نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تربیت مدرس

2 هیات علمی/تربیت مدرس

3 هیات علمی/ تربیت مدرس

چکیده

در این پژوهش اثر متیل¬جاسمونات 1/0 میلی¬مولار به عنوان یک الیسیتور (elicitor) بر فعالیت آنزیم-های آنتی¬اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در کشت سلول Scrophularia striata و محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئید آن در بازه زمانی 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در طی 12 ساعت اولیه دوره تیمار کاهش و پس از آن تا پایان دوره آزمایش افزایش یافت. در حضور متیل¬جاسمونات فعالیت کاتالاز در کلیه نمونه¬ها در مقایسه با شاهد افزایش معنی¬داری داشت در حالیکه فعالیت پراکسیداز پس از 12 ساعت به طور معنی¬داری افزایش یافت. به منظور درک بهتر سازوکار متیل¬جاسمونات، میزان تجمع پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز بررسی شد. میزان پراکسید هیدروژن تنها در کشت¬هایی که به مدت 8 ساعت در تیمار متیل¬جاسمونات بودند نسبت به کشت¬های شاهد افزایش معنی¬داری داشت در حالیکه میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تغییر معنی¬داری نشان نداد. بررسی میزان فنول کل در سلول¬های شاهد و تیمار شده نشان داد که میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش بود و در کشت¬های تیمار شده با متیل¬جاسمونات پس از 48 و 72 ساعت افزایش معنی¬دار ترکیبات فنولی نسبت به شاهد دیده شد. نمونه¬های تیمار شده با متیل¬جاسمونات، از 24 ساعت پس از تیمار تا آخر دوره، نسبت به 12 ساعت اول به طور معنی¬داری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری نسبت به شاهد برخوردار بودند. در حضور متیل¬جاسمونات افزایش توان آنتی¬اکسیدانی و افزایش میزان ترکیبات فنولی با کاهش شاخص¬های تنش اکسیداتیو هماهنگ می¬باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of methyl jasmonate on antioxidant enzyme activities, phenolic and flavonoid compounds in Scrophularia striata cell culture

نویسنده [English]

  • Narges Khanpour-Ardestani 1

چکیده [English]

Effects of 0.1 mM MeJA as an elicitor on the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) and contents of phenolics and flavonoids during 4-72 hours in Scrophularia striata cell culture were studied. Decreasing in SOD activity was observed during first 12- hours after 0.1 mM MeJA treatment and then increased. Activity of CAT enzyme was increased in 0.1mM MJ treated samples significantly in comparing to the control, while POD activity was increased 12 hours after treatment. To study of MeJA mechanism, H2O2 content and lipid peroxidation were investigated. H2O2 content was increased after 8 hour post treatment with MeJA while lipid peroxidation was not changed. The amount of total phenols in control and treated cells showed a gentle slope rising levels of phenolic compounds and 0.1 mM MeJA significantly increased total phenolic compoundes in S. striata cells culture 48 and 72 hours after treatment. Also, flavonoids significantly increased in treated cells compared with controls 24 hours after treatment toward the first 12 hours. Increasing in antioxidant capacity and phenolics and flavonoids contents after elicitation is in accordance with decreasing in oxidative stress index.

کلیدواژه‌ها [English]

  • antioxidant
  • Flavonoids
  • Methyl Jasmonate
  • Phenolic compounds
  • Scrophularia striata

اثر متیل جاسمونات بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در کشت سلول Scrophularia straita Boiss. 

نرگس خانپور اردستانی1، مظفر شریفی1* و مهرداد بهمنش2

1 دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

2 دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 12/6/92               تاریخ پذیرش: 26/8/92

چکیده

در این پژوهش اثر متیل­جاسمونات 1/0 میلی­مولار به‌عنوان یک الیسیتور (elicitor) بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در کشت سلولScrophularia striata  و محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئید آن در بازه زمانی 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در طی 12 ساعت اولیه دوره تیمار کاهش و پس از آن تا پایان دوره آزمایش افزایش یافت. در حضور متیل­جاسمونات فعالیت کاتالاز در کلیه نمونه­ها در مقایسه با شاهد افزایش معنی­داری داشت، در حالیکه فعالیت پراکسیداز پس از 12 ساعت به طور معنی­داری افزایش یافت. به‌منظور درک بهتر سازوکار متیل­جاسمونات، میزان تجمع پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز بررسی شد. میزان پراکسید هیدروژن تنها در کشت­هایی که به مدت 8 ساعت در تیمار متیل­جاسمونات بودند نسبت به کشت­های شاهد افزایش معنی­داری داشت، در حالیکه میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تغییر معنی­داری نشان نداد. بررسی میزان فنول کل در سلول­های شاهد و تیمار شده نشان داد که میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش بود و در کشت­های تیمار شده با متیل­جاسمونات پس از 48 و 72 ساعت افزایش معنی­دار ترکیبات فنولی نسبت به شاهد دیده شد. نمونه­های تیمار شده با متیل­جاسمونات، از 24 ساعت پس از تیمار تا آخر دوره، نسبت به 12 ساعت اول به طور معنی­داری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری نسبت به شاهد برخوردار بودند. البته در حضور متیل­جاسمونات افزایش توان آنتی­اکسیدانی و افزایش میزان ترکیبات فنولی با کاهش شاخص­های تنش اکسیداتیو هماهنگ می­باشد.

واژه­های کلیدی: آنتی­اکسیدان، ترکیبات فنولی، فلاونوئید، متیل­جاسمونات،  Scrophularia striata

* نویسنده­ مسئول، تلفن: 82884479-021، پست الکترونیکی:msharifi@modares.ac.ir   

مقدمه

 

گیاه Scrophularia striata یک گیاه بومی ایران است که در مناطق سردسیر و کوهستانی زاگرس رشد می­کند. از زمان­های قدیم از این گیاه برای درمان و بهبود زخم­های حاصل از سوختگی استفاده می­کردند (1). همواره اعتقاد بر این بوده که این گیاه علاوه بر اینکه باعث تسریع التیام زخم می­گردد از عفونت­های شایع باکتریایی در زخم نیز جلوگیری می­کند؛ دارای اثرات ضد میکروبی، ضد تومور و ضد التهاب است (2). برخلاف تأثیرات دارویی شناخته شده، در مورد ترکیبات مؤثره موجود در این گیاه اطلاعات بسیار کمی در دست می­باشد. بسیاری از خواص دارویی این جنس را به حضور فنیل­اتانوئید گلیکوزیدها نسبت می­دهند. روش­های کشت بافت گیاهی اغلب به‌عنوان مدل برای بررسی­های گوناگون فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و ژنتیکی در گیاهان مورد استفاده قرار می­گیرد (8). کشت سلول­های گیاهی در شرایط آزمایشگاهی برای تولید فراورده­های دارویی گیاهی به‌عنوان یک روش جایگزین و قابل قبول نسبت به استفاده از عصاره گیاه کامل به‌کار گرفته شده و منبع مناسب و مهمی برای تولید متابولیت­های ثانوی با ارزش می­باشد. محتوای متابولیت­های ثانوی در کشت سلول به وسیلۀ دست‌ورزی تنظیم کننده­های رشد، بهینه سازی ترکیبات محیط کشت مانند قند، نیترات، فسفات و افزودن پیش سازها، الیسیتورها و بهینه کردن شرایط کشت با تغییر پارامترهایی مانند نور، pH و هوادهی قابل ارتقا می­باشد. استفاده از الیسیتورها یکی از مؤثرترین راهکارها برای بهبود تولید متابولیت­های ثانوی زیستی است، این مولکول­ها تولید متابولیت­های ثانوی مانند آلکالوئیدها، ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، ترکیبات فنولی و فیتوالکسین­ها را در کشت سلول گیاهی به طور مؤثری تحریک می­کنند (34).

جاسمونات­هاJas) )، شامل جاسمونیک اسیدJA)) و متیل­جاسمونات MeJA))، یک خانواده از ترکیبات سیکلوپنتانون هستند که از طریق مسیر اکتا­دکانوئیک از لینولنیک اسید ساخته می­شوند. به طور کلی این ترکیبات از رشد گیاه جلوگیری می­نمایند، اما به‌عنوان یک شاخه از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی، فرایندهای متنوعی از قبیل رسیدن میوه، پیری، تشکیل غده، تشکیل دانه گرده، پاسخ­های دفاعی علیه آسیب­های مکانیکی و حمله حشرات و بیماری‌زاها را راه­اندازی می­کنند (20). این ترکیبات به‌عنوان الیسیتور و از طریق القای (Elicitation) دستگاه دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیت­های ثانوی نیز می­شوند (20 و 41). به‌علاوه اینکه متیل­جاسمونات تولید گونه­های واکنش­گر اکسیژن (ROS) (Reactive Oxygen Species) را القا می­کند (40). مهمترین گونه­های فعال اکسیژن، رادیکال­های­ آنیون سوپراکسید (O2•-)، هیدروکسیل (OH) و هیدروژن پراکسید (H2O2) هستند (17). این ترکیبات نقش پیامبر ثانوی را در پاسخ­های سلولی بر عهده دارند ولی مقادیر بالای آنها باعث آسیب شدید به سلول می­شود (28). رادیکال­های آزاد در واکنش با پروتئین­ها، لیپیدها و DNA در سلول می­توانند باعث تغییر فعالیت و یا غیرفعال شدن آنها شده و در ­نهایت باعث آپوپتوزیس و مرگ سلول­ها گردند (12). رادیکال­های آزاد با پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول سبب تغییر ساختار و نسبت لیپیدهای غشا شده و باعث کاهش تمامیت غشا و در نتیجه افزایش نفوذپذیری آن می­گردند. گیاه با استفاده از مکانیسم­های آنزیمی و غیر­آنزیمی می­تواند غلظت گونه­های واکنش­گر اکسیژن را کاهش دهد و از این طریق از اثرات مخرب آن بکاهد. البته موفقیت کامل گیاه در این راستا به میزان فعالیت دستگاه آنتی­اکسیدانی گیاه و غلظت گونه­های واکنش­گر اکسیژن بستگی دارد (32). دستگاه دفاعی آنتی­اکسیدان شامل آنزیم­های نظیر سوپراکسید دیسموتاز (SOD) ، کاتالاز (CAT) ، پراکسیداز POD)) و آنتی­اکسیدان­های غیر­آنزیمی شامل فلاونوئیدها، آنتوسیانین­ها و سایر ترکیبات فنولی­، آسکوربات، آلفا­ توکوفرول، بتا­کاروتن و غیره می­باشد (22).

از آنجا که تحقیقات چندانی راجع به گیاه S. striata انجام نشده است، هدف تحقیق حاضر مطالعه ارتباط بین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، تجمع گونه­های واکنش­گر اکسیژن و محتوای ترکیبات فنولی در کشت سلول این گیاه پس از تیمار با متیل­جاسمونات در زمان­های متفاوت می­باشد.

مواد و روشها

جمع­آوری و کشت بذرها: بذرهای Scrophularia striata Boiss. از منطقه آسمان آباد، روستای جانجان، استان ایلام جمع­آوری شدند. بذرها پس از شستشوی سطحی با مایع شوینده، به مدت 70 ثانیه در الکل 70% قرار گرفتند، پس از آبکشی با آب مقطر، 10 دقیقه در پراکسید هیدروژن 3/3% قرار داده شدند. سپس 15 دقیقه به محلول هیپوکلریت سدیم 2% منتقل شدند، پس از شستشوی کامل در مرحلۀ آخر 70 ثانیه در الکل 70% قرار گرفتند و با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرهای استریل به مدت یک شبانه‌روز در محلول 75/0 گرم در لیتر جیبرلین که از قبل توسط فیلتر 2/0 میکرومتر استریل شده بود در دمای 4 درجه سانتی­گراد قرار گرفت و بعد در محیط MS (Murashige and Skoog) بدون هورمون کشت داده شدند. بذرها به مدت سه روز در فیتوترون در تاریکی و پس از آن دو هفته در دمای 25 درجه سانتی­گراد و دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و از گیاهچه­های حاصل برای کشت بافت استفاده شد.

تشکیل کالوس و راه­اندازی کشت سلولی: به‌منظور ایجاد کالوس، قطعاتی از ساقه گیاهچه­ها به طول یک تا دو سانتی­متر به محیط کشت MS پایه حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر نفتالن استیک اسید و 2 میلی­گرم در لیتر بنزیل آمینو پورین منتقل شد. بعد از گذشت 3 تا 7 روز القای کالوس­ها در قطعات شروع شد. کالوس­ها در محیط جامد هر دو هفته یکبار واکشت شدند. برای راه­اندازی کشت سلولی تعلیقی، درون هر ارلن 250 میلی­لیتری، حاوی 50 میلی­لیتر محیط کشت مایع MS با ترکیبات هورمونی یاد شده در بالا و بدون آگار، مقدار 2 گرم کالوس ترد و هم­سن وارد گردید و با سرعت 110 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی­گراد در تاریکی روی شیکر قرار گرفتند و به‌منظور تکثیر و همگن­سازی، هر دو هفته یکبار واکشت گردید. در هر مرحله سلول­ها با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش جمع­آوری شدند و به محیط تازه منتقل گردیدند.

تیمار سلول­ها با متیل­جاسمونات: قبل از اعمال تیمار، دوره رشد برای سلول­ها تعیین گردید. بدین منظور بعد از انتقال 1 گرم توده سلول­ کاملاً همگن شده به ارلن 100 میلی­لیتری حاوی 50 میلی­لیتر از محیط کشت مایع جدید MS دارای 5/0 میلی­گرم بر لیتر نفتالن استیک اسید و 2 میلی­گرم بر لیتر بنزیل آمینو پورین، از روز اول تا روز 29 بعد از انتقال، به فاصله زمانی دو روز یکبار، نمونه­برداری انجام شد و بر اساس وزن­ تر توده سلولی منحنی رشد ترسیم گردید.

به‌منظور اعمال تیمار، مجدداً محیط کشت تعلیقی تهیه گردید و 1 گرم سلول (وزن تر) با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش برداشت و به ارلن حاوی 50 میلی­لیتر از محیط کشت مایع منتقل گردید. از طرفی محلول متیل­جاسمونات تهیه و توسط فیلتر با قطر منافذ 2/0 میکرومتر استریل شد. با توجه به منحنی رشد بدست آمده، در روز هفتم از دوره رشد سلولی به محیط کشت­های سلولی مقداری از محلول متیل­جاسمونات اضافه گردید، به گونه­ای که غلظت نهایی آن 1/0 میلی­مولار باشد. این غلظت با توجه به آزمایش­های مقدماتی در سه غلظت 01/0، 1/0 و 1 میلی­مولار متیل و اندازه­گیری رشد و درصد زنده­مانی سلول­ها انتخاب شد. محیط­های کشت در دمای 25 درجه سانتی­گراد روی شیکر با 110 دور در دقیقه قرار گرفتند و در زمان­های 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. در این آزمایش حداقل 3 تکرار برای هر زمان در نظر گرفته شد. میزان رشد سلولی در حضور متیل­جاسمونات براساس اندازه‌گیری وزن تر سلول­ها در ساعات پس از تیمار تعیین شد.

تعیین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: با همگن­سازی 1/0 گرم سلول­ در 3 میلی­لیتر بافر HEPES- KOH 50 میلی­مولار (8/7=pH) دارای EDTA 1/0 میلی­مولار و سانتریفیوژ عصاره حاصل در 12000 (rpm) به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد، آماده­سازی تمام نمونه­ها انجام شد و بخش روشناور حاصل برای تعیین غلظت پروتئین به روش Bradford (1976) و سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز مورد استفاده قرار گرفت. ترکیب واکنش در حجم نهایی 3 میلی­لیتر شامل بافر HEPES-KOH 50 میلی­مولار (8/7=pH) حاوی EDTA 1/0میلی­مولار، کربنات سدیم 50 میلی­مولار (2/10=pH)، L-متیونین12 میلی­مولار،‌ نیترو بلو تترازولیوم (NBT) 75 میلی­مولار، ریبوفلاوین 1 میکرومولار و 300 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. در کنار هر نمونه، یک شاهد در نظر گرفته شد که دارای تمام موارد فوق بدون عصاره آنزیمی بود و به جای آن همان اندازه از بافر استخراج اضافه گردید. نمونه­ها و شاهد به مدت 15 دقیقه در معرض نور لامپ فلورسنت قرار گرفتند تا تغییر رنگ حاصل گردد. سپس جذب آنها در  طول موج 560 نانومتر قرائت گردید و تفاوت جذب بین هر نمونه و شاهد محاسبه گردید. واحد فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به‌عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 50 درصد احیای NBT در حضور نور گردید (10).

تعیین فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز

روش استخراج پروتئین: در این مرحله 1/0 گرم از سلول­ها در 3 میلی­لیتر بافر سدیم فسفات 25 میلی­مولار (8/6=pH) کاملاً ساییده شد. همگنای حاصل در 12000 (rpm) به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت جدا و برای سنجش غلظت پروتئین موجود در سلول­ها و نیز فعالیت آنزیم استفاده شد. غلظت پروتئین نمونه­ها به روش Bradford (1976) تعیین گردید.

فعالیت آنزیم کاتالاز براساس میزان تجزیه H2O2 و در نتیجه کاهش میزان جذب آن در طول موج 240 نانومتر سنجیده و به ازای میلی­گرم پروتئین عصاره آنزیمی برای یک دقیقه محاسبه شد. مخلوط واکنش (3 میلی­لیتر)، شامل 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 2450 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات 25 میلی­مولار (8/6=pH) و 500 میکرولیتر H2O2 10 میلی­مولار تهیه شد. کلیه مراحل استخراج آنزیمی روی یخ انجام شد (9).

برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش ذکر شده Pandolfini و همکاران (1992) عمل گردید. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات سدیم 60 میلی­مولار (1/6=pH)، گایاکول 28 میلی­مولار و پراکسید هیدروژن 5 میلی­مولار و 500 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. جذب نمونه­ها در طول زمان یک دقیقه در طول موج 470 نانومتر قرائت گردید و فعالیت آنزیم پراکسیداز به­ صورت تغییرات جذب به میلی­گرم پروتئین عصاره بیان گردید.

تعیین مقدار پراکسید هیدروژن (H2O2): بدین منظور 1/0 گرم سلول، روی یخ با 3 میلی­لیتر تری­کلرو استیک اسید 1/0% تا مرحله همگن شدن سائیده و بعد سانتریفیوژ (rpm12000، به مدت 15 دقیقه) شدند. به 1 میلی­لیتر از محلول روشناور،  1 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم (10 میلی­مولار، 7=pH) و 1 میلی­لیتر یدید پتاسیم اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر با اسپکتروفتومتر قرائت شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن محاسبه گردید (37).

تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: میزان آسیب به غشاها با اندازه­گیری مقدار مالونیل دی­آلدئید (MDA) به‌عنوان فراورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تعیین شد. به‌منظور اندازه­گیری MDA میزان 1/0 گرم از سلول­ با 3 میلی­لیتر تری­کلرو استیک اسید 10% سائیده شد. نمونه­ها پس از همگن­سازی، سانتریفیوژ (rpm12000، به مدت 15 دقیقه) شدند. به 1 میلی­لیتر از نمونه­های صاف شده، 1 میلی­لیتر تیو باربیتوریک اسید  (TBA) 25/0% اضافه گردید و به مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه ساننتی­گراد قرار داده شد. میزان  MDA با اندازه­گیری جذب در طول موج­های 532 نانومتر و 600 نانومتر با استفاده از ضریب ثابت خاموشی )1-cm1-mM 155=  ε) محاسبه گردید (15).

تعیین میزان فنول کل: میزان ترکیبات فنولی کل بر اساس روش رنگ‌سنجی فولین- سیوکالتیو و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 762 نانومتر اندازه­گیری شد. بدین ترتیب که ابتدا 3/0 گرم سلول­ در 3 میلی­لیتر متانل80% همگن شد. سپس با سرعت 5000 (rpm)   به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد و عصاره متانلی از رسوب جدا شد. عصاره متانلی برای سنجش فنول کل و فلاوونوئیدها مورد استفاده قرار گرفت. به 500 میکرولیتر عصاره متانلی، 5/2 میلی­لیتر محلول فولین- سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از 2 دقیقه 2 میلی­لیتر محلول سدیم کربنات 7% اضافه شد و جذب بعد از 60 دقیقه در طول موج 762 نانومتر خوانده شد (27). در نهایت، مقدار فنول کل بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.

سنجش و اندازه‌گیری فلاونوئید: به 500 میکرولیتر عصاره متانلی، 100 میکرولیتر از محلول آلومینیوم­کلرید 10%، 100 میکرولیتر پتاسیم استات 1 مولار، 5/1 میلی­لیتر متانول 80% و 8/2 میلی­لیتر آب دیونیزه اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، جذب هر یک از نمونه­ها در طول موج 415 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر سنجیده شد و میزان فلاونوئید براساس منحنی استاندارد روتین (Rutin) محاسبه شد (11).

تحلیل‌های آماری: کلیه آزمایش­ها در سه تکرار از حداقل سه نمونه مستقل انجام شد. مقایسه میانگین­ها با استفاده از روش anova و نرم­افزار MSTAT-C و معنی­دار بودن اختلاف بین آنها با آزمون دانکن در سطح 05/0≥ P انجام شد.

نتایج

تعیین منحنی رشد سلول: پیش از اعمال تیمار، میزان رشد سلول­ها در مدت 29 روز در کشت تعلیقی بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد که پس از کشت، سلول­ها به مدت سه روز در فاز تأخیری بودند، سپس میزان سلول­ها افزایش یافته که این روند تا روز پانزدهم ادامه داشت. پس از این زمان وزن سلول­ها نسبتاً بدون تغییر ماند. شیب رشد سلولی در روز هفتم افزایشی بود که در این زمان سلول­ها در دوره لگاریتمی رشد بوده و بشدت در حال تقسیم بودند. در این زمان حجم توده سلولی به میزان مناسبی رسیده، بنابراین روز هفتم به‌عنوان زمان مناسب برای افزودن تیمار انتخاب گردید.

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- منحنی رشد سلولی در کشت تعلیقی S. striata در محیط کشت MS. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است.


تأثیر متیل­جاسمونات بر رشد سلولی: اندازه­گیری وزن تر سلول­ها نشان داد که تیمار 1/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات از روز هفتم در بازه زمانی 4 تا 24 ساعت در نمونه­های تیمار شده نسبت به  نمونه­های شاهد، تأثیری بر رشد نداشت (شکل 2)، در حالیکه در بازه زمانی 48 تا 72 ساعت رشد سلولی به طور معنی­داری کاهش یافت (05/0P≤).

تأثیر متیل­جاسمونات بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان

تغییرات فعالیت سوپراکسید دیسموتاز: همان گونه که در شکل a3 نشان داده شده است، مقایسه میانگین­ها در سطح 05/0 P≤نشان داد که فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از روز هفتم در بازه زمانی 4 تا 12 ساعت در نمونه­های شاهد رو به افزایش بود و بعد تا 72 ساعت که معادل روز دوازدهم از منحنی رشد می­باشد کاهش معنی­داری داشت.

 

 

 

c

شکل 2- تاثیر متیل­جاسمونات بر رشد سلولی در کشت تعلیقی S. striata. متیل­جاسمونات در روز هفتم دوره رشد به محیط کشت اضافه شد و سلول­ها در زمان­های 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0≥P است.

 

در نمونه­های تیمار شده با 1/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات، در زمان 4 ساعت پس از شروع تیمار فعالیت آنزیم کاهش یافت و بعد تا 48 ساعت پس از آغاز تیمار، افزایش یافت و بعد شروع به کاهش نمود. از طرفی مقایسه بین نمونه­های شاهد و تیمار شده در هر زمان نشان داد که در زمان­های 4 و 12 ساعت پس از شروع تیمار، فعالیت آنزیم مذکور در نمونه­های تیمار شده پایین­تر از نمونه­های شاهد بود، درحالیکه در بازه زمانی 24 تا 72 ساعت فعالیت آنزیم در نمونه­های تیمار شده به صورت معنی­داری بالاتر از نمونه­های شاهد بود.

تغییرات فعالیت پراکسیداز: بررسی نتایج اندازه­گیری فعالیت پراکسیداز نشان داد که از روز هفتم در بازه زمانی مورد مطالعه ( 4 تا 72 ساعت)، بجز 12 ساعت پس از تیمار، تغییر معنی­داری در نمونه­های شاهد وجود نداشت (05/0P≤). در حالیکه در نمونه­های تیمار شده با متیل­جاسمونات از 24 ساعت پس از شروع تیمار افزایش معنی­داری در فعالیت آنزیم پراکسیداز در مقایسه با زمان آغاز آزمایش یعنی روز هفتم داشت (شکل b3). این نتایج نشان داد که در حضور متیل­جاسمونات پس از 12 ساعت فعالیت پراکسیداز از نمونه­های شاهد به طور معنی­داری بیشتر است.

فعالیت کاتالاز: به طور کلی فعالیت کاتالاز در کشت سلولی از روز هفتم به بعد در نمونه­های شاهد و نمونه­های تیمار شده با متیل­جاسمونات رو به افزایش بود. فعالیت کاتالاز در سلول­های تیمار شده با متیل­جاسمونات تقریباً در کلیه نمونه­ها در مقایسه با شاهد افزایش یافت (شکل c3).

مقدار پراکسید هیدروژن: اندازه‌گیری میزان تجمع پراکسید هیدروژن در سلول­ها نشان داد که این ترکیب از روز هفتم تا 72 ساعت، هم در سلول­های شاهد و هم در نمونه­های تیمار شده با متیل­جاسمونات رو به افزایش بود، اما تنها در سلول­هایی که به مدت 8 ساعت پس از تیمار متیل­جاسمونات برداشت شدند نسبت به سلول­های شاهد افزایش معنی­داری داشت و در سایر تیمارها میزان پراکسید هیدروژن بین تیمار و سلول­های شاهد تغییر معنی­داری نداشت (شکل a4).

 

 

 

 

cde

a

b

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

 


 

 

c

i

 

 

 

 

 


شکل 3- تاثیر متیل­جاسمونات بر فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (a)، پراکسیداز(b)  و کاتالاز (c). متیل­جاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلول­ها در زمان­های 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0≥P است.

 

a

d

cd

b

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 4- تاثیر متیل­جاسمونات بر میزان پراکسید هیدروژن (a) و پراکسیداسیون لیپید (b). متیل­جاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلول­ها در زمان­های 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0≥P است.


پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: با توجه به نتایج بدست آمده، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا از روز هفتم تا 72 ساعت، هم در سلول­های شاهد و هم در نمونه­های تیمار شده با متیل­جاسمونات تغییری نداشت و تنها در نمونه­هایی که به مدت 8 و 24 ساعت برداشت شدند افزایش معنی­داری دیده شد. همچنین در حضور 1/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات در میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول­های تیمار شده در مقایسه با نمونه­های شاهد تفاوت معنی­داری (05/0P≤) مشاهده نگردید (شکل b4).

تأثیر متیل­جاسمونات بر تجمع متابولیت­های ثانوی: بررسی میزان فنول کل در سلول­های شاهد و تیمار شده نشان داد که در کشت تعلیقی میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش است که از روز هفتم تا 72 ساعت مورد مطالعه، در هر گروه نسبت به روز هفتم معنی­دار بود. به علاوه اینکه مقایسه مقدار فنول در سلول­های تیمار شده با متیل­جاسمونات با نمونه­های شاهد نشان داد که میزان این ترکیبات در تمام ساعات پس از اعمال تیمار به طور جزئی بیشتر بوده و در 48 و 72 ساعت پس از تیمار افزایش معنی­داری داشت (شکل a5).

 

 

 

a

e

b

e

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 5- تاثیر متیل­جاسمونات بر فنل کل (a) و فلاونوئید (b). میزان فنل کل بر اساس استاندارد گالیک اسید و میزان فلاونوئید بر اساس استاندارد روتین (Rutin) اندازه­گیری شدند. متیل­جاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلول­ها در زمان­های 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح 05/0≥P است.

 

 

نتایج اندازه­گیری محتوای فلاونوئید نشان داد که با گذشت زمان هم در نمونه­های شاهد و هم در نمونه‌های تیمار شده با متیل­جاسمونات، میزان فلاونوئید سلول­ها روند افزایشی دارد. شدت افزایش میزان فلاونوئید در نمونه­های تیمار شده بسیار بیشتر بود، به گونه­ای که از 24 ساعت پس از تیمار، این سلول­ها نسبت به 12 ساعت اول به طور معنی­داری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری برخوردار بودند (شکل b5).

بحث

متیل­جاسمونات باعث القای تنش اکسیداتیو در گیاهان تحت تیمار می­شود (13). به دلیل اینکه متیل­جاسمونات تولید ROS را در گیاهان القا می­کند، بنابراین یک دستگاه آنتی­اکسیدانی مؤثر برای حفظ عملکردهای متابولیسم در شرایط القا ضروریست. دستگاه آنتی­اکسیدان آنزیمی شامل سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز حفاظت علیه تأثیرات سمی ROS را بر عهده دارد. سوپراکسید دیسموتاز اولین آنزیم در فرایند سمیت‌زدایی ROS به‌شمار می­رود. این آنزیم نقش حیاتی در دفاع آنتی­اکسیدانی ایفا می­کند، زیرا تبدیل O2- را به H2O2  کاتالیز می­کند، درحالیکه کاتالاز و پراکسیداز، H2O2 را تخریب می­کنند. در این مطالعه کاهش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در 12 ساعت اول پس از اعمال تیمار متیل­جاسمونات ممکن است به دلیل غیرفعال کردن آنزیم در اثر تولید بیش از حد ROS باشد (36). در حالیکه فعالیت این آنزیم در سلول­هایی که در بازه زمانی 24 تا 72 ساعت پس از اعمال تیمار برداشت شدند، نسبت به گروه شاهد افزایش معنی­داری را نشان داد. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز احتمالاً بدلیل سنتز از نو (De-novo) پروتئین­های آنزیمی و القای بیان ژن رمزگذاری سوپراکسید دیسموتاز می­باشد (38). فعالیت سوپراکسید دیسموتاز موجب تبدیل رادیکال سوپراکسید به H2O2 می‌گردد، سپس H2O2 توسط کاتالاز در پراکسی­زوم و آسکوربات پراکسیداز در سیتوپلاسم، میتوکندری و کلروپلاست سم­زدایی می­گردد (5 و 16).

در گیاهچه بادام­زمینی، متیل­جاسمونات در غلظت­های 100 و 250 میکرومولار باعث افزایش فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز گردیده است (25). همچنین در گیاه آرابیدوپسیس و کلزا، تیمار متیل­جاسمونات فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز را افزایش داد (20). از آنجا که H2O2 سوبسترای کاتالاز می­باشد، می­توان فرض کرد که بخشی از افزایش فعالیت کاتالاز به دلیل تولید H2O2 در سلول­های تیمار شده با متیل­جاسمونات و یا فعالیت سوپراکسید دیسموتاز است. با توجه به نتایج این مطالعه، اندازه‌گیری میزان تجمع پراکسید هیدروژن در سلول­ها نشان داد که این ترکیب تنها در سلول­هایی که به مدت 8 ساعت پس از تیمار متیل­جاسمونات برداشت شدند نسبت به سلول­های شاهد افزایش معنی­داری داشت و در سایر تیمارها در میزان پراکسید هیدروژن نسبت به سلول­های شاهد تغییر معنی­داری مشاهده نشد. بنابراین با توجه به فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و میزان تجمع پراکسید هیدروژن می­توان نتیجه گرفت که غلظت 1/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات به‌عنوان القا کننده عمل نموده و با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان مانع از رخ دادن انفجار اکسیداتیو شده است. علامت­رسانی جاسمونات توسط یک ROS یعنی  H2O2 وساطت می­شود، بنابراین افزایش سطح H2O2  در ساعت 8 پس از تیمار به‌عنوان یک مولکول محرک باعث فعال شدن دستگاه آنتی­اکسیدانی، افزایش فعالیت آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز و جلوگیری از انفجار اکسیداتیو شده است، ازاین‌رو تعدیل سطح H2O2  انجام شده است.

از طرفی ایجاد گونه­های فعال اکسیژن در تنش­های مختلف می­تواند باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا شده که افزایش میزان مالونیل دی­آلدئید به‌عنوان محصول نهایی این اکسیداسیون نشان‌دهنده تخریب و افزایش نفوذپذیری غشا سلول­هاست. رادیکال­های آزاد موجود در سلول باعث صدمه به لیپیدها و اسیدهای چرب غشا شده و رادیکال­های لیپید و پراکسی و هیدروپراکسی تولید می­کنند، رادیکال­های جدید تولید شده می­توانند به واکنش­های اکسیداسیون لیپیدها سرعت بخشند. مالونیل دی­­آلدئید یک محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب اشباع نشده در فسفولیپیدها است. بنابراین مالونیل دی­آلدئید به‌عنوان یک معرف برای بررسی صدمات غشا در شرایط تنش مورد استفاده قرار می­گیرد و شاخص مناسبی برای پراکسیداسیون لیپید غشا محسوب می­شود (19، 23 و 35). Wang  در سال 1999 گزارش کرد که در گیاه توت فرنگی، متیل­جاسمونات با غلظت 1/0 میلی­مولار موجب تغییر نسبت اسیدهای چرب غشا شده و در نتیجه سوبسترا برای رادیکا­های آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی کاهش می­یابد. متیل­جاسمونات با بالا نگه­داشتن سطح فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان مانند کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز مانع اثر رادیکال­های آزاد حاصل از تنش بر غشا می­گردد (39). آنزیم پراکسیداز نیز به‌عنوان گیرنده و جمع کننده پراکسیدها عمل کرده و از اثرات مخرب این مولکول­ها می­کاهد (42). بنابراین در این مطالعه، عدم تغییر معنی­دار میزان مالونیل دی­آلدئید موید کارآمدی دستگاه آنتی­اکسیدانی برای مقابله با تنش اکسیداتیو در غلظت استفاده شده متیل­جاسمونات می­باشد.

گیاهان ترکیبات فنولی را در پاسخ به برخی ترکیبات پیام­رسان که نقش دفاعی مهمی دارند، آزاد می‌کنند. ترکیبات فنولی به خصوص فلاونوئیدها و همچنین فلاونول­ها به دلیل خاصیت آنتی­اکسیدانی قوی قادر به بدام انداختن رادیکال­های آزاد و کاهش تنش اکسیداتیو هستند (3). این ترکیبات با مکانیسم­های متعددی مانند پاکروبی رادیکال­های آزاد، دادن هیدروژن، خاموش کردن اکسیژن یکتایی، کلات کردن یون­های فلزی و یا در همکاری با پراکسیدازها در جمع­آوری یا حذف پراکسید هیدروژن، نقش آنتی­اکسیدانی خود را ایفا می­کنند (14 و 24). مطالعات نشان می­دهد که رابطه مثبتی بین محتوای فنول کل و فعالیت آنتی­اکسیدانی آنها وجود دارد (18). در سلول­های گیاهی ترکیبات فنولی به‌ویژه پلی­فنول­ها در کاهش سم­زدایی پراکسید هیدروژن بسیار کارا عمل کرده و به‌عنوان سیستم پشتیبان چرخه آسکوربات- گلوتاتیون در دفع رادیکال­های پراکسید هیدروژن شرکت می­کنند. وقتی فنول­ها به‌عنوان آنتی­اکسیدان در این واکنش­ها شرکت می­کنند، به رادیکال فنوکسیل اکسید می­شوند. رادیکال­های فنوکسیل از طریق واکنش با آسکوربات به حالت اولیه برمی­گردند (33). در این مطالعه، افزایش ترکیبات فنولی با گذشت زمان بیانگر راهبرد سلول­ها برای مقابله با تنش اکسیداتیو است. به‌علاوه، فلاونوئیدها یکی از گسترده­ترین و متنوع­ترین ترکیبات طبیعی هستند که همانند سایر ترکیبات فنولی توانایی جذب رادیکال­های آزاد را دارند. در تنش­های اکسیداتیو ترکیبات فنولی به‌ویژه فلاونوئیدها می­توانند با فسفولیپیدهای غشا از طریق پیوند هیدروژنی با سرهای قطبی فسفولیپیدها ارتباط برقرار کنند، در نتیجه این ترکیبات در سطح داخل و خارج غشا جمع شده و به دلیل جلوگیری از دستیابی مولکول­های آسیب‌رسان به ناحیه هیدروفوبی دوقطبی به حفظ سیالیت و تمامیت غشا کمک می­کنند (26). این گیاه دارای مقادیر قابل توجهی از فلاونوئیدها مثل نپترین (Nepetrin)، کوئرستین(Quercetine)  و ایزورامنتین-3- روتینوزید (Isorhamnetin-3-o-rutinoside) می­باشد (29). با توجه به وجود ترکیبات فلاونوئیدی در این گیاه می­توان نتیجه گرفت که بخشی از اثرات حفاظتی در آن از طریق تقویت سیستم آنتی­اکسیدانی و مهار تولید ROS اعمال می­گردد (4).

کاربرد متیل­جاسمونات مقدار ترکیبات فنولی را در برخی گیاهان نظیر سیب زمینی، سیب قرمز، مارچوبه و لوبیا سبز افزایش داد (6). Pinot  و همکارانش در سال 1998 بیان کردند که چالکون سنتتاز که پیش‌ساز فلاونوئیدها را تولید می­کند توسط متیل­جاسمونات القا می­شود. متیل­جاسمونات دارای نقش­ دوگانه در تکامل و دفاع می­باشد. این ترکیبات می­توانند با القای مسیرهای علامت­رسانی باعث فعال­شدن واکنش­های دفاعی در گیاه شده و در نتیجه باعث افزایش تولید متابولیت­های ثانوی گردند (41). با توجه به اینکه تأثیر متیل­جاسمونات بر سنتز ترکیبات فنولی به غلظت آن وابسته است (21)، با توجه به نتایج به‌دست آمده از اندازه­گیری ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در سلول­ها پس از تیمار با متیل­جاسمونات، می‌توان نتیجه گرفت که این مولکول در غلظت 1/0 میلی­مولار باعث تحریک آبشار علامت­رسانی در سلول شده و از این طریق باعث افزایش تولید ترکیبات فنولی مختلف می­شود. بنابراین به نظر می رسد که متیل­جاسمونات به‌عنوان الیسیتور سبب افزایش قدرت سیستم آنتی­اکسیدانی و کاهش تنش اکسیداتیو شده و سنتز این ترکیبات را افزایش داده است.

نتیجه­ گیری

با توجه به اینکه گیاه S. striata از گذشته به‌عنوان یک گیاه دارویی کاربرد داشته است و از سوی دیگر نقش ترکیبات فنولی در موارد بالینی به خوبی شناخته شده است، استفاده از متیل­جاسمونات در غلظت مناسب می­تواند راهکاری مؤثر برای راه­اندازی آبشار علامت­رسانی سلولی و افزایش تولید متابولیت­های ثانوی ارزشمند در کشت­های سلولی در بازه زمانی کوتاه باشد و سبب افزایش کارایی درمانی آن ­گردد. علاوه بر آن، افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی به دلیل افزایش توان آنتی­اکسیدانی سلول در حفاظت سلول علیه تنش­های اکسیداتیو نیز نقش مؤثری خواهد داشت.

1-   اردشیری لاجیمی، ع.، برزگر، م.، رضایی طاویرانی، م.، هاشمی، م.، حیدری، س.، مقدم­نیا، ح.، کلانتری، ش. 1388. بررسی اثر عصاره گیاه اسکلروفولاریا استریاتا بر سلول­های فیبروبلاست انسانی. مجله علوم پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی. 19(3): 168- 172.

2-   زمانیان عضدی، م.، اردشیری لاجیمی، ع.، رضایی طاویرانی، م.، رضایی طاویرانی، م. و خدارحمی ر. 1391. بررسی اثر آنتی­بیوتیکی عصاره آبی گیاه اسکروفولاریا استریاتا بر اشرشیاکلی در مقایسه با تتراسایکلین. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایلام. 20 (4): 127- 133.

3-   شرافتی چالشتری، ف.، شرافتی چالشتری، ر. و مؤمنی، م. 1387. اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و اتانولی گیاه گل میمونی (Scrophularia striata) بر اشرشیاکلی در شرایط آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد. 32- 37.

4-   ظاهری، م.، ابراهیمی وسطی کلایی، س. و چراغی، ج. 1390. اثر حفاظتی عصاره بخش­های هوایی اسکروفولاریاتا در برابر نفروتوکسیسیتی ناشی از کادمیوم و جیوه در موش. مجله دانشگاه علوم پزشکی بابل. 13 (4): 48- 53.

 

5-   Asada, K. 1999. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50: 601- 639.

6-   Basilio Heredia, J., Cisneros- Zevallos, L. 2009. The effect of exogenous ethylene and methy jasmonate on the accumulation of phenolic antioxidants in selected whole and wounded fresh produce. Food Chemistry. 115: 1500- 1508.

7-   Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248- 254.

8-   Brown, D. C. W., and Thorpe, T. A. 1984. Organization of plant tissue culture laboratory. Pp. 1-12. In cell culture and somatic cell genetics of plants, Vol. 1. D. K. Vasil (editor). Academic Press, New York.

9-   Cakmak, I., and Horst, W. J. 1991. Effect of aluminum on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max).  Physiol.  Plant. 83: 463- 468.

10-Chance, B., Maehly, A. C. 1955. Assay of catalase and peroxidase, in: L. Packer (Ed.), Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 2: 764.

11-Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., and Chern, J. C. 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis. 10: 178- 182.

12-Chen, B., Huang, J., Wang, J., Huang, L. 2008. Ultrasound effects on the antioxidative defense systems of Porphyridium cruentum. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 16: 88- 92.

13-Chong, T. M., Abdullah, M. A., Fadzillah, N. M., Lai, O. M. and Lajis, N. H. 2005. Jasmonic acid elicitation of anthraquinones with some associated enzymic and non-enzymic antioxidant responses in Morinda elliptica. Enzyme and Microbial Technology. 36: 469- 477.

14-Chu, Y. H., Chang, C. L. and Hsu, H. F. 2000. Flavonoid content of several vegetable and their antioxidant activity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 80: 561-566.

15-De Vos, C. H. R., Schat, H., De Waal, M. D. A., Vooijs, R., Ernst, W. H. O. 1991. Increased  resistance to copper-induced damage of the root  plasma membrane in copper tolerant Silene cucubalus.  Physiol Plant. 82: 523- 528.

16-Foyer, C. H., Lopez-Delgado, H., Dat, J. F. and Scott, I. M. 1997. Hydrogen peroxide and glutathione-associated mechanisms of acclamatory stress tolerance and signaling. Physiologia Plantarum. 100: 241- 254.

17-Franco, R., Schoneveld, O., Georgakilas, G. A. 2008. Oxidative stress, DNA methylation and carcinogenesis. Cancer Letters. 266: 6- 11.

18-Ghasemzadeh, A., Jaafar, H. Z., Rahmat. A. 2010. Antioxidant activities, total henolics and flavonoids content in two varieties of Malaysia young ginger (Zingiber officinale Roscoe). Molecules. 15(6): 4324- 33.

19-Jaleel, C. A., Gopi, B., Sankar, P., Manivannan, A., Kishorekumar, R. S. and Panneers, L. 2007. Studies on germination, seedling vigour, lipid peroxidation and  proline metabolism in Catharanthus roseus seedling under salt stress. South African Journal of Botany. 73(2): 190- 195.

20-Jung, S. 2004. Effect of chlorophyll reduction in Arabidopsis thaliana by methyl jasmonate or norflurazon on antioxidant systems. Journal of Plant physiology and Biochemistry. 42: 231- 255.

21-Horbowicz, M., Chrzanowski, G., Koczkodaj, D., Mitrus, J. 2011. The effect of methyl jasmonate vapors on concentration of phenolic compounds in seedlings of commom buckwheat (Fagopyrume sculentum Moench). Acta Societiatis Botanicorum Poloniae. 80 (1): 5- 9.

22-Karabal, F., Yϋcel, M., Oktem, H. A. 2003. Antioxidant responses of tolerant and sensitive barley cultivars to boron toxicity. Plant Science. 164: 925- 933.

23-Katsuhara, M., Otsuka, T. and Ezaki, B. 2005. Salt stress-induced lipid peroxidation is reduced by glutathione S-transferase, but this reduction of lipid peroxides is not enough for a recovery of root growth in Arabidopsis. Plant Sciences. 169(2): 369- 373.

24-Kovacik, J., Backor, M., Strnad, M. and Repcak, M. 2009. Salicylic acid induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Report. 28: 135- 143.

25-Kumari, G. J., Reddy, A. M., Naik, S. T., Kumar, S. G., Prasanthi, J., Sriranganayakulu, G., Reddy, P. C. and Sudhakar, C. 2006. Jasmonic acid induced changes in protein pattern, antioxidative enzyme activities and peroxidase isozymes in peanut seedlings. Biologia Plantarum. 50: 219- 226.

26-Michalak, A. 2006. Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal stress. Polish J. of Environ. Stud. 15(4): 523- 530.

27-Miliauskas, G., Venskutonis, P. R. and Van Beek, T. A. 2004. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chemistry. 85: 231- 237.

28-Mittler, R., Vanderauwera, S., Suzuki, N., Miller, G., Tognetti, V. B., Vandepoele, K., Gollery, M., Shulaev, V., Van Breusegem, F. 2011. ROS signaling: the new wave? Trends Plant Sci. 16: 300- 309

29-Monsef-Esfahani, H. R., Hajiaghaee, R., Shahverdi, A. R., Khorramizadeh, M. R. and Amini, M. 2010. Flavonoids, cinnamic acid and phenyl propanoid from aerial parts of Scrophularia striata. Pharmaceutical Biology. 48(3): 333- 336.

30-Pandolfini, T., Gabbrielli, R., Comparini, C. 1992. Nickel toxicity and peroxidase activity in seedlings of Triticum aestivum L.. Plant and Cell Environment. 15: 719- 725.

31-Pinot, F., Benveniste, I., Salaün, J., Durst, F. 1998. Methyl jasmonate induces lauric acid γ-hydroxylase activity and accumulation of CYP94A1 transcripts but does not affect epoxide hydrolase activities in Vicia sativa seedlings. Plant Physiol. 118: 1481- 1486.

32-Plazek, A., Zur, I. 2003. Cold-induced plant resistance to necrotrophic pathogens and antioxidant enzyme activities and cell membrane permeability. Plant Science. 164: 1019-1028.

33-Sakihama, Y., Cohen, M. F., Grace, S. C. and Yamasaki, H. 2002. Plant phenolics antioxidant and pro oxidant activity: Phenolics-induced oxidative damage mediated by metal in plants. Toxicology. 177: 67- 80.

34-Sirvent, T. M., and Gibson, D. M. 2002. Induction of hypericin and hyperfolin in Hypericum perforatum L. in response to biotic and chemical elicitors. Physiol. Mol. Plant Path.60: 311- 320.

35-Sofo, A., Dichio, B., Xiloyannis, C. and Masia, A. 2004. Effects of different irradiance levels on some antioxidant enzymes and on malondealdehyde content during rewatering in olive tree. Plant Sciences. 166(2): 293- 302.

36-Stroinski, A., and Kozlowska, M. 1997. Cadmium induced oxidative stress in potato tuber. Acta Sco. Bot. Pol. 66: 189- 195.

37-Velikova, V., Yordanov, I., Edreva, A. 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated been plants protective role of exogenous polyamines. Plant Sci. 151: 59- 66.

38-Verma, S., Dubey, R. S. 2003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci. 164: 645- 655.

39-Wang, S. Y. 1999. Methyl Jasmonate reduces water stress in strawberry. Journal of Plant Growth Regulation. 18: 127- 134.

40-Zhang, L., Xing, D. 2008. Methyl jasmonate induces production of reactive oxygen species and alterations in mitochondrial dynamics that precede photosynthetic dysfunction and subsequent cell death. Plant Cell Physiol. 49(7): 1092- 1111.

41-Zhao, J., Davis, L. C., Verpoorte, R. 2005. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnolgy Advance. 23: 283- 333.

42-Zhou, R., Li, Y., Yan, L., Xie, J. 2011. Effect of edible coatings on enzymes, cell-membrane integrity, and cell-wall constituents in relation to brittleness and firmness of Huanghua pears (Pyrus pyrifolia Nakai, cv. Huanghua) during storage. Food Chemistry. 124: 569- 575.