مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
) تاثیر سیتوکینینهای مختلف بر ریز ازدیادی گیاه اسطوخودوس (Lavandula vera)
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران- شمال، دانشکده علوم زیستی
چکیده
در این تحقیق سیتوکینین¬های مختلف بر سرعت ریزازدیادی اسطوخودوس بررسی شد. جداکشت های دو گره¬ای سترون شده از یک گیاه گلخانه¬ای یکساله در محیط کشت MS دارای هورمون¬های بنزیل آمینو پورین(BAP)،2-¬ ایزوپنتنیل آدنین (2ip) و کینتین (Kin) به تنهائی یا در ترکیب با یکدیگر کشت شد. نتایج حاصل نشان داد سرعت رشد ریز قلمه ها، تعداد گره¬ها و نو ساقه¬های حاصل از هر جدا کشت در محیط کشت به نوع و غلظت هورمون بستگی دارد. بالاترین تعداد نوساقه/¬ جداکشت، تعداد گره/ جداکشت و طول ساقه در محیط کشت دارای BAP ( mgl-12) به دست آمد. در محیط کشت دارای هورمونهای 2ip و Kin ( mgl-12) فاصله میان گره ها افزایش معنی داری را نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در محیط واکشت، بالاترین تعداد نوساقه، گره و طول ساقه در محیط کشت دارای BAP ( mgl-11 )، و بالاترین میانگین طول میان گره در محیط دارای Kin ( mgl-12) حاصل شد. سایر نتایج مشابه مرحله کشت بود. ریشه زائی ریز قلمه ها با دو روش درون شیشه (in vitro) و برون شیشه (ex vitro) بررسی شد. در روش درون شیشه ، ریز قلمه های تکثیریافته از مرحله واکشت، به محیط¬های کشت دارای غلظتهای مختلف IBA وBAP انتقال یافتند. در روش برون شیشه، انتهای ریز قلمه ها با روش سنتی با محلول IBA (mgl-1 300 ) به مدت ده دقیقه تیمار شدند. بالاترین تعداد ریشه، طول ریشه و درصد ریشه زایی در روش برون شیشه به دست آمد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of different cytokinins on micropropagation of Lavandula vera
نویسندگان [English]
- Maryam Peyvandi
- Leila Kazemi
- Ahmad Majd
Dep. of Biology, Fac. Of Science, Islamic Azad University, Tehran-North Branch
چکیده [English]
The effect of different cytokinins on micropropagation of lavandula vera were investigated. Two nodal explants from greenhouse plant were cultured in MS medium supplemented with benzyl aminopurine (BAP), 2-isopentenyl adenine (2ip), Kinetin (Kin) solely or in combination. Results indicated that shoot proliferation depended on type and concentration of hormone. The highest number of nods and new shoots per explants and stem length was produced in the medium with BAP( 2 mgl-1). Growth of internodes was significantly increased in the medium with Kin and 2ip (1 mgl-1).In the subculture media, the highest number of nodes and new shoots per explants was obtained in the medium with BAP (1 mgl-1). Maximum of internode length was achieved in the medium with Kin (2 mgl-1). In vitro shoots were rooted in vitro or ex vitro. By using in vitro method, microshoots were cultured in the media supplemented with different concentration of indole butyric acid (IBA) and Kin. In ex vitro method, the base of microshoots was treated with IBA (300 mgl-1). The highest number of roots as well as length of roots was obtained in ex vitro rooting method.
Keywords: Lavandula vera, micropropagation, microshoots, cytokinin
کلیدواژه‌ها [English]
- Lavandula vera
- micropropagation
- microshoots
- Cytokinin
تأثیر سیتوکینینهای مختلف بر ریزازدیادی گیاه اسطوخودوس (Lavandula vera)
مریم پیوندی*، لیلا کاظمی و احمد مجد
تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران- شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست‌شناسی
تاریخ دریافت: 11/10/91 تاریخ پذیرش: 12/8/92
چکیده
در این تحقیق سیتوکینینهای مختلف بر سرعت ریزازدیادی اسطوخودوس بررسی شد. جداکشتهای دو گرهای سترون شده از یک گیاه گلخانهای یکساله در محیط کشت MS دارای هورمونهای بنزیل آمینو پورین (BAP)، 2- ایزوپنتنیل آدنین (2ip) و کینتین (Kin) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر کشت شد. نتایج حاصل نشان داد که سرعت رشد ریز قلمه ها، تعداد گرهها و نوساقههای حاصل از هر جدا کشت در محیط کشت به نوع و غلظت هورمون بستگی دارد. بالاترین تعداد نوساقه/ جداکشت، تعداد گره/ جداکشت و طول ساقه در محیط کشت دارای BAP ( mgl-12) به‌دست آمد. در محیط کشت دارای هورمونهای 2ip و Kin ( mgl-12) فاصله میان گره ها افزایش معنی داری را نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در محیط واکشت، بالاترین تعداد نوساقه، گره و طول ساقه در محیط کشت دارای BAP ( mgl-11 )، و بالاترین میانگین طول میان گره در محیط دارای Kin (mgl-12) حاصل شد. سایر نتایج مشابه مرحله کشت بود. ریشهزایی ریز قلمه ها با دو روش درون شیشه (in vitro) و برون شیشه (ex vitro) بررسی شد. در روش درون شیشه، ریزقلمه های تکثیریافته از مرحله واکشت، به محیطهای کشت دارای غلظتهای مختلف IBA وBAP انتقال یافتند. در روش برون شیشه، انتهای ریز قلمه ها با روش سنتی با محلول IBA (mgl-1 300) به مدت ده دقیقه تیمار شدند. بالاترین تعداد ریشه، طول ریشه و درصد ریشه زایی در روش برون شیشه به‌دست آمد.
واژه‌های کلیدی: اسطوخودوس، ریزازدیادی، ریز قلمه، سیتوکینین
* نویسنده مسئول، تلفن: 09122899867 ، پست الکترونیکی: m_peyvandi@iau-tnb.ac.ir
مقدمه
اسطوخودوس از خانواده Labiatea می باشد. گونههای مختلف اسطوخودوس گیاهان نیمه خشبی چند ساله و مخصوص مناطق خشک و نیمه خشک هستند (15، 16). گلها به صورت سنبله های دراز است. منشأ آنها جنوب اروپا در مناطق مدیترانه ای گزارش شده است (9 ، 11). تاکنون حدود 48 گونه از این گیاه شناسایی شده است. ارتفاع این گیاه متفاوت و بین 40 تا 60 سانتی متر است. پیکر رویشی این گیاه حاوی مواد متفاوت ازجمله اسانسها می‌باشد. مهمترین ترکیبات تشکیلدهنده اسانس شامل اسید بوتیریک، کامفور، ژرانیول، لینالیل و لینالیل استات می باشند که در ترکیبات آرایشی، عطرسازی و داروسازی کاربرد دارند (3،19). از این گیاه لوسیونی تهیه می شود که در درمان زخم های دیر علاج و دردهای روماتیسمی و بعضی بیماریهای جلدی و پوست سر استفاده می شود. مصرف این گیاه در درمان آسم، سردرد، اختلالات کبد و طحال و ضعف اعصاب کاربرد دارد.
این گیاه در روشهای سنتی معمولا با ریشه‌دار کردن قلمهها و یا توسط بذر تکثیر می شود که بسیار روند کندی دارد (3، 9).
روش کشت در شیشه این امکان را به وجود می آورد که گیاه با سرعت بیشتری رشد نماید. البته این روش به دلیل وجود فنل زیاد در گیاه همواره با مشکل مواجه بوده است، زیرا هنگام سترون کردن و قطعه نمودن نمونهها، به دلیل اکسیداسیون ترکیبات فنلی بافتها سریع قهوهای میشوند (5، 6). ریزازدیادی عمدتا شامل رشد جوانههای جانبی، اندامزایی و رویانزایی است (10، 18). رشد شاخه جانبی زمانی اتفاق می افتد که جوانههای جانبی از تسلط انتهایی آزاد گردند. این عمل عمدتا با استفاده از هورمونهای شیمیایی (خصوصا سیتوکینین) در محیط کشت انجام میشود (4، 17). در واقع ریزازدیادی نوعی تکثیر رویشی است که به صورت تکثیر شاخه از جدا کشتهای مختلف نظیر جوانههای جانبی یا انتهای ایجاد شاخههای نابجا به صورت مستقیم، یا رویانزایی از بافت یا اندام و یا رویانهای تخمی میسر است.
نقش نوع سیتوکینینها در سرعت رشد و نوع اکسینها بر ریشهزائی قلمه های ریزازدیاد شده در برخی ارقام اسطوخودوس نظیر Lavandula dentate مطالعه شده است (10،18).
هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات تیمارهای هورمونی سیتوکینین و اکسین بر روی ریزازدیادی اسطوخودوس Lavandula vera در محیط کشت MS بود.
مواد و روشها
آزمایشها در دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران – شمال، آزمایشگاه محمودیه انجام شد.
نمونه گیاهی: گیاه اسطوخودوس رقم vera از گیاه یکساله گلخانهای برداشت شد.
محیطهای کشت: محیط کشت MS Murashig, Skoog, 1962)) (14) دارای ( mgl-12-1)2ip ، Kin، BAP،IBA به تنهایی یا مخلوط با یکدیگر استفاده شد (جدول 1). پس از افزودن هورمونها و قبل از اضافه کردن آگار، pH محیط کشت 8/5 تنظیم شد و بعد در فشار 05/1 کیلو گرم بر سانتی متر مربع و دمای 120 درجه سانتیگراد سترون شد. پس از سرد شدن محیط تا 30 درجه سانتیگراد، محیطها در زیر دستگاه لامینار ایرفلوکابینت به شیشههای سترون مخصوص کشت منتقل شدند.
کشت نمونه ها: شاخههای جوان از گیاه مادری جدا شد و پس از شستشو با آب جاری با کلرید جیوه (1/0%) و شستشو با آب مقطر (3 بار ) سترون گردید. پس از حذف برگها و جوانههای انتهایی، بخشهای دارای دو گره، در محیط کشت پایهMS دارای هورمون های BAP، kin، 2ip و مخلوط این هورمون ها کشت گردیدند (جدول 1). نوساقه های سترون 45 روزه حاصل برای مراحل بعدی استفاده شد.
واکشت نمونهها: بخشهای دارای دو گره از ساقههای سترون مرحله اول در محیط کشت مشابه با محیط کشت پایه اولیه واکشت شدند. سی روز پس از واکشت شاخصهای رشد بررسی شد.
در کلیه آزمایشها نمونهها در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و در دمای 25 درجه سانتیگراد در اتاق کشت نگهداری شدند.
ریشه‌دار نمودن ریزقلمه‌ها: نوساقههای حاصل از کشت در شیشه با روشهای زیر ریشه‌دار شد:
الف) ریشهزایی در شیشه (in vitro): ساقه های سترون حاصل از رشد جوانه های جانبی در محیط کشت دارای BAP (mgl-1 2)، برای ریشه دار شدن به محیط کشتهای جدید دارای IBA با غلظت های(mgl-1 5/0 ،1 ، 2 ) به تنهایی یا همراه با هورمون BAP (mgl-1 1/0) منتقل شدند.
ب) ریشهزایی برون شیشه (ex vitro): انتهای ریز قلمه های حاصل از رشد در محیط کشت دارای BAP (mgl -1 2) پس از شستشو با آب شهر و زدودن آگار، با محلول IBA( mgl-1300( سترون به مدت 10 دقیقه تیمار شدند. سپس نمونه های تیمار شده در محیط کشت فاقد هورمون کشت شدند.
تجزیه آماری: برای تیمارهای سیتوکینین، هر تیمار حداقل با 7 تکرار و در هر تکرار 4 نمونه کشت شد. تعداد شاخهها، گرهها، طول میان گره و طول ساقه در هر جداکشت، 30 روز پس از تیمار بررسی شد.
برای آزمایشهای ریشهزایی، هر تیمار حداقل با 4 تکرار و هر تکرار با 4 نمونه انجام شد. 30 روز پس از تیمار درصد ریشهزایی، تعداد و طول ریشه یادداشت شد.
داده ها براساس نرم افزار SPSS (ver.14) آنالیز شد. مقایسه میانگین داده ها بر اساس برنامهANOVA و گروه بندی میانگین ها بر اساس آزمون دانکن در سطح اطمینانp≤0/05 انجام شد.
نتایج
نتایج استفاده از سیتوکینینهای مختلف نشان داد که رشد نوساقههای اسطوخودوس، تعداد گره ها و تعداد نوساقهها و برگهای جدید به ازای هر ریز نمونه و طول هر میان گره به نوع و غلظت هورمونهای محیط بستگی دارد.
اثر انواع سیتوکینین بر روی میزان تکثیر:
مرحله کشت: سرعت رشد ریز نمونهها در محیط کشت دارای BAP افزایش معنی داری را نشان داد، به‌طوری‌که بالاترین تعداد شاخه (86/3) و طول ساقه (cm01/12) در محیط کشت دارای هورمون BAP ( mgl-1 2) بدست آمد. وجود BAP به تنهایی یا همراه سایر هورمونها موجب افزایش در تعداد نوساقهها و جدا کشت شد (شکل 1)(جدول1).
مرحله واکشت: نتایج نشان داد همانند مرحله کشت، حضور BAP موجب افزایش معنی داری در تعداد نوساقه ها/ جداکشت، طول ساقه و تعداد گره/جداکشت می گردد. به‌طوری‌که بیشترین تعداد نوساقه/جداکشت (23/7)، تعداد گره/جداکشت (97/12) و بیشترین میزان طول ساقه ها/جداکشت (cm 73/23) در محیط کشت دارای هورمون BAP (mgl-1 1) بدست آمد، اما فاصله میان گرهها در محیط کشت دارای Kin به تنهایی بیشتر از سایر محیطها بود (شکل 1)(جدول2).
جدول1- میانگین شاخصهای رشد جوانههای جانبی گیاه مادری در محیط کشت پایه MS در تیمارهای متفاوت سیتوکینین در مرحله کشت، Mean±SE، (گروه‌بندی براساس آزمون دانکن (05/0≥P). حروف مشترک نشاندهنده معنی‌دار نبودن یبن میانگینهاست).
|
هورمونmgl-1 |
تعداد نوساقه/ جداکشت |
تعداد گره/ جداکشت |
طول میان‌گره |
طول ساقه‌ها/ جداکشت |
||
|
BAP |
2ip |
Kin |
||||
|
1 |
0 |
0 |
45/3±36/0 (ab) |
21/6±66/0 (ab) |
19/1±10/0 (cd) |
82/11±54/1 (a) |
|
2 |
0 |
0 |
86/3±26/0 (a) |
11/7±45/0 (a) |
09/1±07/0 (cde) |
01/12±98/0 (a) |
|
0 |
1 |
0 |
57/2±23/0 (bcd) |
62/4±41/0 (c) |
12/1±08/0 (cde) |
79/7±67/0 (d) |
|
0 |
2 |
0 |
58/2±19/0 (bcd) |
67/4±29/0 (c) |
20/1±07/0 (cd) |
82/8±77/0 (bcd) |
|
0 |
0 |
1 |
41/2±24/0 (cde) |
07/5±47/0 (bc) |
08/1±06/0 (cde) |
10/8±74/0 (d) |
|
0 |
0 |
2 |
03/2±21/0 (de) |
25/5±43/0 (bc) |
28/1±06/0 (c) |
22/9±78/0 (bcd) |
|
1 |
0 |
1 |
26/3±28/0 (ab) |
52/7±56/0 (a) |
04/1±05/0 (de) |
96/10±76/0 (abc) |
|
2 |
0 |
2 |
17/3±19/0 (abc) |
23/6±39/0 (ab) |
94/0±06/0 (e) |
33/8±58/0 (cd) |
|
1 |
1 |
0 |
76/3±35/0 (a) |
44/7±75/0 (a) |
01/1±08/0 (de) |
42/11±10/1 (ab) |
|
2 |
2 |
0 |
24/3±26/0 (ab) |
72/6±58/0 (a) |
92/0±06/0 (e) |
25/9±84/0 (bcd) |
|
0 |
1 |
1 |
92/1±14/0 (de) |
92/2±28/0 (d) |
53/1±10/0 (b) |
37/7±72/0 (d) |
|
0 |
2 |
2 |
70/1±14/0 (e) |
45/2±24/0 (d) |
75/1±08/0 (a) |
91/6±56/0 (d) |
شکل 1- رشد جداکشتهای جوانههای جانبی در محیطهای کشت و واکشت مختلف؛A : در محیط کشت دارای هورمون BAP (mgl-1،B : محیط دارای BAP ,Kin (mgl-1 1)، C: محیط دارای Kin (mgl-1 2)، D: رشد ریز قلمههای سترون در محیط واکشت مختلف دارای هورمون BAP (mgl-1 1)، E: رشد ریز قلمههای سترون در محیط واکشت دارای هورمون Kin (mgl-1 1)، F: رشد ریز قلمههای سترون در محیط واکشت دارای 2ip وKin (mgl-1 2)
ریشهزایی: ریشهزایی در شیشه: ریز قلمه های رشد یافته در محیط کشت BAP(mgl -1 2) به محیط های دارای غلظتهای مختلف IBA به تنهایی یا همراه با Kin انتقال یافتند. ریشهزایی تنها در محیط کشت دارای IBA
(mgl-1 2) و Kin (mgl-1 1/0) (67/16%) مشاهده شد(جدول3).
جدول 2- رشد جوانههای جانبی نوساقههای سترون در محیط کشت پایه MS در تیمارهای متفاوت سیتوکینین در مرحله واکشت، Mean±SE (گروه‌بندی براساس آزمون دانکن (05/0≥P). حروف مشترک نشاندهنده معنی‌دار نبودن بین میانگینهاست).
|
هورمونmgl-1 |
تعداد نوساقه/جداکشت |
تعداد گره/ جداکشت |
طول میان‌گره |
طول ساقه‌ها/ جداکشت |
||
|
BAP |
2ip |
Kin |
||||
|
1 |
0 |
0 |
23/7±64/0 (a) |
97/12± 16/1(a) |
90/1±13/0 (cd) |
73/23±27/2 (a) |
|
2 |
0 |
0 |
91/6±70/0 (a) |
72/11±18/1 (a) |
73/1±06/0 (d) |
66/19± 95/1(b) |
|
0 |
1 |
0 |
98/3±29/0 (b) |
74/6± 44/0(b) |
79/1±10/0 (cd) |
68/10±83/0 (c) |
|
0 |
2 |
0 |
76/3±28/0 (b) |
57/6± 43/0(b) |
79/1±10/0 (cd) |
31/10±83/0 (c) |
|
0 |
0 |
1 |
96/2±27/0 (bcd) |
59/5±48/0 (bc) |
93/1±09/0 (cd) |
30/9±83/0 (c) |
|
0 |
0 |
2 |
33/2±30/0 (cd) |
87/5±60/0 (bc) |
80/2±18/0 (a) |
62/10±04/1 (c) |
|
1 |
0 |
1 |
48/3±28/0(bc) |
84/7±58/0 (b) |
36/2±11/0 (b) |
55/12±83/0 (c) |
|
2 |
0 |
2 |
74/3±28/0 (b) |
11/7±51/0 (b) |
96/1±09/0 (cd) |
58/10±78/0 (c) |
|
1 |
1 |
0 |
97/3±38/0 (b) |
73/7±78/0 (b) |
94/1±11/0 (cd) |
85/12±24/1 (c) |
|
2 |
2 |
0 |
75/3±31/0 (b) |
32/7±63/0 (b) |
11/2±15/0 (bc) |
08/11±00/1 (c) |
|
0 |
1 |
1 |
25/2±20/0 (d) |
95/3±41/0 (cd) |
76/1±12/0 (cd) |
75/10±15/1 (c) |
|
0 |
2 |
2 |
96/1±20/0 (d) |
15/3± 32/0(d) |
66/1±08/0 (d) |
95/8±72/0 (c) |
جدول 3- درصد ریشهزایی، میانگین طول و تعداد ریشه در تیمارهای مختلف، Mean±SE (گروه‌بندی بر اساس آزمون دانکن (05/0≥P). حروف مشترک نشاندهنده معنی‌دار نبودن بین میانگینهاست.
|
تیمار |
هورمونmgl-1 |
درصد ریشهزایی |
تعداد ریشه |
طول ریشه (cm) |
|
|
IBA |
Kin |
||||
|
در شیشه |
1 |
0 |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
|
در شیشه |
2 |
0 |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
|
در شیشه |
5/0 |
1/0 |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
|
در شیشه |
1 |
1/0 |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
00/0±00/0(b) |
|
در شیشه |
2 |
1/0 |
67/16±24/11(ab( |
41/0±29/0(b) |
62/0±43/0(ab) |
|
برون شیشه |
300 |
0 |
00/30±51/10(a) |
50/2±07/1(a) |
86/1±78/0(a) |
ریشهزایی برون شیشه: 30% نمونه های تیمار شده با اکسین، پس از انتقال به محیط کشت فاقد هورمون، ریشه دار شدند (جدول 3).
بحث
در مطالعه حاضر اثرات هورمونی سیتوکینین ها و اکسین در محیط کشت MS بر روی تکثیر اندام هوایی و ریشه زایی اسطوخودوس ارزیابی شدند.
سیتوکینینها در تقسیم سلولی و تحریک رشد در جوانه های جانبی، در مهار رشد ریشه و مهار پیری دخالت دارند. اگرچه نوع و غلظت این تنظیم کنندههای رشد گیاهی در القا اندامزایی نیز نقش بسزایی دارد (1، 5، 19).
نتایج این بخش از پژوهش نشان داد که در مرحله اول (مرحله کشت)، محیط کشت دارای BAP (mgl-1 2) باعث افزایش شاخه زایی، تعداد گره و طول ساقه شد و Kin (mgl-1 2) باعث افزایش رشد میانگین گره گردید. مقایسه نتایج مرحله کشت و واکشت نشان می دهد که در مرحله کشت BAP (mgl-1 2) و در مرحله واکشت، با افزایش سن ریز قلمه ها BAP (mgl-1 1) کارآمدتر می باشد.
تحقیقات نشان داده است که سرعت رشد ریز قلمه ها در گونه های مختلف اسطوخودوس به نوع و تراکم سیتوکینین استفاده شده وابسته است (6، 10). مطالعات Nobre (1996) بر ریزازیادی گیاهLavandula Stoechas (15)، Chishti و همکاران (2006) در گیاه lavendua officinali (7)و . Diasو همکاران (2002) در گیاه Lavandula viridis (9) نشان داده است که هورمون BAPمؤثرتر از Kin است. Andrade و همکاران (1999) تأثیر بنزیلآدنین (BA) و تیدیازورون (TDZ) را بر سرعت ریزازدیادی Lavandula Vera بررسی کردند (3). نتیجه این تحقیق نشان داد که استفاده از BAو TDZ باعث افزایش تکثیر شاخه و رشد طولی ساقه میشود. همچنین Echeverrigarayو همکاران (2005) نشان دادند که هورمون BAبه تنهایی یا همراه با تراکم کم IBA رشد را افزایش می‌دهد (11).
هورمون اکسین و ترکیبات مشابه آن عامل مناسب برای ریشه زایی می باشند. این هورمون به راحتی سبب تحریک سلولهای دایره محیطی در بخشهای بالایی ناحیه تارهای کشنده میشود، این تحریک منتج به تقسیم سلولهای این منطقه و در نهایت تشکیل ریشه می‌گردد (2، 8، 12، 13). بررسی ها نشان داده است که اکسین به تنهایی یا همراه با سیتوکینین موجب تحریک ریز قلمه های گونه های مختلف اسطوخودوس میشود (3، 9).
در تحقیق حاضر ریشهزایی با استفاده از روش سنتی ریشه‌دار نمودن (تیمار ریز قلمه ها با محلول اکسین) بالاتر از ریشهزایی در شیشه بود.
(علمی)', './data/plant/coversheet/561453619817.jpg'))
دوره 28، شماره 2 - شماره پیاپی 2
شهریور 1394صفحه 257-263
- تاریخ دریافت: 11 دی 1391
- تاریخ بازنگری: 23 مهر 1392
- تاریخ پذیرش: 12 آبان 1392