نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

2 عضو هیات علمی - گروه زیست شناسی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

چکیده

شوری خاک یکی از عوامل مهم محیطی کاهش رشد و محصول گیاهان در دنیاست و در توزیع گیاهان نقش تعیین کننده دارد. سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی گیاهان نقش مهمی در تحمل به شوری را ایفا می‌کنند. در پژوهش حاضر اثر تنش شوری و برهمکنش آن با آسکوربیک اسید بر محتوای H2O2، مالون‌دی‌آلدئید، پایداری غشا و میزان فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز در گیاه شاهی مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار انجام شد. گیاهان یک هفته پس از اولین تیمار برداشت شدند. نتایج نشان دادند که شوری موجب افزایش محتوای H2O2 و مالون‌دی‌آلدئید برگ‌ها و ریشه‌ها و فعالیت آنزیم‌های ‌کاتالاز و پراکسیداز ریشه‌ها و کاهش وزن تر بخش‌های هوایی و ریشه‌ها و پایداری غشای برگ‌ها شد و آسکوربیک اسید موجب کاهش اثرات تنش شوری روی گیاهان گردید. بنابراین، به نظر می‌رسد که آسکوربیک اسید با کمک به غلبه بر اثرات اکسیداتیو موجب افزایش تحمل به شوری در گیاه شاهی می شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The role of ascorbic acid in reduction of oxidative effects of salinity on Lepidium sativum L.

نویسندگان [English]

  • azadeh Najjar-khodabakhsh 1
  • Nader Chaparzadeh 2

1 Department of Biology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran

2 Academic member -

چکیده [English]

Soil salinity is one of the most important factors reducing the growth and yield of plants worldwide and determining plant distribution. Antioxidant systems play a crucial role in salt tolerance of plants. In this investigation, the effect of salt stress and its interaction with ascorbic acid on production of H2O2, malondialdehyde, membrane stability and root activities of catalase and peroxidase in Lepidium sativum L. were investigated. The experiment was conducted in a completely randomized design with four replications. Plants were harvested one week after starting treatments. The results showed that salinity increased the amount of H2O2 and malondialdehyde in leaves and roots, and catalase and peroxidase enzymes activities of the roots. Salinity decreased fresh weight of the shoots and roots, and membrane stability of the leaves. This reports shows that exogenous ascorbic acid can alleviate salinity stress effects on plants. As a whole, these data suggest that the ascorbic acid increased the tolerance of Lepidium sativum under salinity stress by overcoming the oxidative effects.

کلیدواژه‌ها [English]

  • ascorbic acid
  • Lepidium sativum L
  • Oxidative
  • Salinity

نقش آسکوربیک اسید در تقلیل اثرات اکسیداتیو شوری روی گیاه شاهی

آزاده نجار خدابخش و نادر چاپارزاده*

تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، گروه زیست شناسی گیاهی

تاریخ دریافت: 23/11/92             تاریخ پذیرش: 8/2/93 

چکیده 

شوری خاک یکی از عوامل مهم محیطی کاهش رشد و محصول گیاهان در دنیاست و در توزیع گیاهان نقش تعیین کننده دارد. سیستم­های آنتی­اکسیدانی گیاهان نقش مهمی در تحمل به شوری را ایفا می­کنند. در پژوهش حاضر اثر تنش شوری و برهمکنش آن با آسکوربیک اسید بر محتوای H2O2، مالون­دی­آلدئید، پایداری غشا و میزان فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز در گیاه شاهی مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار انجام شد. گیاهان یک هفته پس از اولین تیمار برداشت شدند. نتایج نشان دادند که شوری موجب افزایش محتوای H2O2 و مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها و فعالیت آنزیم­های ­کاتالاز و پراکسیداز ریشه­ها و کاهش وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها و پایداری غشای برگ­ها شد و آسکوربیک اسید موجب کاهش اثرات تنش شوری روی گیاهان گردید. بنابراین، به نظر می­رسد که آسکوربیک اسید با کمک به غلبه بر اثرات اکسیداتیو موجب افزایش تحمل به شوری در گیاه شاهی می شود.

واژه­های کلیدی: آسکوربیک اسید، شاهی، اکسیداتیو، شوری.

* نویسنده مسئول، تلفن: 34327541-041، پست الکترونیکی: nchapar@azaruniv.ac.ir

مقدمه

 

تنش­های محیطی اثرات متنوعی بر رشد و نمو گیاهان می گذارند. شوری یکی از مشکلات اصلی در تولید محصولات کشاورزی و تعیین کننده پراکنش گیاهان در طبیعیت می­باشد. شوری از طریق ایجاد سمیت یونی، کمبود عناصر غذایی و خشکی فیزیولوژیکی بر جنبه های مختلف فیزیولوژیکی گیاهان تاثیر می­گذارد (31). بسیاری از تنش­های محیطی همچون شوری، خشکی، عناصر سنگین و نور با ایجاد تنش ثانویه اکسیداتیو آسیب گیاهان را تشدید می­کنند. به هنگام تنش اکسیداتیو به دلایل مختلف گونه­های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species, ROS) تشکیل می شوند. کلروپلاست­ها، میتوکندری­ها، پراکسیزوم­ها و غشاهای سلولی جایگاه اصلی تولید ROS محسوب می­شوند. ROSها شامل رادیکال­های آزاد (سوپراکسید -O2، هیدروکسیل OH، پرهیدروکسیل HO2 و رادیکال­های آلکوکسیل (RO و اشکال غیررادیکالی (پراکسید هیدروژن و اکسیژن یکتایی) می­باشند (18) که در صورت ضعف مکانیسم­های حفاظتی منجر به تخریب سلولی به وسیله اکسیداسیون لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک خواهند شد (8). ROSها در همه گیاهان در مقادیر مختلف  طی متابولیسم طبیعی تولید می­شوند ولی افزایش و تجمع بیش از حد آن­ها در شرایط نامطلوب ایجاد می­شود. ROSها فرآیندهایی مانند رشد و نمو، چرخه سلولی، مرگ سلولی برنامه­ریزی شده، پاسخ به تنش­های غیرزیستی و دفاع در برابر پاتوژن­ها را کنترل می­کنند (18). گیاهان برای خنثی کردن اثرات تخریبی گونه­های فعال اکسیژن دارای سیستم­های آنتی­اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی هستند. آسکوربیک اسید یکی از آنتی اکسیدان های غیرآنزیمی جاروب کننده رادیکال­های آزاد برای حفاظت  سلول ها در مقابل آسیب­های اکسیداتیو می­باشد (8). این مولکول، ترکیب 6 کربنی است که به عنوان آنتی­اکسیدان محلول در سلول­های جانوری و گیاهی عمل می نماید. گیاهان، قارچ­ها و بسیاری از جانوران به طرق متفاوت توانایی بیوسنتز آسکوربیک اسید را دارند. انسان به دلیل نداشتن برخی آنزیم­های مسیر بیوسنتز آسکوربیک اسید فاقد این توانایی می­باشد (35). آسکوربیک اسید درفضاهای آپوپلاستی، سیتوزول، میتوکندری­ها، پراکسی­زوم­ها، گلی­اکسی­زوم­ها و واکوول­ها در غلظتی در حد چند  میلی­مولار وجود دارد (13). در گیاهان آسکوربیک اسید نقش­ زیادی در عملکردهای فیزیولوژیکی ازجمله تقسیم سلولی، گسترش دیواره سلولی و سایر پدیده­های رشدی ایفا می­کند و منبع اصلی و مستقیم ویتامین C برای انسان محسوب می­شود (13). گزارش هایی از بهبود رشد گیاهان در شرایط شوری به وسیله کاربرد برون زای آسکوربیک اسید  نیز در دست است (4).

شاهی گیاهی یک­ساله، متعلق به تیره براسیکاسه و به ارتفاع حدود 30 تا 50 سانتی­متر می­باشد. منشا آن به منطقه وسیعی از مصر تا تبت نسبت داده شده است. برگ و ساقه آن رنگ سبز روشنی دارد و گل­هایش سفید است. شاهی اثر ضد آسکوربوت قوی داشته، اشتهاآور، مدر و تصفیه کننده خون است و دانه آن به عنوان داروی خلط­آور مصرف می­شود (2). به دلیل ماهیت آنتی اکسیدانی آسکوربیک اسید و تاثیر آن در بهبود رشد گیاهان تحت تنش، در پژوهش حاضر تاثیر آن بر جنبه های اکسیداتیو تنش شوری در گیاه شاهی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

بذرهای سالم  و یک دست گیاه شاهی (Lepidium sativum L. cv. Red Mobarakeh) انتخاب و با هیپوکلریت سدیم 1% ضدعفونی و با آب مقطر شستشو داده شدند. بذرها پس از 4 ساعت نگهداری در آب مقطر به گلدان­های حاوی پرلیت انتقال یافته و با محلول غذایی هوگلند تغذیه شدند. گلدان­ها در شرایط نوری تنظیم شده 14 ساعت نور و 10 ساعت تاریکی در شدت نور فتوسنتزی 250 میکرو­مول فوتون بر متر مربع و رطوبت 30 تا 40 درصد و دمای 2±25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. پس از 14 روز، دانه رست­ها به چهار گروه تقسیم شدند: گروه اول با محلول هوگلند (تیمار شاهد)، گروه دوم با محلول هوگلند حاوی 1 میلی­مولار آسکوربیک اسید (تیمار ASA)، گروه سوم با محلول هوگلند حاوی 225 میلی­مولار  NaCl (تیمار NaCl) و گروه چهارم با محلول هوگلند حاوی 1 میلی­مولار آسکوربیک اسید و 225 میلی­مولار  NaCl(تیمار ASA+NaCl) به مدت هشت روز تیمار شدند. 24 ساعت بعد از آخرین تیمار برگ­ها و ریشه­ها جهت آنالیز استفاده شدند.

تعیین وزن تر: ابتدا گرد و غبار و نمک احتمالی باقیمانده در سطح بخش­های هوایی و ریشه­ها پس از شستشو با آب مقطر و خشک کردن مجدد حذف و سپس وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها با ترازوی حساس اندازه­گیری شد.

سنجش محتوای H2O2 : مقداری بافت برگی و ریشه­ای تر با بافر فسفات پتاسیم (50 میلی­مول و 5/6=pH) همگن و به مدت 25 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. مقداری از عصاره رویی با تیتانیوم کلراید 1% مخلوط و به مدت 25 دقیقه دیگر سانتریفیوژ شد. میزان جذب مایع رویی در طول موج nm 410 تعیین (22) و محتوای H2O2 با استفاده از ضریب تصحیح M-1 cm-1μ 28/0 بر حسب μmol g-1 وزن تر ارزیابی شد.

 سنجش محتوای مالون­دی­آلدئید: مقداری بافت برگی و ریشه­ای تر با تری کلرواستیک اسید (TCA) %1/0 همگن و به مدت 5 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. مقداری از محلول رویی با TCA 20% حاوی تیوباربیتوریک اسید %5/0 مخلوط و 30 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. واکنش درآب یخ متوقف و پس از سانتریفیوژ میزان جذب مایع رویی­ در طول موج­های532 و 600 نانومتر تعیین (3) و محتوای مالون­دی­آلدئید از روی ضریب تصحیح
mM-1 cm-1 155 برحسب μmol g-1 وزن تر ارزیابی شد.

سنجش شاخص پایداری غشا (Membrane Stability Index, MSI): قطعات برگی هم اندازه در فالکون­های حاوی آب مقطر در دمای آزمایشگاه به مدت 24 ساعت روی دستگاه شیکر تکان داده شده و میزان هدایت الکتریکی (C1) محلول ها اندازه­گیری شد. سپس همان قطعات در اتوکلاو تخریب و پس از آن به مدت 1 ساعت روی دستگاه شیکر تکان داده شده و دوباره میزان هدایت الکتریکی (C2) محلول ها تعیین و شاخص پایداری غشا از رابطه زیر محاسبه شد (33):

MSI = [1- (C1/C2)]×100

استخراج عصاره آنزیمی: مقداری بافت ریشه­ای تر در دمای C° 4 با بافر فسفات سدیم حاوی EDTA و پلی­وینیل پلی­پیرولیدون (mM 100 و 5/7 =pH) همگن و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور و دمای C° 4  سانتریفیوژ شد. از محلول رویی جهت سنجش فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز مقداری از مایع رویی با بافر فسفات (mM 50 و 8/7 = pH) حاوی گایاکول mM 40 و آب اکسیژنه mM 20 مخلوط شد. میزان تولید تتراگایاکول در nm 470 در 1 دقیقه اندازه­گیری و فعالیت آنزیمی با استفاده از ضریب تصحیح mM-1 cm-1 39/6 به صورت واحد آنزیمی بر میلی­گرم پروتئین گزارش شد. میزان پروتئین هر نمونه بر اساس روش برادفورد اندازه­گیری شد (23).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: مقداری از مایع رویی با بافر فسفات (mM100 و 5/7 =pH) و آب اکسیژنه mM 2 مخلوط و بعد از 3 دقیقه معرف تیتانیوم اضافه و  پس از سانتریفیوژ در 4000 دور، میزان جذب مایع رویی در nm 420 اندازه­گیری شد. مقدار پروتئین هر نمونه بر اساس روش برادفورد تعیین و با استفاده از منحنی استاندارد آب اکسیژنه با غلظت­های 10-0 میلی­مول بر لیتر تعیین فعالیت کاتالاز به صورت واحد آنزیمی بر میلی­گرم پروتئین گزارش شد (39).

تجزیه و تحلیل آماری: برای انجام تجزیه های آماری از نرم افزار  SPSS نسخه 16 و برای رسم نمودارها از Excel استفاده شد. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

نتایج

وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها: طبق نتایج به دست آمده شوری موجب کاهش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها نسبت به شاهد شد. آسکوربیک اسید باعث افزایش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها شد. وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری افزایش معنی دار نشان داد ولی نسبت به تیمار شاهد تفاوت معنی داری نداشت (شکل 1).

 

شکل 1- مقادیر میانگین  وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شرایط شاهد شد. آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها شد. محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری کاهش نشان داد ولی نسبت به تیمار شاهد در برگ­ها تفاوت معنی داری نداشت (شکل 2).

 

شکل 2- مقادیر میانگین محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

محتوای مالو­ن­دی­­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها: شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شد. این در حالی است که تیمار آسکوربیک اسید محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها را به طور معنی­داری کاهش داد. محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه شاهد تفاوت معنی داری نداشت ولی نسبت به تیمار شوری کاهش یافت (شکل 3).

 

شکل 3- مقادیر میانگین محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

پایداری غشاهای سلولی: نتایج حاصل از اثرات شوری روی شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها نشان داد که شوری موجب کاهش معنی­دار MSI برگ­ها نسبت به شاهد شد. تیمار آسکوربیک اسید باعث افزایش معنی­دار MSI برگ­ها شد. MSI برگ­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه شاهد و گیاهان تحت تنش شوری افزایش معنی داری داشت (شکل 4).

 

شکل 4- مقادیر میانگین  MSI برگ­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها: فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها هم در تنش شوری و هم تحت تیمار آسکوربیک اسید افزایش معنی­دار نسبت به شرایط شاهد نشان داد. همچنین در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها نسبت به تیمار شوری و شاهد افزایش معنی­داری نشان داد (شکل 5).

 

شکل 5- مقادیر میانگین  فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها با 4 تکرار ±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P< است.

فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها: در ریشه گیاهان، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم کاتالاز و آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار فعالیت آنزیم نسبت به شرایط شاهد شد. در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید، فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها نسبت به تنش شوری و شاهد کاهش معنی­داری یافت (شکل 6).

 

شکل 6- مقادیر میانگین فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها با 4 تکرار±SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0P< است.

بحث 

وزن تر بخش­های هوایی  و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب کاهش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 1). کاهش رشد، عمده­ترین اثر شوری بر گیاهان است (10). تنش شوری بر کاهش رشد گیاهان به طرق مختلف تاثیر می گذارد. کاهش جذب آب در شرایط شوری از اثرات اولیه روی گیاهان می باشد که این مسئله بر رشد تاثیر جدی می گذارد (اثر اسموتیک شوری). با گذشت زمان و انباشتگی یون های سمی در بافت های برگی فرآیند فتوسنتز آسیب دیده و کاهش رشد مضاعف می شود. جلوگیری از رشد گیاه در شرایط شوری ممکن است از طریق افزایش تولید برخی هورمون ها به ویژه آبسیزیک اسید صورت بگیرد (29). همچنین شوری نیاز انرژیایی لازم برای حفظ حالت طبیعی سلول را افزایش داده و در نتیجه انرژی کمتری برای نیازهای رشدی باقی می­ماند. برخی از گیاهان در شرایط تنشی توان آنتی اکسیدانی خود جهت مقابله با شرایط جدید را افزایش می دهند (10). تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار وزن تر بخش­های هوایی و ریشه­ها در حضور و عدم حضور نمک شد. ASA با افزایش جذب نیتروژن (از طریق سنتز مالات و تبادل آن با نیترات) می­تواند به افزایش رشد گیاه کمک کند (6). همچنین ASA در سنتز گلیکوپروتئین­های اکستانسین غنی از هیدروکسی پرولین دیواره نقش دارد (14). ASA یکی از ترکیبات مهم در حفظ حالت ردوکس سلولی می­باشد که در شرایط تنشی در عملکرد مناسب سلول دخالت می­کند. این ترکیب به عنوان کوفاکتور مهم در بیوسنتز برخی هورمون­های گیاهی از جمله جیبرلین (37)، می­تواند سبب افزایش تقسیم و توسعه سلولی و رشد گیاه شود. گزارش­هایی از افزایش مقدار ASA  در طی تنش شوری روی گیاهان وجود دارد (26). از طرف دیگر تیمار برون زای گیاهان با ASA می تواند با حفظ فتوسنتز و رنگدانه های فتوسنتزی در شرایط تنش شوری رشد گیاهان را بهبود بخشد (19). اثر بهبودی کاربرد ASA در رشد گیاهان دیگر از جمله لوبیا (5) و نخود (5 و 8) نیز گزارش شده است.

محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شده است (شکل 2). افزایش میزان پراکسید هیدروژن در طی تنش شوری در گیاهان دیگر نیز  گزارش شده است (6 و 20). تنش شوری همانند بسیاری از تنش های محیطی می تواند به تنش ثانویه اکسیداتیو در گیاهان منجر شود (11). اکسیژن­های فعال توسط فعالیت­های متابولیکی مختلف در کلروپلاست­ها، میتوکندری­ها، پراکسی­زوم­ها، میکروبادی­ها، NADPH اکسیدازهای متصل به غشاهای سلولی و پراکسیدازهای دیواره سلولی تولید می­شوند (30). گیاهان وقتی در معرض تنش­های محیطی قرار می­گیرند، اشکال مختلفی از اکسیژن­های فعال، که به بافت­های گیاهی صدمات اکسیداتیو وارد می سازند، را تولید می­کنند (38). در شرایط تنشی تعادل تولید و حذف گونه­های فعال اکسیژن به هم خورده و مقدار آنها افزایش می­یابد. در میان گونه­های فعال اکسیژن، H2O2 از اهمیت خاصی برخوردار است. H2O2 دارای پایداری ببیشتر و نیمه عمر طولانی است و به آسانی از غشاهای سلولی عبور می­کند (40).  هیدروژن پراکسید همچنین در برخی غلظت ها به عنوان مولکول علامتی عمل می کند، بطوریکه با پیش تیمار این ترکیب، تحمل به شوری در گیاهان می تواند افزایش یابد (17).

نتایج نشان داد که تیمار آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای H2O2 برگ­­ها و ریشه­ها می شود. مطابق با نتایج این پژوهش، کاهش سطح H2O2  با کاربرد ASA در گندم تحت تنش شوری نیز گزارش شده است (6). همچنین محتوای H2O2 برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری نیز کاهش یافت. گیاهان به طور طبیعی مکانیسم­هایی برای از بین بردن گونه­های فعال اکسیژن دارند. از جمله مکانیسم های دفاعی افزایش تولید ترکیبات آنتی اکسیدان می باشد. ASA یک مولکول آنتی­اکسیدان درون زا و محلول در آب است که در گیاهان به عنوان ماده اولیه در چرخه سم­زدایی آنزیمی H2O2 عمل می­کند (8). ASA به طور مستقیم رادیکال­های هیدروکسیل و سوپراکسید را حذف و H2O2 را به کمک آسکوربات پراکسیداز به آب احیا می­کند (4).

محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 3). رادیکال­های آزاد اکسیژن توانایی انجام واکنش­های اکسیداسیون با اسیدهای چرب غیراشباع را دارند که منجر به پراکسیداسیون لیپیدها و تخریب غشاهای سلولی می شود (27). گونه های فعال اکسیژن به فسفولیپیدها در محل پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع و پیوند استری بین گلیسرول و اسیدهای چرب آسیب می­رسانند. اندازه­گیری محصولات پراکسیداسیون یکی از قابل­قبول­ترین روش­های اندازه­­گیری صدمات اکسیداتیو به غشاهای سلولی است. پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع، آلدئیدهایی را تولید می­کند که این محصولات آلدئیدی به عنوان شاخص تنش اکسیداتیو بیان می­شوند (38). پراکسیداسیون چربی ها به عنوان یک فرآیند متابولیکی طبیعی تحت شرایط عادی نیز صورت می پذیرد ولی در شرایط تنشی تشدید می شود. پیامد عمل گونه­های فعال اکسیژن نه تنها آسیب به چربی هاست بلکه پروتئین­ها و DNA نیز صدمه دیده و در شایط حاد منجر به مرگ سلولی می­شوند (18). افزایش پراکسیداسیون چربی ها در شرایط تنش شوری در گیاهان دیگر نیز گزارش شده است (3 و 12).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تیمار آسکوربیک اسید باعث کاهش معنی­دار محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها شد. همچنین محتوای مالون­دی­آلدئید برگ­ها و ریشه­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شوری کاهش یافت (شکل 3). ASA با خنثی­سازی رادیکال­های اکسیژن از طریق مصرف اکسیژن­های فعال و تولید مونو دهیدروآسکوربات از بروز آسیب به سلول و چربی های غشاها جلوگیری کرده و سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدی می­شود (37). مونو دهیدروآسکوربات دوباره توسط مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز به آسکوربات تبدیل می­شود. تاثیر کاهندگی پراکسیداسیون چربی ها با کاربرد برگی ASA، در گیاه کلزای تحت تنش شوری نیز مشاهده شده است (1).

پایداری غشاهای سلولی: بر اساس نتایج، شوری موجب کاهش معنی­دار شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها نسبت به شاهد شد (شکل 4). یکی دیگر از روش­ها برای بررسی عملکرد فیزیولوژیکی سلول ها، سنجش نفوذپذیری غشاهای سلولی و تغییرات ساختاری آنها است. غشاهای سلولی  محتوای درونی سلول ها را از محیط بیرونی جدا می کنند. غشا اولین جایگاهی است که در معرض تنش شوری قرار می­گیرد (7). هرگونه تغییر در ساختار غشاهای سلولی عملکرد سلول ها را متاثر می کند. همانطور که در بخش قبلی بیان شد، پراکسیداسیون چربی­ها به وسیله گونه­های فعال اکسیژن طی تنش شوری یکی از مکانیسم­های مهم تخریب غشاهای سلولی می باشد.  با آسیب به ساختار و یکپارچگی غشاها نقل و انتقال یون ها و متابولیت ها از تعادل خارج شده و این مسئله عوارض مخربی برای سلول خواهد داشت (36).

همان طور که در شکل 4 نشان داده است، تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها شد. همچنین شاخص پایداری غشاهای سلولی برگ­ها در گیاهان تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری افزایش یافت. یکی از دلایل اصلی تاثیر مثبت ASA در حفظ و پایداری ساختار غشاهای سلولی تاثیر آن در تولید مجدد ویتامین E از رادیکال مربوطه می­باشد (30). همچنین ویتامین E رادیکال­های لیپوپراکسی را پاکسازی و رادیکال αتوکوفروکسیل را تولید می­کند که توسط ASA دوباره به شکل احیا بر می­گردد و از این طریق باعث انسجام غشایی می­شود. ویتامین E آنتی­اکسیدان­ محلول در چربی بسیار مهمی بوده و در غشاهای غنی از اسیدهای چرب غیراشباع کلروپلاست­ها وجود دارد که از پراکسیداسیون اسیدهای چرب جلوگیری کنند. زنجیره فیتیل آنها به اسیدهای چرب آزاد متصل شده و از هم گسیختگی اسیدهای چرب در غشاها را به حداقل می­رساند. همچنین ASA با کاهش تجمع پراکسید هیدروژن از پراکسیداسیون لیپیدی و تغییر نفوذپذیری غشاها جلوگیری کرده و مانع نشت یونی می­شود (16). تاثیر ASA در کاهش اثرات شوری روی پایداری غشاهای سلولی گیاهان دیگر از جمله پیاز نیز گزارش شده است (34).

 فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها: بر اساس نتایج، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها نسبت به شاهد شد (شکل 5). نقش آنزیم­های آنتی­اکسیدان همانند پراکسیداز و کاتالاز در کاهش آسیب وارده به ماکرومولکول­ها و نهایتا ساختارهای سلولی توسط ROS ثابت شده است. درمجموع، بین توان آنتی اکسیدانی (آنزیمی و غیر آنزیمی) و درجه تحمل به انواع تنش ها همبستگی وجود دارد (5). پراکسیداز یک پروتئین دارای هِم است که برای اکسیداسیون سوبستراهای مختلف از H2O2 استفاده می­کند. این آنزیم به طور عمده در دیواره سلولی قرار داشته و دارای نقش­های مختلفی از جمله اکسیداسیون ترکیبات فنلی، پلی­مریزاسیون به منظور سنتز لیگنین و پاکسازی H2O2 می­باشد (25). H2O2 یک مولکول علامتی مهم در پاسخ به تنش­های زیستی و غیرزیستی می­باشد که باعث القای سنتز تعدادی از آنزیم های دفاعی در گیاهان شده و موجب تغییر تحمل گیاه علیه تنش­های مذکور می­شود. در این بررسی، افزایش فعالیت پراکسیداز با افزایش تولید پراکسید هیدروژن همراه بود. افزایش فعالیت این آنزیم نشان­ دهنده این است که پراکسیداز نقش مهمی را در سمیت­زدایی از پراکسید هیدروژن ایفا می­کند. افزایش فعالیت پراکسیداز در ریشه و ساقه گیاه Crithmum maritimum (9) و برگ های تحت تنش شوری در مقایسه با گیاه شاهد گزارش شده است. میزان افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در گونه های گیاهی و حتی ارقام مختلف یک گونه تحت تنش شوری یکسان نمی باشد (21). الگوی فعالیت آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز در ریشه گیاهان ممکن است در تنش کوتاه مدت و دراز مدت شوری متفاوت باشد به طوری که در ریشه کلم تیمار شوری پس از یک روز موجب کاهش ولی پس از هفت روز موجب افزایش فعالیت این آنزیم ها شد (20).

بر اساس داده های شکل 5، تیمار ASA باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها شد. همچنین فعالیت آنزیم پراکسیداز ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری افزایش یافت. افزایش فعالیت آنزیم در سویا (15) و نیشکر (28) تحت تنش شوری توسط تیمار برون زای ASA نیز گزارش شده است. همان طور که در قبل بیان شد، پراکسیدازها می­توانند به عنوان آنتی­اکسیدان عمل نمایند. بنابراین، آسکوربیک اسید برای آنزیم­ آسکوربات پراکسیداز که در تجزیه H2O2 نقش دارد به عنوان سوبسترا عمل می­کند (24) و احتمالا بتواند با تامین سوبسترای مورد نیاز آنزیم در سم­زدایی H2O2 نقش ایفا کند.

فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها: بر اساس نتایج ارایه شده در شکل 6، شوری موجب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها نسبت به گیاهان شاهد شد. در تنش شوری یکی از مهمترین ترکیبات سمی تولید شده ناشی از رادیکال­های آزاد اکسیژن، پراکسیدهیدروژن می­باشد. کاتالاز یک آنزیم تترامر حاوی هِم است که در تمام موجودات هوازی وجود داشته و در تجزیه H2O2 نقش دارد. گونه های فعال اکسیژن علاوه بر اینکه متابولیت­های سمی برای سلول هستند، نقش مهمی در انتقال علایم در فرآیندهای سلولی به عنوان پیامبر ثانویه برای فعال شدن فاکتورهای رونویسی و بیان ژن­ها ایفا می­کنند (5). افزایش فعالیت کاتالاز در هر دو رقم حساس و مقاوم به شوری در گیاه گندم گزارش شده است (32). از طرف دیگر، این آنزیم در گیاه شورپسند Cakile maritima  در شرایط شوری دارای نقش حفاظتی نمی باشد (10). در شرایط تنش شوری، مقدار H2O2 در سلول­ها افزایش می­یابد که کاتالاز یکی از تخصصی­ترین و اصلی­ترین آنزیم­های پاکسازی­کننده H2O2 محسوب می شود.

نتایج شکل 6 حاکی از کاهش معنی دار فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها در تیمار آسکوربیک اسید می باشد. همچنین فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه­ها در گیاه تیمار شده با شوری توام با آسکوربیک اسید نسبت به گیاه تحت تنش شوری کاهش یافت. یکی از مکانیسم­های مهم عملکردی آسکوربیک اسید پاکسازی موثر گونه های اکسیژن فعال و حفاظت سلول ها از آسیب اکسیداتیو می باشد. آنزیم کاتالاز، H2O2 را به آب و اکسیژن تبدیل و در طی این واکنش آسکوربیک اسید به عنوان دهنده هیدروژن عمل می­کند (20). کاهش  فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار ASA، می­تواند دلیلی بر خنثی شدن رادیکال­های آزاد اکسیژن به وسیله ASA (شکل 2) و بهبود وضع رشدی (شکل 1) و فیزیولوژیکی (شکل 4) گیاهان باشد.  

جمع­بندی

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که شوری 225 میلی مولار NaCl منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاه شاهی شده و کاربرد ریشه­ای آسکوربیک اسید به عنوان آنتی­اکسیدان می­تواند اثرات مضر و تنش اکسیداتیو حاصل از شوری را بهبود بخشد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه شهید مدنی آذربایجان به خاطر حمایت مالی و آقای علیرضا محمدپور به سبب همکاری آزمایشگاهی سپاسگزاری می نمایند.

1-   دولت آبادیان آ.، مدرس ثانوی س.م. و شریفی م. 1388. اثر تغذیه برگ با آسکوربیک اسید بر فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان، تجمع پرولین و لیپید پراکسیداسیون کلزا (.Brassica napus L) در شرایط تنش شوری.‎ مجله علوم و فنون کشاورزی ومنابع طبیعی، 47.

2-   زرگری ع. 1371. گیاهان دارویی. جلد اول. انتشارات دانشگاه تهران.

3-   قربانلی م.، احمدی ف.، منفرد ا. و بخشی خانیکی غ. 1391. اثر تنش شوری و برهمکنش آن با آسکوربات بر میزان فعالیت آنزیم های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، پرولین و مالون­دی­آلدئید در گیاه زیره سبز چهار هفته پس از جوانه زنی. فصلنامه علمی-پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، (1)28: 27-14.

 

4-   Alqurainy F. 2007. Responses of bean and pea to vitamin C under salinity stress. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 3: 714-722.

5-   Ashraf M. 2009. Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers. Biotechnology Advances, 27:84–93.

6-   Azzedine F., Cherroucha H. and Baka M. 2011. Improvement of salt tolerance in durum wheat by ascorbic acid application. Journal of Stress Physiology and Biochemistry, 7(1): 27-37.

7-   Bajji M., Kinet J.M. and Lutts S. 2001. The use of the electrolyte leakage method for assessing cell membrane stability as a water stress tolerance test in durum wheat. Plant Growth Regulation, 45: 1-10.

8-   Beltagi M.S. 2008. Exogenous ascorbic acid (vitamin C) induced anabolic changes for salt tolerance in chick pea (Cicer arietinum L.) plants. African Journal of Plant Science, 2(10): 118-123.

9-   Ben Amor N., Ben Hamed K., Debez A., Grignon C. and Abdelly C. 2005. Physiological and antioxidant responses of the perennial halophyte Crithmum maritimum to salinity. Plant Science, 168(4): 889-899.

10-Ben Amor N., Jimenez A., Megdiche W., Lundqvist M., Sevilla F. and Abdelly C. 2006. Response of antioxidant systems to NaCl stress in the halophyte Cakile maritima. Physiologia Plantarum, 126: 446-457.

11-Chaparzadeh N., Aftabi Y., Dolati M., Mehrnejad F. and Pessarakli M. 2014. Salinity tolerance ranking of various wheat landraces from the west of the urmia saline lake in iran by using physiological parameters. Journal of Plant Nutrition, 37: 1025-1039.

12-Chaparzadeh N., D’Amico M.L., Khavari-Nejad R.A., Izzo R. and Navari-Izzo F. 2004. Antioxidative responses of Calendula officinalis under salinity conditions. Plant Physiology and Biochemistry, 42: 695-701.

13-Conklin P. 2001. Recent advances in the role and biosynthesis of ascorbic acid in plants. Plant, Cell and Environment, 24: 383-394.

14-Davey M.W., Montagu M.V., Inzé D., Sanmartin M., Kanellis A., Smirnoff N., Benzie I.J.J., Strain J.J., Favell D. and Fletcher J. 2000. Plant L‐ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 825-860.

15-Dehghan G., Rezazadeh L. and Habibi G. 2011. Exogenous ascorbate improves antioxidant defense system and induces salinity tolerance in soybean seedlings. Acta Biologica Szegediensis, 55: 261-264. 

16-Farouk S. 2011. Osmotic adjustment in wheat flag leaf in relation to flag leaf area and grain yield per plant. Journal of Stress Physiology and Biochemistry, 7: 117-138.

17-Fedina I.S., Nedeva D. and Çiçek N. 2009. Pre-treatment with H2O2 induces salt tolerance in barley seedlings. Biologia Plantarum, 53: 321-324.

18-Gill S.S. and Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909-930.

19-Hamada A.M. and Al-Hakimi A.M. 2009. Exogenous ascorbic acid or thiamine increases the resistance  of sun flower and maize plants to salt stress. Acta Agronomica Hungarica, 57:335-347.

20-Hernandez M., Fernandez-Garcia N., Diaz-Vivancos P. and Olmos E. 2010. A different role for hydrogen peroxide and the antioxidative system under short and long salt stress in Brassica oleracea roots. Journal of Experimental Botany, 61: 521-535.

21-Izadi M. H., Rabbani J., Emam Y., Pessarakli M. and Tahmasebi A. 2014. Effects of salinity stress on physiological performance of various wheat and barley cultivars. Journal of Plant Nutrition, 37: 520-531.

22-Jana S. and Chaudhuri M.A. 1981. Glycolate metabolism of three submerged aquatic angiosperms during aging. Aquatic Botany, 12: 345-54.

23-Krizek D.T., Britz S.J. and Mirecki R. M. 1998. Inhibitory effects of ambient levels of solar UV‐A and UV‐B radiation on growth of cv. New Red Fire lettuce. Physiologia Plantarum, 103: 1-7.

24-Lee S.K. and Kader A.A. 2000. Pre-harvest and post-harvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology, 20: 207-220.

25-Mafakheri A., Siosemardeh A., Bahramnejad B., Struik P.C. and Sohrabi Y. 2011. Effect of drought stress and subsequent recovery on protein, carbohydrate contents, catalase and peroxidase activities in three chickpea (Cicer arietinum) cultivars. Australian Journal of Crop Science, 10: 1255-1260.

26-Mohamed M.A., Matter M.A. and Saker M.M. 2010. Effect of salt stress on some defense mechanisms of transgenic and wild potato clones (Solanum tuberosum L.) grown in vitro. Natural Science, 12: 181–193.

27-Montillet J.L., Chamnongpol S., Rusterucci C. and Triantaphylides C. 2005. Fatty acid hydroperoxides and H2O2 in the execution of hypersensitive cell death in tobacco leaves. Plant Physiology, 138: 1516-1526.

28-Munir N. and Aftab F. 2011. Enhancement of salt tolerance in sugarcane by ascorbic acid pretreatment. African Journal of Biotechnology, 10: 18362–18370.

29-Munns R. 2002. Comparative physiology of salt and water stress. Plant Cell and Environment, 25: 239-250.

30-Parida A.K. and Das A.B. 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicology and Environmental Safety, 60: 324-349.

31-Parvaiz A. and Satyawati S. 2008. Salt stress and phyto-biochemical responses of plants. Plant Soil and Environment, 54: 89-99.

32-Sairam R.K., Rao K.V. and Srivastava G.C. 2002. Differential response of wheat genotypes to long-term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science, 163: 1037-1046.

33-Sairam R., Singh D. and Srivastava G. 2003. Changes in activities of antioxidant enzymes in sunflower leaves of different ages. Biologia Plantarum, 47: 61-66.

34-Salama K.H. 2009. Amelioration of NaCl-induced alterations on the plasma membrane of Allium Cepa L. by ascorbic acid.  Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3: 990-994.

35-Smirnoff N., Conklin P.L. and Loewus F.A. 2001. Biosynthesis of ascorbic acid in plants. Annual Review Plant Physiology, 52: 437-467.

36-Stevens J., Senaratn T. and Sivasithamparam K. 2006. Salicylic acid induces salinity tolerance in tomato (Lycopersicon esculentum cv. Roma): associated changes in gas exchange, water relations and membrane stabilisation. Plant Growth Regulation, 49: 77-83.

37-Taqi A.K., Mazid M. and Firoz M. 2011. A review of ascorbic acid potentialities against oxidative stress induced in plants. Journal of Agrobiology, 28(2): 97-111.

38-Torres-Franklin M.L., Contour-Ansel D., Zuily-Fodil Y. and Pham-Thi A.T. 2008. Molecular cloning of glutathione reductase cDNAs and analysis of GR gene expression in cowpea and common bean leaves during recovery from moderate drought stress. Journal of Plant Physiology, 165: 514-521.

39-Wahid A., Perveen M., Gelani S. and Basra Sh. 2007. Pretreatment of seed with H2O2 improves salt tolerance of wheat seedlings by alleviation of oxidative damage and expression of stress proteins. Journal of Plant Physiology, 164: 283-294.

40-War A. R., Paulraj M. G., War M. Y., and Ignacimuthu S. 2011. Role of salicylic acid in induction of plant defense system in chickpea (Cicer arietinum L.). Plant Signaling and Behavior, 6: 1787-1792.