نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تربیت مدرس

2 دانشگاه تهران

چکیده

چکیده
براساس داده های آژانس حفاظت محیط زیست، سرب مهم ترین فلز آلاینده محیط می باشد. در این تحقیق تاثیر فلز سرب بر گیاه یونجه در مرحله جوانه زنی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظوردانه رست های 7 روزه یونجه در محیط هیدروپونیک تحت تیمار غلظت های 0،120،240، 500 و 1000 میکرومولار سرب قرار گرفتند و پس از 10 روز بررسی های ریخت شناختی و فیزیولوژیک بر روی آنها انجام گرفت. براساس نتایج میزان جذب سرب در اندام هوایی و ریشه ها با افزایش غلظت سرب در محیط افزایش یافت و در نتیجه میزان رشد گیاه با افزایش میزان جذب سرب کاهش یافت. میزان تولید پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدهید به عنوان شاخص های تنش اکسیداتیو افزایش یافت. تحت تنش سرب میزان تولید فلاونوئیدها و فعالیت آنزیم پراکسیداز در اندام هوایی و ریشه ها افزایش یافت و میزان ترکیبات فنولی در ریشه ها کاهش و در اندام هوایی افزایش نشان داد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Lead accumulation and it's effects on peroxidase activity, phenolic and flavonoid compounds in seedlings of Medicago sativa L.

نویسنده [English]

  • vahid niknam 2

چکیده [English]

Heavy metal pollution is one of the most important ecological problems in the whole world. According to the environmental protection agency (EPA), Pb is the most common heavy metal contaminant in the environment. In this study the effects of Pb stress (0, 120, 240, 500, 1000 μM Pb) on 7 days seedlings of Medicago sativa L. were investigated in hydroponic culture.
The our results indicated Pb accumulation in roots and aerial parts and an increasing trend in total biomass was observed with increas of Pb concentration in medium which reduced later. Compared with control seedlings, increase in the contents of MDA and H2O2 were observed in those the seedlings under Pb stress. Moreover, increase in total flavonoids content, and peroxidase activity in roots and shoots of the treated seedlings were observed under Pb stress. Content of total phenolics decreased in roots and increased in shoots comparing to than the control.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Flavonoids
  • Lead
  • Medicago sativa L
  • Phenolic compounds
  • Peroxidase

بررسی میزان انباشتگی سرب و تأثیر آن بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در مرحله جوانه‌زنی در گیاه یونجه (Medicago sativa L.)

سیما قلیچ1، فاطمه زرین کمر1* و وحید نیکنام2

1 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی 

2 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 8/9/91                 تاریخ پذیرش: 11/3/92 

چکیده

براساس داده‌های آژانس حفاظت محیط‌زیست، سرب مهمترین فلز آلاینده محیط می‌باشد. در این تحقیق تأثیر فلز سرب بر گیاه یونجه در مرحله جوانه‌زنی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور دانه‌رست‌های 7 روزه یونجه در محیط هیدروپونیک تحت تیمار غلظت‌های 0،120،240، 500 و 1000 میکرومولار سرب قرار گرفتند و پس از 10 روز بررسی‌های ریخت‌شناختی و فیزیولوژیک بر روی آنها انجام شد. براساس نتایج میزان جذب سرب در اندام هوایی و ریشه‌ها با افزایش غلظت سرب در محیط افزایش یافت و در نتیجه میزان رشد گیاه با افزایش میزان جذب سرب کاهش یافت. میزان تولید پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدهید به‌عنوان شاخص‌های تنش اکسیداتیو افزایش یافت. تحت تنش سرب میزان تولید فلاونوئیدها و فعالیت آنزیم پراکسیداز در اندام هوایی و ریشه‌ها افزایش یافت و میزان ترکیبات فنولی در ریشه‌ها کاهش و در اندام هوایی افزایش نشان داد.

واژه‌های کلیدی: پراکسیداز، ترکیبات فنولی، سرب، فلاونوئید، یونجه

* نویسنده مسئول، تلفن: 82884440-021، پست الکترونیکی:Zarinkamar@modares.ac.ir

مقدمه  

 

آلودگی فلزات سنگین درنتیجه فعالیت‌های گسترده صنعتی و کشاورزی یکی از مهمترین مشکلات بوم‌شناختی در مقیاس جهانی است (14). براساس داده های آژانس حفاظت محیط زیست، سرب مهمترین فلز آلاینده محیط می‌باشد. آلودگی سرب در محیط زیست باعث اثراتی از قبیل مهار جوانه‌زنی دانه، اختلال در میتوز، مهار رشد جوانه و ریشه، کاهش فتوسنتز و تنفس، اختلال در توزیع مواد غذایی، بر هم زدن تعادل آب، تغییر در تعادل هورمونی گیاه، تغییر در قابلیت نفوذپذیری غشا و مهار یا فعال سازی فعالیت‌های آنزیمی می‌شود (14،15،25). فلزات سنگین از طریق واکنش فنتون اقدام به تولید انواع فعال اکسیژن می‌کنند (10). تجمع انواع فعال اکسیژن منجر به تنش اکسیداتیو می‌گردد که می‌تواند باعث آسیب به اجزای سلول از قبیل غشاها، پروتئین‌ها و DNA شود (23). گیاهان برای حذف یا کاهش انواع فعال اکسیژن از سیستم های آنتی اکسیدان آنزیمی و غیرآنزیمی استفاده می‌کنند. از میان آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی مشخص شده که ترکیبات فلاونوئیدی دارای خواص آنتی اکسیدانی قوی می‌باشند(21، 24 و 26). همچنین مشخص شده است که فلاونوئیدها به‌عنوان ترکیبات کلاته کننده فلزات، نقش مهمی در ایجاد تحمل نسبت به تنش فلزات سنگین در گیاهان به عهده دارند (20). از میان آنزیم های آنتی اکسیدان نیز آنزیم پراکسیداز نقش مهمی در از بین بردن رادیکال های آزاد اکسیژن به‌ویژه پراکسید هیدروژن دارد. مشخص شده است که حضور فلزاتی از قبیل مس، آلومینیوم و کادمیم سبب افزایش فعالیت این آنزیم می‌گردد (5، 8، 27). مطالعات نشان داده که گونه Medicago sativa L. قادر به تحمل فلزات سنگین و رشد در خاکهای آلوده است. این گونه دارای بیومس زیاد جوانه و ریشه می‌باشد (28) و گزارشها حکایت از تجمع مقادیر بالای فلزات سنگینی ازجمله روی، سرب، نیکل، کروم، کادمیم، مس و نقره در بافت های این گیاه دارد (28، 22، 12، 11، 4). بنابراین هدف مطالعه حاضر بررسی میزان انباشتگی سرب و تأثیر آن بر برخی سازوکارهای فیزیولوژیک دخیل در تحمل تنش فلز سرب در گیاه یونجه  در مرحله جوانه‌زنی می‌باشد.

مواد و روشها

آماده سازی بذرها، کشت گیاه و اعمال تیمار سرب: بذرهای گیاه یونجه (Medicago sativa L. cv. Hamedani) از مؤسسه تهیه و اصلاح نهال و بذر کرج تهیه شد. برای آماده سازی ابتدا بذرها با شوینده های معمولی به خوبی شسته شدند و پس از آبکشی به مدت 20 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 20 درصد (دارای 5 درصد کلر فعال) ضد عفونی سطحی شدند. پس از 3 بار آبکشی با آب مقطر در ظروف پتری حاوی کاغذ صافی مرطوب در شرایط تاریکی برای جوانه‌زنی قرار داده شدند. پس از جوانه‌زنی دانه‌رست‌های 5 روزه یکدست و همسان به محیط هوگلند 2/1 منتقل شدند وpH  محلول غذایی روی 5/6 تنظیم شد. سپس نمونه‌ها در اتاق رشد با دمای شب 2 ±18 و دمای روز 2±22، نور 16 ساعت و تاریکی 8 ساعت و رطوبت 70-65 درصد قرار داده شدند. دانه‌رست‌های 7 روزه، به مدت 10 روز تحت تیمار با غلظت‌های 0، 120، 240، 500 و 1000 میکرومولار سرب قرار گرفتند. برای بررسی اثر سرب بر جوانه‌زنی این بذرها تعدادی از پتری‌های حاوی بذر با غلظت‌های 120، 240، 500 و 1000  میکرومولار سرب تحت تیمار قرار گرفتند و درصد جوانه‌زنی آنها بعد از 3 و 7 روز محاسبه گردید.

اندازه گیری وزن خشک اندام هوایی و ریشه: پس از خارج کردن گیاهان از محلول هوگلند و شستشوی ریشه ها، اندام هوایی از محل یقه از ریشه ها جدا شد. سپس نمونه ها در انکوباتور در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت خشک شدند و وزن خشک آنها اندازه گیری شد.

آماده سازی نمونه ها برای هضم اسیدی و استخراج سرب از گیاه: نمونه های خشک شده اندام هوایی و ریشه توسط نیتروژن مایع در هاون کوبیده و به پودر تبدیل شدند.

1/0 گرم از پودر تهیه شده از اندام هوایی ریشه برای انجام فرایند هضم اسیدی توزین شد. در این تحقیق از روش اکسیداسیون تر برای استخراج سرب از گیاه استفاده شد. بدین منظور آمیزه نیتریک اسید، پرکلریک اسید و سولفوریک اسید با نسبت حجمی 40:4:1 بکار برده شد (13).

اندازه‌گیری میزان سرب در نمونه های گیاهی: نمونه های گیاهی و محلولهای استاندارد به‌منظور اندازه‌گیری میزان سرب موجود در آنها توسط دستگاه جذب اتمی SHIMADZU مدل AA- 6709 آنالیز شدند.


محاسبهTransfer Factor (TF)  و  Bioconcentration Factor (BCF):

 

 

غلظت فلز در اندام هوایی

غلظت فلز در محیط رشد

                       

                                                                                                   غلظت فلز در ریشه

BCF=                                                                                 TF=

                                                                                                   غلظت فلز در محیط

 


استخراج و سنجش محتوای فلاونوئید کل: نمونه‌های منجمد شده ریشه به میزان 1/0 گرم در 10 میلی لیتر اتانول: اسید استیک , v:v)1:99( عصاره‌گیری شد. سپس لوله های آزمایش به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و بعد سرد شدند. آنگاه جذب آنها در طول موج‌های 270، 300 و 330 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر مدل  UV2100اندازه‌گیری شد. محتوای فلاونوئید با استفاده از ضریب خاموشیcm-1M-1 33000  محاسبه گردید (17).

سنجش محتوای ترکیبات فنلی محلول: میزان 1/0 گرم از بافت­های خشک ریشه و اندام هوایی گل در 20 میلی­لیتر متانول 80 درصد همگن شد و به مدت 3 ساعت در حمام آب گرم در دمای 70 درجه سانتی­گراد گذاشته شد. سپس با سرعت 9000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شد. عصاره متانولی از رسوب جدا شد و حجم عصاره متانولی اندازه گرفته شد. 5 میلی­لیتر از عصاره متانولی برداشته و خشک گردید. عصاره خشک شده در 5 میلی­لیتر آب دیونیزه حل شد (19). برای اندازه‌گیری ترکیبات فنلی کل از معرف  Folin-Ciocalteauاستفاده شد و گالیک­اسید به‌عنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. 5/0 میلی لیتر از این معرف به 5/0 میلی لیتر عصاره استخراج شده گیاهی و استانداردهای گالیگ اسید اضافه و بعد به مخلوط حاصل 4 میلی لیتر سدیم کربنات 1 مولار اضافه شد. پس از 15 دقیقه نگهداری در دمای محیط، جذب نمونه ها در طول موج 765  نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل UV2100 خوانده شد و نتایج به صورت میلی‌گرم هم گالیگ اسید بر گرم وزن خشک گزارش گردید (7).

استخراج و سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: نمونه های منجمد ریشه و اندم هوایی به میزان 2/0 گرم در 3 میلی لیتر بافر Na-Phosphate 60 میلی مولار با 1/6  pH= عصاره‌گیری شدند. سوسپانسیون حاصل در g×15000، به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد. از بخش رویی برای اندازه گیری فعالیت پراکسیداز استفاده گردید. ترکیب واکنش در حجم نهایی 3 میلی لیتر شامل مواد زیر بود (18):

بافر Na-Phosphate 60 میلی مولار با 1/6pH=، محلول گایاکول 28 میلی مولار، محلول پراکسید هیدروژن 5 میلی مولار و عصاره آنزیمی به مقدار مناسب.

فعالیت آنزیم به صورت تغییر در جذب در 470  نانومتر بعد از یک دقیقه نسبت به میلی­گرم پروتئین محاسبه گردید. میزان پروتئین طبق روش برادفورد و با استفاده از BSA (آلبومین سرم گاوی) به‌عنوان استاندارد تعیین شد.

استخراج و سنجش میزان پراکسید هیدروژن (H2O2) : نمونه های منجمد ریشه و اندم هوایی به میزان 1/0 گرم در 2 میلی لیتر TCA (Trichloroacetic acid) 1/0% عصاره‌گیری شدند. سوسپانسیون حاصل در g×12000، به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد. سپس به 5/0 میلی‌لیتر از محلول رویی، 5/0 میلی‌لیتر بافر K-Phosphate 10 میلی مولار با 7pH= و 1 میلی لیتر محلول KI یک مولار اضافه شد. مخلوط واکنش را به مدت 1 ساعت در تاریکی در دمای اتاق قرار داده و بعد جذب آنها در طول موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل UV2100 خوانده شد. میزان پراکسید هیدروژن با توجه به منحنی استاندارد غلظت‌های مختلف پراکسید هیدروژن محاسبه گردید (3).

تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: این آزمایش بر اساس روش (9) با استفاده از اندازه­گیری مالون­دی­آلدئید (MDA)، به عنوان فرآوردة نهایی پراکسیداسیون لیپید غشا انجام شد. نمونه­های منجمد شده به میزان 5/0 گرم در 3 میلی‌لیتر TCA (Trichloroacetic acid) 10% عصاره­گیری شدند. سپس به یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون صاف شده 1 میلی‌لیترTBA (Thiobarbituric acid) 5/0٪ به هر کدام از نمونه­ها اضافه شد و در حمام آب گرم Cº 100 به مدت 30 دقیقه قرار گرفتند. بعد از گذشت 30 دقیقه، لوله­ها از حمام خارج شده و پس از سرد شدن میزان MDA با اندازه­گیری جذب در طول موج­های 532 و 600 نانومتر با استفاده از ضریب ثابت (mM-1cm-1 155=ε) محاسبه گردید.

تحلیل‌های آماری: کلیه آزمایش ها در 3 تکرار با حداقل 3 نمونه مستقل انجام شد. بررسی‌های آماری با نرم‌افزار MSTAT-C انجام شد. برای انجام آنالیز واریانس داده ها ازANOUVA  یکطرفه و برای مقایسه میانگین ها از آزمون دانکن با ضریب اطمینان 95 درصد استفاده شد.

نتایج

محاسبه درصد جوانه‌زنی بذرهای یونجه پس از 3 و 7 روز نشان داد که تحت تأثیر غلظت های در حال افزایش سرب درصد جوانه زنی بذرها به طور معنی داری کاهش می‌یابد (P≤0.05). همچنین درصد جوانه‌زنی بعد از 7 روز نسبت به 3 روز در نمونه های شاهد افزایش و در نمونه های تحت تیمار کاهش نشان داد (شکل 1).

مقایسه میانگین وزن خشک اندام هوایی و ریشه نشان‌دهنده تفاوت معنی دار در سطح 5 درصد میان گیاهان شاهد و گیاهان تحت تیمار سرب می‌باشد. میانگین وزن خشک ریشه و اندام هوایی گیاهان با افزایش میزان غلظت سرب کاهش نشان می‌دهد (جدول1). همچنین طول ریشه گیاهان تحت تیمار سرب در مقایسه با گیاهان شاهد کاهش یافته است (جدول 1).  طول ریشه در گیاهان تحت تیمار 120 میکرومولار سرب با گیاهان شاهد دارای تفاوت معنی‌دار نمی‌باشد اما  در سایر غلظت ها کاهش طول ریشه در سطح 5 درصد معنی‌دار بوده است (جدول 1).

 

 

 

نتایج حاصل از سنجش میزان سرب در ریشه و اندام هوایی نشان‌دهنده افزایش میزان جذب سرب با افزایش میزان غلظت سرب در محیط رشد گیاهان می‌باشد. مقایسه میانگین داده‌های حاصل از سنجش میزان سرب در اندام هوایی و ریشه گیاهان تحت تیمار نشان داد که بیشترین میزان جذب در ریشه و اندام هوایی در غلظت 1000 میکرومولار سرب بوده و کمترین مقادیر متعلق به گروه شاهد بود (شکل 2).

محاسبه شاخص‌های تجمع و انتقال سرب نشان داد که شاخص BCF در ریشه های تحت تیمار بیشتر از اندام هوایی بوده است. میزان شاخصBCF هم در اندام هوایی و هم در ریشه ها کمتر از یک می‌باشد و تنها در غلظت 120 میکرومولار سرب در ریشه بیشتر از یک است. همچنین میزان این شاخص با افزایش غلظت سرب در محیط رشد افزایش یافت. شاخص TF نیز با افزایش غلظت سرب در محیط رشد افزایش یافت و در همه تیمارها مقدار این شاخص کمتر از یک محاسبه شد (جدول 2).

 

 

 

نتایج نشان می‌دهد که محتوای فلاونوئید کل در ریشه و اندام هوایی گیاهان تحت تیمار با افزایش غلظت سرب افزایش یافته است و این افزایش در هر 3 طول موج از لحاظ آماری معنی‌دار می‌باشد (شکل 3 و 4).

نتایج حاصل از سنجش محتوای فنول کل در اندام هوایی و ریشه نشان‌دهنده تفاوت معنی دار محتوای فنول کل در گیاهان شاهد و تحت تیمار سرب می‌باشد. محتوای فنول کل در اندام هوایی گیاهان تحت تیمار نسبت به گروه شاهد با افزایش غلظت سرب در محیط رشد افزایش یافته است، در حالیکه در ریشه گیاهان تحت تیمار محتوای ترکیبات فنلی کل با افزایش غلظت سرب در محیط رشد کاهش یافته است (شکل 5).

 

 

شکل1- درصد جوانه‌زنی بذرها تحت تیمار سرب

 

 

شکل 2- میزان سرب جذب شده در ریشه و اندام هوایی تحت تأثیر مقدار سرب                            شکل 3- تغییرات محتوای فلاونوئید کل ریشه

                                   در محیط

 

 

شکل 4- تغییرات محتوای فلاونوئید کل اندام هوایی            

شکل 5- تغییرات محتوای ترکیبات فنلی کل (ستونهایی که با حروف یکسان نشان داده شده است در سطح ٥% و بر اساس آزمون دانکن اختلاف معنی‌داری  با هم ندارند)

 

 

 

نتایج حاصل از اندازه‌گیری میزان تولید مالون دی آلدئید به عنوان فراورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نشان‌دهنده افزایش معنی دار MDA در ریشه های گیاهچه های یونجه تحت تنش سرب می‌باشد. البته بیشترین میزانMDA  مربوط به تیمار 1000 میکرو مولار سرب است (نمودار 6).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز نشان داد که در ریشه گیاهان تحت تیمار سرب فعالیت آنزیم پراکسیداز نسبت به گروه شاهد افزایش یافته است. این افزایش از لحاظ آماری در سطح 5 درصد معنی‌دار است و بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز مربوط به ریشه گیاهچه‌های تحت تیمار 1000 میکرو مولار سرب می‌باشد. سنجش فعالیت پراکسیداز در اندام هوایی نمونه های تحت تیمار سرب هیچ‌گونه تفاوت معنی‌داری را با گروه شاهد نشان نداد (شکل 7). 

نتایج حاصل از سنجش میزان پراکسید هیدروژن در گیاهچه‌های یونجه نشان داد که میزان این ماده در اندام هوایی و ریشه گیاهچه های تحت تیمار با غلظت های مختلف سرب به طور معنی‌داری افزایش یافته است (شکل 8).


 

    

 

شکل 6- تغییرات میزان مالون دی آلدئید (ستونهایی که با حروف یکسان نشان داده شده است در سطح 5% و بر اساس آزمون دانکن اختلاف معنی‌داری با هم ندارند) 

شکل 7- فعالیت آنزیم پراکسیداز (ستونهایی که با حروف یکسان نشان داده شده است در سطح ٥% و بر اساس آزمون دانکن اختلاف معنی‌داری با هم ندارند)


 

 

شکل 8- تغییرات میزان  H2O2(ستونهایی که با حروف یکسان نشان داده شده است در سطح ٥ %و بر اساس آزمون دانکن اختلاف معنی‌داری با هم ندارند)


بحث و نتیجه‌گیری

آلودگی سرب در محیط زیست باعث اثراتی از قبیل مهار جوانه‌زنی دانه، اختلال در میتوز، القای کلروز و نکروز در برگ، مهار رشد جوانه و ریشه، کاهش فتوسنتز و تنفس، کاهش سنتز DNA، اختلال در توزیع مواد غذایی، بر هم زدن تعادل آب، تغییر در تعادل هورمونی گیاه، تغییر در قابلیت نفوذپذیری غشا و مهار یا فعال سازی فعالیت های آنزیمی می‌گردد (25، 14). درصد جوانه‌زنی بذرهای گیاه یونجه تحت تأثیر غلظت های مختلف سرب کاهش یافت. نتایج مطالعات مختلف نشان‌دهنده کاهش میزان جوانه‌زنی بذرهای گونه‌های گیاهی مختلف تحت تنش فلزات سنگین می‌باشد (14،31). همچنین بیشتر مطالعات انجام شده نشان‌دهنده کاهش زیتوده خشک اندام هوایی و ریشه تحت تنش سرب و سایر فلزات سنگین است که مشابه نتایج به‌دست آمده در این مطالعه می‌باشد. بنابراین به نظر می‌رسد که کاهش زیتوده گیاهان به دلیل کاهش تقسیمات سلولی، کاهش میزان فتوسنتز و یا کاهش جذب آب و مواد معدنی می‌باشد (32، 31، 29، 25، 6، 1). مقایسه میزان سرب جذب شده در ریشه و اندام هوایی نشان می‌دهد که بیشتر سرب جذب شده در گیاه در ریشه‌ها انباشته شده است و بخش کمی از آن به اندام هوایی منتقل شده است. البته نتایج مشابهی در مورد انباشتگی سرب در سایر گونه‌ها به‌دست آمده است (33، 15). همچنین مقایسه شاخص‌هایBCF  و TF نشان می‌دهد که هرچه بر میزان غلظت سرب در محیط رشد گیاه افزوده می‌شود میزان انتقال آن از ریشه به اندام هوایی افزایش می‌یابد و در غلظت های بسیار بالای سرب، تجمع سرب در ریشه برای کاهش سمیت این فلز سنگین در گیاه به تنهایی مؤثر نبوده و گیاه از سازوکار انتقال و کدبندی سرب در اندام هوایی استفاده می‌کند.

در بسیاری از گونه‌های گیاهی تنش فلزات سنگین منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو و تولید انواع فعال اکسیژن می‌گردد. انواع فعال اکسیژن از طریق پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی سبب آسیب غشا شده و همچنین می‌توانند سبب آسیب به پروتئین‌ها، مولکول DNA و کلروفیل شوند (21، 2). در میان انواع فعال اکسیژن مولکول پراکسید هیدروژن (H2O2) نسبتا پایدارتر و خطرناکتر است، زیرا می‌تواند از غشا عبور کرده و به اندامک های درون سلولی برسد (21). گیاهان برای حذف یا کاهش ROS از سیستم های آنتی اکسیدان آنزیمی و غیرآنزیمی استفاده می‌کنند (26، 24، 21). از میان آنزیم های آنتی اکسیدان آنزیم پراکسیداز نقش مهمی در از بین بردن رادیکال های آزاد اکسیژن به‌ویژه پراکسید هیدروژن دارد. نتایج به‌دست آمده از مطالعه حاضر نشان می‌دهد که در گیاهچه‌های یونجه نیز میزان تولید پراکسید هیدروژن و هم میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز با افزایش میزان غلظت سرب افزایش می‌یابد. این نتایج نشان‌دهنده ایجاد تنش اکسیداتیو ناشی از تنش سرب و افزایش میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز به‌عنوان یک آنزیم آنتی اکسیدان مهم برای به حداقل رساندن آسیب های ناشی از افزایش میزان تولید پراکسید هیدروژن می‌باشد. همچنین افزایش میزان مالون دی آلدئید در این مطالعه بیانگر افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در شرایط تنش فلزات سنگین ازجمله سرب است. افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز می‌تواند به دلیل تجمع H2O2 و افزایش سایر انواع فعال اکسیژن تحت تنش سرب باشد (30، 33، 29).

یکی از سازوکارهای مؤثر در افزایش میزان تحمل فلزات سنگین تولید و انباشتگی ترکیبات فنولی است. نتایج به‌دست آمده در این مطالعه نشان‌دهنده کاهش میزان ترکیبات فنولی محلول در ریشه و افزایش آنها در اندام هوایی می‌باشد. مطالعات قبلی نشان داده است که کاهش میزان ترکیبات فنلی محلول می‌تواند به علت سنتز سایر ترکیبات فنولی ازجمله لیگنین باشد. همچنین مشخص شده است که در استرس فلزات سنگین فنول‌های متصل به دیواره بیشتر از فنل‌های محلول تحت تأثیر قرار می‌گیرند (16). یکی از بزرگترین گروه‌های ترکیبات فنولی فلاونوئیدها هستند که به طور وسیعی در تمام سلسله گیاهی حضور دارند. فلاونوئیدها هم به‌عنوان عوامل آنتی اکسیدان و هم به‌عنوان ترکیبات کلاته کننده فلزات، نقش مهمی در ایجاد تحمل نسبت به تنش فلزات سنگین در گیاهان به عهده دارند (20). گیاه یونجه دارای ترکیبات متعدد فلاونوئیدی در ریشه‌ها و برگ های خود می‌باشد. افزایش محتوای فلاونوئید کل در اندام هوایی و ریشه گیاهچه‌های یونجه در پاسخ به تنش سرب نشان‌دهنده نقش این گروه از متابولیت‌های ثانویه در افزایش تحمل گیاهچه‌های یونجه نسبت به تنش سرب می‌باشد.

بنابراین با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه می‌توان اینگونه نتیجه‌گیری کرد که با افزایش تجمع سرب در ریشه و اندام هوایی، میزان رشد گیاهچه‌های یونجه کاهش می‌یابد و این گیاه برای تحمل تنش سرب از سازوکارهای محافظتی آنتی‌اکسیدان از قبیل افزایش میزان محتوای فلاونوئیدی و فنولی و افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز استفاده می‌کند.

  1. حافظی م، نمکی شوشتری ع، اسرار ز،  ترکزاده م (1388) تأثیرات غلظتهای سمی کادمیوم بر میزان گره زایی و تثبیت ازت سوشهای مختلف باکتری سینوریزوبیوم ملیلوتی (وحشی و دارای پلازمید) در گیاه یونجه(Medicago sativa) . مجله زیست شناسی ایران. جلد22. 626-635.
  2. زارع ده آبادی س، اسرار ز (1388) بررسی اثر مقدار اضافی عنصر روی (Zinc) بر القای تنش اکسیداتیوو تجمع برخی عناصر در گیاه نعناع سبز(Mentha spicata L.). مجله زیست شناسی ایران. جلد22 .228-218.
    1. Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, S. and Karanov, E. (2001) The effect of drought and ultravioletradiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant Cell and Environment 24:1337-1344.
    2. Bali, R., Siegele, R., T. Harrisa, A. (2010) Phytoextraction of Au: Uptake, accumulation and cellular distribution in Medicago sativa and Brassica juncea. Chemical Engineering Journal 156: 286–297.
    3. Bhuiyan, N., Liu, W., Liu, G., Selvaraj, G., Wei, Y., King, J. (2007) Transcriptional regulation of genes involved in the pathways of biosynthesis and supply of methyl units in response to powdery mildew attack and abiotic stresses in wheat. Plant Molecular Biology 64: 305-318.
    4. Bosabalidis, A., Panou-Filotheou, H. (2004) Root structural aspects associated with copper toxicity in oregano (Origanum vulgare subsp. hirtum) Plant Science 166: 1497–1504.
    5. Boonyuen, C., Wangkarn, S., Suntornwat, O., & Chaisuksant, R. (2009).   Antioxidant capacity and phenolic content of Mimusops elengi fruit extract. Kasetsart Journal of Natural Sciences 43: 21−27.
    6. Claus, H. (2004) Laccases: structure, reactions, distribution. Micron 35: 93-96.
    7. De Vos, C., Schat, H., De Waal, M., Vooijs, R and Ernst, W. (1991). Increased to copper-induced damage of the root plasma membrane in copper tolerant silene cucubalus, Plant Physiol 82:523-528.

 

10.  Dat, J., Vandenabeele, S.,Vranova, E., Van Montagu, M., Inze, D., Van Breusegem, F.(2000) Dual action of the active oxygen species during plant stress responses, Cellular and Molecular life sciences 57: 779-795.

11.  Gardea-Torresdey, J.L., Tiemann, K.J., Gamez, G., Dokken, K(1999) Effects of chemical competition for multi-metal binding by Medicago sativa (alfalfa). Journal of Hazardous Materials B69: 41–51.

12.  Gardea-Torresdey, J.L., Tiemann, K.J., Gamez, G., Rodriguez, O.(1998) Phytofiltration of hazardous cadmium, chromium, lead and zinc ions by biomass of Medicago sativa (Alfalfa). Journal of Hazardous Materials 57 : 29-39.

13.  Gupta, P.K. (2000) Soil, plant, water and fertilizer analysis. Agrobios, New Dehli, India P: 438.

14.  Islam, E., Li, T., Yang, X., Liu, D., Jin, X., Meng, F. (2007) Effect of Pb toxicity on root morphology, physiology and ultrastructure in the tow ecotype Elsholtzia argyi. Journal of hazardous material 147: 806-816.

15.  Kopittke, M., Asher, P. J., Mensies, N.(2007) Toxic effect of Pb2+on  growth of cowpea (Vigna unguiculata). Environmental pollution xx.1-8.

16.  Kovacik, J ., Klejdus, B., Hedbavny, J., covska, S., Zon, J. (2010) Significance of phenols in cadmium and nickel uptake. Journal of Plant Physiology   168: 576-584.

17.  Krizek, D.T., Kramer, G.F., Upadyaya, A., Mirecki, R.M. (1993)  UV-B response of cucumber seedling grown under metal halide and high pressure sodium/deluxe lamps. Physiol. Plant 88: 350 – 358.

18.  Kar, M., Mishra, D. (1976): Polyphenol oxidase activies during rice leaf senescence. Plant Physiol. 57: 315-319.

19.  Marinova, D., Ribarova, F., Atanassova, M. (2005) Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables. J. Univ. Chem. Technol. Metall. 40: 255-260.

20.  Matsouka, I., Beri, D., Chinou, I., Haralampidis, K., G. Spyropoulos, C. (2011) Metals and selenium induce medicarpin accumulation and excretion from the roots of fenugreek seedlings: a potential detoxification mechanism. Plant soil published online.

21.  Michalak, A. (2006) Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal Stress. Polish J. of Environ. Stud 15: 523-530.

22.  Peralta-Videa, J.R ., Gardea-Torresdey, J.L., Gomez, E., Tiemann, K.J., Parsons, J.G., Carrillo, G. (2002) Effect of mixed cadmium, copper, nickel and zinc at different pHs upon alfalfa growth and heavy metal uptake. Environmental Pollution 119: 291–301.

23.  Pietta, P. G.(2000) Flavonoids as Antioxidants. J. Nat. Prod 63: 1035-1042.

24.  Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I .(2006) Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. TRENDS in Plant Science 12: 29-36.

25.  Sharma, P and Dubey, R. (2005) Lead toxicity in plant. Plant physiology 17: 32-52

26.  Skorzynska-Polit, E., Drakiewicz, M., Wianowskab, D., Maksymieca, W., L.Dawidowiczb, A., Tukiendorfa, A. (2004) The influence of heavy metal stress on the level of some flavonols in the pri mary leaves of Phaseolus coccineus. Acta physiologiae plantarum  26: 247-254.

27.  Snowden, K. C., Gardner, R. C. (1993) Five genes induced by aluminum in wheat (Triticum aestivum L.) roots. Plant Physiology 103: 855-861. 

28.  Singh, A., Eapen, S., Fulekar, M.H. (2008) Potential of Medicago sativa for uptake of cadmium from contaminated environment. Romanian Biotechnological Letters 14 : 4164-4169.

29.  Tripathi, R.D., Mishra, S., Srivastava, S., Kumar, R., Seth, C.S ., Gupta, D.K. (2006) Lead detoxification by coontail (Ceratophyllum demersum L.) involves induction of phytochelatins and antioxidant system in response to its accumulation. Chemosphere  65: 1027–1039.

30.  Verma, S and Dubey R.S. ( 2003) Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Science 164 : 645-655.

31.  Vollenweider, S., Cosio, C., Gunthardt-Georg, M., Keller, C. (2006) Localization and effects of cadmium of cadium- tolerant willow (Salix viminalis) II. Microlocalization and cellular effects of cadmium. Environmental and Experimental Botany 58: 25-40.

32.  Vollenweider, S., Cosio, C., Keller, C. (2006) Localization and effects of cadmium of cadium- tolerant willow (Salix viminalis) I. Macrolocalization and phytotoxic effects of cadmium.Environmental and Experimental Botany 58: 64-74.

33.  Yu, D., Yan, X ., Wang, H ., Wang.  (2006) Response of submerged plant (Vallisneria spinulosa) clones to lead stress in the heterogenous soil. Chemosphere 63 : 1459–1465.