نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تهران

2 عضو هیات علمی دانشگاه تهران

چکیده

بذرهای Astragalus compactus از تهران جمع آوری شد. گیاهان در اتاق رشد تحت شرایط نوری 16 ساعت نوری و 8 ساعت تاریکی رشد کردند. سپس ریزنمونه های برگ، ساقه، دمبرگ و برگهای لپه ای آن با سویه های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز شامل 2659، 15834 وWT تلقیح شدند. قدرت تشکیل ریشه موئین توسط سویه های مذکور در حالت تلقیح با ایجاد زخم روی ریزنمونه ها موفق تر از حالت تلقیح سوسپانسیونی بوده است. آگروباکتریوم ریزوژنز سویه WT در این گونه موفق به تشکیل ریشه موئین نشد، در حالیکه سویه های 2659 و 15834 تشکیل ریشه موئین را در ریزنمونه های مشابه القا کردند. درصد تشکیل ریشه موئین سویه 2659 از سویه 15834 بیشتر بوده است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Virulence of Different Strains of Agrobacterium rhizogenes on genetic transformation in Astragalus compactus

نویسندگان [English]

  • sedigheh habibi 1
  • vahid niknam 1
  • Hassan Ebrahimzadeh 2
  • masoud mirmasoumi 2

1 university of tehran

چکیده [English]

Astragalus compactus L. seeds were collected fromTehran of Iran. Plants were grown in growth chamber under 16 h daily light periods and leaves, stems, prdicle and cotyledon leaves explantn from three- week- old sterilized seedlings cut and infected with Agrobacterium rhizogenes Strains 15834, 2659 and WT.
Hairy roots obtained from leave and stem explants but did not induce hairy roots of cotyledon and pedicle explants of Astragalus compactus.
Strain 2659 resulted in the highest amount of hairy root formation in this Species. Strain 15834 was beneficial but not as effective as strain 2659. In contrast to these two strain, strain WT did not induce hairy roots in any of the explants used in this study. Thus, this strain seems to be totally avirulent to Astragalus compactus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Astragalus
  • Agrobacterium rhizogenes
  • hairy root

مقایسه توانایی ایجاد ریشه موئین توسط سویه‌های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز در Astragalus compactus

صدیقه حبیبی، وحید نیکنام*، حسن ابراهیم‌زاده و مسعود میرمعصومی

تهران، دانشگاه تهران پردیس علوم، دانشکده زیست‌شناسی، بخش علوم گیاهی و قطب تبارزائی موجودات زنده ایران 

تاریخ دریافت: 22/3/90               تاریخ پذیرش: 30/8/90

چکیده

بذرهای Astragalus compactus از منطقه جاجرود جمع‌آوری شد. گیاهان در اتاق رشد تحت شرایط نوری 16 ساعت نوری و 8 ساعت تاریکی رشد کردند. سپس ریزنمونه‌های برگ، ساقه، دمبرگ و برگهای لپه‌ای آن با سویه‌های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز شامل 2659، 15834 و WT تلقیح شدند. قدرت تشکیل ریشه موئین توسط سویه‌های مذکور در حالت تلقیح با ایجاد زخم روی ریزنمونه‌ها موفق‌تر از حالت تلقیح سوسپانسیونی بود. آگروباکتریوم ریزوژنز سویه  WT در این گونه موفق به تشکیل ریشه موئین نشد، در حالیکه سویه‌های  2659 و 15834 تشکیل ریشه موئین را در ریزنمونه‌های مشابه القا کردند؛ به‌طوری‌که درصد تشکیل ریشه موئین سویه  2659 از سویه  15834بیشتر بود. افزایش برخی از اسیدهای فنلی و ایجاد ترکیبات جدید در ریشه های موئین امکان تولید وافزایش متابولیتهای ثانوی داروئی توسط کشت ریشه های موئین گون را نشان داد.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02161113637 ، پست الکترونیکی:  vniknam@khayam.ut.ac.ir

مقدمه

 

گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات شیمیایی تولید شده توسط گیاهان که شامل آلکالوئیدها، آنتراکوئینون‌ها و فلاوونوئیدها هستند نقش مهمی را در صنایع داروسازی، لوازم آرایشی، عطرسازی، رنگرزی و طعم‌دهنده‌ها ایفا می‌کنند. گیاهان بسیاری از این ترکیبات را در مسیر متابولیسم ثانویه تولید می‌کنند. متابولیت‌های ثانویه برای رشد سلول های گیاهی ضروری نیستند و در مقادیر اندک تولیدمی‌شوند(7).

 Srivastava و Srivastava کشت‌های ریشة موئین شمار زیادی از گیاهان دو لپه‌ای و تک لپه‌ای را مورد مطالعه قرار دادند و تولید متابولیت‌های ثانویه مشابه را مانند ریشه‌های طبیعی مشاهده کردند . لذا سیستمی را برای تولید متابولیت ثانویه پیشنهاد کردند(18). امتیاز بزرگ ریشه‌های موئین این است که آنها اغلب ظرفیت‌های بیوسنتزی بیشتری برای تولید متابولیت ثانویه در مقایسه با گیاه والدشان نشان می‌دهند(4 و 13). به علاوه، کشت‌های ریشه موئین برای تولید طیفی از متابولیت‌های ثانویه که در گیاه والد وجود ندارند، نیز شناخته شده‌اند. بنابراین یک سیستم ریشه‌ای تراژنی پتانسیل چشمگیری برای بیان ژن‌های اضافی همراه با پلاسمید Ri، مخصوصا با ژن‌های اصلاح شده، درون سلولهای گیاهی با سیستم‌های حامل آگروباکتریوم ریزوژنز ایجاد می‌کند (3).

گیاهان سردة گون (آستراگالوس) گیاهانی هستند یکساله یا چند ساله، علفی یا بوته‌ای یا درختچه‌ای، دارای تیغ یا فاقد آن، دارای ساقه یا فاقد آن، و برگ‌ها با برگچه‌های جفت یا فرد می‌باشد. ریشه‌های گونه‌های مختلف گون در پزشکی چین جهت جلوگیری از تصلب شرائین، ضد فشار خون، مدر و ضد سرطان استفاده می‌شود. البته از نظر شیمیایی، فلاوونوئیدها در سرده گون به طور وسیعی مطالعه شده‌اند (16).

در این مطالعه، القا و رشد ریشه‌های موئین از
Astragalus compactus با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنز نشان داده شده است. هدف از این مطالعه مقایسه قدرت ایجاد ریشه موئین سویه‌های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز بر روی این گونه است تا برای مطالعات بعدی بهترین سویه انتخاب شود و محتوای متابولیت‌های ثانویه ازجمله اسیدهای فنلی در ریشه‌های تراریخت و ریشه‌های طبیعی مورد مقایسه قرار گیرند.

مواد و روشها

مواد گیاهی: بعد از جمع‌آوری بذرها، به‌منظور شکستن خواب بذر با استفاده از کاغذ سمباده بر روی سطح آن خراشیدگی‌هایی ایجاد شد ( 12 و19). سپس بذرها طی مراحلی بشرح زیر ضدعفونی شدند: 2-3 بار شستشو با آب، قرار دادن آنها در اتانول 70% به مدت 60 ثانیه، 2-3 بار آبکشی با آب مقطر، قرار دادن آنها در هیپوکلریت سدیم 5/5 % حاوی دو قطره tween 20 به مدت 15 دقیقه و بعد 4-5 بار آبکشی با آب مقطر استریل (6 و 8 ).

سپس بذرهای ضدعفونی شده در محیط کشت MS نیمه غلظت بدون هورمونهای رشد با 8/0 % آگار و 3% ساکارز کشت داده شده و در تاریکی قرار گرفتند. به محض ظهور ریشه‌ها، آنها به اتاق رشد تحت دوره نوری 16 ساعت نوری و 8 ساعت تاریکی منتقل گردیدند (14 ).

سویه‌های باکتریایی: سویه‌های 15834، 2659 و WT آگروباکتریوم ریزوژنز برای تلقیح استفاده شدند. این سویه‌ها از دانشگاه گنت بلژیک تهیه شدند. این سویه‌ها روی محیط   LB با 5/1 % آگار در 25 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت رشد کردند(15).

القای ریشه موئین توسط آگروباکتریوم ریزوژنز: آزمایش با چهار ریزنمونه برگی، ساقه، دمبرگ و برگ‌های لپه‌ای تهیه شده از دانه‌رست‌های 3 هفته‌ای انجام شد. سطوح زخمی ریزنمونه‌ها با سویه‌های 15834، 2659 و WT آلوده شدند و بعد به محیط MS درون پتری‌دیش‌ها منتقل شدند. ریزنمونه‌های تلقیح شده پس از حدود 60 ساعت از محیط MS خارج شده و در پتری‌دیش‌های محتوی محیط کشت MS با 8/0% آگار و 3% ساکارز به اضافه آنتی‌بیوتیک سفاتوکسیم با غلظت 250 میلی‌گرم در لیتر قرار گرفتند تا باکتریهای اضافی از محیط حذف گردند. عمل واکشت معمولا هر 48 ساعت یا به محض مشاهده آلودگی انجام شد. 50 نمونه در سه تکرار برای هر گونه استفاده شد. در هر پلیت 5 عدد از ریزنمونه‌های تلقیح شده قرار داده شدند و در دمای 25 درجه سانتیگراد در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. برای هر نوع ریزنمونه تعدادی ریزنمونه شاهد نیز در نظر گرفته شد. فراوانی تشکیل ریشه موئین توسط هر سویه متفاوت بود. ظهور ریشه‌های موئین در محل بریدگی‌های ریزنمونه‌های تلقیح شده مشاهده شد. زمانی که طول ریشه‌های موئین حداقل به 2 سانتی‌متر رسید آنها به محیط نیمه غلظت B5 بدون هر گونه هورمون رشد (75/5 = pH ) محتوی 3% ساکارز منتقل گردیدند و در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 25 درجه سانتیگراد روی دستگاه شیکر با 80 دور در دقیقه قرار گرفتند (17). ریشه‌ها هر 15 روز به محیط تازه واکشت شدند.

استخراج ترکیبات فنلی: به‌منظور استخراج ترکیبات فنلی، 4/0 گرم ماده خشک گیاهی توسط 4 میلی لیتر  متانل 80% عصاره‌گیری شد و با استفاده از کاغذ صافی صاف گردید. روشناور حاصل را در پتری‌دیش ریخته، این عمل سه بار تکرار شد. مجموعه روشناورها در هوای آزاد تبخیر گردید. پس از تبخیر روشناورها، باقی مانده ته ظرف را با 7 میلی لیتر استونیتریل شسته و در قیف دکانتور ریخته شد و حدود 5 میلی لیتر n هگزان به دکانتور اضافه گردید و کمی تکان داده شد. بعد از مدتی دو فاز تشکیل شد. فاز فوقانی حاوی ناخالصی‌های فنلی از قبیل تری گلیسریدهایی بود که در n هگزان حل شد و فاز تحتانی حاوی اسیدهای فنلی بود که در استونیتریل حل گردید.

مشتق سازی اسیدهای فنلی: برای بررسی ترکیبات فنلی با روش کروماتوگرافی گاز– مایع (GLC )، 1 میلی لیتر از معرف پیریدین را به ظرف محتوای ترکیبات فنلی خشک شده اضافه کرده و به خوبی تکان داده شد. محلول فوق به یک ظرف کوچک دربدار منتقل گردید. سپس به آن 2/0 میلی لیتر معرف هگزامتیل دی سیلازان و 1/0 میلی لیتر تری متیل کلروسیلان اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس گردید. از این پس عصاره‌ها جهت آنالیزGLC توسط دستگاه GC ساخت شرکت شیماتزو مورد استفاده قرار گرفتند (5).

نتایج

در این تحقیق بطورکلی ریشه‌های موئین
Astragalus compactus به‌منظور مقایسه توانایی القای ریشه موئین سویه‌های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز تولید شده‌اند.

القای ریشه موئین: هیچ ریشه موئینی روی سطوح بریده شده ریزنمونه‌های برگ‌های لپه‌ای و دمبرگ
Astragalus compactus تشکیل نشد. در تعدادی از ریزنمونه‌های برگی ریشه‌های موئین ظاهر گردیدند. همچنین در هیچکدام از پلیت‌های شاهد نیز هیچ ریشه موئینی تشکیل نشد.

در گونه  Astragalus compactus47% از ریزنمونه‌های برگی تلقیح شده با سویه 2659 پس از 27 روز و 36% از ریزنمونه‌های برگی تلقیح شده با سویه 15834 پس از 35 روز ریشه موئین تشکیل دادند. همچنین در 35% از ریزنمونه‌های ساقه تلقیح شده با سویه 2659 نیز ریشه موئین مشاهده شد (شکل 1).

رشد ریشه‌های موئین در محیط کشت تعلیقی: دو هفته پس از ظهور ریشه‌های موئین، طول آنها اندازه‌گیری شد. قطعات 2 سانتی متری از ریشه‌های موئین را برش داده و هر کدام را در یک ارلن 250 میلی لیتری محتوی 50 میلی لیتر محیط نیمه غلظت B5 محتوای 38 میکروگرم در لیتر سفاتوکسیم قرار دادیم. هر 15 روز طی هر واکشت طول ریشه‌ها اندازه‌گیری می‌شد. نتایج به‌دست آمده نشان داد که سرعت نسبی رشد ریشه‌های موئین در گونه Astragalus compactus تلقیح شده با سویه 2659 برابر با 14/0 گرم در روز بوده است. در صورتی‌که سرعت رشد ریشه کنترل 002/0 گرم در روزهای اول بود که در روزهای آینده رشدشان متوقف شد. ریشه‌های موئین حاصل از تلقیح گونه‌ها با سویه 15834بعد از چند روز قهوه‌ای رنگ شده و از بین رفتند.

 

شکل 1- درصد تشکیل ریشه موئین در قطعات برگی و ساقه
A. compactus در مجاورت سویه‌های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز: 1. سویه 2659،  2. سویه 15834 و 3. سویه wt 

در این تحقیق نشان داده شده است که همه سویه‌ها بجز WT سبب القای ریشه موئین در این گونه می‌شوند. ریشه‌های موئین توسط 15834 و 2659 القا شده بودند (شکل 1).

نتایج حاصل از بررسی ترکیبات فنلی: یک قلة ناشناخته با 17/10 درصد بین هیدروکسی بنزوئیک اسید و سیرنژیک اسید در ریشه موئین دیده شد. درصد کوماریک اسید از 705/0 درصد در برگ و 207/0 درصد در ریشه تراریخت نشده به 749/7 درصد در ریشه موئین افزایش یافت. یک قلة ناشناخته با 85/17 درصد بین سیرینژیک اسید و کوماریک اسید مشاهده می‌شد که در نمونه‌های دیگر وجود نداشت. درصد کافئیک اسید و نارنژینین نیز در ریشه‌های موئین افزایش یافته بود. قلة ناشناخته دیگری با 2/56 درصد ترکیب فنلی بین دو استاندارد کافئیک اسید و نارنژینین تنها در ریشه‌های موئین دیده شده است (جدول 2). بقیه قله‌هایی که درصد ترکیبات فنلی‌شان خیلی نزدیک بهم بود در تحقیق حاضر مورد توجه قرار نگرفته‌اند. به طور کلی بررسی ترکیبات فنلی به کمک GLC، روند کاهشی یا افزایشی منظمی را در نمونه‌های تراریخت شده

و نمونه‌های غیرتراریخت نشان نداده است. در جدول 1 انواع ترکیبات فنلی استاندارد و زمان بازداری آنها مشخص شده است.

جدول 1- انواع ترکیبات فنلی استانده و زمان بازداری آنها

زمان بازداری

ترکیبات فنلی

زمان بازداری

ترکیبات فنلی

509/14

087/15

381/21

742/27

-

فرولیک اسید

کافئیک اسید

نارنژینین

کلروژنیک اسید

-

128/8

467/8

369/11

503/12

022/13

384/13

وانیلین

سینامیک اسید

دی هیدروکسی بنزوئیک اسید

سیرینژیک اسید

کوماریک اسید

گالیک اسید


 

 

جدول 2- درصد اسیدهای فنلی شناخته شده و ناشناخته ) (%GLC در قطعات جداکشت گونهA.compactus

ریشه موئین 

ریشه 

برگ 

ترکیبات فنلی 

-

198/0

168/10

-

749/7

298/0

615/6

-

075/1

265/1

785/0

229/56

711/0

286/0

19/0

-

194/16

207/0

164/0

-

277/10

541/0

-

-

-

135/0

596/1

3/0

-

782/46

855/17

-

718/1

0048/1

098/0

-

281/2

32/0

563/0

وانیلین

هیدروکسی بنزوئیک اسید

ناشناخته

سیرنژیک اسید

ناشناخته

کوماریک اسید

گالیک اسید

ناشناخته

ناشناخته

فرولیک اسید

کافئیک اسید

ناشناخته

نارینژنین

 


بحث

فرآیند تراریختی بافت های گیاهی با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنز تحت تاثیر عوامل مختلفی شامل ژنوتیپ، ساختار قطعه ی جداکشت، سن قطعه ی جداکشت، نوع سویه های باکتریایی و عوامل شیمیایی و فیزیکی محیط کشت قرار می گیرد. قابلیت متفاوت سویه های مختلف این باکتری ها در انتقال T-DNA به قطعات جداکشت یک گونه ی خاص و متعاقباً القای تشکیل ریشه ی موئین در آن ها به خوبی در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است. نتایج مطالعه ی حاضر نشان داد که القای ریشه ی موئین در گونه های مورد بررسی تحت تاثیر سویه های آگروباکتریوم ریزوژنز و نوع قطعه ی جداکشت مورد استفاده قرار گرفت به نحوی که تقریباً در همه ی قطعات جداکشت برگی از گونه های مختلف، ریشه ی موئین تشکیل شد. اما از هیچ کدام از قطعات دمبرگ، محور زیر لپه و برگ های لپه ای تلقیح شده با آگروباکتریوم ریزوژنز ریشه ی موئینی حاصل نشد.

ریشه های  موئین  که در اثر آلودگی گیاه با باکتری آگروباکتریوم ریزوژنز تولید می شود دارای سرعت رشد بالا و پایداری ژنتیکی زیادی بوده و به عنوان منبعی برای تولید متابولیتهای ثانویه گیاهان  مورد استفاده قرار می گیرد ( 1و 2).

همانطوریه در قسمت نتایج ذکر شد دو سویه 15834 و 2659  توانستند باعث القای ریشه موئین در گونه مورد مطالعه از گون شوند. این نتایج نشان دادند که ژنوتیپ یک عامل مهم برای القای ریشه موئین توسط آگروباکتریوم ریزوژنز است. نتایج ما با یافته‌های Dobigny و همکاران در رابطه با تشکیل ریشه‌های موئین در دو رقم از سیب زمینی تحت تاثیر سویه های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز همخوانی دارد (3). Ionkova و همکاران (1997) قبلاً تاثیر متفاوت سویه های مختلف آگروباکتریوم ریزوژنز در القای ریشه موئین در آستراگالوس مونگولیکوس را نشان داده اند (10).  اما تا کنون داده منتشر شده ای در مورد گونه مورد مطالعه در این تحقیق یافت نشده است.

نظر به افزایش و بروز برخی از اسیدهای فنلی در ریشه های موئین گونه مورد مطالعه در مقایسه با ریشه های شاهد غیر تراریخت (جدول 2) امید به امکان افزایش متابولیتهای ثانوی منجمله ترکیبات فنلی با کشت ریشه های موئین وجود دارد. با اینحال تکرار پذیر بودن این نتایج از اهمیت زیادی برخوردار است. تحقیقات بیشتر و تکمیلی می تواند موفقیت این روش را بیشتر تضمین نماید.

در پایان لازم به ذکر است که تا کنون گزارش های محدودی در مورد القای ریشه موئین در گونه های مختلف گون منتشر شده است (9، 10 و 11). همانطوریه می دانیم تکنیک کشت ریشه موئین از تکنیک های مفید برای تولید متابولیتهای ثانوی در گیاهان است و در مورد گونه های گون نیز از ریشه های موئین جهت استخراج متابولیتهای ثانوی مانند ساپونین ها (9و 10) و موسیلاژ (11) استفاده شده است. نظر به اینکه گونه های مختلف گون از نظر خواص داروئی مورد توجه هستند (10و 21) و تاکنون بر روی گون های بومی ایران از نظر خواص داروئی و ترکیبات شیمیائی موجود در آنها تحقیقات زیادی انجام نشده است و با توجه به اهمیت کشت ریشه های موئین از نظر زیست فناوری (20) بنابراین می توان به آینده کشت ریشه های موئین جهت تولید متابولیتهای ثانوی و ترکیبات داروئی امید وار بود.

 

سپاسگزاری:

این تحقیق با حمایت مالی صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور ( طرح شماره 90003944) انجام گرفته است که بدینوسیله تشکر و قدردانی می شود.


  1. آذرمهر بنت الهدی ، کریمی فرح، تقیزاده مسعود،  موسوی گرگری سید لطیف (1392) مقایسه رشد و توان تولید متابولیتهای ثانویه در دودمانهای ریشه مویی تراریخت حاصل از کاسنی(Cichorium intybus) . مجله پژوهش های گیاهی، جلد 26، شماره 4، صفحه: 476-485.
  2. شیرازی زهرا ، پیری خسرو ، میرزایی اصل اصغر ، حسنلو طاهره،  قیاسوند طیبه (1393) اثر محرکهای اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات بر میزان تولید ماده مؤثره گلیسیریزین و ایزولیکویریتیجنین در ریشه های مویین شیرین بیان (Glycyrrhiza glabra L.). جلد 27، شماره 3، صفحه: 440-449.
    1. Dobigny, A., Ambros, A., Haicour, R., David, C., Rossignol, L and Sihachakr, D. (1995) Transformation of Potato Using Mannopine and Cucumpine Straina of Agrobacterium rhizogenes, Plant Cell Tissue and organ Culture 40, 225- 230.
    2. Doran, P.M. (2002) Properties and applications of hairy- root cultures. In Plant biotechnology and transgenic plants, Eds., Okasman- Caldenty, K.- M. and W.H. Barz. Marcel Dekker Inc., New York, pp: 143-162.
      1. Ebrahimzadeh, H. and Niknam, V. (1999) A new derivatization method for the analysis of steroidal sapogenins by Gas-Liquid Chromatography. Indian Drugs, 36(6), 333-356.
      2. Ercan, G., Yuce, S. and Turgut, K. (1997) Kokboya Bitkisinin (Rubia tinctorum L.) In vitro Kosullannda Rejenrrasyon Yeteneginin Arastirmasi. Tr. J. of  Agriculture and forestry, 21: 487- 491.
    3. Giri, A. and Narasu, M.L.  (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnol. Adv., 18: 1-22.
    4. Heijden, R., Verpoorte, R., Hoekstra, S. S and Hoge, H. C. (1994) Nordamnacanthal, a Major Anthraquinone from on Agrobacterium rhizogenes Induced root culture of R. tinctorum, Plant Physiol. Biochem., 32(3): 399- 404.
      1. Hirotani M., Zhou Y., Rui H.  And Furuya T. (1994) Cycloartane triterpene glycosides from the hairy root cultures of Astragalus membranaceus. Phytochemistry 37(5):1403-1407.
      2. Ionkova I., Kartnig T.,  and Alfermann W.)1997) Cycloartane saponin production in hairy root cultures of Astragalus mongholicus. Phytochemistry, 45: 1597-1600.
      3. Isa, T., Ogasawara, T. and Hiroko, K. (1989) Induction of hairy-Root Plant, and Mucilage Production by Hairy-Root. Plant Tissue Culture Letters, 6(3): 134-137.
    5. Miklas, P.N., Townsend, C.E. and Ladd, S.L.  (1987) Seed coat anatomy and the scarification of Cicer milkvetch seed. Crop Sci., 27: 766-772.
    6. Mukundan, U., Dawda, HG. and Ratnaparkhi, S. (1997) Hairy root Culture and Secondary Metabolite Production. Agro Botanica, Mumbai, India.
    7. Murashige, T., and Skoog, F. (1962) A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassayes with Yobacco Tissue Cultures, Physiol. Plant., 15: 473-497.
      1. Park S. U. and Facchini P. J. (2000) Agrobacterim rhizogenes- mediated transformation of opium poppy,Papaver somniferum L., and California poppy, Eschscholzia californica Cham., root cultures. J. Exp. Bot.51: 1005-1016.
    8. Polat, E., Caliskan- Alankus, O., Perrone, A., Piacente, S., Bedir, E. (2009) Cycloartane- type glycosides from Astragalus amblolepis. Phytochemistry, 70: 628-634.
    9. Saito, K., Maitani, T., and Yoshihira, K. (1991) Uptake of Arsenic by Cultured Hairy roots of Rubia tinctorum from Liquid Medium. Journal of Food Hygienic Society of Japan. 32, 5, 414- 415.
      1. Srivastava, S. and Srivastava, A. K. (2007) Hairy root culture for mass-production of high value secondary metabolites. Crit. Rev. Biotechnol. 27: 29-43.
    10. Townsend, C. E. and W. McGinnies (1972) Temperature requirements for seed germination of several forage legumes Agron. J. 64: 809- 812 .
    11. Veerasham, C. (2004) Medicinal Plant Biotechnology. CBS Pub., New Dehli, India.
    12. Xie, P.S. and Leung, A. Y. (2009) Understanding the traditional aspect of Chinese medicine in order to achieve meaningful quality control of chineese material medica, Chromatography,  A. 1216 (11): 1933- 1940.