بررسی ویژگی‏های ریخت‏شناسی و تشریحی گل نر، مراحل تکوین بساک و دانه‏ گرده در پسته‏ خوراکی (Pistacia vera L.) 

نجمه حسینی، الهه زمانی بهرام‏آبادی و فرخنده رضا نژاد^*

کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، گروه زیست‌شناسی 

تاریخ دریافت: 3/9/91                 تاریخ پذیرش: 6/6/92 

چکیده

پسته‏ خوراکی (Pistacia vera L.) از گونه‏های مهم سرده‏ Pistacia L. و تیره‏ Anacardiaceae است. با هدف توسعه‏ دانش در مورد این گونه‏ ارزشمند، ویژگی‏های ریخت‏شناسی و تشریحی گل نر، مراحل تکوین بساک و دانه‏ گرده‏ آن با روش‌های سلول‏بافت‌شناسی مانند تهیه‏ برش و مشاهده با میکروسکوپ‏های نوری و الکترونی بررسی شد. نتایج نشان داد که گل‌های نر در گل‏آذین خوشه دارای 6-4 پرچم، 2 یا 3 کاسبرگ و 1-0 براکته می‌باشند. دو کیسه‌ هر سمت (تکای) بساک از یکدیگر بطور کامل جدا هستند و شکوفایی آنها بصورت طولی و عمقی از محل رابط می‌باشد. تقسیم سیتوپلاسم طی میوز سلول‏های مادر میکروسپور، بطور همزمان رخ می‌دهد، تتراد حاصل از نوع چهار وجهی و لایه‏ تاپی از نوع ترشحی است. تعداد لایه‌های سلولی لایه‌ میانی سه یا بیشتر بوده که بطور قابل توجهی پایا بوده و در مراحل پایانی بلوغ همراه با لایه‌ تاپی یا حتی در زمان شکوفایی بساک از بین می‌روند. لایه مکانیکی با تزئینات فیبری می‌باشد و اپیدرم روی آن قرار دارد. دانه‏های گرده، کروی و دارای 5-3 منفذ رویشی و تزئینات سوراخ‏دار هستند.

واژه‏های کلیدی: پسته، تشریح، تکوین، دانه‏ گرده، گل نر

* نویسنده مسئول، تلفن : 3222032-0341 پست الکترونیکی: frezanejad@mail.uk.ac.ir

مقدمه

پسته‏ی خوراکی یا Pistacia vera، از تیره‏ Anacardiaceae و راسته‏ی Sapindales است (6). تیره‏ Anacardiaceae به پنج طایفه‏ تقسیم شده که سردۀ Pistacia L. در طایفه‏ی Rhoeae قرار دارد (11). این سرده تک‌نیا (Monophiletic) و بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی برگ، دارای دو بخش Pistacia و Lenticella است و پسته در بخشPistacia  قرار داده شده است (6). سردۀ پسته توسط Zohary )1952) به یازده گونه طبقه‌بندی شده (27) اما مطالعات جدیدتر این سرده را دارای نه گونه و پنج زیرگونه می‏دانند (6). بر اساس صفات ریخت‌شناسی، پسته (P. vera) را قدیمی‌ترین گونۀ این سرده می‌دانند (9).

P. vera گونه‌ای درختی، دوپایه و دارای برگ‌های مرکب شانه‏ای است که در پاییز می‌ر‌یزند (6). هر برگ دارای یک جوانۀ منفرد در زاویۀ خود است که اغلب این جوانۀ جانبی به پریموردیم گل‌آذین متمایز می‌گردد (15)، هر گل آذین نر 500-450 و هر گل آذین ماده 250-150 گل دارد (7). ارتفاع این درخت ممکن است به 10-7 متر برسد و عمر بسیار طولانی دارد (7). زمانی که گل ماده باز می‌شود سطح کلاله پذیرای گرده است و تولید میوه و دانه بطور معمول بدنبال گرده‌افشانی موفق صورت می‌گیرد. جوانۀ گل‌آذین ماده، واقع روی یک شاخه‏ی چوبی یکساله، اوایل فروردین شروع به تورم می‌کند و در طول دو هفته‏ی آخر فروردین، 100 تا 300 گل داخل هر گل‌آذین گرده‌افشانی می‌شوند (15). مطالعات ریخت‏شناسی و تکوینی گل ماده و رویان‌زایی در سردۀ Pistacia L. (4، 6، 8، 16) و در گونۀ P. vera (18، 19، 23، 24) توسط محققان مختلف انجام شده است. بعنوان مثال در گزارش‏های Endress و Bachelier (2007) در مورد سردۀ Pistacia L. مشخص شده است که گل ماده 8-5 زائدۀ کاسبرگ مانند دارد، مادگی دارای تخمدان کروی حجیم با خامه کوتاه و کلاله سه شاخه (در هر شاخه دارای دو لوب) می‌باشد. Grundwag (1976) گزارش کرد که در این سرده مادگی، تک‌خانه و دارای یک تخمک قاعده‌ای واژگون، تک لایه و پر‌خورش است. کیسه‏ی رویانی در این سرده (16) و گونه (18) تیپ علف هفت‏بند (Polygonum) را دارد. اما این مطالعات در مورد گل نر بمیزان کمتری وجود دارد (6، 7، 8، 22، 25، 26). بیشتر این بررسی‏ها روی ساختار ریختی بودند و نمو گل در پسته کمتر مطالعه شده است. مطالعات ریخت‏شناسی دانه‏ی گرده‏ی پسته توسط محققان مختلفی انجام شده است و نتایج این تحقیقات نشان می‏دهد که ریخت‏شناسی آن در بین واریته‏های مختلف، متنوع است (5، 12، 25، 26).

دانه‌های پسته، باعث اهمیت اقتصادی ویژه‏ی سردۀ Pistacia L. در تیره‏ی Anacardiaceae شده‌اند. طبق گزارش‌های بانک اطلاعات مولکولی پسته ایران در سال 1387، پسته اولین محصول صادراتی غیر‌نفتی ایران است (1). تاکنون مطالعات و روش‏های متعددی بمنظور توسعه‏ی دانش و آگاهی در مورد این گونۀ ارزشمند و همچنین تشخیص تفاوت‏ها بین واریته‏های مختلف آن انجام شده‏‏است، اما بررسی‏های ریخت‏شناسی و تکوینی گل، بخصوص گل نر بسیار محدودند. صفات مهم اندام‏های زایشی و همچنین مطالعۀ مراحل تکوینی گامتوفیت‏ها جایگاه بزرگی در علم گیاه‌شناسی دارند و از ابزار مناسب برای شناسایی و طبقه‏بندی گیاهان هستند. بنابراین بررسی ویژگی‏های ریخت‏شناسی و تشریحی گل نر و مراحل تکوینی بساک و دانه‏ی گرده در پسته، بعنوان‏ هدف این پژوهش در نظر گرفته شد.

مواد و روشها

نمونه‌برداری از گل‌ها، در فصل بهار، از منطقه‏ی نوق رفسنجان انجام شد. این منطقه، بین 16ّ 55ْ تا 2ّ 56ْ طول شرقی و 36ّ 30ْ تا 14ّ 31ْ عرض شمالی در شمال شهرستان رفسنجان واقع شده است (2). بمنظور مطالعۀ مراحل نموی بساک، نمونه‌برداری از جوانۀ گل‌آذین نر تا زمان باز شدن بساک‌ها و گرده‌ا‌فشانی انجام شد.

ریخت‏شناسی گل آذین‏ و گل‏ نر با استفاده از میکروسکوپ تشریحی بررسی شد.

برای مطالعات تشریحی و نموی، نمونه‌ها بوسیلۀ محلول FAA (90٪ اتانول 70+ 5٪ فرمالدهید+ 5٪ اسید استیک) بمدت 72-24 ساعت تثبیت و بعد بمدت 24 ساعت زیر آب جاری قرار داده شدند. نمونه‌ها در سری‌های رو به افزایش اتانول آب‌گیری (Dehydration) و در نهایت در الکل 70 درصد تثبیت شدند. برای پارافین‌دهی، ابتدا آب‌گیری نمونه‌ها با استفاده از اتانول 70 انجام شد، سپس تولوئن (حلال پارافین) بتدریج جایگزین اتانول موجود در بافت‌ها گردید، به این ترتیب که: نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در محلول‌هایی با میزان رو به افزایش تولوئن قرار داده شدند. سپس بتدریج پارافین جایگزین تولوئن موجود در بافت‌ها گردید، به این ترتیب که نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در محلول‌هایی با میزان رو به افزایش پارافین قرار داده شدند. آنگاه از نمونه‌هایی که حداقل 2 هفته در پارافین مذاب قرار گرفته بودند، قالب‌گیری انجام شد و برش‌گیری با میکروتوم چرخشی انجام گردید (14). بمنظور رنگ‌آمیزی، ابتدا لام‌ها با تولوئن پارافین‌زدایی شدند. سپس آب‌دهی (Hydration) نمونه‌ها با سری‌ اتانول رو به کاهش و آب مقطر صورت گرفت، نمونه‌ها بمدت 15 دقیقه در سبز سریع قرار گرفتند و بمدت 30 ثانیه با اسید استیک 1% شسته شدند و بمدت 15 دقیقه با سافرانین رنگ گرفتند (13). برای چسباندن نمونه‌ها، ابتدا برش‏ها‌ در آب مقطر و سری‌ اتانول رو به افزایش آب‌گیری و بعد در تولوئن شفاف‌سازی شدند. سرانجام لام‌ها با استفاده از چسب انتالن و لامل دائمی شدند. مطالعه میکروسکوپی نمونه‌ها توسط میکروسکوپ نوری (Olympus BH2 Japan) انجام شد و از نمونه‌های مناسب، توسط دوربین دیجیتال کنن مدل (IXUS 120 IS USA Canon) عکس‌برداری شد.

بمنظور بررسی‏ با میکروسکوپ الکترونی نگاره، دانه‏های گرده روی پایه‏های آلومینیومی چسبانده شدند. پایه‏های آماده، با دستگاه پوشش‏دهنده‏ی (SCDOO5BAL-TEC ALCATEL Belgium) میکروسکوپ الکترونی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، با طلا پوشش‏دهی شدند. سپس با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (CamScan Mv2300 SEM CANADA) موجود در دانشگاه شهید باهنر کرمان  بررسی و عکس‏برداری شدند.

نتایج

مطالعۀ ریخت‌شناسی و تشریحی گل‌های نر نشان داد که گل‌‌آذین‌های نر بصورت خوشه‏ی مرکب قبل از ایجاد برگ‌ها، بصورت جانبی روی شاخه‏‌‌ها تشکیل می‌شوند (شکل A1). در زمان شکوفایی گل‌ها، بساک‌ها قرمز ‌رنگ هستند و طی مراحل نموی تغییر رنگ می‏دهند. در زمان گرده‌افشانی یا بطور کامل زرد می‌شوند و یا این‌ که قاعدۀ آنها به رنگ زرد در‌می‌آید، ولی نوک آنها همچنان قرمز باقی‌ می‌ماند. تغییر رنگ بساک‌ها از سطح شکمی گل‌آذین آغاز می‏شود و به سطح پشتی می‌رسد (شکل B,C1). گل‌های نر دارای 6-4 پرچم با بساک بزرگ‌ و حجیم، 2 یا 3 کاسبرگ و 1-0 براکته می‌باشند که کاسبرگ‌ها و براکته‌ها بر اساس اندازه قابل تشخیص هستند. میله‏ی پرچم‌ها کوتاه و حجیم است و شکوفایی بساک‏ها بصورت طولی و عمقی (در مجاور دسته‌ی آوندی مرکزی بساک) رخ می‏دهد (شکل D-I1). برش‌های عرضی گل‌آذین نر تعداد بساک‌ها را در هر گل تأیید کرد، که تعداد 5 بساک غالب بود. در این برش‌ها تعداد کاسبرگ و براکته و تفکیک آنها از یکدیگر مشخص نبود (شکل J1). برش طولی گل‌آذین قرار گرفتن گل‌ها بصورت خوشه را تأیید می‌کند، همچنین مجاری ترشحی در کنار دستجات آوندی دیده می‌شوند (شکل K1).

بررسی برش‏های میکروسکوپی نشان داد که تکوین بساک شامل سه مرحلۀ پیش‌میوزی، میوزی و پس‌میوزی است. در مرحلۀ پیش‌میوزی از تقسیم و تمایز یک یا چند سلول زیر‌اپیدرمی بساک، دیواره‏ی میکروسپورانژ و بافت هاگزا تولید می‌شود. بافت هاگزا بوسیله‏ی سلول‌های در حال تقسیم با رنگ‌پذیری بالا و سیتوپلاسم متراکم مشخص می‌شود (شکل A, B2). فاصلۀ دو اسپورانژ شکمی نسبت به دو اسپورانژ پشتی بیشتر است و در این مرحله میکروسپورانژها‌ی واقع در یک خانه (Theca) به میزان زیادی از هم جدا هستند و در واقع از هم فاصله دارند، اما در بخش عمقی نیز بوسیله‏ی تیغه (Septum) از یکدیگر جدا می‌شوند. همزمان با تقسیمات بافت هاگزا، تقسیمات مماسی بعضی از سلول‌های حاصل از تقسیم سلول‏های زیر اپیدرمی در جهت تشکیل دیواره‌های بساک صورت می‌گیرد (شکل C2). مرحلۀ پیش‌میوزی با توقف میتوز بافت هاگزا و تغییر شکل سلول‌های هاگزا به سلول‌های مادر میکروسپور کامل می‌شود که سلول‌هایی درشت با هسته‌های حجیم و سیتوپلاسم متراکم هستند (شکلD2). مرحلۀ میوزی با فاصله گرفتن سلول‌های مادر میکروسپور از سلول‌های تاپی آغاز می‌شود، در این مرحله فرو‌رفتگی میانی هر خانۀ بساک بطور کامل عمیق شده و مجاور دسته‏ی آوندی مرکزی بساک می‏رسد، به‌طوری که دو میکروسپورانژ درون یک خانه (تکا) بطور کامل از یکدیگر جدا می‌شوند و تیغه یا سپتوم دیده نمی‌شود (شکل E, F2). همزمان با میوز I دیواره‏ی پکتوسلولزی سلول‌های مادر میکروسپور هیدرولیز و بوسیلۀ دیواره‌های کالوزی جدید جانشین می‌شود که این دیواره‌ها، سلول‌های مادر میکروسپور را از برهم‌کنش بر یکدیگر، طی میوز جدا نگه می‌دارند.

شکل A-K1. ریخت و ساختار تشریحی گل‏آذین و گل‌‌ نر پسته (P. vera): A- ظهور گل‌آذین نر قبل از برگ‌ها بصورت جانبی، X5/1، B- سطح پشتی گل‌آذین نر همراه با بساک‌های قرمز،X 3، C- سطح شکمی گل‌آذین نر که شروع تغییر رنگ بساک‌ها به رنگ زرد را نشان می‌دهد،X 3، D- سه گل نر بصورت خوشه دارای دمگل‌های کوتاه و بساک‌های حجیم، X4، E- گل دارای شش بساک، سه کاسبرگ و فاقد براکته،X 4، F- گل دارای چهار بساک، دو کاسبرگ و یک براکته، X4، G- گل دارای پنج بساک، دو کاسبرگ و یک براکته، X4، H- گل دارای چهار بساک، دو کاسبرگ و یک براکته،X 4، I- گل دارای چهار بساک، دو کاسبرگ و فاقد براکته،X 4، J- برش عرضی گل‌آذین، پیکان باریک به گل دارای پنج بساک، پیکان قطور به گل دارای چهار بساک و نوک پیکان به گل دارای شش بساک اشاره می‌کنند،X 6، K- برش طولی گل‌آذین، پیکان به مجاری ترشحی در کنار دستجات آوندی اشاره می‌کند، X3 (رنگ‏آمیزی با سبز سریع و سافرانین). A= بساک، S= کاسبرگ، B= براکته.

در زمان میوز سلول مادر میکروسپور، دیواره‏ی بساک از اپیدرم، یک لایۀ مکانیکی، بیش از سه لایۀ میانی و لایۀ تغذیه‌ای تشکیل شده است (شکل G, H2).

شکلA-I2. مراحل تشکیل میکروسپور‌های تتراد درون بساک پسته (P. vera) در برش عرضی. A- نمای کامل برش عرضی بساک در مرحلۀ تقسیم میتوز سلول‌های بافت هاگزاX 40،B – تقسیم سلول‌های بافت هاگزا با بزرگنمایی بیشتر،X 100، C- تقسیمات مماسی سلول‌های حاصل از سلول جداری برای تولید لایه‌های دیواره‏ی بساک هم‌زمان با تقسیمات میتوزی بافت هاگزا، پیکان به سلول در حال تقسیم مماسی اشاره می‌کند، X80، D- توقف میتوز سلول‌های بافت هاگزا و تولید سلول‌های مادر میکروسپور، X60، E - فاصله گرفتن سلول‌های مادر میکروسپور از لایۀ تغذیه‌ای، X10، F- ایجاد فاصله میان لایۀ تغذیه‌ای با سلول‌های مادر میکروسپور با بزرگنمایی بیشتر، X40، G- نمای کامل بساک با سلول‌های مادر میکروسپور در حال میوز، X10،H – دیواره‏ی بساک زمان میوز سلول مادر میکروسپور که از اپیدرم، یک لایۀ مکانیکی، بیش از سه لایۀ میانی و لایۀ تغذیه‌ای تشکیل شده است،X 60، I- سلول مادر میکروسپور در مرحله دو و چهار هسته‌ای، X120، J- تقسیم سیتوپلاسم بطور همزمان در سلول‌های مادر میکروسپور و تولید تتراد چهاروجهی که با لایۀ ضخیمی از کالوز شفاف احاطه شده است،X 50، K- آغاز تجزیه‏ی دیواره‏ی کالوزی اطراف تتراد و رها شدن میکروسپور‌های آزاد، نوک پیکان به دانه‌های نشاسته‏ی موجود در لایۀ میانی اشاره می‌کند،X 60. ST= بافت هاگزا، MMC= سلول مادر میکروسپور، Ts= مادر میکروسپور چهارهسته‌ای (سلول تتراد)، Bs= مادر میکروسپور دو هسته‌ای (سلول دیاد)، Tp= لایۀ تغذیه‌ای.

تقسیم سیتوپلاسم طی میوز این سلول‌ها بطور همزمان رخ می‌دهد و درون هر میکروسپوراژ در این مرحله سلول‌های مادر میکروسپور دو و چهار هسته‌ای به ترتیب بعد از میوز I و II حضور دارند (شکل I2). بعد از میوز تقسیم سیتوپلاسم بوسیله‏ی بنیان‌گذاری شیار‌هایی از پیرامون سلول مادر میکروسپور بسمت مرکز سلول و ایجاد چهار سلول میکروسپور انجام می‌شود و این سلول‌ها بصورت چهار‌وجهی جهت‌گیری و بعنوان تتراد چهار‌وجهی (Tetrahedral) نامیده می‌شوند. همه‏ی تترادها از نوع چهاروجهی هستند و چهار سلول در یک دیواره‏ی کالوزی مشترک قرار می‌گیرند و همچنین بوسیله‏ی کالوز از هم جدا می‌شوند (شکل J2). مرحلۀ پس‌میوزی با شکست دیواره‏ی کالوزی و گذر از مرحلۀ تتراد به مرحلۀ میکروسپور آزاد آغاز می‌شود که در آغاز این مرحله، میکروسپورها هنوز در آرایش تتراد می‌باشند (شکل K2). میکروسپور‌ها پس از رهایی از تتراد و در ابتدای تمایز دارای هسته‏ی مشخص با موقعیت حاشیه‌ای و سیتوپلاسم متراکم می‌باشند. سپس پوشش کالوزی بطور کامل از بین می‌رود و دیواره‏ی بساک دارای لایۀ مکانیکی، سه لایۀ میانی و لایۀ تغذیه‌ای می‌باشد (شکل A3). سرانجام همراه با تمایز دانه‌های گرده‌ی بالغ، لایه‌های میانی و تاپی تحلیل می‌روند، که تاپی از نوع ترشحی است (شکل B, C3). سپس آثار ضخیم‌شدگی دیواره‌های لایۀ مکانیکی بجزء دیواره‏ی رو به اپیدرم آشکار می‌شود که باعث می‌گردد این لایه الگوی –U شکل را به نمایش بگذارد.

شکل A-F3. A- ساختار تشریحی برش‌های عرضی بساک پسته (P. vera) از زمان تولید میکروسپور آزاد تا شکوفایی بساک. A- تجزیه کامل دیواره کالوزی اطراف تتراد‌ها و تولید میکروسپور‌های آزاد، دیواره‏ی بساک از یک لایۀ اپیدرم، یک لایه دیواره‏ی مکانیکی، سه لایۀ میانی و یک لایۀ تاپی تشکیل شده است، X50، B- نمای کامل برش عرضی بساک در مرحله میکروسپور‌های آزاد و تحلیل لایه تغذیه‌ای، X10، C- میکروسپور‌های در حال تغذیه از لایۀ تغذیه‌ای، پیشروی تحلیل لایۀ ‌تغذیه‌ای بهمراه سلول‌های لایۀ میانی، X50، D- نمای کامل برش عرضی بساک در مرحلۀ دانه‏ی گرده‏ی بالغ، نوک پیکان به محل تجزیه‏ی دیواره‏ی یک حفره برای شکوفایی بساک اشاره می‌کند،X 10، E- بزرگنمایی بیشتر بساک دارای دانه‏ی گرده‏ی بالغ که لایۀ مکانیکی الگوی U- شکل را به نمایش گذاشته بهمراه اثراتی از لایۀ تغذیه‌ای و لایۀ میانی، نوک پیکان به باقی‌مانده‏ی لایۀ تغذیه‌ای اشاره می‌کند، X40، F- نمای کامل بساک شکوفا، X10. Ep= لایه اپیدرم، En= لایه مکانیکی، ML= لایه میانی.

دیواره‏ی بساک دارای دانه‏ی گرده‏ی بالغ، دارای لایه مکانیکی با الگوی U- شکل بهمراه اثراتی از لایۀ تاپی و لایۀ میانی است. در اثر قطع ارتباط دو دیواره‏ی میانی هر خانه با قسمت مرکزی بساک شکوفایی طولی و عمقی رخ می‌دهد (شکلD-F3).

مطالعۀ ریخت‏شناسی دانه‏ی گرده‏ی پسته نشان داد که گرده‏ها کروی شکل و دارای 5-3 (با تعداد غالب 5) منفذ (Pore) هستند. دانه‏های گرده دارای تزئینات شبکه‌ای (Reticulate) هستند که در بین شبکه‌ها سوراخ‌های (Brochi) با اندازه‌ی یکسان (Reticulate- Homobrochate) وجود دارد (شکل A-D4).

شکل A-C4. A- تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از دانه‏های گرده‏ی بالغ پسته (P. vera)، شکل کروی دانه‏های گرده‏ و تعداد 4 و 5 منفذ رویشی در این شکل مشخص هستند، X400، B – دانه‏ی گرده‏ای با 5 منفذ رویشی با بزرگ‏نمایی بیشتر، X 500، C و D- نگاره‏ی دانه‏ی گرده‏ی پسته که تزئینات شبکه‌ای حفره‌ای روی سطح آن مشخص است، بزرگ‏نمایی به ترتیب در C و D، µm 5 و µm 2 است.