn, P. and Siripong, P. 2009. Effect of auxin and cytokinin on phyllanthusol a production by callus cultures of Phyllanthus acidus skeels. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Sciences, 5 (2): 258-263.

9-Fakhari, S., Sharifi, M., Yousefzadi, M. and Beshamgan, E. 2013. Effect of some phytohormones on podophyllotoxin production in cell and plantlets cultures of Linum album. Journal of Medicinal Plants and By-Products,1: 83-89.

10-Farkya, S, Bisaria, V. S. and Shrivastava, A. K. 2004. Biotechnological aspects of the production of the anticancer drug podophyllotoxin. Applied Microbiology Biotechnology, 65(5): 504-519.

11-Geng, S., Ma, M., Ye, H. C., Liu, B. Y., Li, G. F. and Cong, K. 2001. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. Plant Science, 160(4): 691-698.

12-Jain, P. and Rashid, A. 2001. Stimulation of shoot regeneration on Linum hypocotyl segments by thidiazuron and its response to light and calcium. Biologia Plantarum, 44(4): 611-613.

13-Janowicz, J., Niemann, J. and Wojciechowski, A. 2012. The effect of growth regulators on the regeneration ability of flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyl explants in in vitro culture. Journal of Biotechnology, Computational Biology and Bionanotechnology, 93(2): 135-138.

14-Janowicz, J. and Wojciechowski, A. 2009. The evaluation of regeneration ability of two flax (Linum usitatissimum L.) cultivars in in vitro culture. Oilseed Crops, 30(1): 35-50.

15-Kalyaeva, N. M., Zakharchenko, N. S., and Bur’yanov, Y. I. 2000. Features of fiber flax plant regeneration. Biotekhnologiya, 6: 34–40.

16-Michel, Z., Hilaire, K. T., Mongomake, K., Georges, A. N. and Justin, K. Y. 2008. Effect of genotype, explants, growth regulators and sugars on callus induction in cotton (Gossypium hirsutum L.). Australian Journal of Crop Science, 2: 1-9.

17-Mohagheghzadeha, A., Hemmatia, Sh. and Alfermannb, W. 2006. Quantification of aryltetralin lignans in Linum album organs and in vitro cultures. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1): 47-56.

18-Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473-497.

19-Murch, S. J., KrishnaRaj, S. and Saxena, P. K. 2000b. Phytomaceuticals: mass production, standardization, and conservation. Scientific Review of Alternative Medicine, 4(2): 39-43.

20-Petersen, M. and Alfermann, A. W. 2001. The production of cytotoxic lignans by plant cell cultures. Applied Microbiology and Biotechnology, 55(2): 135-142.

21-Smollny, T., Wichers, H., Kalenberg, S., Shahsavari, A., Petersen, M., Alfermann, A. W. 1998. Accumulation of podophyllotoxin and related lignans in cell suspension cultures of Linum album. Phytochemistry, 48(6): 975-979.

22-Tavakkol Afshari, R., Angoshtari, R. and Kalantari, S. 2011. Effects of light and different plant growth regulators on induction of callus growth in rapeseed (Brassica napus L.) genotypes. Plant Omics Journal, 4(2): 60-67.

23-Vrbova, M., Kotrba, P., Horacek, J., Petr Smykal, P., Svabova, L., Vetrovcova, M., Smykalova, I. and Griga, M. 2013. Enhanced accumulation of cadmium in Linum usitatissimum L. plants due to overproduction of metallothionein α-domain as a fusion to β-glucuronidase protein. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 112(3): 321-330.

24-Yildiz, M. and Özgen, M. 2006. A comparison of growth regulators for adventitious shoot regeneration from hypocotyls of flax (Linum usitatissimum L.). Journal of Food, Agriculture and Environment, 4(3): 171-174.

25-Yousefzadi, M., Sharifi, M., Behmanesh, M., Moyano, E., Bonfill, M., Cusido, R. M. and Palazon, J. 2010. Podophyllotoxin: Current approaches to its biotechnological production and future challenges. Engineering in Life Sciences, 10(4): 281-292.

26-Zhan, X. C., Jones, D. A. and Keer, A. 1989. In vitro plantlet formation in Linum marginale from cotyledons, hypocotyls, leaves, roots and protoplasts. Australian Journal of Plant Physiology, 16(4): 315-320.