نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 فراغ التحصیل کارشناسی ارشد دانشگاه اصفهان
2 دانشگاه سیستان و بلوچستان
3 دانشگاه اصفهان
چکیده
جلبک Dunaliella توانایی ذخیره کردن حجم بالایی از بتاکاروتن را خود در شرایط نامناسب دارند. در این تحقیق، سوسپانسیونهای جلبکی از گونههای D. bardawil و D. salina در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دمای 25 درجه سانتیگراد کشت داده شدند و پس از افزایش میزان بتاکاروتن سلولی پس از 2 هفته، نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد منتقل و پس از 8 ساعت مجدداً به دمای 25 درجه سانتیگراد انتقال و میزان کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a نمونهها اندازهگیری و شاخصهای مربوط به آن ارزیابی شد. نتایج نشان داد که میزان بتاکاروتن در D. bardawil به ویژه در غلظت 3 مولار نمکی بیشتر از D. salina است. همچنین پس از انتقال به دمای 25 درجه سانتیگراد شاخصهای FV/Fo (کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II)،φPo (انتقال الکترون به فئوفیتین وQA)، ψo (انتقال الکترون از QA به QB)، φEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II)، φRo (میزان احیای پذیرنده انتهایی زنجیر انتقال الکترون در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I) و φDo (میزان اتلاف انرژی) در D. bardawil تغییرات کمتری نسبت به D. salina در محیط 3 مولار نمکی از خود نشان دادند. با توجه به نتایج به نظر میرسد، در محیطهای حاوی غلظت بالای نمک، D. bardawil هنگامی که از دمای صفر درجه سانتیگراد به 25 درجه سانتیگراد منتقل میشود با کارایی بهتری به حالت طبیعی اولیه باز میگردد. در چنین شرایطی D. bardawil در قیاس با D. salina توانایی بیشتری در تجمع بتاکاروتن و در پی آن حفاظت از مراکز واکنش PSII دارد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Relationship between ß-carotene accumulation and cold stress resistance in unicellular green alga Dunaliella using Chl-a fluorescence kinetic
نویسندگان [English]
چکیده [English]
Unicellular green alga Dunaliella has capability to accumulate massive beta-carotene in its chloroplasts under unsuitable conditions. In this study D.bardawil and D.salina were cultured on mediums containing 1M, 2M and 3M of NaCl at 25°C in six replicate. After two weeks, when beta-carotene content was increased, samples were transferred to 0°C and after 8h they were returned to 25°C. Then parameters of Chl-a fluorescence was measured and its parameters were evaluated. According to the result, amount of beta-carotene in D. bardawil especially in 3M NaCl was higher than D. salina. In addition, analysis of fluorescence parameters such as FV/Fo (activity of the water-splitting complex), φPo (electron transport to pheophytin and QA), ψo (electron transport from QA to QB), φEo (electron transport in electron transport chain), φRo (reduction rate of end acceptor of electron transport chain) and φDo (rate of energy dissipation) indicated less changes in D. bardawil than D. salina in 3M NaCl when return to 25°C. According to the result, it seems that in the medium containing high concentration of NaCl, D. bardawil has better recovery when transferred from 0°C to 25°C. In such condition, D. bardawil is able to accumulate more beta-carotene than D. salina and in turn is able to protect PSII reaction centers.
کلیدواژهها [English]
بررسی رابطه بین تجمع بتاکاروتن و مقاومت به تنش سرما با استفاده از کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a در جلبک سبز تک سلولی Dunaliella
مرضیه پائیزی1، علیرضا عینعلی2 و منصور شریعتی1*
1 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2 زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 3/11/90 تاریخ پذیرش: 12/2/91
چکیده
بتاکاروتن در شرایط نامناسب رشدی ازجمله شدت بالای نور، غلظتهای بالای نمک، دماهای پایین یا بالا و کمبود نیترات در کلروپلاست گیاهان عالی و جلبکهای سبز ذخیره شده از دستگاه فتوسنتزی، بهویژه فتوسیستم II (PSII) محافظت میکند. جلبک سبز تکسلولی Dunaliella بهویژه گونههای D. bardawil و D. salina توانایی ذخیره کردن حجم بالایی از بتاکاروتن را در کلروپلاست خود در شرایط نامناسب دارند. در این تحقیق، برای بررسی نقش بتاکاروتن در مقاومت به تنش سرما در جلبک Dunaliella، سوسپانسیونهای جلبکی از گونههای D. bardawil و D. salina در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دمای 25 درجه سانتیگراد در شش تکرار کشت داده شدند و پس از افزایش میزان بتاکاروتن سلولی و اندازهگیری میزان آن، پس از 2 هفته، نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد منتقل شده، پس از 8 ساعت دوباره به دمای 25 درجه سانتیگراد انتقال یافتند. سپس میزان کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a نمونهها اندازهگیری و شاخصهای مربوط به آن ارزیابی شد. نتایج نشان داد که میزان بتاکاروتن در D. bardawil بهویژه در غلظت 3 مولار نمکی بیشتر از D. salina است. همچنین پس از انتقال به دمای 25 درجه سانتیگراد شاخصهای FV/Fo (کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II)،φPo (انتقال الکترون به فئوفیتین وQA)، ψo (انتقال الکترون از QA به QB)، φEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II)، φRo (میزان احیای پذیرنده انتهایی زنجیر انتقال الکترون در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I) و φDo (میزان اتلاف انرژی) در D. bardawil تغییرات کمتری نسبت به D. salina در محیط 3 مولار نمکی از خود نشان دادند. با توجه به نتایج به نظر میرسد، در محیطهای حاوی غلظت بالای نمک، D. bardawil هنگامی که از دمای صفر درجه سانتیگراد به 25 درجه سانتیگراد منتقل میشود با کارایی بهتری به حالت طبیعی اولیه باز میگردد. در چنین شرایطی D. bardawil در قیاس با D. salina توانایی بیشتری در تجمع بتاکاروتن و در پی آن حفاظت از مراکز واکنش PSII دارد.
واژههای کلیدی: بتاکاروتن، تنش سرما، دونالیلا، فتوسیستم II، کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a
* نویسنده مسئول، تلفن: 37932472-031، پست الکترونیکی: mansour_shariati@yahoo.com
مقدمه
دمای پایین، بهعنوان عاملی تنشزا در محیط پیرامون گیاهان، میتواند سرعت فرایندهای بیوشیمیایی سلولها را به صورت متفاوتی تحت تأثیر قرار دهد و در نتیجه منجر به ایجاد عدم تعادل در فرایندهای اصلی مسیرهای متابولیک شود (26). فتوسنتز جزو اولین فرایندهایی است که در گیاهان عالی و جلبکهای سبز تحت تأثیر دمای پایین قرار میگیرد (9). به علت سرعت بیشتر واکنشهای فتوشیمیایی اولیه در فتوسیستم II و I نسبت به انتقال الکترون و واکنشهای بیوشیمیایی فتوسنتز، حضور موجودات فتوسنتزکننده در محدودهای از انرژی نورانی که بیش از نیاز فرایند فتوسنتز است، به عدم تعادل انرژی و به طور کلی بازدارندگی نوری (photoinhibition) منجر میشود (13). حساسیت واکنشهای بیوفیزیکی فتوسنتز نسبت به تنش سرما بهمراتب کمتر از واکنشهای بیوشیمیایی است. کلروفیلها جذب فوتونهای نوری را همچنان در دمای پایین ادامه میدهند، در حالی که انتقال انرژی از طریق الکترونها به ترکیبات پذیرنده الکترون با سرعت کافی انجام نمیشود (15). همچنین، تنش سرما ظرفیت تثبیت CO2 را کاهش میدهد. در نتیجه دمای پایین، شدت نور بهینه را که برای اشباع فتوسنتز (saturation irradiance) مورد نیاز است، کاهش میدهد (16). زمانی که انرژی نورانی به دام افتاده از میزان انرژی لازم برای تبدیل به انرژی شیمیایی بیشتر باشد، فتوسیستم II (PSII) دستگاه فتوسنتزی آسیب میبیند. علاوه بر آن، بازدارندگی نوری ایجاد شده در اثر کاهش دما، به تشکیل گونههای فعال اکسیژن، از طریق احیا مولکول O2 به سوپراکسید (O2-·) یا از طریق انتقال انرژی از کلروفیل تحریک شده سهتایی (triplet) به مولکول O2 و تشکیل مولکول اکسیژن یکتایی منجر میشود. تولید گونههای فعال اکسیژن در این شرایط، میتواند باعث آسیب بیشتر دستگاه فتوسنتزی، بهویژه زنجیره انتقال الکترون PSII شود (10 و 13).
موجودات فتوسنتزکننده ازجمله گیاهان و جلبکهای سبز با استفاده از مکانیسمهای سازشی مانند افزایش تولید و عملکرد آنتیاکسیدانها (نظیر آسکوربات، گلوتاتیون و آنزیم سوپر اکسید دسموتاز) به سیستمهای فتوشیمیایی و بیوشیمیایی خود اجازه تطبیق با شرایط تنشزا را میدهند (17 و 18). یکی از ترکیبات آنتیاکسیدان، رنگیزه آروماتیک بتاکاروتن است که در شرایط نامناسب رشدی در کلروپلاست گیاهان عالی و جلبکهای سبز ذخیره شده و از طریق خاموشسازی مولکول کلروفیل تحریک شده تریپلت و حفظ پایداری کمپلکسهای رنگیزه-پروتئین در غشا تیلاکوئیدها و یا از طریق جذب نور در شدتهای بالای نور بهعنوان یک فیلتر نوری از دستگاه فتوسنتزی بهویژه PSII محافظت میکند (14، 29). جلبک سبز تک سلولی Dunaliella، بهویژه گونههای D. bardawil و
D. salina توانایی ذخیره کردن مقدار قابل توجهی از بتاکاروتن در کلروپلاست خود را در شرایط نامناسب محیطی مانند شدت بالای نور، غلظتهای بالای نمک (8)، دماهای پایین یا بالا (4 و 5)، کمبود مواد غذایی مانند نیترات و سولفات (1 و 2) و همچنین غلظت بالای فلزات سنگین نظیر مس و کادمیوم را دارد (22 و 23). توانایی بتاکاروتن در خاموشسازی گونههای فعال اکسیژن باعث شده است که کاربرد آن بهعنوان آنتیاکسیدان برای پیشگیری و مقابله با سرطانها بررسی شود (6). با توجه به خصوصیات منحصر به فرد جلبک Dunaliella در تجمع بتاکاروتن، روشهای بیوتکنولوژی برای افزایش میزان بتاکاروتن در مقیاس صنعتی در این جلبک طراحی شده است (11 و 12). در حال حاضر، از بتاکاروتن جلبک Dunaliella به طور گستردهای در صنایع غذایی و دارویی استفاده میشود.
با توجه به نقش بتاکاروتن بهعنوان یک آنتیاکسیدان در جاروب کردن گونههای فعال اکسیژن و حفاظت از رنگیزههای فتوسنتزی در گیاهان و جلبکهای سبز تحت شرایط نامساعد محیطی و همچنین توانایی جلبک Dunaliella در تجمع این رنگیزه در شرایط تنشزا، بررسی نقش بتاکاروتن در مقاومت یا عدم مقاومت جلبک Dunaliella به تنش سرما و تأثیر آن در حفاظت از PSII جلبک Dunaliella تحت این شرایط بهعنوان هدف این تحقیق در نظر گرفته شد.
مواد و روشها
تهیه سوسپانسیون جلبکی از جلبک Dunaliella : گونههای D. bardawil سویه UTEX 2538 و D. salina سویه UTEX 200 از کلکسیون دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه گردید. تلقیح گونههای مورد نظر در ارلنهای حاوی 100 میلیلیتر محیط کشت اصلاح شده جانسون (21) با 6 تکرار، در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl و اسیدیته 7-5/7، به صورتی انجام شد که تعداد سلولها در هر ارلن تقریباً 104*24 در هر میلیلیتر از سوسپانسیون جلبکی باشد. سپس سوسپانسیونهای تهیه شده در دمای 25 درجه سانتیگراد در اتاقک کشت و در شدت نور 100 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه به مدت 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی بر روی شیکر (Heidolph UNIMAX 2010) با سرعت 96 دور در دقیقه قرار گرفتند.
پس از گذشت 2 هفته، سوسپانسیونهای جلبکی به دمای صفر درجه سانتیگراد منتقل و پس از 8 ساعت دوباره به دمای 25 درجه سانتیگراد انتقال یافتند.
اندازهگیری میزان بتاکاروتن: برای اندازهگیری میزان بتاکاروتن سلولی، پس از گذشت 2 هفته، از سوسپانسیونهای جلبکی مورد مطالعه نمونهبرداری انجام شد. یک میلیلیتر از محلول نمونهبرداری شده به میکروفیوژتیوپ منتقل و توسط دستگاه سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه با دور g13000 سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به طور کامل خارج و به رسوب باقی مانده در ته میکروفیوژتیوپ، یک میلیلیتر استون 80% اضافه شد و توسط ورتکس به خوبی با رسوب جلبکی مخلوط گردید. دوباره عمل سانتریفیوژ به مدت 2 دقیقه تکرار شد. محلول رویی برای اندازهگیری میزان بتاکاروتن از میکروفیوژتیوپ استخراج و میزان جذب آن با استفاده از دستگاه اسپکترومتر (Shimadzu UV-160A) در طول موجهای 412، 431، 460 و 480 نانومتر قرائت شد. در نهایت با استفاده از فرمولهای مربوطه، میزان بتاکاروتن بر حسب میکروگرم در سلول محاسبه گردید و منحنی آنها بر حسب زمان رسم شد (7).
اندازهگیری کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a : برای بررسی نقش بتاکاروتن در محافظت از PSII جلبک
D. salina تحت تنش سرما، عملکرد PSII این جلبک با استفاده از اطلاعات حاصل از کینتیک فلوئورسنس کلروفیل a که از نوردهی نمونههای سازگار شده به تاریکی منتشر میشود، ارزیابی شد. به این منظور، نمونهبرداری از سوسپانسیونهای جلبکی 4 ساعت پس از انتقال آنها از دمای صفر درجه به دمای 25 درجه سانتیگراد، در شرایط کاملاً استریل انجام شد. برای اندازهگیری فلوئورسنس کلروفیل a، یک میلیلیتر از محلول نمونهبرداری شده به شیشه مخصوص اندازهگیری فلوئورسنس منتقل شد و بعد شیشهها به مدت 10 دقیقه در تاریکی نگهداری شدند. انتشار فلوئورسنس کلروفیل a با استفاده از دستگاه Handy PEA (Plant Efficiency Analyser, Hansatech, UK) در یک اتاقک کاملاً تاریک ثبت گردید. اطلاعات اولیه حاصل از کینتیک فلوئورسنس (مانند Fo، FM، FJ)، با استفاده از روش OJIP-test به شاخصهای بیوفیزیکی (مانند FV/Fo، φPo، φEo، ψo، φRo و φDo که تعاریف آنها در جدول 1 ذکر شده است) تبدیل شده و در نهایت با استفاده از نرمافزار HP4 Boilyzer، شاخصهای ذکر شده برای بررسی عملکرد فتوسیستم II ارزیابی و نمودارهای مربوط به آنها رسم شد (24 و 25).
جدول 1- خلاصهای از شاخصهای OJIP-test، حاصل از اطلاعات اولیه استخراج شده از کینتیک فلوئورسنس
شاخصهای اولیه کینتیک فلوئرسنس کلروفیل a |
|
|
نور فلوئورسنس در sµ 50 |
Fo |
|
نور فلوئورسنس در sµ 150 |
F150 |
|
نور فلوئورسنس در sµ 300 |
F300 |
|
نور فلوئورسنس در سطح J (در ms2) |
FJ |
|
حداکثر نور فلوئورسنس |
FM |
|
شاخصهای بیوفیزیکی حاصل از OJIP-test |
||
کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II |
FV/Fo |
|
انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در فتوسیستم II |
φPo |
|
میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II |
φEo |
|
انتقال الکترون از QA به QB در فتوسیستم II |
ψo |
|
میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I |
φRo |
|
میزان اتلاف انرژی به صورت انرژی گرمایی |
φDo |
|
کلیه آزمایشها در سه تکرار انجام و مقایسه میانگینها با استفاده از روش آزمون دانکن انجام گردید.
نتایج
برای بررسی بهتر نقش بتاکاروتن در مقاومت یا عدم مقاومت به تنش سرما در جلبک Dunaliella، آزمایشی طراحی گردید که قبل از تیمار سرما ابتدا میزان بتاکاروتن جلبکها افزایش یافته و بعد تیمار انجام گیرد. بدین منظور، ابتدا سوسپانسیونهای جلبکی از سویههای مورد مطالعه در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دمای 25 درجه سانتیگراد کشت داده شدند و پس از افزایش میزان بتاکاروتن سلولی و اندازهگیری میزان آن، پس از دو هفته نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد منتقل شده و پس از 8 ساعت دوباره به دمای 25 درجه سانتیگراد انتقال یافتند. سپس میزان فلوئورسنس کلروفیل aنمونهها اندازهگیری و اطلاعات حاصل از آن توسط OJIP-test و نرمافزار Biolyzer ارزیابی شد.
میزان بتاکاروتن در سلولهای جلبک D.bardawil و D.salina : مقایسه میزان بتاکاروتن در گونههای مورد مطالعه نشان میدهد که میزان بتاکاروتن در جلبک
D. bardawil با افزایش میزان نمک در محیط کشت، بهویژه در غلظت 3 مولار نمک افزایش یافته است. در حالی که میزان بتاکاروتن در سلولهای جلبک D. salina که در سوسپانسیونهای جلبکی با غلظتهای 1 و 2 مولار NaCl رشد یافتهاند تقریباً مشابه بوده و میزان آن در غلظت 3 مولار نمک نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار NaCl تا حدودی افزایش یافته است. همچنین نتایج نشان میدهد که میزان بتاکاروتن در سلولهای جلبک D. bardawil بهویژه در غلظت 3 مولار نمکی بیشتر از میزان آن در سلولهای جلبک D. salina است (شکل 1).
بررسی اثر تنش سرما بر کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II (FV/Fo) جلبک Dunaliella : مقایسه روند تغییرات شاخص FV/Fo (کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث کاهش کارایی کمپلکس تجزیه آب شده است (شکل 2). با افزایش میزان نمک، کاهش کارایی کمپلکس تجزیه آب در نمونههای جلبک D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25درجه سانتیگراد)، تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص FV/Fo در نمونههای جلبک
D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود. در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک
D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر کارایی کمپلکس تجزیه آب در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص FV/Fo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک کاهش بیشتری نشان میدهد (شکل 2).
بررسی اثر تنش سرما بر انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در فتوسیستم II (φPo) جلبک Dunaliella : مقایسه روند تغییرات شاخص φPo (میزان انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در فتوسیستم II) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث کاهش کارایی انتقال الکترون به فئوفایتین و QA شده است (شکل 3). با افزایش میزان نمک، کاهش میزان انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در فتوسیستم II در نمونههای جلبک D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25درجه سانتیگراد) تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص φPo در نمونههای جلبک D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود. در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر میزان انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص φPo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک کاهش بیشتری نشان میدهد (شکل 3).
شکل 1- میزان بتاکاروتن موجود در سلولهای جلبک D. bardawil (UTB) و جلبک D. salina (UTS) 2 هفته پس از تلقیح سلولهای جلبکی در محیطهایی با غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
شکل 2- کارایی کمپلکس تجزیه آب در سمت دهنده فتوسیستم II (FV/Fo) گونههای D. bardawil (UTB) و D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
شکل 3- میزان انتقال الکترون به فئوفایتین و QA در فتوسیستم II (φPo) گونههای D. bardawil (UTB) و D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
بررسی اثر تنش سرما بر انتقال الکترون از QA به QB در فتوسیستم II (ψo) جلبک Dunaliella : مقایسه روند تغییرات شاخص ψo (انتقال الکترون از QA به QB در فتوسیستم II) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث کاهش کارایی انتقال الکترون از QA به QB در فتوسیستم II شده است (شکل 4). با افزایش میزان نمک، کاهش میزان انتقال الکترون از QA به QB در نمونههای جلبک D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25درجه سانتیگراد) تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص ψo در نمونههای جلبک
D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود. در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک
D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر میزان انتقال الکترون از QA به QB در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص ψo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک کاهش بیشتری نشان میدهد (شکل 4).
بررسی اثر تنش سرما بر میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II (φEo) جلبک Dunaliella : مقایسه میزان شاخص φEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث کاهش کارایی میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II شده است (شکل 5). با افزایش میزان نمک، کاهش میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II در نمونههای جلبک
D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25 درجه سانتیگراد) تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص φEo در نمونههای جلبک
D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود. در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک
D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص φEo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک کاهش بیشتری نشان میدهد (شکل 5).
بررسی اثر تنش سرما بر میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I (φRo) جلبک Dunaliella : مقایسه میزان شاخص φRo (میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث کاهش میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I شده است (شکل 6). با افزایش میزان نمک، این کاهش در نمونههای جلبک
D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25 درجه سانتیگراد) تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص φRo در نمونههای جلبک
D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود.
شکل 4- میزان انتقال الکترون از QA به QB در فتوسیستم II (ψo) گونههای D. bardawil (UTB) و D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
شکل 5- میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II (φEo) گونههای D. bardawil (UTB) و D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
شکل 6- میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I (φRo) گونههای D. bardawil (UTB) و
D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
شکل 7- میزان اتلاف انرژی (φDo) گونههای D. bardawil (UTB) و D. salina (UTS)، پس از انتقال نمونهها از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl (مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام شد و حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار (P<0.05) میباشد).
در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک
D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر میزان احیای پذیرندههای انتهایی در سمت پذیرنده الکترون فتوسیستم I در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص φRo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک کاهش بیشتری نشان میدهد (شکل 6).
بررسی اثر تنش سرما بر میزان اتلاف انرژی (φDo) در جلبک Dunaliella : مقایسه میزان شاخص φDo (میزان اتلاف انرژی) در غلظتهای 1، 2 و 3 مولار NaCl در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که انتقال نمونهها به دمای صفر درجه سانتیگراد در هر 3 غلظت NaCl باعث افزایش میزان اتلاف انرژی شده است (شکل 7). با افزایش میزان نمک، افزایش میزان اتلاف انرژی در نمونههای جلبک D. bardawil که از دمای صفر درجه سانتیگراد به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند، نسبت به نمونههای شاهد (25 درجه سانتیگراد) تا حدودی بهبود یافته است؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار NaCl کمترین میزان تغییرات در شاخص φDo در نمونههای جلبک D. bardawil که به دمای 25 درجه سانتیگراد منتقل شدهاند نسبت به نمونههای شاهد مشاهده میشود. در حالی که افزایش میزان نمک در محیط کشت جلبک
D. salina منجر به تأثیر بیشتر تنش سرما بر میزان اتلاف انرژی در این جلبک میشود؛ بهطوریکه در غلظت 3 مولار نمک میزان شاخص φDo نسبت به غلظتهای 1 و 2 مولار نمک افزایش بیشتری نشان میدهد (شکل 7).
بحث
حضور موجودات فتوسنتزکننده در محدودهای از انرژی نورانی که بیش از نیاز فرایند فتوسنتز است، منجر به عدم تعادل انرژی و به طور کلی بازدارندگی نوری میشود. تنش سرما با ایجاد اختلال در فعالیت آنزیمهای چرخه کالوین، ظرفیت تثبیت CO2 را کاهش داده و باعث کاهش سرعت انتقال انرژی از طریق الکترونها به ترکیبات پذیرنده الکترون میشود، در حالی که بر جذب نور توسط کلروفیلها تأثیر چندانی ندارد (15 و 28). زمانی که میزان انرژی نورانی جذب شده بیش از نیاز دستگاه فتوسنتزی باشد، شرایط لازم را برای ایجاد اکسیداسیون نوری و تولید رادیکالهای آزاد فراهم میکند. تولید رادیکالهای آزاد منجر به آسیب مراکز واکنش فتوسیستم II و بهویژه پروتئین D1 میشود. همچنین تنش سرما با کند کردن سرعت جایگزینی پروتئین D1 به داخل مرکز واکنش فتوسیستم II، روند ترمیم فتوسیستم II را با مشکل مواجه ساخته، و مانع فعالیت طبیعی مراکز واکنش این فتوسیستم میشود. با توجه به اهمیت کارایی کمپلکس تجزیه آب در فتوسیستم II (19) و همچنین ارتباط آن با پروتئینهای D1 و D2 در مرکز واکنش این فتوسیستم (30)، آسیب پروتئین D1 در مرکز واکنش فتوسیستم II به علت کاهش دما و همچنین کند شدن سرعت جایگزینی پروتئین D1 به داخل مرکز واکنش فتوسیستم II تحت این شرایط، میتواند در کاهش کارایی کمپلکس تجزیه آب (FV/Fo) دخالت داشته باشد. بررسی نتایج حاصل از اثر تنش سرما بر کینتیک کلروفیل a در دو گونه D. bardawil و D. salina نشان میدهد که کاهش دما منجر به کاهش کارایی کمپلکس تجزیه کننده آب در نمونههای تحت تیمار سرما نسبت به نمونههای شاهد شده است (شکل 2). همچنین میزان انتقال الکترون به فئوفایتین و QA (شکل 3) و پس از آن، انتقال الکترون از QA به QB (شکل 4) و در نهایت احیای پذیرندههای نهایی در سمت پذیرنده فتوسیستم I (شکل 5) تحت تأثیر تنش سرما در گونههای مورد مطالعه کاهش مییابد. با توجه به نتایج و همچنین اهمیت نقش کمپلکس تجزیه آب در ادامه جریان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II میتوان گفت، کاهش کارایی کمپلکس تجزیه آب در اثر کاهش دما احتمالاً در کاهش میزان انتقال الکترون به پذیرندههای الکترون فتوسیستم II نقش داشته و اختلال در فعالیت زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II (φEo) این دو جلبک در اثر کاهش دما میتواند به علت کاهش کارایی کمپلکس تجزیه آب تحت تأثیر تنش سرما باشد.
دمای پایین با تأثیر منفی بر مراکز واکنش فتوسیستم II، باعث افزایش تراکم مراکز واکنش غیر فعال در این فتوسیستم میشود. هنگامی که تراکم مراکز واکنش فعال کاهش یابد، درصد تبدیل انرژی نوری جذب شده به انرژی برانگیختگی که در اثر برانگیخته شدن کلروفیل a در مراکز واکنش فعال فتوسیستم II به دام میافتد نیز کاهش مییابد (27). در اثر کاهش میزان انرژی به دام افتاده توسط مراکز واکنش، میزان انرژی که به درون زنجیره انتقال الکترون منتقل میشود کاهش یافته و در نتیجه انرژی لازم برای احیای پذیرندههای الکترون در مسیر زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II به خوبی فراهم نمیشود که این امر به نوبه خود منجر به کاهش فعالیت زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II (φEo) میشود. از طرفی کاهش میزان انرژی به دام افتاده در اثر غیر فعال شدن مراکز واکنش فتوسیستم II تحت تیمار سرما، میتواند میزان اتلاف انرژی به صورت انرژی گرمایی را افزایش دهد (25). افزایش میزان شاخص φDo (شکل 7) در نمونههای جلبکی D. bardawil و D. salina که در این تحقیق در اثر کاهش دما مشاهده شد، میتواند مؤید این امر باشد.
تنش شوری یکی از عوامل تنشزا در محیط زندگی جلبک Dunaliella است که باعث افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن در این جلبک میشود (3). یکی از راهکارهای جلبک Dunaliella برای مقابله با این شرایط تولید و تجمع کاروتنوئیدها ازجمله بتاکاروتن است. گزارش شده است بتاکاروتن 10% از وزن خشک جلبک D. bardawil را در غلظتهای بالای نمک تشکیل میدهد (4). به نظر میرسد افزایشی که در میزان بتاکاروتن سلولهای جلبک
D. bardawil تحت تنش شوری، بهویژه غلظت 3 مولار NaCl، در این تحقیق مشاهده شد، یک پاسخ حفاظتی است و از آنجا که بتاکاروتن دارای نقش آنتیاکسیدانی است، احتمالاً سلول با این واکنش، توانایی خود را در برابر اثرات منفی غلظتهای بالای نمک (ازجمله تنش اکسیداتیو القاء شده تحت این شرایط) افزایش میدهد.
مقایسه میزان بتاکاروتن در دو گونه جلبکی مورد مطالعه نشان میدهد که میزان بتاکاروتن در D. bardawil بهویژه در غلظت 3 مولار نمکی بیشتر از D. salina است. همچنین پس از انتقال نمونههای جلبکی به دمای 25 درجه سانتیگراد شاخصهای FV/Fo (میزان کارایی کمپلکس تجزیه آب)، φPo (انتقال الکترون به فئوفیتین وQA)، ψo (انتقال الکترون از QA بهQB)، φEo (میزان انتقال الکترون در زنجیره انتقال الکترون)، φRo (میزان احیای پذیرنده انتهایی زنجیر انتقال الکترون) و φDo (میزان اتلاف انرژی) در
D. bardawil تغییرات کمتری نسبت به D. salina در محیط 3 مولار نمکی از خود نشان دادند. با توجه به نتایج به نظر میرسد در محیطهای حاوی غلظت بالای نمک، جلبک D. bardawil هنگامی که از دمای صفر درجه سانتیگراد به 25 درجه سانتیگراد منتقل میشود با کارایی بهتری به حالت طبیعی اولیه باز میگردد. زیرا در چنین شرایطی (غلظت بالای نمک) جلبک D. bardawil در قیاس با جلبک D. salina توانایی بیشتری در تجمع بتاکاروتن دارد. با توجه به افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن در اثر کاهش یافتن دما (20) و همچنین بازدارندگی نوری القا شده در اثر تنش سرما (13)، علاوه بر کارتنوئیدها, تولید آنتیاکسیدانهایی مانند آسکوربات، گلوتاتیون و آنزیم سوپراکسید دسموتاز نیز میتواند نقش داشته باشند. با توجه به نتایج این تحقیق به نظر میرسد، تجمع بالای بتاکاروتن در جلبک D. bardawil (بهعنوان یک آنتیاکسیدان برای مقابله با رادیکالهای آزاد و یا بهعنوان یک فیلتر نوری برای جذب انرژی نورانی مازاد بر نیاز دستگاه فتوسنتزی) به افزایش حفاظت از مراکز واکنش فتوسیستم II در این گونه جلبکی منجر شده، درنتیجه کارایی جلبک D. bardawil را در انجام واکنشهای اولیه فتوسنتز در محیطهای حاوی غلظت بالای نمک افزایش داده است.
جمعبندی
با توجه به نتایج این تحقیق میتوان گفت تجمع بتاکاروتن در جلبک D. bardawil، در غلظتهای بالای نمک، پیش از اعمال تنش سرما به حفاظت از فتوسیستم II دستگاه فتوسنتزی این جلبک در برابر شرایط نامساعدی که در اثر تنش سرما ایجاد میشود، کمک کرده و باعث افزایش مقاومت جلبک D. bardawil در این شرایط میشود، بهطوریکه پس از انتقال از دمای صفر درجه به دمای 25 درجه سانتیگراد با کارایی بهتری به حالت طبیعی اولیه باز میگردد.
سپاسگزاری
بدینوسیله از مسئولان محترم تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان به دلیل حمایت مالی در انجام این تحقیق قدردانی میگردد. همچنین نویسندگان مقاله از قطب تنشهای گیاهی در دانشگاه اصفهان نیز تشکر و قدردانی مینمایند.