هر موجود زنده برای تأمین غذا، رشد و تولید مثل احتیاج به عناصر معدنی دارد، ارزش همه این عناصر در خاک از نظر احتیاج گیاه به آنها یکسان نیست (12). عناصر را می‌توان به چند دسته تقسیم نمود، گروهی از این عناصر برای گیاه ضروری محسوب شده و باید در مقادیر کافی در دسترس گیاه باشند و باقی عناصر هر یک به مقدار بسیار کم برای گیاه ضروری هستند. گذشته از این، عناصر دیگری بدست آمده و شناخته شدند (2)، که احتمالا برای گیاه ضروری نبوده ولی می‌توانند در رشد، حیات و تکمیل چرخه رویشی آن اثرات مفید داشته باشند، ازجمله تیتانیوم که یک عنصر با اثرات فیزیولوژیکی می‌باشد و یکی از عناصر مؤثر بر روند رشد، تولید مثل و فرایندهای اصلی متابولیسم می‌باشد (2). این فلز در زمره عناصر ضروری نمی‌باشد و بر طبق برخی گزارش‌ها شواهدی مبنی بر اینکه این عنصر برای گیاهان عالی ضروری و یا اینکه سمی است وجود ندارد ولی به طور کلی مفید بوده و می‌تواند منجر به بهبود متابولیسم زیستی در گیاهان شود (2)، که این اثرات قابل تعمیم به جلبک‌ها می‌باشد. دونالیه لا یک جلبک سبز تک‌یاخته‌ای مقاوم به نمک با پراکنش وسیع جغرافیایی است (3). این جلبک بعلت فقدان دیواره یاخته‌ای سلولزی به سرعت نسبت به تغییرات و فشارهای اسمزی خارج و داخل سلولی واکنش نشان می دهد. از این رو می‌توان گفت دونالیه لا یک پروتوپلاست واقعی می‌باشد (1)، همچنین بعلت ساده بودن ساختار یاخته‌ای می‌تواند به‌عنوان یک سیستم مدل در مطالعات فیزیولوژی گیاهی مورد توجه قرار گیرد (3). بنابراین هدف این تحقیق بررسی پارامترهای تعداد سلول، میزان رنگیزه‌ها در شرایط آزمایشگاهی جلبک فوق در حضور فلز تیتانیوم بوده است. پس با در نظر گرفتن اثرات مثبت آن آیا می‌توان تیتانیوم را به‌عنوان یک عنصر ضروری برای جلبک فوق استفاده نمود؟

مواد و روشها

گونه جلبکی Dunaliella salina و سویه UTX-200 از کلکسیون جلبک‌های دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه شد و در محیط کشت مایع تغییر یافته جانسون و همکاران (1968) که حاوی 5/1 مولار نمکNaCl  است کشت شده و در شرایط 160 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه و دمای 3±25 درجه سانتی‌گراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفت. در ادامه آزمایش محلول تری کلراید تیتانیوم ساخته شده به نحوی به ارلن‌ها اضافه گردید که در نهایت سوسپانسیون جلبکی حاوی غلظت‌های به‌ترتیب 0، 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم باشد. برای اندازه‌گیری پارامترهای ذکر شده نمونه‌برداری در زمانهای0 ، 1، 4، 7، 10، 13، 16، 19، 22 و 25 روز انجام شد. در کلیه آزمایش‌ها pH توسط اسید کلریدریک و NaOH بر روی 5/7 تنظیم گردید. در برخی از آزمایش‌ها که نیاز به pH برابر 8/5 (نزدیک به 6) بود از اسید استیک استفاده گردید. همچنین در آزمایش‌هایی که اثر تیتانیوم در حضورEDTA  بررسی گردید از  Na₂-EDTA(1 میلی مولار) استفاده گردید که به محلول تری کلراید تیتانیوم اضافه شد. برای شمارش سلولها، نمونه‌های D.salina پس از تیمار با تیتانیوم، به لوله آزمایش منتقل گردید و بنا به تراکم سلولها در روزهای مختلف محیط کشت هم مولار (5/1 مولار نمک NaCl) برای رقیق کردن اضافه گردید. سپس یک قطره از نمونه توسط پاستور پیپت بر روی لام توما (هموسایتومتر) منتقل و توسط میکروسکوپ نوری تعداد سلولها شمارش و محاسبه گردید. عمل فوق در مورد شاهد و سوسپانسیونهای جلبکی گونه D.salina تیمار شده با تیتانیوم در روزهای مورد مطالعه در 3 تکرار انجام شد. برای اندازه‌گیری مقدار کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و بتاکاروتن، 1 میلی لیتر از نمونه جلبکی را در میکروفیوژ تیوب ریخته و با دور 13000 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ(EPPENDROF, AG 22331 Hamburg) نموده، سپس محلول رویی به دقت خارج و به آن استون 80% اضافه گردید، پس از ورتکس در نهایت جذب نوری با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (SHIMADZU UV-160A) در طول موج‌های 412، 431، 450، 460 و 480 قرائت و مقادیر مذکور با استفاده از فرمولهای مربوطه محاسبه گردید.این عمل برای همه تیمارهای جلبک D.salina در سه تکرار در روزهای اندازه‌گیری انجام شد (4).

اندازه‌گیری فتوسنتز توسط دستگاه پلاروگراف (Hansatech, U.K) انجام گردید. به‌منظور بررسی اثر تیتانیوم بر فتوسنتز جلبکD. salina  برای تیمارها از محلول تیتانیوم به همراه بافر فسفات و برای شاهد از بافر فسفات 5/1 مولار (با مولاریته نمکیNaCl  یکسان با سوسپانسیون جلبکی) استفاده شد. آزمایش در دو بخش24 ساعته ( بلند مدت) و آنی ( کوتاه مدت) انجام گردید، در بخش آنی پس از آماده سازی سوسپانسیون جلبکی، تیتانیوم بلافاصله و در همان لحظه اضافه و فتوسنتز و تنفس اندازه‌گیری و مورد بررسی قرار گرفت و در بخش بلندمدت در زمان صفر، 6 و 24 ساعت پس از شروع آزمایش فتوسنتز و تنفس اندازه‌گیری و بررسی گردید. برای ساخت بافر فسفات ازKH₂PO₄  (25/0 میلی مولار)،K₂HPO₄  (25/0 میلی مولار)،MgCl₂  (2/0 میلی مولار)،NaHCO₃  ( 25 میلی مولار) وNaCl  استفاده گردید، که مولاریته (5/1 مولار نمک NaCl) آن با مولاریته محیط جلبکی گونه D.salina مورد آزمایش یکسان بود. به محلول مورد استفاده در تنش، بافر فسفات و نمکTiCl₃  اضافه شد. اسیدیته محلول بر روی 7 تنظیم گردید.

نتایج

برای بررسی اثر فلز تیتانیوم بر تقسیم سلولی و میزان رشد، گونه جلبکی­Dunaliella salina سویه UTEX-200 تحت تیمار غلظت‌های مختلف تیتانیوم شامل صفر (شاهد) ،100، 150 و200 میکرو مولار قرار گرفت و روند رشد و تقسیم سلولی در طی یک دوره رشد 25 روزه بررسی گردید. به‌منظور انتخاب غلظت مناسب تیتانیوم و بررسی اثر آن بر تقسیم سلولی و میزان رشد، جلبک Dunliella ابتدا در غلظت‌های 100، 200، 300، 400 و 500 کشت داده شد. با توجه به بررسی‌های انجام شده محدوه غلظت انتخابی برای تیمار سوسپانسیون جلبکی 100 تا 200 میکرو مولار تیتانیوم بوده، زیرا غلظت‌های بالاتر از 300 میکرو مولار موجب مرگ تعداد زیادی از سلولها گردید، ازاین‌رو، این محدوده انتخاب گردید. نمودار 1 میانگین تعداد سلولهای جلبکی در گونه D. salina را در غلظت‌های مورد نظر نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد شیب مشابهی از افزایش میزان رشد سلولی بین نمونه شاهد و سلولهای جلبکی در معرض تیمارهای 100، 150 و 200 میکرو مولار دیده می‌شود و تفاوت قابل ملاحظه‌ای در سرعت تقسیم سلولی تیمارها نسبت به شاهد وجود ندارد. با توجه به این که میزان کلروفیل و بتاکاروتن یکی از شاخص‌های رشد می‌باشند، بنابراین میزان کلروفیل و بتاکاروتن تحت تأثیر تیمار غلظت‌های مورد نظر تیتانیوم اندازه‌گیری شد. نمودار 2 میزان کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) در غلظت‌های مختلف تیتانیوم را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان کلروفیل کل در واحد حجم سوسپانسیون از تغییرات میزان تقسیم سلولی تبعیت می‌کند و روند میزان کلروفیل کل در تمامی تیمارها و شاهد مشابه می‌باشد و تفاوتی مشاهده نمی‌گردد. نمودار 3 میزان بتاکاروتن را در واحد حجم (میلی لیتر) در غلظت‌های مختلف تیتانیوم نشان می‌دهد. در این نمودار روند کاملا هماهنگی در تیمارهای 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم مشابه با نمونه شاهد در میزان بتاکاروتن دیده می‌شود.

نمودار 4 میزان کلروفیل سلولی در غلظت‌های مختلف تیتانیوم را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان کلروفیل سلولی در تیمارها و شاهد نسبت به هم روند مشابهی داشته است و تغییر چندانی دیده نمی‌شود.

نمودار 5 میزان بتاکاروتن سلولی را در غلظت‌های مختلف تیتانیوم نشان می‌دهد. همان گونه که مشاهده می‌گردد میزان بتاکاروتن در نمونه شاهد و تیمارها تقریبا به صورت روندی مشابه پیش می‌رود، و هیچ گونه تفاوتی مشاهده نمی‌گردد.

نمودار 1- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر تعداد سلول در جلبک  D. salina(مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 2- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر میزان کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) در جلبک
 D. salina (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 3- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر میزان بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) در جلبک
 D. salina (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 4- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر میزان کلروفیل سلولی در جلبک D. salina )مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 5- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر میزان بتاکاروتن سلولی در جلبک D. salina (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

اثر تیتانیوم بر تقسیم سلولی، میزان کلروفیل و بتاکاروتن در حضور EDTA : با توجه به این که برخی از کاتیون‌ها در شرایط قلیایی به صورت آزاد نبوده و به فرم غیر محلول و رسوب در می‌آیند، بنابراین اضافه کردن EDTA در محیط از غیر محلول شدن کاتیون‌ها جلوگیری می‌کند، از این رو در بخش دوم این تحقیق اثر تیتانیوم بر میزان تقسیم سلولی، میزان کلروفیل و بتاکاروتن در حضور EDTA بررسی گردید.

نمودار 6 اثر غلظت‌های متفاوت از تیتانیوم بر تقسیم سلولی در حضور EDTA را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد در روزهای اولیه تقسیم سلولی در تمامی تیمارها با نمونه شاهد تفاوتی وجود نداشته است ولی از روز 12 به بعد تیمارهای 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم در حضورEDTA  تقسیم سلولی بیشتری نسبت به شاهد داشته و این افزایش در تیمارها نسبت به شاهد از تفاوت مشهودی برخوردار می‌باشد ولی بین غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تفاوتی مشاهده نمی‌گردد. تعداد سلولها در روز 25 در حضور EDTA در کلیه تیمارها تقریبا 17 میلیون سلول در میلی لیتر بوده است. نمودار 7 اثر غلظت‌های متفاوت تیتانیوم بر میزان کلروفیل کل در واحد (حجم میلی لیتر) در حضور EDTA را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان کلروفیل نمونه شاهد و غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم تا روز 10 مشابه بوده ولی از این روز به بعد میزان کلروفیل تیمارهای 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم مشابه ولی نسبت به شاهد افزایش داشته و تفاوت مشهودی در مقدار کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) تمامی تیمارها در مقایسه با شاهد مشاهده می‌گردد. میزان کلروفیل در تمامی تیمارها در روز 25 تقریبا 25 میکروگرم در میلی لیتر بوده است. در نمودار 8 میزان بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) تمامی تیمارها نسبت به شاهد از روز 12 به بعد افزایش داشته است ولی بین غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تفاوت چندانی مشاهده نمی‌گردد. میزان بتاکاروتن در تمامی تیمارها در روز 25 تقریبا 7 میکروگرم در میلی لیتر بوده است. نمودار 9 اثر غلظت‌های متفاوت تیتانیوم بر میزان کلروفیل سلولی در حضور EDTA را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد در کلیه تیمارها تفاوت قابل ملاحظه‌ای با نمونه شاهد دیده نمی‌شود و با گذشت زمان هیچ گونه تغییری در میزان کلروفیل سلولی ملاحظه نمی‌گردد و از روند ثابتی پیروی می‌کند. در نمودار 10 اثر غلظت‌های متفاوت تیتانیوم بر میزان بتاکاروتن سلولی در حضور EDTA نشان داده شده است، همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان تغییرات بتاکاروتن سلولی مشابه روند تغییرات کلروفیل سلولی بوده و تفاوت قابل ملاحظه‌ای بین تیمار‌ها با یکدیگر و هر کدام با شاهد ملاحظه نمی‌گردد.

نمودار 6-اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر تعداد سلول در حضور EDTA در جلبک D. salina (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 7-اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) در حضور EDTA در جلبک D. salina (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 8- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) در حضور EDTA در جلبک D. salina (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 9- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر کلروفیل سلولی در حضور EDTA در جلبک D. salina (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl  می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 10- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد بر بتاکاروتن سلولی در حضور EDTA در جلبک D salina (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

اثر تیتانیوم در pH اسیدی بر میزان تقسیم سلولی، کلروفیل و بتاکاروتن: جلبک دونالیه لا در محدوده  pH قلیایی رشد و چرخه زندگی خود را کامل می‌کند. اما با توجه به اینکه در برخی گزارش‌ها دیده شده است تیتانیوم در pH اسیدی (نزدیک به 6 ) بیشترین اثر و جذب را داشته است، بنابراین در این تحقیق اثر غلظت‌های متفاوت تیتانیوم در pH اسیدی (حدود6) بر میزان رشد سلولی، کلروفیل و بتاکاروتن در دونالیه لا مورد بررسی قرار گرفت. نمودار 11 اثر غلظت‌های متفاوت تیتاتیوم را در pH اسیدی بر رشد سلولی نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد روند هماهنگی در میزان تعداد سلول در تمامی غلظت‌های اعمال شده از تیتانیوم و شاهد تا روز 5 مشاهده می‌گردد و الگوی رشد سلولی مشابهی در تیمارها نسبت به شاهد تا این روز دیده می‌شود ولی از روز 10 به بعد در تمامی تیمارها میزان تعداد سلول نسبت به شاهد با شیب تندی رو به افزایش است و تفات قابل ملاحظه‌ای در روند رشد سلولی شاهد با تمامی تیمار‌ها دیده می‌شود و در بین کلیه غلظت‌های اعمال شده 100، 150 و 200 میکرو مولار تفاوتی مشاهده نمی‌گردد. تعداد سلولها در روز 25 با  pHاسیدی در کلیه تیمارها تقریبا 22 میلیون سلول در میلی لیتر بوده است. نمودار 12 اثر غلظت‌های متفاوت تیتانیوم در pH حدود 6 بر میزان کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان کلروفیل در تمامی تیمارها از روز 10 به بعد نسبت به شاهد از سیر صعودی برخوردار می‌باشد. به طور کلی میزان کلروفیل شاهد در سطح بسیار پایین‌تری نسبت به میزان کلروفیل در تمامی تیمارها می‌باشد؛ به‌نحوی‌که میزان کلروفیل در تمامی تیمارها در روز 25 تقریبا 30 میکروگرم در میلی لیتر بوده است.

بر طبق نمودار 13 روند هماهنگی در میزان بتاکاروتن در تمامی غلظت‌های اعمال شده از تیتانیوم و نمونه شاهد تا روز 18 مشاهده می‌گردد و پس از این زمان میزان بتاکاروتن در تیمارهای تیتانیوم با شیب تندی نسبت به نمونه شاهد رو به افزایش می‌باشد. در روز 25 میزان بتاکاروتن در تیمارهای 100 و 150 میکرو مولار تیتانیوم تقریبا 8 میکروگرم در میلی لیتر بوده است. اما بالاترین میزان بتاکاروتن در تیمار 200 میکرو مولار تیتانیوم مشاهده می‌شود و این مقدار تقریبا 10 میکروگرم در میلی لیتر بوده است. نمودار 14 میزان کلروفیل سلولی را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان کلروفیل سلولی در تمامی تیمارها نسبت به نمونه شاهد مشابه می‌باشد و تفاوت قابل ملاحظه‌ای بین میزان کلروفیل سلولی در تیمارها و شاهد دیده نمی‌شود. نمودار 15 میزان بتاکاروتن سلولی را نشان می‌دهد، میزان تغییرات بتاکاروتن سلولی مشابه روند تغیرات کلروفیل سلولی بوده و تفاوت قابل ملاحظه‌ای بین تیمارها با یکدیگر و هر کدام با شاهد مشاهده نمی‌گردد.

نمودار 11- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد در  pHاسیدی (حدود6) بر تعداد سلول در جلبکD. salina  (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 12- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد در  pHاسیدی (حدود6) بر کلروفیل کل در واحد حجم (میلی لیتر) جلبکD. salina  (میزان شوری محیط کشت 5/1  مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 13- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد در  pHاسیدی (حدود6) بر بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) جلبکD. salina  (میزان شوری محیط کشت 5/1  مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 14- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد در  pHاسیدی (حدود6) بر کلروفیل سلولی در جلبک
 D. salina . (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 15- اثر غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم و شاهد در  pHاسیدی (حدود6) بر بتاکاروتن سلولی در جلبک
D. salina  (میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

بررسی اثر تیتانیوم بر فتوسنتز و تنفس: در این تحقیق اثر تیتانیوم بر متابولیسم (فتوسنتز و تنفس) جلبکsalina  .D مورد مطالعه قرار گرفت که در بخش اول اثر بلندمدت تیتانیوم بر میزان فتوسنتز و تنفس در طی 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. از بین غلظت‌های100، 150 و 200 میکرو مولار غلظت 150 میکرو مولار انتخاب گردید، زیرا در آزمایش‌های انتخاب غلظت مطلوب برای تیمار بلندمدت، غلظت‌های 100 و 200 میکرو مولار هیچ تفاوتی با شاهد نداشتند. در نتیجه غلظت 150 میکرو مولار به‌عنوان غلظت اصلی برای آزمایش بلندمدت انتخاب گردید. نمودار 16 نتایج حاصل از اعمال بلندمدت تیتانیوم بر فتوسنتز می‌باشد. همان طور که ملاحظه می‌گردد در ساعات اولیه میزان فتوسنتز در تیمار 150 میکرو مولار تیتانیوم نسبت به شاهد افزایش داشته است و پس از گذشت 6 ساعت از شروع آزمایش میزان فتوسنتز در نمونه شاهد و تیمار در هر دو برابر شد و بعد از 24 ساعت میزان فتوسنتز در تیمار 150 میکرو مولار نسبت به نمونه شاهد به طور معنی‌داری کاهش یافت. نمودار 17 نتایج حاصل از اعمال بلندمدت تیتانیوم بر تنفس را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد میزان تنفس در تیمار 150 میکرو مولار تیتانیوم نسبت به نمونه شاهد به تدریج رو به کاهش می‌باشد، به طوری که 24 ساعت بعد از اعمال تنش، کاهش تنفس در تیمار نسبت به شاهد از تفاوت مشهودی برخوردار می‌باشد. میزان تنفس در نمونه شاهد هم بعد از 24 ساعت کاهش یافته است. در بخش دوم اثر آنی یا همان کوتاه‌مدت افزایش تیتاتیوم از غلظت 50 میکرو مولار تا 200 میکرو مولار بر فتوسنتز و تنفس بررسی گردید. در تمام آزمایش‌ها هر کدام از تیمارها با شاهد مربوط به خود سنجیده شدند و بعد نمودارها با استفاده از نرم‌افزار ترسیم شدند. نمودار 18 درصد تغییرات فتوسنتز در تیمارهای کوتاه‌مدت 50، 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌گردد با افزایش غلظت تیتانیوم از 50 تا 150 میکرو مولار میزان فتوسنتز افزایش یافته است اما از این غلظت بالاتر منجر به کاهش میزان فتوسنتز گردیده است، به طوری که در تیمار 200 میکرو مولار نسبت به سایر تیمارها فتوسنتز در سطح پایین‌تری قرار دارد، یعنی با 4 برابر کردن تیتانیوم میزان فتوسنتز کمتر می‌شود. نمودار 19 درصد تغییرات تنفس در تیمارهای کوتاه‌مدت 50، 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم را نشان می‌دهد، در غلظت 50 میکرو مولار میزان تنفس افزایش یافته ولی با افزایش غلظت تیتانیوم تا 200 میکرو مولار میزان تنفس کاهش یافته است که بیشترین میزان کاهش در غلظت 200 میکرو مولار تیتانیوم می‌باشد.

نمودار 16- نتایج حاصل از اعمال تنش بلندمدت تیتانیوم بر فتوسنتز خالص در نمونه D. salina (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 17. نتایج حاصل از اعمال تنش بلندمدت تیتانیوم بر تنفس در نمونه D. salin (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نموار 18. درصد تغییرات فتوسنتز خالص با افزایش غلظت تیتانیوم از 50 میکرو مولار تا 200 میکرو مولار در آزمایش کوتاه‌مدت در نمونهD.salina  (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

نمودار 19- درصد تغییرات تنفس با افزایش غلظت تیتانیوم از 50 میکرو مولار تا 200 میکرو مولار در آزمایش کوتاه‌مدت در نمونه
 D. salina (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد).

بحث

با وجود این که تیتانیوم در زمره عناصر ضروری نمی‌باشد ولی در گزارش‌ها (13، 11، 6، 2) دیده شده است که این عنصر برای گیاهان عالی مفید می‌باشد و می‌تواند منجر به بهبود متابولیسم زیستی در گیاهان شود. بنابراین در این تحقیق اثر تیتانیوم بر فاکتورهای رشد مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور غلظت مطلوب تیتانیوم به نحوی انتخاب گردید که اثر کشندگی شدید در سلول نداشته باشد، محدوده غلظت انتخابی برای تیمار سوسپانسیونهای جلبکی 200-100 میکرو مولار تیتانیوم بوده، زیرا غلظت‌های بالاتر موجب مرگ تعداد زیادی از سلولهاگردید. در بخش اول پژوهش حاضر تیمار غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرو مولار تیتانیوم به سوسپانسیون جلبکی دونالیه لا اعمال شد و مقدار کلروفیل و تعداد سلول مورد بررسی قرار گرفت. بر طبق نتایج هیچ گونه افزایشی در تقسیم سلولی و میزان کلروفیل و بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) و در سلول جلبک مشاهده نگردید، در حالی که بر اساس گزارش (6) تیمار تیتانیوم منجر به افزایش در پارامترهای فیزیولوژیک و رنگیزه‌های گیاهان شده است، از این رو به نظر می‌رسد تیتانیوم در غلظت‌های غیر کشنده 100، 150 و 200 میکرو مولار به دلایلی نظیر نبودpH  مناسب و غیر قابل دسترس بودن، نتواند از خلال غشا عبور و تأثیر مناسب بر متابولیسم و روند تقسیم سلولی جلبک دونالیه لا بگذارد و در غلظت‌های بالاتر به دلیل باند شدن با غشا ممکن است مانع فعالیت سلول شده و آن را مختل کند (8). گزارش شده است (8) که عنصر آلومینیوم به واسطه اتصال به غشا سلول دونالیه لا می‌تواند از فعالیت آن جلوگیری نماید. یکی از مشکلات قابل ذکر در مورد برخی از کاتیون‌ها و فلزات سنگین این می‌باشد که در محیط‌های قلیایی به صورت آزاد نبوده و به فرم غیر محلول و رسوب در می‌آیند، در نتیجه از دسترس گیاهان خارج می‌شوند (14). از طرفی حضور عامل‌های کلات کننده مانندEDTA  از غیر محلول شدن کاتیون‌ها در محیط جلوگیری می‌کند و با انتقال یون‌ها در نزدیکی سطح ریشه آن را بهتر در دسترس گیاهان قرار می‌دهد (15). بنابراین به نظر می‌رسد در آزمایش‌های قبلی، تیتانیوم احتمالا به فرم غیر محلول در آمده و از دسترس جلبک خارج شده است، از این رو تأثیر تیتانیوم بر میزان تقسیم سلولی، میزان کلروفیل و بتاکاروتن در حضور EDTA بررسی گردید. طبق نتایج میزان تقسیم سلولی در حضور EDTA اثر افزایشی در کلیه تیمارها داشته است، همچنین میزان کلروفیل و بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) تمامی تیمارها نسبت به نمونه شاهد یک روند افزایشی داشته است. چنین نتایجی با گزارش‌ها (2، 6) مبنی بر افزایش پارامترهای فیزیولوژیک ازجمله رشد سلولی و رنگیزه‌ها در گیاهان مطابقت دارد، به طوری که تیتانیوم روی بیوماس گیاهان اثرات مطلوب و تأثیر بسزایی در جذب سایر عناصر و تجمع کاتیونهای ضروری برای رشد داشته است که تیتانیوم بر ATPase و یا تحریک سنتز کوفاکتورهای فلزی اثر گذاشته و باعث افزایش جذب سایر عناصر شده است (11). با توجه به این که حضور EDTA باعث افزایش تأثیر تیتانیوم بر سیستم سلولی و رنگیزه‌ها شده است، از این رو به نظر می‌رسد که در بخش اول، علت عدم تأثیر تیتانیوم ناشی از عدم جذب آن بوده است که در بخش دوم تحقیق EDTA با تیتانیوم باند شده و باعث جذب بیشتر و تأثیر آن شده است (15). بنابراین عدم افزایش کلروفیل و بتاکاروتن در سلول در هر دو بخش آزمایش می‌تواند بیانگر این باشد که افزایش میزان کلروفیل و بتاکاروتن در واحد حجم به واسطه اثر تیتانیوم بر متابولیسم سلول نبوده، بلکه ناشی از افزایش تقسیم سلولی بوده که به تبع افزایش در حجم را به دنبال داشته است. در گزارش (10) دیده شده است که یون‌های بسیاری از فلزات در یک محدوده مطلوب و بهینه از pH به صورت محلول بوده، بنابراین در دسترس و قابل جذب برای گیاهان می‌باشند و این که در چه محدوده‌ای ازpH  قابل جذب باشند به طبیعت شیمیایی فلز مربوطه برمی‌گردد. فلز تیتانیوم در pH تقریبا 6 (اسیدی) جذب بیشتری داشته است (7)، از این رو تیمار تیتانیوم در این  pHانجام شد؛ با توجه به نتایج، میزان تقسیم سلولی به طور قابل ملاحظه‌ای نسبت به نمونه شاهد افزایش داشته است. میزان کلروفیل و بتاکاروتن در واحد حجم (میلی لیتر) در تمامی تیمارها نسبت به نمونه شاهد یک روند افزایشی داشته است که این نتایج با گزارش مبنی بر این که حلالیت فلزات در pH اسیدی بیشتر شده (7) و منجر به افزایش رنگیزه‌ها در جلبک‌ها می‌شود (6، 13)، مطابقت دارد. نتایج اثر pH مشابه با نتایج اثر تیتانیوم در حضور EDTA بوده است، زیرا همانند حضور EDTA، در pH اسیدی (محدوده 6) میزان تقسیم سلولی و رنگیزه‌ها در واحد حجم افزایش داشته است، اما میزان کلروفیل و بتاکاروتن در سلول همانند آزمایش‌های قبلی هیچ افزایشی را به دنبال نداشته است که حکایت از عدم تأثیر تیتانیوم بر متابولیسم سلول بوده و افزایش در رنگیزه‌ها ناشی از افزایش تعداد سلولها بوده است. با توجه به مقادیر ذکر شده در بخش نتایج، مقایسه میزان تقسیم سلولی در حضورEDTA  وpH  نشان می‌دهدکه درpH  اسیدی میزان تقسیم سلولی بیشتر (22 میلیون سلول در میلی لیتر) از تقسیم سلولی در حضورEDTA  (17 میلیون سلول در میلی لیتر) می‌باشد، پس به نظر می‌رسدpH  و حل‌پذیری تیتانیوم اثر بیشتری نسبت به باند شدن آن در حضورEDTA  دارد. گزارش شده است که تیتانیوم می‌تواند منجر به افزایش فتوسنتز در گیاهان گردد (5)، هر چند در خصوص تنفس اطلاعات چندانی وجود ندارد، همین طور تحقیق جامعی در خصوص اثر تیتانیوم بر فتوسنتز و تنفس بر جلبک‌های پرسلولی و تک سلولی وجود ندارد. پس از انجام آزمایش نتایج حکایت از کاهش میزان فتوسنتز و تنفس در حضور تیتانیوم در طی یک دوره 24 ساعته داشت که بر خلاف گزارش‌های موجود در مورد گیاهان بود. از این رو به نظر می‌رسد تیتانیوم با تأثیر بر ساختار غشاء مانع فعالیت‌های متابولیسمی نظیر فتوسنتز و تنفس گردد (5)، از طرفی در آزمایش کوتاه‌مدت که به صورت آنی و بلافاصله اعمال شده است با افزایش تیتانیوم تا 150 میکرو مولار میزان فتوسنتز افزایش یافته است ولی در غلظت‌های بالاتر کاهش می‌یابد؛ بنابراین این افزایش می‌تواند بیانگر ورود تیتانیوم به داخل سلول و تأثیر مثبت بر فتوسنتز و اثر منفی بر تنفس باشد. البته در نتایج تقسیم سلولی و رنگیزه‌ها تفاوتی بین غلظت‌های 100، 150 و 200 میکرومولار تیتانیوم ملاحظه نشد ولی در تأثیر آنی تیتانیوم در بخش فتوسنتز و تنفس بین غلظت‌ها تفاوت معنی‌داری مشاهده گردید که خود حکایت از این داشت که بررسی فتوسنتز و تنفس نسبت به تقسیم سلولی تحت این شرایط یک شاخص دقیق‌تر بوده و تفاوت را بهتر و بیشتر نشان می‌دهد. همچنین نتایج بخش‌های قبلی حکایت از این بوده که افزایش در واحد حجم رنگیزه‌ها ناشی از افزایش تعداد سلول بوده نه اثر آن بر متابولیسم سلول، اما نتایج حاصل از فتوسنتز و تنفس نشان می‌دهد که تیتانیوم می‌تواند بر متابولیسم سلول نیز اثر داشته باشد. از طرفی گزارش شده است (5) که تیتانیوم می‌تواند در زنجیره انتقال الکترون جایگزین برخی از فلزات شود و میزان انتقال الکترون را بهبود ببخشد که به نظر می‌رسد در شرایط کوتاه‌مدت این جایگزینی در زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی باعث افزایش فتوسنتز ولی در تنفس احتمالا با تأثیر بر سایر بخش‌های میتوکندریایی تنفس را مختل نماید. در شرایط طولانی‌مدت به نظر می‌رسد این افزایش در انتقال الکترون اختلالاتی را در سلول ایجاد نماید (5). لازم به یادآوریست که همیشه فعالیت‌های فتوسنتزی با تعداد سلول رابطه مستقیم ندارد.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از مسئولان محترم تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان به‌دلیل حمایت مالی در انجام این تحقیق قدردانی می‌گردد. نویسندگان مقاله از دست‌اندرکاران قطب تنش‌های گیاهی در دانشگاه اصفهان نیز تشکر و قدردانی می‌نمایند.