اثر محرک­های اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات بر میزان تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در ریشه­های مویین شیرین‌بیان ((Glycyrrhiza glabra L. 

زهرا شیرازی¹، خسرو پیری^1*، اصغر میرزایی اصل¹، طاهره حسنلو² و طیبه قیاسوند³ 

¹ همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی 

² کرج، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، گروه فیزیولوژی مولکولی 

³ همدان، دانشگاه علوم پزشکی، مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی

تاریخ دریافت: 13/11/90             تاریخ پذیرش: 11/4/91 

چکیده

در این پژوهش اثر محرک­های اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات روی سرعت رشد و تولید متابولیت­های ثانویه در ریشه­های مویین شیرین‌بیان مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به اهمیت متابولیت­های ثانویه گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین موجود در ریشه­های این گیاه، از روش القاء ریشه­های مویین تراریخت استفاده شد. کشت ریشه­های مویین با تلقیح ریزنمونه­های برگ و ساقه از گیاهچه­های سه هفته­‌ای با آگروباکتریوم ریزوژنز ایجاد شد. حضور T-DNA در لاین­های ریشه مویین توسط PCR تأیید گردید. اثر محرک اسید سالیسیلیک سبب افزایش تولید گلیسیریزین شد. نتایج آزمون همبستگی، رابطه معکوسی بین وزن خشک و مقدار گلیسیریزین را در نتیجه تیمار با اسید سالیسیلیک نشان داد. بیشترین مقدار گلیسیریزین و کمترین مقدار وزن خشک در غلظت 500 میکرومولار حاصل شد .تیمار ریشه­های مویین با اسید سالیسیلیک باعث کاهش معنی­دار ایزولیکویریتیجنین شد. همچنین نتایج نشان داد، استفاده از متیل جاسمونات باعث کاهش تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین می­شود.

واژه­های کلیدی: شیرین‌بیان، ریشه­های مویین، گلیسیریزین، ایزولیکویریتیجنین، محرک­ها

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188130783، پست الکترونیکی   khpiri@gmail.com

مقدمه

شیرین‌بیان ((Glycyrrhiza glabra L. از گیاهان دارویی تیره نخودیان (Fabaceae) می­باشد. اندام مورد مصرف آن ریشه و استولون است که دارای ترکیباتی مانند تری­ترپن­ساپونین­ها، چالکون­ها و 300 نوع فلاونوئید می­باشد (2، 3 و11). بسیاری از اثرات درمانی ریشه شیرین‌بیان بعلت دو گروه از ترکیبات ساپونینی و فلاونوئیدی است (28). استفاده از شیرین‌بیان در اختلالات کبدی حاد، هپاتیت B و C مزمن، هموفیلی و اختلالات سیستم ایمنی مؤثر می­باشد. ترکیب گلیسیریزین در صنایع غذایی و همچنین در درمان اختلالات ریوی، گوارشی، کبدی، صفراوی و زخم­های معده استفاده می­شود (13 و 45). از عصاره آن داروهایی مانند (Aspalon)^R و Glycyron)^R) تولید می­شود (9، 19 و 28). ایزولیکویریتیجنین چالکونی ساده و پیش ماده تولید ترکیبات فلاونوئیدی است و دارای اثرات استروژنی، آنتی‌اکسیدان، ضد حساسیت و ضد التهاب بوده و به‌عنوان داروی ضد سرطان و مؤثر در درمان آریتمی می‌باشد (18). با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت­های ثانویه کند می­باشد، استفاده از روش­های بیوتکنولوژی در شرایط این ویترو (in vitro) این موقعیت را فراهم می­سازد که تولید در شرایط کنترل شده و در زمان کوتاه­تری انجام گیرد (36 و 44). در برخی از روش­های بیوتکنولوژی مانند کشت سلول و سوسپانسیون سلولی نیز مقدار تولید متابولیت­های ثانویه بدلیل عدم تمایز بافت کم است و برخی از متابولیت­ها فقط در بافت­هایی که تمایز مورفولوژیکی نشان می­دهند، تجمع می­یابند. ازجمله روش­های کشت تمایز یافته، کشت ریشه می­باشد (1 و 8). کشت ریشه بصورت ریشه­های نابجا و ریشه­های تراریخت انجام می­شود (15). سیستم کشت ریشه در گیاهان معمولا سرعت رشد کمتری نشان داده و نیاز به فیتوهورمونی خارجی دارد (4). روش جایگزین برای تولید مواد دارویی با منشأ ریشه، تراریختی گیاهان با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنز و ایجاد سیستم کشت ریشه مویین می‌باشد (17 و 44). این باکتری از محل زخم وارد گیاه شده و با انتقال قطعهT-DNA  پلاسمید Ri به درون ژنوم سلول گیاهی، ریشه­های نئوپلاستیک را در گیاه ایجاد می­کند (14، 16، 40، 43 و 49). سرعت رشد بالا، انشعابات فراوان، نگهداری آسان در محیط عاری از هورمون­های گیاهی، پایداری ژنتیکی و بیوسنتزی از مزایای کشت ریشه­های مویین می­باشد (1، 16، 23، 27 و 40). بدلیل مقدار پایین تولید متابولیت با استفاده از تکنولوژی کشت بافت، از روش­های متعددی برای جبران آن استفاده می­گردد (23). یکی از روش­ها استفاده از محرک­ها (Elicitors) می­باشد که معمولا باعث تسریع در تشکیل متابولیت­های ثانویه می­شوند (35). مکانیسم­های دفاعی گیاه با شناسایی این سیگنال­ها (محرک) بوسیله گیرنده­های موجود در غشای پلاسمایی و تولید ترکیبات اسید جاسمونیک و اسید سالیسیلیک اندوژن فعال می­شود. فعال شدن پاسخ دفاعی سبب سنتز پروتئین­های مرتبط با مکانیسم­های دفاع سلولی و القاء تولید متابولیت­های ثانویه با ایجاد یکسری تغییرات سلولی می­گردد (42). در بیشتر موارد اضافه­کردن محرک­ها در غلظت­های کم به سیستم­های سلولی، بیوسنتز ترکیبات خاصی را تحریک و یا بهبود می­بخشد (32 و 34). با توجه به نوع گیاه و نوع متابولیت مورد نظر، می­توان از عصاره­های استخراج شده از ارگانسیم­ها و یا از برخی مواد شیمیایی به‌عنوان محرک استفاده نمود (12). در این تحقیق از دو محرک متیل جاسمونات و اسید سالیسیلیک به‌منظور بررسی تولید گلیسیریزین، ایزولیکویریتیجنین و سرعت رشد ریشه­های مویین شیرین بیان استفاده شد که این دو محرک در القاء و سنتز متابولیت­های ثانویه ریشه­های تراریخت بسیاری از گونه­های گیاهی مؤثر می­باشند.

مواد و روشها

القاء ریشه­های مویین: بذرهای گیاه شیرین‌بیان از شرکت پاکان بذر اصفهان (منطقه ورزنه اصفهان) تهیه گردید و بذرها به مدت 40 دقیقه در اسید سولفوریک غلیظ (98 در صد) قرار گرفتند، سپس چندین بار با آب مقطر استریل آبکشی شده و پس از آن روی محیط MS (31) نیمه جامد کشت شدند. برای تهیه کشت سوسپانسیون باکتری، از آگروباکتریوم ریزوژنز سویه AR15834 که از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج تهیه گردید، استفاده شد. برای تلقیح ریزنمونه­های بدست آمده از گیاهچه­های یک کلونی از باکتری کشت شده در محیط کشت جامد LB در شرایط استریل برداشته شد (37) و در محیط کشت مایع LB دارای آنتی‌بیوتیک ریفامپسین کشت گردید. در مرحله بعد محیط LB مایع آلوده شده به باکتری به اتاق رشد با دمای °C 28 منتقل شد و روی شیکر با سرعت 110 دور در دقیقه به مدت 24 ساعت در شرایط تاریکی قرار گرفت تا باکتری رشد کرده و فعال شود. برای تراریختی، جذب نوری در طول موج 600 نانومتر حدود 6/0 تنظیم گردید. ریزنمونه­های برگ و ساقه از گیاهچه­های سه هفته­ای به مدت 20 دقیقه در سوسپانسیون باکتری قرار گرفتند، سپس به محیط کشت MS نیمه جامد منتقل شدند و در اتاق رشد در دمای °C 2±25 و و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. 48 ساعت بعد از هم‌کشتی برای حذف باکتری، ریزنمونه‌ها به محیط نیمه جامد MS دارای 500 میلی­گرم در لیتر سفوتاکسیم منتقل گردیدند. برای حذف کامل باکتری در واکشت­های بعدی از غلظت­های پائین­تر سفوتاکسیم استفاده گردید. تراریختی ریشه­های مویین را می­توان با ردیابی ژن­های موجود روی T-DNA این باکتری که مهمترین آنها ژن­های rolA، rolB وrolC  می­باشند، تأیید نمود. تأیید تراریختی ریشه­های مویین شیرین‌بیان از طریق تکنیک PCR و پس از اطمینان از حذف باکتری در ریشه­ها انجام شد. بدین منظور ابتدا استخراج DNA از ریشه­های مویین و طبیعی گیاه با استفاده از بافر استخراج CTAB انجام شد. تکثیر ژن  rolB با آغازگرهای اختصاصی

Forward  primer  5'- ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA -3' 

Reverse  primer  5'- TTAGGCTTC TTTCATTCGGTTTACTGCAGC -3'

و برای 37 چرخه شامل واسرشت در دمای °C 94 به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای °C58 به مدت 1 دقیقه و گسترش در دمای °C 72 به مدت 1 دقیقه انجام شد. در نهایت بعد از تأیید مولکولی ریشه­های مویین یک لاین برای بررسی اثر محرک­ها انتخاب شد.

اثر محرک­ها بر سرعت رشد و محتوای تولید متابولیت­های ثانویه: بعد از تهیه محیط کشت MS مایع، در ارلن­های 250 میلی لیتری به مقدار 50 میلی لیتر از محیط توزیع شد و عمل استقرار ریشه‌های (3-2) سانتی‌متری دارای انشعاب (با وزن خشک حدود 5-4 میلی‌گرم) در محیط مایع انجام گردید. همه نمونه­ها برای ادامه رشد روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه قرار گرفتند. بعد از پایان دوره 55 روزه، به‌منظور بررسی تأثیر محرک­ها در رشد ریشه­ها و تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین، محرک­های متیل جاسمونات در 4 غلظت (200، 100، 50، 0 میکرو مولار) و اسید سالیسیلیک در 4 غلظت (500، 250، 125، 0 میکرو مولار) به محیط کشت اضافه گردید و ریشه­ها به مدت 72 ساعت در محیط حاوی محرک­ها قرار گرفتند. برای تعیین سرعت رشد ریشه­ها بر اساس وزن خشک تولید شده، ریشه­ها برداشته شده و پس از خشک شدن کامل اندازه­گیری شدند. برای اندازه­گیری گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین ابتدا ریشه­ها به روش هایاشی و همکاران (21) عصاره­گیری شدند و بررسی کمی به وسیله دستگاه HPLC انجام شد. کلیه نتایج در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 16 آنالیز شد. استاندارد گلیسیریزین از شرکت فلوکا و ایزولیکویریتیجنین از شرکت ایندو فاین تهیه گردید. نمونه­ها برای اندازه­گیری گلیسیریزین به روش هارست و همکاران (24) بعد از حل شدن در آب مقطر به دستگاه  HPLCبا مشخصات ستون ( mm9/3×150) RPC18، اندازه منافذ 5 میکرومتر و فاز متحرک شامل اسید استیک، آب و متانول به‌ترتیب به نسبت 6: 34 :60 انجام شد. برای ایزولیکویریتیجنین به روش لیو و همکاران (29) بعد از حل شدن در متانول 100 درصد به دستگاه با مشخصات ستون ( mm6/4×250RPC18 (، اندازه منافذ 5 میکرومتر و فاز متحرک شامل اسید استیک (یک درصد) و استونیتریل به نسبت 55 : 45 تزریق شد.

شکل1- کشت ریشه­های مویین شیرین بیان در محیط مایع

نتایج  

القاء ریشه­های مویین: گیاه شیرین­بیان با تلقیح به سویهAR15834 باکتری آگروباکتریوم ریزوژنز پاسخ مثبت نشان داد و استفاده از این سویه باعث تولید ریشه­های مویین در ریزنمونه­ها شد. ریشه­های مویین تولید شده از نظر مورفولوژی خصوصیاتی از قبیل رشد سریع، انشعابات فرعی زیاد در محیط فاقد هورمون را از خود بروز دادند و به­راحتی از ریشه­های معمولی قابل تشخیص بودند. ریشه­های مویین پس از انتقال به محیط MS مایع سریع­تر از نمونه­های کشت شده روی محیط نیمه جامد مشابه رشد کردند (شکل 1).

تأیید تراریختی ریشه­های مویین: الکتروفورز ژل آگارز محصولات PCR در دستگاه ژل داکیومنت مشاهده شد. برای هر یک از نمونه­های ریشه مویین و پلاسمید باکتری (شاهد مثبت) تک باند مشاهده گردید (شکل 2).

بررسی اثر اسید سالیسیلیک بر تولید متابولیت­های ثانویه و وزن خشک ریشه­های مویین: تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که غلظت­های مختلف اسید سالیسیلیک بر تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در سطح احتمال یک درصد تأثیر معنی­داری داشت. مقایسه میانگین وزن خشک ریشه­های مویین تیمار شده با اسید سالیسیلیک تفاوت معنی­داری را در سطح احتمال یک درصد نشان نداد ولی در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی­داری مشاهده شد (جدول 1).

اسید سالیسیلیک باعث افزایش معنی­دار در تولید گلیسیریزین شد و بیشترین مقدار گلیسیریزین بر اثر تیمار با 500 میکرو­مولار اسید سالیسیلیک بدست آمد. در غلظت­های پایین­تر اسید سالیسیلیک میزان تولید گلیسیریزین تفاوت معنی­داری با شاهد نداشت. تیمار ریشه­های مویین با اسید سالیسیلیک باعث کاهش معنی­دار ایزولیکویریتیجنین شد. البته کمترین مقدار این ماده در 500 میکرو­مولار بدست آمد.

جدول1- مقایسه میانگین میزان تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین به روش  Duncanدر غلظت­های مختلف اسید سالیسیلیک در سطح احتمال 1 درصد و وزن خشک در سطح احتمال 5 درصد

                           0                          ^ab 6/280                          ^b 83/27                           ^a 36/90

125                        ^a 337                              ^b 52/10                           ^b 73/23

250                        ^a 55/321                          ^b 95/17                           ^b 42/25

آزمون وزن خشک در سطح احتمال 1 درصد معنی دار نشد

جدول2- آزمون همبستگی بین وزن خشک، مقدار گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین بر اثر تیمار با اسید سالیسیلیک

                                                                          گلیسیریزین           ایزولیکویریتیجنین         وزن خشک

                               گلیسیریزین                1

                                      ایزولیکویریتیجنین          267/0-                    1

                                           وزن خشک            ^٭٭993/0 -               150/0                         1

جدول3- مقایسه میانگین وزن خشک، میزان تولید گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین به روش Duncan در غلظت­های مختلف متیل جاسمونات در سطح احتمال 1 درصد

                                     0                                 ^a6/280                         ^a 83/27                           ^a 36/90

                                     50                                ^a 6/234                        ^ab 77/16                          ^b 16/14

100                                ^a 8/431                        ^a 05/20                            ^b 73/8

اگر­چه کمترین مقدار ایزولیکویریتیجنین در غلظت 500 میکرو­مولار اسید سالیسیلیک حاصل شد ولی در این غلظت رنگ محیط بر خلاف تیمار با سایر غلظت­ها تغییر نمود و بافت ریشه، قهوه­ای و نرم شد که ممکن است در این غلظت فلاونوئیدها از جمله ایزولیکویریتیجنین وارد محیط کشت شده­باشند (شکل3). برای پاسخ دقیق­تر نیاز به بررسی مولکولی همزمان ژن­های مسیر تولید ایزولیکویریتیجنین در این غلظت می­باشد.

شکل2- نتایج ژل محصولات  PCRریشه­های مویین شیرین بیان. چاهک شماره1: مارکر مولکولی (Kb1)، چاهک شماره :7 پلاسمید باکتری، چاهک شماره 9: ریشه طبیعی، چاهک شماره 2: آب مقطر و بقیه چاهک­ها: ریشه های مویین