القای جنین‌های سوماتیکی اولیه از جداکشت برگ در نارون ملج (Ulmus glabra)

سیده مریم میرعباسی¹، بتول حسین‌پور^2*، سیدعلی قائم‌مقامی³ و محمد رضا سنجابی²

¹ تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

² تهران، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده کشاورزی، گروه تولیدات گیاهی و کشاورزی پایدار

³ تهران، سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده کشاورزی 

تاریخ دریافت: 19/7/92                تاریخ پذیرش: 25/2/93

چکیده

نارون ملج (Ulmus glabra) گونه ای جنگلی است که از لحاظ اقتصادی ارزش بالایی دارد اما به دلیل حساسیت به بیماری مرگ هلندی، نارون در معرض نابودی قرار گرفته است. به همین دلیل تکثیر درون شیشه این گیاه جهت اصلاح ژنتیکی آن حائز اهمیت است. در این تحقیق برای اولین بار جنین‌های سوماتیک کروی شکل بطور مستقیم از جداکشت برگ گیاهان درون شیشه ای به دست آمد. در آزمایش اول ریزنمونه های دو ژنوتیپ مختلف بر روی محیط MS حاوی BA یا Kin و یا TDZ در شرایط نوری کشت شدند. آزمایش دوم شامل محیط MS حاوی 200 میلی گرم در لیتر کازئین هیدرولیزات به همراه غلظت های متفاوتی از 2,4-D و Kin در شرایط تاریکی بود. در آزمایش سوم محیط MS ½ همراه با 200 میلی گرم در لیتر کازئین هیدرولیزات و سطوح پایین 2,4-D  به همراه سطوح مختلف Kin در شرایط نور یا تاریکی آزمون شد. جنین های سوماتیک کروی شکل به صورت مستقیم در تیمارهای آزمایش سوم و در ژنوتیپ شماره دو تولید شد. درصد جنین زایی در اکثر تیمارهای آزمایش سوم صددرصد بود اما بالاترین میانگین تعداد جنین به ازای هر جداکشت مربوط به تیمار 2/0 میلی گرم در لیتر 2,4-D (48/60) و تیمار 4/0 میلی گرم در لیتر 2,4-D همراه با 2/0 میلی‌گرم در لیتر Kin (76/47) می باشد. نتایج نشان داد که درصد جنین زایی و میانگین تعداد جنین به ازای هر جداکشت در شرایط تاریکی در مقایسه با شرایط نوری بسیار بالاتر بود.

واژه‌های کلیدی: برگ، جنین‌زایی سوماتیکی، ملج 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09127341544 ، پست الکترونیکی: hosseinpour@irost.ir

مقدمه

گونه نارون ملج  (Ulmus glabra )از گونه های بسیار با ارزش جنگلی است که به دلیل قطع بی رویه و کاهش جمعیت این گونه و از طرفی حساسیت به بیماری مرگ هلندی نارون در حال انقراض می‌باشد. به همین دلیل وجود یک روش تکثیر درون شیشه ای برای این گیاه جهت حفظ ذخایر ژنتیکی باقی مانده در این گونه و همچنین اصلاح مولکولی آن حائز اهمیت است. جنین زایی سوماتیکی یکی از روش های تکثیر درون شیشه ای است که نسبت  به  روشهای  دیگر  مزیت هایی  از  لحاظ

کاهش دوره تکثیر و بالا بودن راندمان تولید دارد.

در ایران گونه نارون ملج در ارتفاعات متوسط و فوقانی جنگل های شمال از ارسباران و آستارا و طالش تا کجور مازندران و گرگان انتشار دارد. چوب درختان نارون به خصوص ملج در ردیف یکی از بهترین چوب های صنعتی است که حدود 5/3 تا 4 درصد از میزان بهره برداری سالیانه کلیه چوب‌های جنگلی ایران را تشکیل می دهد. به طوری‌که حدود چهار درصد حجم تجارتی جنگل های شمال را درختانی از گونه های ملج و اوجا (U. minor)  تشکیل می‌دادند. اما امروزه به دلیل گسترش بیماری "مرگ هلندی نارون" و زوال، حدود کمتر از یک درصد از این حجم تجاری به گونه های ملج و اوجا تعلق دارد (23).

امکان انتشار عامل بیماری به وسیله سوسک های پوستخوار خانواده Scolytidae، این بیماری را از خیلی از بیماری های مشابه متمایز می کند (2). پاتوژن منتقل شده توسط این سوسکها قارچی است به نام Ophiostoma novo-ulmi که به صورت سیستمیک در گیاه پراکنده شده و باعث انسداد و ایجاد حفره در آوندهای چوبی و سرانجام علائم پژمردگی می شود (23).

در ایران طی چهل سال گذشته حدود یک میلیون درخت نارون اوجا و ملج بر اثر این بیماری از بین رفته اند. با شیوع بیماری، اروپا و آمریکای شمالی اقدام به کنترل بیماری با استفاده از روشهای شیمیایی و بیولوژیکی کردند (10). به طور کلی این روش ها پر زحمت و پر هزینه بوده و تأثیرات مثبت کمی داشته اند. برنامه اصلاحی و انتخاب نیز در کشورهای خارجی ازجمله باعث معرفی درختان متحمل به این بیماری با درجات متفاوت شده است اما مقاومتی که طی برنامه اصلاحی بوجود می آید احتمالا کمی بوده و از طرفی تکثیر سوماکلونال درختان باعث کاهش تنوع ژنتیکی و افزایش آسیب‌پذیری آنها می‌شود. در نتیجه حساسیت آنها به مسائل محیطی مثل آفات و بیماری های جدید افزایش می یابد. به علاوه اینکه روش‌های اصلاح درختان نیاز به زمان بسیار طولانی دارد.

ریزازدیادی در گونه های مختلف خانواده نارون گزارش شده است (11). در نارون ملج ریزازدیادی با استفاده از جوانه های جانبی توسط بیروسیکوا و همکاران مطالعه شده است (4). ذبیحی و همکاران (2008) کالوس زایی و باززایی از گره های درخت نارون ملج و همچنین شاخه زایی از جوانه های جانبی را گزارش کردند (1). اما ریزازدیادی از طریق القای جنین سوماتیکی به دلیل دارا بودن همزمان ساختار دوقطبی ساقه و ریشه نیازی به تغییر محیط کشت و محرک های هورمونی متفاوت جهت اندام زایی ندارد و به لحاظ کاهش زمان مورد نیاز جهت تکثیر بیشتر مورد توجه اصلاحگران می‌باشد (15). جنین زایی سوماتیکی به دو صورت غیرمستقیم (به واسطه کالوس) و یا مستقیم (بدون ایجاد کالوس) می تواند تشکیل شود که در حالت مستقیم ضمن صرف زمان کمتر و پایداری ژنتیکی، بسیار برتر می باشد (16،17،18،19). کاند و همکاران (2004) با استفاده از برگ گیاهان حاصل از تکثیر درون شیشه گونه نارون اوجا توانستند جنین غیرمستقیم تولید کنند (6). کوریدورا و همکاران (2002) نیز با استفاده از بذرهای نارس نارون اوجا و ملج جنین های ناقص به دست آوردند (8). اما جنین زایی از طریق بذر چندان مورد توجه اصلاحگران نیست، زیرا بذرهای متفاوت ژنوتیپهای متفاوتی خواهند داشت، ضمن اینکه از بین رفتن بذر مورد نظر معادل از بین رفتن یک ژنوتیپ خاص می باشد (26 و 27). تاکنون فقط جنین سوماتیکی غیرمستقیم در گونه های خانواده نارون گزارش شده است (6). در این تحقیق برای اولین بار جنین های سوماتیک کروی شکل به طور مستقیم بر روی برگ های درخت ملج بدست آمد و نشان داده شد که القای جنین سوماتیک به طور مستقیم در این گونه امکان‌پذیر می باشد.

مواد و روشها

به منظور ریز ازدیادی، دو پایه قوی و چند ساله نارون در فصل بهار انتخاب شد. جوانه های جانبی از شاخه های یکساله به طول 10 تا 20 سانتیمتر و قطر 4/0 تا 7/0 سانتی متر از قسمت تاج درخت جدا شدند. جوانه ها ابتدا با مایع ظرفشویی و آب جاری به مدت نیم ساعت شستشو داده شده و با پرسیدین (پراستیک اسید(peraceticacid)) یک دهم درصد حاوی دو تا سه قطره تویین به مدت 15 – 10 دقیقه ضد عفونی شدند. سپس با آب مقطر استریل حاوی 500 میلی گرم در لیتر پودر اسید سیتریک و به مدت 15 دقیقه شستشو داده شدند. جوانه های فلس‌دار به مدت 15 دقیقه و جوانه های جوانتر که فاقد فلس بودند و یا جوانه های انتهایی به مدت 10 دقیقه با این روش ضدعفونی شدند. جوانه های فلس‌دار فلس‌برداری شده و به ریزنمونه های دو تا سه سانتیمتری که هر یک دارای حداکثر دو جوانه بودند، تقسیم شدند. در مرحله استقرار ریزنمونه های جوانه‌دار به شیشه های مک کارتی حاوی محیط WPM (Woody Plant Medium) و 4/0 میلی گرم در لیتر  BAP (Banzil Amino Purin) منتقل شدند. در مرحله پرآوری جوانه هایی که پس از حدود چهار هفته تولید شاخساره به طول حدود سه سانتی متر کردند درون شیشه های مربایی حاوی محیط MS به همراه 2/0 میلی گرم در لیتر Topolin و 100 میلی گرم در لیتر آهن سکوسترین، 30 گرم در لیتر سوکروز، 7/5 گرم در لیتر آگار Duchefa (7/5pH ) واکشت شدند. ریزنمونه‌های برگی جهت آزمایش جنین زایی از سه برگ انتهایی نزدیک به مریستم و به ابعاد پنج میلی متر مربع جدا شده و با اسکالپل بر روی قطعات برگی زخم وارد شد. برای القای جنین زایی سه آزمایش انجام شد. در آزمایش اول از محیط MS (Murashige and Skoog) حاوی یکی از هورمون های BA (6-benzyl Adenine) یا Kinetin و یا TDZ (Thidiazuron) هریک با مقادیر 1/0، 2/0، 5/0 و1 میلی گرم در لیتر (در کل 12 تیمار) استفاده گردید. قطعات برگ هر دو ژنوتیپ بر روی هر تیمار کشت شده و در روشنایی قرار داده شدند. هر تیمار شامل چهار تکرار بوده و هر تکرار نیز حاوی پنج قطعه برگ بود. آزمایش دوم بر روی محیط پایه MS حاوی 200 میلی گرم کازئین هیدرولیزات ، 30 گرم سوکروز و 7/5 گرم آگار (7/5pH ) و سطوح بالای 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid)(0،5/0، 1، 5/1، 2 میلی گرم در لیتر) در ترکیب با Kin (0، 1/0، 2/0 میلی گرم در لیتر) انجام شد. مجموعا 15 تیمار به ازای هر ژنوتیپ اختصاص یافت که هر تیمار شامل چهار تکرار و هر تکرار شامل پنج قطعه برگ بود. تیمارها در دمای 25 درجه و در تاریکی قرار داده شدند. در آزمایش سوم محیط پایه½MS حاوی 200 میلی گرم در لیتر کازئین هیدرولیزات، 15 گرم در لیتر سوکروز و 7/5 گرم در لیتر آگار (7/5pH ) و سطوح پایین 2,4-D و Kin مورد استفاده قرار گرفت. تیمارهای مورد آزمایش شامل موارد زیر بودند:

1/0 میلی گرم در لیتر2,4-D  وKin  (0، 05/0، 1/0 میلی گرم در لیتر)؛

2/0 میلی گرم در لیتر2,4-D  وKin  (0، 05/0، 1/0، 2/0 میلی گرم در لیتر)؛

3/0 میلی گرم2,4-D  وKin  (0، 05/0، 1/0، 2/0، 3/0، میلی گرم در لیتر)؛

4/0 میلی گرم در لیتر2,4-D  وKin  (0، 05/0، 1/0، 2/0، 3/0، 4/0 میلی گرم در لیتر).

هر تیمار شامل سه تکرار و هر تکرار شامل هفت قطعه برگ بود. در آزمایش سوم تأثیر تاریکی٬ روشنایی و تاریکی-روشنایی نیز بر روی هر تیمار بررسی شد. تیمارهای تاریکی-روشنایی پس از سه روز قرارگرفتن در تاریکی در معرض نور قرار گرفتند.

داده‌برداری یک ماه پس از کشت انجام شد. فاکتورهای مورد ارزیابی شامل درصد جنین زایی و تعداد جنین به ازای هر جداکشت بوده است. در تمام مراحل استقرار، ریزازدیادی، آزمایش اول و بخشی از آزمایش سوم که نمونه ها در معرض روشنایی قرار گرفتند تناوب نوری 16 ساعتی و شدت نور 2000 لوکس اعمال گردید، دما نیز در تمام آزمایش ها °C2±24 بود. تجزیه و تحلیل داده ها توسط نرم افزار کامپیوتری SAS و با استفاده از روش ANOVA انجام شد. بدین‌ترتیب تجزیه واریانس اثر 2,4-D و Kin در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد و اثر نور و ترکیبات مختلف هورمونی به عنوان دو فاکتور در قالب طرح کاملا تصادفی فاکتوریل تجزیه گردیدند (جدول شماره 1، آزمایش سوم). برای مقایسه میانگین ها از آزمون دانکن در سطح یک درصد استفاده شد.

نتایج 

نمونه های برگ ژنوتیپ یک در هر سه آزمایش و ژنوتیپ دو نیز در آزمایش اول و دوم تولید کالوس غیر جنین‌زا کردند که از ذکر نتایج آزمایشهای کالوس زایی و باززایی در اینجا صرف نظر می شود.

تنها نمونه های برگ ژنوتیپ دو در آزمایش سوم تولید جنین کروی شکل کردند. روند شکل‌گیری جنین ها در ژنوتیپ دو به این صورت بود که جداکشتهای برگ پس از حدود سه تا چهار روز متورم شده و پس از حدود دو هفته تشکیل جنین های سوماتیک کروی شکل آغاز شد. جنین ها مستقیما بدون تشکیل فاز کالوس بر روی برگ ها تشکیل شدند. جنین قلبی شکل نیز با فراوانی بسیار کم در تیمار 1/0 میلی گرم در لیتر 2,4-D  و 1/0  میلی گرم در لیتر Kin مشاهده شد (شکل 1).

جدول 1- تغییرات مشاهده شده در برگ‌های جوان دو ژنوتیپ ملج در سه آزمایش طراحی شده برای القای جنین‌زایی

پس از ظهور جنین ها و در مراحل پایانی دوره کشت کالوس ها ظاهر شده و جنین ها را دربر گرفتند و در تعدادی نمونه نیز ریشه نابجا از کالوس خارج شد (شکل 2).

طبق جدول دو، 18 ترکیب مختلف بین دو هورمون 2,4-D و Kin تفاوت معنی داری نشان دادند. همچنین اثر شرایط نوری بر روی درصد جنین زایی و میانگین تعداد جنین های کروی شکل در هر جداکشت معنی دار بود.

شکل 2- مراحل ظهور جنین‌های سوماتیکی. شکل a ابتدای ظهور جنین‌های کروی شکل به صورت مستقیم را نشان می‌دهد که تقریبا در اواخر هفته دوم است. شکل b در پایان هفته سوم و همزمان با ظهور کالوسهای برفی می‌باشد. شکل c در پایان هفته چهارم بوده و ظهور ریشه با منشأ کالوس را نشان می‌دهد.

جدول 2- تجزیه واریانس مربوط به آزمایش اثر ترکیبات مختلف سطوح پایین 2,4-D و Kin در شرایط نوری مختلف بر درصد جنین‌زایی و میانگین تعداد جنین‌ها در هر برگ (ژنوتیپ دوم در آزمایش سوم)

**: احتمال معنی‌دار شدن در سطح یک درصد

نتایج آزمایش تأثیر تیمارهای نوری بر روی جنین زایی نشان داد که در آزمایش ما نور اثر بازدارنده‌ای بر روی فرایند جنین زایی داشت، به‌طوری‌که میانگین درصد جنین زایی در تاریکی 25/74 و در دو تیمار روشنایی و روشنایی-تاریکی به ترتیب 98/50 و 18/53 بود. البته دو تیمار روشنایی و روشنایی-تاریکی از لحاظ آماری تفاوت معنی داری نداشتند (شکل 3).

همچنین مقایسه اثر تیمارهای مختلف نوری بر روی میانگین تعداد جنین سوماتیک به ازای هر جداکشت نشان داد که از لحاظ آماری تاریکی تأثیر مثبت و نور تأثیر منفی داشت. میانگین تعداد جنین سوماتیک به ازای هر جداکشت در تیمارهای تاریکی 12/27 و در دو تیمار تاریکی-روشنایی و روشنایی به ترتیب 79/13 و 02/9  بود

(شکل 4).

با توجه به اثر مثبت تاریکی بر روی جنین زایی٬ در مقایسه اثر تیمارهای مختلف هورمونی بر روی درصد جنین زایی و میانگین تعداد جنین ها به ازای هر جداکشت، تیمارها در شرایط تاریکی نگهداری شدند. در بررسی اثر ترکیب های مختلف هورمونی بر روی میانگین درصد جنین زایی مشخص شد که تمامی تیمارهایی که سطوح 2,4-D آنها 1/0، 2/0 و 3/0 میلی گرم در لیتر بود صرف‌نظر از ترکیبات مختلف Kin در این آزمایش به جنین زایی پاسخ مثبت دادند. اما در سطح 4/0 میلی گرم در لیتر 2,4-D، تیمارهای هورمونی C₄₁٬ C₄₃ و C₄₅  پاسخ به جنین زایی منفی بود. میانگین فراوانی جنین زایی تیمارهای C₁₁٬ C₁₃٬ C₂₁٬ C₂₂٬ C₂₃٬C₃₁٬  C₃₃٬ C₄₄ و C₄₆ صددرصد بود

(شکل 5).

شکل3- مقایسه میانگین درصد جنین‌های سوماتیک کروی شکل مستقیم در تیمارهای مختلف نوری

شکل4- مقایسه میانگین تعداد جنین‌های سوماتیک کروی شکل مستقیم به ازای هر جداکشت برگ در تیمارهای مختلف نوری

بررسی اثر تیمارهای هورمونی مختلف بر روی میانگین تعداد جنین های کروی به ازای هر جداکشت نشان داد که به ترتیب تیمار C₂₁ و بعد C₄₄ و C₄₂ بیشترین تعداد جنین به ازای هر جداکشت را داشتند که این میزان به ترتیب 48/60، 76/47 و 52/46  بوده است (شکل 6). البته باید در نظر گرفت که طبق شکل 5 درصد جنین زایی در تیمارهای C₂₁ ، C₄₂ و C₄₄ به ترتیب 100، 90، 100 بوده است، بنابراین بهترین تیمارها از نظر بالاترین فراوانی جنین زایی و بالاترین میانگین تعداد جنین در هر جداکشت C₂₁ و C₄₄ بودند.

بحث

گونه های متعلق به خانواده نارون ازجمله نارون اوجا و ملج ارزش اقتصادی مهمی از نظر محیط‌زیست و همچنین صنعت چوب دارند، به طوری‌که حفظ، تکثیر و بهبود خواص تجاری آنها جز اهداف اصلاحی به‌نژادگران می باشد.

شکل 5 – مقایسه میانگین درصد جنین‌زایی سوماتیکی در تیمارهای مختلف هورمونی

C₁₁= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin                             C₁₂= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin

C₁₃= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin                             C₂₁= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin

C₂₂= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin                           C₂₃= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin

C₂₄= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin                             C₃₁= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin

C₃₂= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin                           C₃₃= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin

C₃₄= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin                             C₃₅= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.3 mg/l Kin

C₄₁= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin                             C₄₂= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin

C₄₃= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin                             C₄₄= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin

C₄₅= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.3 mg/l Kin                             C₄₆= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.4 mg/l Kin

شکل 6- مقایسه میانگین تعداد جنین‌های سوماتیک به ازای هر جداکشت در تیمارهای هورمونی مختلف 

C₁₁= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin                             C₁₂= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/lKin

C₁₃= ½ MS + 0.1 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin                             C₂₁= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin

C₂₂= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin                           C₂₃= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin

C₂₄= ½ MS + 0.2 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin                             C₃₁= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin

C₃₂= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.05 mg/l Kin                           C₃₃= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin

C₃₄= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin                             C₃₅= ½ MS + 0.3 mg/l 2,4-D+ 0.3 mg/l Kin

 C₄₁= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.0 mg/l Kin                            C₄₂= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.05mg/l Kin

C₄₃= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.1 mg/l Kin                             C₄₄= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.2 mg/l Kin

C₄₅= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.3 mg/l Kin                             C₄₆= ½ MS + 0.4 mg/l 2,4-D+ 0.4 mg/l Kin