پاسخ شاخص کارایی فتوسنتزی (PI_ABS) نسبت به کمبود نیترات در گیاهان تنباکو (Nicotiana plumbaginifolia) تراریخته شده با ژن ناقل نیترات AtNRT2.1 با استفاده از فلئورسنس کلروفیل a

رضا حسامی و منصور شریعتی^*

اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 8/3/91                 تاریخ پذیرش: 15/10/91 

چکیده

مطالعات بر روی گیاه تنباکو تراریخته شده با ژن AtNRT2.1 مربوط به سیستم ترابری با تمایل بالا HATS (High Affinity Transport System) نشان داده­است که استفاده از روش اندازه­گیری وزن تر و خشک از حساسیت کافی برای نشان دادن تفاوت­های میان گیاهان تراریخته و خودرو برخوردار نیست، ازاین‌رو در این تحقیق از روش حساستر فلئورسنس کلروفیل a استفاده گردید. بدین منظور گیاهان تنباکو خودرو و تراریخته شده با ژنAtNRT2.1  در محیط هیدروپونیک کشت و نیترات در غلظت کم در محدوده فعالیت سیستم  HATSبه محیط کشت افزوده شد. گیاهان مورد سنجش وزن تر، کلروفیل نسبی و شاخص کارایی (PI_ABS) با استفاده از فلئورسنس کلروفیل a قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تفاوت معنی‌داری در وزن تر و کلروفیل نسبی در گیاه خودرو و تراریخته وجود ندارد. تفاوت معنی‌دار پارامتر شاخص کارایی در گیاهان تراریخته نسبت به گیاه خودرو در 4 ساعت اول آزمایش نشان می­‌دهد که این برتری احتمالا ناشی از جذب بهتر نیترات در اثر بیان دائمی ژن انتقالی در ساعات اولیه آزمایش باشد.

واژه‌های کلیدی: نیترات، فلئورسنس کلروفیلa، شاخص کارایی، ژن AtNRT2.1، تنباکو (N. Plumbaginifolia)

* نویسنده مسئول، تلفن: 37932472-031، پست الکترونیکی:  mansour_shariati@yahoo.com

مقدمه

نیتروژن یک عنصر اساسی برای زندگی می‌باشد، زیرا این عنصر یکی از اجزای ساختمانی دو ماکرومولکول مهم بیولوژیک، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌باشد (18). نیتروژن موجود در خاک به اشکال مختلفی شامل نیترات، آمونیوم، اوره، اسیدهای آمینه و غیره وجود دارد. نیترات
(^-NO₃) مهمترین منبع نیتروژن معدنی در خاکهای دارای تهویه کافی می‌باشد (12). گیاهان نیترات مورد نیاز خود را از محلول خاک از خلال غشاء پلاسمایی سلولهای اپیدرمی و کورتکس ریشه جذب می­کنند (12). مطالعات ترمودینامیکی مشخص کرده که حتی در غلظت‌های بالاتر نیترات در خاک، جذب این ترکیب نیازمند یک سیستم فعال ثانویه می‌باشد و مطالعات فیزیولوژیک مدارکی را دال بر جذب نیترات به صورت همراه با پروتون (H⁺) ارائه کرده‌اند. بنابراین جذب نیترات وابسته به فعالیت پمپ پروتون (H⁺-ATPase) می‌باشد (12). بر اساس مطالعات فیزیولوژیکی سه نوع فرایند جذب مختلف برای نیترات یافت شده است، یک سیستم با تمایل پایین بنام LATS (Low Affinity Transport System) که در غلظت‌های بالای نیترات (بیش از 5/0 مولار) فعالیت می‌نماید و دو سیستم با تمایل بالا بنام HATS (High Affinity Transport System) که در غلظت‌های کم نیترات (کمتر از 5/0 مولار) فعالیت می‌نمایند، شامل cHATS که به صورت دائمی (Constitutive) بیان می‌شود و نوع iHATS که به صورت القاءشونده (inducible) با نیترات عمل می‌کند. دو خانواده ژنی NRT1 (Nitrate transporter1) و NRT2 (Nitrate transporter2) در گیاهان عالی یافت شده‌اند که به‌ترتیب مسئول سیستم LATS و HATS می‌باشند. از خانواده ژنی NRT2 دو ژن NRT2.1 و NRT2.2 در جذب نیترات نقش دارند (26). در گیاهان عالی ژن­های خانواده NRT2 در آرابیدوپسیس (11 و 30)، جو (25 و 28)، تنباکو (22)، گندم (29) و سویا (4) شناسایی شده‌اند. در تنباکو یک یا دو ژن از خانواده NRT2 وجود دارد که در ریشه‌ها بیان بالایی دارد (22). در گیاه آرابیدوپسیس که بیشتر مطالعات مربوط به جذب نیترات از طریق HATS در آن انجام شده، هفت ژن از خانواده NRT2 جداسازی شده است که با نامهای AtNRT2.1، AtNRT2.2، AtNRT2.3، AtNRT2.4، AtNRT2.5، AtNRT2.6 و AtNRT2.7 نامگذاری شده‌اند (14 و 30). در این بین NRT2.1 اهمیت بیشتری در جذب نیترات از طریق سیستم iHATS دارد (21). پروتئین NRT2.1 به تنهایی در فرایند جذب نیترات عمل نمی‌کند، بلکه به یک پروتئین دیگر بنام NAR2 که اخیرا AtNRT3.1 (Nitrate transporter 3) نامیده شده است، نیاز دارد؛ که این موضوع در آرابیدوپسیس (20 و 21) نشان داده شده است. گزارش‌ها حکایت از آن دارد که بیان زیاد ژن NRT2.1 در گیاه تراریخته شده تنباکو با ژن NpNRT2.1 (13) و افزایش میزان mRNA مربوط، باعث جذب زیاد نیترات نشده است. از طرفی تحقیقات بر روی گیاه تنباکو تراریخته شده با ژن AtNRT2.1 از گیاه آرابیدوپسیس (1، 2 و 31) حکایت از آن دارد که گیاه تراریخته فقط در دو تا سه ساعت اول، نسبت به نوع خودرو جذب بیشتری دارد و پس از آن تفاوت معنی‌داری در میزان جذب نیترات بین دو نوع گیاه مشاهده نشد. همچنین مقایسه وزن خشک و وزن تر عدم تفاوت معنی‌داری را نشان داد که به نظر می‌رسد مقایسه تغییرات وزن در میزان کم نیترات 100 تا 200 میکرو مولار (در محدوده HATS) نمی‌تواند از حساسیت لازم برای مقایسه گیاه تراریخته با نوع خودرو برخوردار باشد. از طرفی نتایج نشان داده است (3) که در برخی حالات گیاه تراریخته میزان کلروفیل نسبی بیشتری نسبت به نوع خودرو دارد. برخی گزارش‌ها حکایت از آن دارد که فتوسیستم II (PSII) نسبت به شرایط مختلف فیزیولوژیکی و تنشی گیاه (6 و 23) ازجمله کمبود نیترات (7، 9 و 17) حساس است که به نظر می‌رسد با اندازه‌گیری فلئورسنس کلروفیل  a مربوط به PSII و تحلیل پارامترهای آن می‌توان به یک راه‌ حل مناسب برای تحلیل شرایط درونی و واکنش‌های گیاهان مختلف در وضعیتهای مختلف دست یافت. بنابراین به نظر رسید برای بررسی تفاوت گیاه تراریخته شده با ژن AtNRT2.1 از گیاه آرابیدوپسیس نسبت به نوع خودرو از سیستم حساستری مانند شاخص کارایی فتوسنتزی (PI_ABS) از طریق اندازه‌گیری غیر تهاجمی فلئورسنس کلروفیل a استفاده گردد، به‌طوری‌که در طول آزمایش برخلاف سایر آزمایش‌های معمول فیزیولوژیکی مانند عصاره‌گیری و استخراج ترکیبات سلولی، گیاه آسیب ندیده و کاملا در شرایط in vivo بررسی می‌گردد.

مواد و روشها

بذرهای کاشته شده در این تحقیق از آزمایشگاه پروفسور Glass از دانشگاه UBC ونکوور کانادا تهیه شدند و شامل بذرهای خودرو فاقد هر گونه ژن انتقالی، دارای ژن NRT2.1 خودی و بذرهای تراریخته تنباکو لاین B11 (نسل T2) دارای ژن انتقالی NRT2.1 و NAR2 از گیاه آرابیدوپسیس و مارکر ژنی مقاومت به کانامایسین و تحت کنترل پروموتر 35S از ویروس موزائیک گل کلم (CaMV) می‌باشند، که توسط شریعتی در آزمایشگاه UBC ونکوور کانادا و نیز توسط علمی و همکاران (1387) از نظر انتقال و حضور ژن و هموزیگوسیتی مورد تأیید قرار گرفتند (2).

شرایط رشد: بذرهای گیاهان خودرو و تراریخته شده لاین B11 گیاه تنباکو در گلدانهای کوچک با قطر 8 و ارتفاع 7 سانتی‌متر بر روی خاک تجاری پیت ماس حاوی 5/1 گرم کود NPK با نسبت 7/14-5-4/12 کشت شدند. سپس گلدانها به اتاقک کشت با شدت نور 150 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه و رژیم نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای C ° 1±27 روز و C ° 1±24 شب منتقل شدند. ده روز پس از کشت بذرها طی عمل جوانه‌زنی گیاهچه‌ها ظاهر شدند. گیاهچه‌ها به مدت یک ماه در این شرایط رشد کردند تا از لحاظ اندازه و استقامت ساقه برای انتقال به محیط هیدروپونیک به حد مناسب برسند.

محیط هیدروپونیک: در این آزمایش از محیط کشت هیدروپونیک تعدیل شده با غلظت 1/0 جانسون (10) با ترکیبی شامل CaSO₄, 2H₂O (400 میکرو مولار)، H₃BO₃ (5/2 میکرو مولار)، MnSO₄, H₂O (2/0 میکرو مولار)، ZnSO₄, 7H₂O (2/0 میکرو مولار)، CuSO₄, 5H₂O (05/0 میکرو مولار)، Na₂MoO₄, 2H₂O (05/0 میکرو مولار)، FeSO₄, 7H₂O - EDTA (2 میکرو مولار)، MgSO₄, 7H₂O (100 میکرو مولار)، KH₂PO₄ (200 میکرو مولار)، K₂SO₄ (400 میکرو مولار) و Ca(NO₃)₂, 4H₂O (بر حسب نیاز) در تانک‌هایی به گنجایش 15 لیتر استفاده شد. pH محیط هیدروپونیک مذکور در حدود 5/6 نگهداری شد. منبع تأمین ازت مورد نیاز گیاهان، نیترات کلسیم Ca(NO₃)₂ بود که برای آزمایش‌های محدوده HATS مقدار 200 میکرو مولار و آزمایش‌های محدوده LATS مقدار 5 میلی مولار در نظر گرفته شد.

بررسی وزن تر: قبل از افزودن نیترات به محیط کشت در محدوده HATS و بعد از انجام آزمایش‌های مربوط به فلئورسنس، گیاهان از محلول غذایی خارج شدند و بعد آب موجود بر روی سطح ریشه‌ها توسط کاغذ صافی خشک گردید و گیاهان مورد اندازه‌گیری وزنی قرار گرفتند. بدین صورت که وزن تر هر گیاه جداگانه توسط ترازو اندازه‌گیری و ثبت شد. این عمل در 3 تکرار جداگانه و هر کدام شامل 6 گیاه برای هر لاین انجام شد.

طیف‌سنجی فلئورسنس کلروفیل a: برای انجام طیف‌سنجی کلروفیل a از اندازه‌گیری فلئورسنس به روش nonmodulated بسیار سریع با دقت زمان 10 میکروثانیه و به مدت 1 ثانیه استفاده شد. قبل از اندازه‌گیری فلئورسنس ابتدا بخشی از برگ گیاه که مورد اندازه­گیری قرار می‌گیرد با استفاده از گیره­های مخصوص برای 15 دقیقه در تاریکی (dark adapted) قرار گرفته تا همه سیستم‌های نوری از انرژی (الکترون) تخلیه گردند. برای تعیین زمان قرار­گیری در تاریکی، گیاهان به مدت صفر، 10، 15، 20، 25، 30، 35، 40، 50 و 60 دقیقه در تاریکی قرار گرفته و میزان Fv/Fm (بازده کوانتومی اولین واکنش‌های فتوشیمیایی) اندازه‌گیری گردید (16) و با توجه به اینکه پس از 15 دقیقه میزان Fv/Fm ثابت باقی ماند، این زمان انتخاب گردید. برای اندازه‌گیری فلئورسنس با استفاده از لامپ‌های LED دستگاه HandyPEA (Plant Efficiency Analyzer, Hansatech, UK) نور قرمز فوق اشباع فتوسیستم‌ها به مقدار 3200 میکرومول فوتون در مترمربع در ثانیه با طول موج 650 نانومتر به سطح نمونه تابانیده و همزمان فلئورسنس تابیده شده از برگ اندازه­گیری شد. سپس داده­های حاصل توسط نرم‌افزار BiolyzerHP3 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و شاخص کارایی سیستم فتوسنتزی PI_ABS (Performance Index per Absorbance) گیاهان تراریخته و خودرو با استفاده از اندازه‌گیری شاخص‌های: بازده جذب نور (RC/ABS) (Reaction Centre / Absorbance)، کارایی کوانتومی فتوشیمیایی اولیه (TR₀/ABS) (Trapping per Absorbance) و کارایی کوانتومی انتقال الکترون (ET₀/TR₀) (Electron Transport per Trapping) تا آخرین پذیرنده الکترون اندازه­گیری و از فرمول زیر (15) محاسبه گردید.

PI_ABS = (RC/ABS) . [(ET_O/TR_O)/l -(ET_O/TR_O)] . [ET_O/ABS/1-(ET_O/TR_O)]

در این مرحله از هر گیاه 5 برگ به‌ترتیب از بالا (برگ شماره 1) به پایین (برگ شماره 5) مورد طیف‌سنجی قرار گرفت و میانگین 5 برگ به‌عنوان مقدار مربوط به هر گیاه در نظر گرفته شد.

شرایط HATS: گیاهان خودرو و تراریخته شده لاین B11 به صورت مشترک به تانکهای 15 لیتری دارای محیط هیدروپونیک یک دهم جانسون حاوی 500 میکرومولار نیترات منتقل شدند. گیاهان به مدت یک هفته در این شرایط قرار داده شدند و بعد به محیط هیدروپونیک تازه دارای همه ترکیبات غذایی بجز نیترات منتقل شدند تا با ایجاد شرایط محرومیت از نیترات هم ذخایر ازت گیاهان کاهش یابد و هم سیستم القایی iHATS خاموش گردد. بعد از یک هفته، گیاهان برای انجام آزمایشهای اصلی مجدداً به محیط کشت تازه فاقد نیترات منتقل و یک روز به‌منظور سازگاری در محیط جدید قرار داده شدند. سپس 200 میکرومولار نیترات (غلظت مورد نیاز فعالیت سیستم HATS) به محیط کشت اضافه و در زمانهای صفر (بلافاصله پس از افزودن نیترات)، 4 و 24 ساعت از گیاهان طیف فلئورسنس گرفته شد. این مرحله در 3 تکرار جداگانه و هر تکرار شامل 2 تانک 15 لیتری محیط هیدروپونیک هر کدام شامل 3 گیاه خودرو و 3 گیاه تراریخته (در مجموع هر تکرار جداگانه شامل 6 گیاه خودرو و 6 گیاه تراریخته) انجام گردید.

شرایط LATS: علاوه بر آزمایش­های انجام شده در محدوده HATS به‌عنوان مطالعات اضافه و تکمیلی، آزمایشها در محدوده LATS تکرار گردید. بدین منظور پس از انجام آزمایش­های محدوده HATS، گیاهان برای مدت یک هفته به محیط بدون نیترات انتقال یافتند. سپس یک روز قبل از انجام آزمایش به یک محیط هیدروپونیک تازه منتقل شدند. سپس نیترات به غلظت نهایی 5 میلی مولار (غلظت مورد نیاز فعالیت سیستم LATS)، به محیط اضافه و فلئورسنس کلروفیل a در زمانهای صفر (بلافاصله پس از افزودن نیترات)، 4 و 24 ساعت اندازه­گیری گردید. داده­های فلئورسنس کلروفیل a مربوط به هر دو شرایط HATS و LATS بوسیله نرم‌افزار BiolyzerHP3 بررسی گردید.

اندازه‌گیری کلروفیل نسبی: برای بررسی اثر جذب نیترات بر روی محتوای کلروفیل نسبی در گیاهان تراریخته در قیاس با گیاهان خودرو، پس از اندازه‌گیری فلئورسنس کلروفیل a، گیاهان توسط دستگاه اندازه‌گیری محتوای کلروفیل مدل Minolta – SPAD-502(Japan) مورد بررسی محتوای کلروفیل نسبی قرار گرفتند. برای این منظور کلروفیل نسبی در سه نقطه از هر برگ برای 5 برگ از هر گیاه اندازه گیری شد. میانگین اعداد مربوط به محتوای کلروفیل نسبی سه نقطه یک برگ به‌عنوان میانگین کلروفیل نسبی برگ و میانگین اعداد مربوط به کلروفیل 5 برگ یک گیاه به‌عنوان محتوای کلروفیل نسبی هر گیاه محاسبه شد. این عمل برای سه تکرار مستقل هر کدام برای دو تانک حاوی سه گیاه از هر لاین انجام شد.

نتایج

بررسی تأثیر جذب نیترات بر روی وزن تر در شرایط HATS: بررسی اثر جذب نیترات (در غلظت 200 میکرو مولار در محدوده HATS) بر وزن تر گیاهان خودرو و تراریخته در شکل 1 نشان داده شده است. همانطور که مشاهده می‌گردد، نتایج حکایت از عدم تفاوت معنی‌داری بین گیاهان دارای ژن انتقالی (تراریخته) و گیاهان فاقد این ژن (خودرو) از نظر وزن تر دارد.

مطالعه شاخص کارایی (PI_ABS) سیستم فتوسنتزی در شرایط کمبود نیترات در محدوده iHATS: شکل2 مقایسه شاخص کارایی سیستم فتوسنتزی در گیاهان تنباکو تراریخته و خودرو در شرایط کمبود نیترات در محدوده iHATS را در غلظت 200 میکرومولار نیترات نشان می‌دهد. نتایج حکایت از آن دارد که به فاصله 4 ساعت پس از افزودن نیترات میزان شاخص PI_ABS در گیاهان تراریخته نسبت به زمان صفر آزمایش حدود 145 درصد افزایش نشان داده است، که این مقدار در گیاهان خودرو حدود 110 درصد می‌باشد. این تفاوت معنی‌دار بوده و نشان‌دهنده افزایش بیشتر کارایی سیستم فتوسنتزی به میزان تقریبی 32 درصد در گیاهان تراریخته در قیاس با گیاهان خودرو در زمان 4 ساعت می‌باشد. اابته در زمان 24 ساعت این شاخص در گیاهان تراریخته نسبت به خودرو تفاوت معنی‌داری را نشان نمی‌دهد، بنابراین کارایی سیستم فتوسنتزی در دو نوع گیاهان برابر شده است. از طرفی PI_ABS هر دو لاین در زمان 24 ساعت نسبت به زمان 4 ساعت افزایش معنی‌داری را نشان می‌دهد، به‌طوری‌که این افزایش در حدود 35 درصد می‌باشد.

شکل 1- مقایسه وزن تر بین گیاهان خودرو و تراریخته در اثر جذب نیترات     مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد.

شکل 2- مقایسه درصد تغییرات نسبت به زمان صفر PI_ABS (مقدار کارایی سیستم فتوسنتزی تا آخرین پذیرنده الکترون نسبت به واحد جذب نور) بین گیاهان خودرو و تراریخته، 4 و 24 ساعت پس از افزودن 200 میکرو مولار نیترات (در محدوده HATS)

مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد.  

بررسی تغییرات شاخص کارایی (PI_ABS) در طول گیاه از برگ‌های 1 تا 5 (از بالا به پایین): شکل 3 نشان‌دهنده میزان شاخص کارایی (PI_ABS) در طول گیاه از برگهای بالایی به پایینی (شماره 1 تا 5) در گیاهان خودرو و تراریخته می‌باشد. همانطور که ملاحظه می‌گردد در تمام زمانهای مورد بررسی بطور کلی از برگ‌های 1 تا 5 از بالا به پایین میزان PI_ABS کاهش می‌یابد. از طرفی در تمامی برگ‌ها با گذشت زمان میزان PI_ABS افزایش می‌یابد. علاوه بر این در برگ‌های بالایی تفاوت بیشتری در مقادیر PI_ABS بین زمانهای صفر، 4 و 24 ساعت مشاهده می‌شود، بدین صورت که در زمان صفر در برگ اول مقدار PI_ABS حدود 30 می‌باشد، در ادامه با افزودن نیترات در زمان 4 ساعت مقدار شاخص PI_ABS به حدود 50 و در زمان 24 ساعت به حدود 65 رسیده است. اما در برگ پنجم دامنه تغییرات این شاخص نسبت به زمان کمتر می‌باشد و از حدود 10 در زمان صفر به حدود 20 در زمان 24 ساعت می‌رسد. از طرفی در برگ 3 در گیاهان تراریخته میزان PI_ABS نسبت به گیاهان خودرو در تمام زمانهای مورد بررسی تفاوت معنی‌داری دارد. همین روند در برگ 4 نیز (بجز در زمان صفر) مشاهده می‌شود.

مطالعه شاخص کارایی فلئورسنس کلروفیل a (PI_ABS) در اثر تیمار با نیترات در محدوده LATS: شکل 4 درصد تغییرات شاخص کارایی (PI_ABS) گیاهان تنباکو لاین‌های خودرو و تراریخته در زمانهای صفر، 4 و 24 ساعت پس از افزودن نیترات به مقدار 5 میلی مولار (در محدوده LATS) به محلول غذایی آنها را نشان می‌دهد.

شکل 3- تغییرات PI_ABS (شاخص کارایی) در طول گیاه از برگهای بالا به پایین در گیاهان خودرو و تراریخته، در زمان صفر، 4 و 24 ساعت پس از افزودن 200 میکرومولار نیترات (در محدوده HATS)

مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4- مقایسه درصد تغییرات نسبت به زمان صفر PI_ABS (مقدار کارایی سیستم فتوسنتزی تا آخرین پذیرنده الکترون نسبت به واحد جذب نور) بین گیاهان خودرو و تراریخته در اثر تیمار با 5 میلی مولار نیترات (در محدوده LATS)   مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد. 

مطابق این شکل در زمان 4 ساعت در هر دو لاین نسبت به زمان صفر آزمایش حدود 10 درصد افزایش در شاخص PI_ABS مشاهده می‌شود، اما اختلاف معنی‌داری بین گیاهان تراریخته و خودرو از نظر کارایی سیستم فتوسنتزی وجود ندارد. نتایج مربوط به زمان 24 ساعت نیز حکایت از عدم تفاوت معنی‌داری بین گیاهان تراریخته و خودرو از نظر افزایش کارایی سیستم فتوسنتزی دارد. علاوه بر این، در زمان 24 ساعت نسبت به زمان صفر حدود 50 درصد و نسبت به زمان 4 ساعت حدود 40 درصد افزایش در PI_ABS گیاهان تراریخته و خودرو مشاهده می‌شود.

شکل 5- مقایسه محتوای کلروفیل نسبی در گیاهان تراریخته در قیاس با گیاهان خودرو تنباکو در پاسخ به جذب نیترات در محدوده LATS (با غلظت نهایی 5 میلی مولار)    مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد.

اندازه‌گیری محتوای کلروفیل نسبی در گیاهان خودرو و تراریخته در اثر جذب نیترات در محدوده LATS: شکل 5 مقایسه محتوای کلروفیل نسبی گیاهان تراریخته و خودرو را نشان می‌دهد. همانگونه که ملاحظه می‌گردد، در گیاهان تراریخته محتوای کلروفیل نسبی افزایش معنی‌داری را نسبت به گیاهان خودرو نشان نمی‌دهد. شکل 6 نشان‌دهنده محتوای کلروفیل نسبی در طول گیاه از برگهای بالایی به پایینی پس از افزودن نیترات به محیط غذایی گیاهان در محدوده LATS می‌باشد. همانطور که ملاحظه می‌گردد محتوای کلروفیل نسبی در طول گیاهان تراریخته و خودرو از بالا به پایین از برگهای 1 تا 5 کاهش می‌یابد که از برگ 3 به بعد مشهودتر است. مطابق این شکل فقط در برگ 5 اختلاف معنی‌داری بین گیاهان خودرو و تراریخته وجود دارد و در برگهای 1 تا 4 تفاوت معنی‌داری بین دو لاین مشاهده نمی‌گردد، به‌طوری‌که میانگین همه برگهای گیاهان تفاوت معنی‌داری را نشان نمی‌دهد.

شکل 6- مقایسه محتوای کلروفیل نسبی در طول گیاه از برگهای 1 تا 5 از بالا به پایین در اثر تیمار با نیترات در محدوده LATS (با غلظت نهایی 5 میلی مولار)   مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از روش آزمون t-test به صورت دو به دو جداگانه و در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار 5 درصد انجام شده است. *: بیانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد.