مطالعه محتوای ساپونین در بخش­های هوایی و ریشه سه گونه از جنس  L. Verbascum 

رویا کرمیان^* و فاطمه قاسملو

همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی 

تاریخ دریافت: 16/4/92                تاریخ پذیرش: 28/10/92

چکیده

ساپونین­ها، متابولیت­های ثانویه­ای هستند که در بسیاری از گیاهان و برخی از جانوران یافت می­شوند. آنها گلیکوزیدهایی با وزن مولکولی بالا هستند که دارای گروه قندی متصل به یک آگلیکون تری­ترپنوئیدی یا استروئیدی می­باشند. بسیاری از ساپونین­ها خاصیت پاک­کنندگی دارند و در آب کف پایدار ایجاد می­کنند. جنس گل ماهورVerbascum L.) ) حاوی ترکیبات و اجزاء فعالی است که فعالیت سیکلواکسیژنازی را کاهش می­دهد. در این بررسی، محتوای ساپونین کل در ریشه و بخش­های هوایی 3 گونه از جنس Verbascum شاملV. nudicaule ،V. sinuatum  و  V. speciosumبه صورت کمی و کیفی به روش­های طیف­سنجی نوری و کروماتوگرافی لایه نازک مطالعه شد. در این بررسی، 5 فرکشن مختلف از هر اندام گیاه بدست آمد که مقدار ساپونین استخراج شده از ریشه بیشتر از بخش­های هوایی بود. در میان این سه گونه،V. speciosum  بیشترین مقدار ساپونین را هم در ریشه و هم در بخش­های هوایی نشان داد. همچنین کروماتوگرافی لایه نازک عصاره سه گونه Verbascum بر روی صفحات TLC، لکه­های ساپونینی را با R_f­های مختلف در محدوده 73/0-13/0 آشکار نمود.

واژه­های کلیدی: طیف­سنجی نوری، ساپونین، کروماتوگرافی لایه نازک، L. Verbascum 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183134161، پست الکترونیکی:R_karamian@basu.ac.ir

مقدمه

مواد مؤثره گیاهان همواره به عنوان موادی غیر قابل جایگزین مورد استفاده بوده و خواهند بود. با گذشت زمان تعداد گیاهان دارویی شناخته شده افزوده شده و زمینه­های کاربرد آنها نیز گسترده­تر شده­است. به طور کلی ترکیبات ضدمیکروبی گیاهان، شامل مجموعه متنوعی از ترکیبات مانند ساپونین­ها، فنل­ها، هیدروکسامیک اسید­های حلقوی، گلیکوزیدهای سیانوژنیک، ایزوفلاونوئیدها، سزکوئی­ترپنوئید­ها، مشتقات اندولی حاوی سولفور و برخی ترکیبات دیگر هستند (11، 16، 22، 19). ساپونین­ها گلیکوزید­هایی با وزن مولکولی بالا هستند که از یک بخش قندی متصل به آگلیکون تری­ترپنوئیدی یا استروئیدی تشکیل می­شوند. آگلیکون یا بخش غیرقندی مولکول ساپونین­ها، ژنین یا ساپوژنین نامیده می­شود که با پیوند گلیکوزیدی به بخش قندی متصل می­شود. با توجه به نوع ژنین، ساپوژنین­ها را می­توان به سه گروه 1) گلیکوزید­های تری­ترپنوئیدی، 2) گلیکوزید­های استروئیدی و 3) گلیکوزید­های آلکالوئیدی- استروئیدی تقسیم نمود. یک یا بیش از یکی از این سه ساختار، در برخی گونه­های گیاهی یافت می­شوند. اهمیت این ترکیبات به دلیل فعالیت ضدمیکروبی مؤثر آنهاست که اغلب در مقادیر فراوان در گیاهان سالم یافت می­شوند. این مولکول­ها به عنوان حفاظت­کننده­های گیاهی ضدمیکروبی نیز شناخته شده­اند (11، 16، 17، 22، 19). قندهایی که به طور معمول در ساختار ساپونین­ها وجود دارند، آرابینوز، گالاکتوز، گلوکز، رامنوز، گزیلوز، گالاکتورونیک اسید و گلوکورونیک اسید هستند (5، 6).

اعضای جنس گل ماهور (Verbascum L.) متعلق به تبار Verbaceae از تیره Scrophulariaceae (21) با 42 گونه در ایران هستند که 14 گونه از آنها انحصاری است (9). گل ماهورها (Verbascum L.) با گل­های زرد رنگ و برگ­های اغلب کرک­آلود و ضخیم خود مشخص می­شوند (4). از روزگاران کهن از این گیاهان برای درمان سرفه و مشکلات تنفسی استفاده می­شده­است. مهاجران اروپایی این گیاه را با خود به آمریکا برده و از این گیاه برای درمان سرفه، سرماخوردگی، التهاب حلق و گلو، ورم لوزه­ها، اسهال و بواسیر و عفونت­های مجاری ادراری استفاده می‌کرده‌اند) 14.( گونه­های گل ماهور حاوی ترکیبات و اجزاء فعالی هستند که می­توانند فعالیت سیکلواکسیژنازی را کاهش دهند. در عصاره این گیاهان مواد واجد فعالیت پاد­عفونی­کنندگی و پادالتهابی مانند ساپونین گلیکوزید، گلیکوزید فنیل اتانوئید و ورباسکوزید وجود دارند که مورد اخیر دارای قدرت ترمیم‌کننده زخم نیز می‌باشد (13).

آزمایش­های انجام شده بر روی گل ماهور مشخص نموده­است که این گیاه دارای ترکیبات متعددی ازجمله هشت گروه عمده ساپونین­ها، ایریدوئید گلیکوزیدها، فنیل­اتانوئید گلیکوزیدها مانند ورباسکوزید، مونوترپن گلیکوزیدها، نئولیگنان­ها مانند نئولیگنان، فلاونوئیدها مانند آپی­ژنین، استروئیدها و اسپرمین آلکالوئیدها می­باشد (27).

مطالعه محتوای میزان فنل و فلاونوئید کل در سه گونه Verbascum شاملV. nudicaule ،V. sinuatum  و  V. speciosum نشان داده­است که گونه V. sinuatum با محتوای فنل و فلاوونوئید کل 2/118 و 77/5 میلی­گرم در گرم وزن خشک، بیشترین مقدار فنل و فلاونوئید کل را در بین سه گونه داراست. همچنین بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی این سه گونه نشان داد که عصاره متانولی بخش­های هوایی این گونه­ها توانایی قابل ملاحظه­ای در مهار رادیکال آزاد (DPPH) 2, 2- diphenyl-1-picryl-hydrazyl و کلات­کنندگی آهن دارند (12). ایریدوئید گلیکوزیدها بطور گسترده در جنس Verbascum یافت می­شوند، بویژه catalpol، aucubin و مشتقات آسیلی آنها که در گونه­های مختلف این جنس گزارش شده­است (23، 24( .

Amirnia و همکاران (2011) در مطالعات خود بر روی خواص ضدباکتریایی گونه V. speciosum علیه سه گونه باکتری (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli) نشان دادند که عصاره آبی و اتانولی گونه V. speciosum در تمام غلظت­های اعمال شده، خاصیت ضدباکتریایی نشان می­دهند و با افزایش غلظت این خاصیت نیز افزایش می­یابدSenator . و همکاران (2007) نشان دادند که گونه V. sinuatum بیشترین بازدارندگی را در برابر باکتری­های گرم مثبت نشان می­دهد، اما در برابر باکتری­های گرم منفی پتانسیل بازدارندگی کمتری دارد.

با توجه به خواص دارویی، آنتی­اکسیدانی و ضدباکتریایی جنسVerbascum  و فقدان گزارش­های کافی در مورد این گیاه، انجام هر گونه مطالعه در زمینه استخراج و شناسایی ترکیبات ﻣﺆثره این گیاه حائز اهمیت است. در مطالعه حاضر، محتوای ساپونین در بخش­های هوایی و ریشه سه گونه از جنس Verbascum شاملVerbascum nudicaule ،Verbascum sinuatum  و  Verbascum speciosumبا استفاده از حلال­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت و با توجه به نتایج بدست آمده، بهترین حلال و مناسبترین اندام برای استخراج ساپونین در این گونه­ها معرفی شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی: سه گونه گیاهی از جنسVerbascum L.  از ارتفاعات الوند همدان از ارتفاع 2100 متری جمع­آوری شدند. بخش­های هوایی و ریشه آنها پس از جمع­آوری، در دمای اتاق و سایه خشک شدند و برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. محل جمع آوری، ارتفاع محل، زمان جمع­آوری و شماره هرباریومی گونه­ها در جدول 1 ارائه شده­است.

جدول 1- مشخصات گونه­های مورد مطالعه از جنس.Verbascum

تعیین اندیس کف­کنندگی ساپونین­ها: 100 میلی­گرم از نمونه گیاهی پودر شده در 10 میلی­لیتر آب جوش حل شد و به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش حرارت داده شد. پس از سرد شدن، مخلوط حاصل صاف شد و از آن محلول‌هایی با غلظت 10-1 میلی­گرم بر میلی­لیتر، در سه تکرار تهیه شد. سپس محتوای لوله­ها به مدت 15 ثانیه با استفاده از ورتکس در جهت طولی بشدت مخلوط شدند و در نهایت، ارتفاع کف حاصل در آنها اندازه­گیری گردید (26).

استخراج ساپونین­های تری­ترپنوئیدی: در این روش 2 گرم پودر خشک در دستگاه سوکسله با 120 میلی­لیتر اتانول 50%، 70%، 100% هر یک به مدت 2 ساعت عصاره­گیری شد. ابتدا با 120 میلی­لیتر اتانول 50% عصاره­گیری شروع و پس از زمان 2 ساعت عصاره حاصل جدا شد. سپس عصاره­گیری با 120 میلی­لیتر اتانول 70% به مدت 2 ساعت ادامه یافت. عصاره حاصل جداسازی و در نهایت عصاره­گیری با اتانول خالص به پایان رسید. عصاره­های حاصل تحت خلأ در دمای 80 درجه سانتی­گراد تغلیظ شدند. سپس مواد ساپونینی و غیرساپونینی عصاره­های اتانولی 50% و 70% در یک قیف جداکننده توسط 15 میلی­لیتر دی­اتیل­اتر جداسازی و دو فاز آبی و فاز دی­اتیل اتری (که حذف شدند) حاصل شد، سپس لایه آبی در یک قیف جداکننده با 10 میلی­لیتر n- بوتانول، به دو لایه آبی و بوتانولی تفکیک شد (شکل 1). در نهایت بخش­های آبی و بوتانولی عصاره­های اتانولی 50% و 70% و عصاره حاصل از اتانول 100% تحت خلأ توسط دستگاه روتاری  Lab Tech مدل Ev 311 تغلیظ شدند و مورد سنجش قرار گرفتند (22).

مطالعه کمی ساپونین­ها به روش طیف­سنجی نوری: در هر مرحله عصاره­گیری 01/0 میلی­لیتر از فرکشن­های مختلف در لوله آزمایش ریخته شد و تا تبخیر کامل حلال درون آون با دمای 100 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن، به هر یک از لوله­ها 5 میلی­لیتر معرف وانیلین 7/0% در اسید سولفوریک 65% اضافه شد. این معرف ناپایدار است و باید تازه تهیه شود. مخلوط موجود در لوله­ها با استفاده از ورتکس بشدت هم زده شد و به مدت یک ساعت، در حمام آب گرم با دمای ( 1 ± 60 سانتی­گراد) قرار گرفت. سپس واکنش به مدت 10 دقیقه در حمام آب یخ متوقف و در نهایت جذب مخلوط واکنش در طول موج 473 نانومتر اندازه‌گیری شد (8). برای رسم منحنی استاندارد از ساپونین استاندارد (Merck) استفاده شد. منحنی استاندارد در محدوده صفر تا 400 میکرو­گرم در میلی­لیتر رسم شد. محتوای ساپونین موجود در عصاره با استفاده از منحنی استاندارد (شکل 2) برآورد شد و بر حسب درصد وزن خشک محاسبه گردید.

مطالعه کیفی ساپونین­ها به روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): 60 میکرولیتر (سه بار و هر بار 20 میکرولیتر پس از خشک شدن لکه قبلی) از فرکشن­های مختلف استخراج شده بر روی صفحات آلومینیومی (20 × 20) پوشیده شده از یک لایه سیلیکاژل 60F₂₅₄ (Merck) (به عنوان فاز ثابت) قرار داده شد. سپس صفحات درون تانک کروماتوگرافی که قبلاً با مخلوط آمونیاک، اتانول و n- بوتانول (5/7: 5/2: 5/10) ( به عنوان فاز متحرک) اشباع شده­بود، قرار داده ­شدند (25).

شکل 1- روش استخراج ساپونین در سه گونه Verbascum.

برای ظهور لکه­های ساپونین، صفحات TLC پس از خشک شدن با محلول اسید سولفوریک 15% افشانه شدند. در نهایت صفحات به مدت 10-15 دقیقه در آون 110 سانتی­گراد قرار گرفتند، تا رنگ آنها در نور مرئی آشکار گردد (25). پس از ظهور لکه­ها  R_f هر یک از آنها از رابطه زیر محاسبه شد:  

فاصله طی شده حلال از مبدأ / فاصله طی شده لکه از مبدأ R_f =

مطالعات آماری: سنجش مقدار کمی ساپونین با سه تکرار انجام شد. پس از اثبات وجود اختلاف معنی­دار میان میانگین­ها با روش آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA One-way)، گروه­بندی آنها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال P ≤0.05 انجام شد.

نتایج

تعیین اندیس کف­کنندگی ساپونین­ها: با مشاهده کف پایدار در آزمون تعیین شاخص کف­کنندگی (26) وجود ساپونین در ریشه و بخش­های هوایی گونه­های مختلفVerbascum  ثابت شد. ارتفاع کف در لوله­ها کمتر از یک، مساوی و یا بیشتر از یک سانتی­متر بود. با افزایش حجم عصاره (غلظت عصاره)، ارتفاع کف پایدار ایجاد شده در لوله­ها نیز افزایش یافت. 

ارتفاع کف ایجاد شده در ریشه گونه­های V. sinuatum و V. speciosum معادل 03/2 سانتی­متر و در بخش­های هوایی به ترتیب معادل 03/1 و 3/1 سانتی­متر بود، که نشان دهنده شاخص کف­کنندگی بسیار زیاد ریشه و بخش­های هوایی این دو گونه است (اشکال 3، 4).

شکل 2- منحنی استاندارد ساپونین

شکل 3- مقدار کف ایجاد شده بر اساس غلظت عصاره در گونه  .Verbascum sinuatum 

شکل 4- مقدار کف ایجاد شده بر اساس غلظت عصاره در گونه .Verbascum speciosum

ارتفاع کف ایجاد شده در ریشه گونه V. nudicaule معادل 2 سانتی­متر بود که نشان داد شاخص کف­کنندگی آن بیشتر از یک (100%) است. اما ارتفاع کف ایجاد شده در بخش­های هوایی کمتر از یک (93/0) است، که نشان دهنده شاخص کف­کنندگی کمتر آن بود (شکل 5).

استخراج ساپونین­های تری­ترپنوئیدی: در این مطالعه 5 فرکشن مختلف از هر اندام بدست آمد. فرکشن­های حاصل از ریشه در هر سه گونه Verbascum، حاوی بیشترین مقدار ساپونین (درصد وزن خشک) در مقایسه با بخش­های هوایی بودند.

شکل 5- مقدار کف ایجاد شده بر اساس غلظت عصاره در گونه  .Verbascum nudicaule

در گونه V. sinuatum، بیشترین مقدار ساپونین استخراج شده مربوط به فرکشن 1 ریشه و کمترین مقدار مربوط به فرکشن 5 ریشه بود. در گونه V. speciosum، بیشترین مقدار ساپونین استخراج شده مربوط به ریشه (فرکشن­های 1 و 2) و کمترین مقدار مربوط به اتانول خالص از بخش­های هوایی بود. در گونه V. nudicaule بیشترین مقدار ساپونین استخراج شده در ریشه و بخش­های هوایی مربوط به فرکشن 1 بود، که ساپونین حاصل از ریشه دو برابر بخش­های هوایی بود (جدول 2).

جدول 2- مقایسه محتوای ساپونین در ریشه و بخش­های هوایی سه گونه  .Verbascum

مقدار ساپونین بر حسب میانگین سه تکرار ± خطای معیار نشان داده شده است.

همانطور که در شکل 6 مشاهده می­شود، از لحاظ مقدار کل ساپونین استخراج شده از بخش­های هوایی و ریشه، اختلاف معنی­داری میان سه گونه Verbascum وجود داشت. به طوری­که بیشترین مقدار ساپونین کل در بخش­های هوایی و ریشه، متعلق به گونه V. speciosum بود. از سوی دیگر مقایسه مقدار ساپونین کل در ریشه و بخش­های هوایی هر سه گونه نشان داد که مقدار ساپونین استخراج شده از ریشه تقریباً دو برابر بخش­های هوایی بود.

مطالعه کیفی ساپونین­ها به روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): کروماتوگرافی لایه نازک عصاره­ها، پنج لکه ساپونینی را در محدوده 71/0-13/0 R_f = به رنگ­های صورتی تا ارغوانی را آشکار نمود. لکه­های غیر­ساپونینی با رنگ خاکستری بصورت همراه و یا جدا از لکه­های ساپونینی (با توجه به مراحل مختلف استخراج و نوع حلال) در کروماتوگرام­ها مشاهده شدند. عصاره خام واجد لکه­های غیرساپونینی بود، که طی بخش­سازی در حلال­های مختلف در مرحله آخر عصاره­گیری حذف شدند. لکه شماره 2 در ریشه گونه V. sinuatum با مقدار 31/0=   R_fو در بخش­های هوایی آن لکه شماره 2 با مقدار 47/0=  R_f اصلی­ترین ترکیبات ساپونینی بودند (جدول 3).

در ریشه V. speciosum لکه­های شماره 1، 2 ،3 و 4 با مقادیر 43/0=  R_f و در بخش­های هوایی، لکه­های شماره 1، 2 و 3 با مقادیر 46/0=   R_fبعنوان ترکیبات ساپونینی عمده شناسایی شدند (جدول 4). در شکل 7 تصاویر کروماتوگرام مربوط به فرکشن‌های مختلف استخراج ساپونین از ریشه و بخش­های هوایی V. speciosum نشان داده شده است.

در ریشه V. nudicaule لکه­ شماره 1 با مقدار 25/0=   R_fو در بخش­های هوایی لکه­ شماره 3 با مقدار 19/0=   R_f دو ترکیب ساپونینی اصلی بودند (جدول 5) .

شکل 6- مقایسه مقدار ساپونین کل استخراج شده از ریشه و بخش­های هوایی سه گونه مختلف.Verbascum

بر اساس آزمون دانکن اعداد با حروف مشابه در سطح P ≤0/05 اختلاف معنی­داری ندارند.

بحث

نام ساپونین­ها بر اساس فعالیت سطحی آنها انتخاب شده است، زیرا بسیاری از آنها دارای خاصیت کف­کنندگی هستند و در آب کف پایدار تولید می­کنند (24). قابلیت ایجاد کف یکی از ویژگی­های ساپونین­هاست که با استفاده از آن می‌توان به احتمال حضور این ترکیبات در گیاه پی برد. عصاره­های استخراج شده گیاهان مورد بررسی با تشکیل کفی پایدار در آزمون تعیین شاخص کف­کنندگی، وجود ساپونین را در بخش­های هوایی و ریشه سه گونه Verbascum به اثبات رساندند. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت عصاره، میزان کف ایجاد شده در هر سه گونه Verbascum  افزایش می­یابد. ارتفاع کف پایدار ایجاد شده در ریشه و بخش­های هوایی گونه­های V. sinuatum و V. speciosum با هم برابر و در گونه V. nudicaule بیشتر بود. همچنین مقدار کف ایجاد شده در ریشه هر سه گونه بیشتر از 100% بود. از آنجا که ساپونین­ها در بسیاری از داروهای سنتی و گیاهان دارویی، به خصوص در مشرق زمین یافت شده­اند، بنابراین تلاش زیادی برای تعیین ویژگی­ها و خواص فارماکولوژیکی و زیستی آنها انجام شده است.

جدول 3- مشخصات لکه­های ساپونینی در ریشه و بخش­های هوایی گونه .Verbascum sinuatum

جدول 4- مشخصات لکه­های ساپونینی در ریشه و بخش­های هوایی گونه .Verbascum speciosum

جدول 5- مشخصات لکه­های ساپونینی در ریشه و بخش­های هوایی گونه Verbascum nudicaule.

شکل 7- تصاویر کروماتوگرام مربوط به فرکشن‌های مختلف استخراج ساپونین از ریشه و بخش‌های هوایی در گونه Verbascum speciosum.

1) فرکشن آبی50% ، 2) فرکشن بوتانولی 50%، 3) فرکشن آبی 70%، 4) فرکشن بوتانولی 70%  و 5) اتانول خالص