نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

پروانش با داشتن دو مادۀ ارزشمند به نامهای وینبلاستین و وینکریستین در برگها با اثر آنتی نیوپلازی (ضد تومور) از گیاهان مهم دارویی به شمار می رود. با توجه به ارزش بالای آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین در صنایع دارویی، هر گونه افزایشی در مقدار این آلکالویید در گیاه می تواند از جنبه اقتصادی پر ارزش باشد. این تحقیق در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در چهار سطح کود نیتروژن (0، 100، 150، 200)، در چهار تکرار در سال 87 در شهر کرج انجام شد. متغیرهای اندازگیری شده شامل عملکرد اندام هوایی و سرشاخه­ها، غلظت و عملکرد آلکالویید وینکریستین و وینبلاستین بودند. نتایج آزمایش نشان داد که عملکرد اندام هوایی با افزایش تیمار نیتروژن تا غلظت 200 کیلوگرم در هکتار نسبت به شاهد افزایش یافته و عملکرد سرشاخه­ها در تیمارهای مختلف معنی­دار نبود. بیشترین غلظت و عملکرد آلکالویید وینکریستین در شاهد و بیشترین غلظت و عملکرد آلکالویید وینبلاستین در تیمار200 کیلوگرم در هکتار نیتروژن اندازه گیری شدند. در تیمار 200 کیلوگرم نیتروژن در هکتار وینکریستین در برگ اندازه گیری نشد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of diferent levels of N fertilization on Yield and Amount of Alkaloids vincristine and vinblastine in Periwinkle (Cataharanthus roseus L.G.Don)

چکیده [English]

Periwinkle (Catharanthus roseus (L. ) G. Don), a medicinal plant, which economiclly is highly valued because of  its anti-cancer lalkaloids of  vincristine and vinblastine. Since the availability of nitrogen (N) is expected to play an important role in the biosynthesis and accumulation of alkaloids in plants, the effect of N fertilization on the content of alkaloids of periwinkle was studied. the four levels of 0, 100, 150, 200 kg/ha N fertilization in a bulok completely randomized design with three replications. N fertilization significantly increased the content of alkaloids in leaves. This study showed that  by increasing N fertilization dry weight increased. The highest level  of alkaloid vincristine was in the 0 kg/ha of N fertilization and  the highest level alkaloid vinblastine was in the 200 kg/ha of N fertilization. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • vinca
  • Nitrogen
  • vinblastine
  • vincristine
  • dry weight

تأثیر سطوح مختلف نیتروژن بر عملکرد و غلظت آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین در گیاه پروانش roseus G. Don) (Catharanthus 

زیبا غلامحسین پور*،1، خدایار همتی 1، حمید رضا دورودیان 2،عظیم قاسم نژاد1 و علی شرفی3

1 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه باغبانی

2 لاهیجان، دانشگاه آزاداسلامی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

3 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 6/10/89           تاریخ پذیرش: 8/5/90 

چکیده

پروانش با داشتن دو مادۀ ارزشمند به نامهای وینبلاستین و وینکریستین در برگها با اثر آنتی نیوپلازی (ضد تومور) از گیاهان مهم دارویی به شمار می رود. با توجه به ارزش بالای آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین در صنایع دارویی، هر گونه افزایشی در مقدار این آلکالویید در گیاه می تواند از جنبه اقتصادی پر ارزش باشد. این تحقیق در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در چهار سطح کود نیتروژن (0، 100، 150، 200)، در چهار تکرار در سال 87 در شهر کرج انجام شد. متغیرهای اندازگیری شده شامل عملکرد اندام هوایی و سرشاخه­ها، غلظت و عملکرد آلکالویید وینکریستین و وینبلاستین بودند. نتایج آزمایش نشان داد که عملکرد اندام هوایی با افزایش تیمار نیتروژن تا غلظت 200 کیلوگرم در هکتار نسبت به شاهد افزایش یافته و عملکرد سرشاخه­ها در تیمارهای مختلف معنی­دار نبود. بیشترین غلظت و عملکرد آلکالویید وینکریستین در شاهد و بیشترین غلظت و عملکرد آلکالویید وینبلاستین در تیمار200 کیلوگرم در هکتار نیتروژن اندازه گیری شدند. در تیمار 200 کیلوگرم نیتروژن در هکتار وینکریستین در برگ اندازه گیری نشد.

واژه­های کلیدی: پروانش، نیتروژن، عملکرد، وینبلاستین، وینکریستین 

* نویسنده مسئول،  تلفن: 4420981-0171، پست الکترونیکی: Ziba_hossienpour@yahoo.com

مقدمه

 

پروانش یکی از گیاهان دارویی مهم با نام علمی
( roseus G. Don (Catharanthus از خانوادۀ خرزهره (Apocynaceae) می­باشد (شکل 1). این گیاه دارای ترکیبات آلکالوییدی وینبلاستین و وینکریستین است، که از داروهای مهم مورد مصرف در شیمی درمانی انواع مختلف سرطان، خصوصاً بیماریهای هوچکین، لنفوم و لوسمی می باشد (7 و 10). وینبلاستین و وینکریستین دو آلکالویید ایندول از نوع دیمری هستند که جزء با ارزش­ترین آلکالوییدهای پروانش بوده و تنها در یک گروه متیل یا فرمیل در بخشی از ویندولین باهم متفاوت هستند (2). امروزه علی رغم پیشرفتهای زیاد در زمینه سنتز ترکیبات دارویی، این آلکالوییدها هنوز از طریق استخراج گیاه پروانش به دست می­آید (20).

یکی از نیازهای مهم در برنامه ریزی زراعی به منظور حصول عملکرد بالا و با کیفیت مطلوب مخصوصاً در مورد گیاهان دارویی، ارزیابی سیستمهای مختلف تغذیه گیاه است (3، 4 و 9). تحقیقات گذشته نشان داده است که شرایط محیطی مناسب مانند تغذیه، آبیاری و زمان برداشت می تواند در میزان افزایش آلکالوییدها مؤثر باشد (4 و 11). کاربرد صحیح و مناسب عناصر و مواد غذایی در طول مراحل کاشت، داشت و برداشت گیاهان دارویی، نه تنها نقش عمده‌ای در افزایش عملکرد دارد، بلکه در کمیت و کیفیت مواد مؤثره آنها نیز تأثیر دارد. نیتروژن عنصری ضروری و اساسی برای گیاهان محسوب می‌گردد، که به نوعی باعث افزایش آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین می‌شود.

نیتروژن به صورت اوره، نیترات و آمونیوم به خاک اضافه می­شود و با عناصری نظیر کربن، اکسیژن، هیدروژن و حتی گوگرد ترکیب شده و مواد بسیار ارزشمندی نظیر آمینواسیدها، نوکلئیک اسیدها، آلکالوییدها و بازهای پورینی را تولید می­نماید (25). مقادیر مختلف کودهای نیتروژن در شرایط اکولوژیکی متفاوت آثار گوناگون بر عملکردهای رویشی گیاهان می­گذارد (9 و 11). با افزایش مقدار نیتروژن در دسترس، غلظت آلکالویید کل گیاه نیز افزایش می­یابد (7 و 10). تمام منابع، معنی­دار بودن اثر ذخایر نیتروژن را بر روی عملکرد وزن تر و خشک در گیاه پروانش ثابت کرده­ا­ند، ولی پیشنهادهای ارائه شده بسته به شرایط مختلف در دزهای متفاوت است. این مقدار در منابع مختلف از 50 کیلوگرم در هکتار (18) و 100- 80 کیلوگرم در هکتار (19) تا 150 کیلوگرم در هکتار (26) گزارش شده است. بیشترین غلظت عملکرد در 3 ژنوتیپ گیاه پروانش Nirmal ,NEU1-7 ,NEu24-17 در 150 کیلوگرم در هکتار به دست آمد(27).

 

 

شکل 1- گیاه پروانش

با توجه به ارزش بالای آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین در درمان بیماریهای سرطانی و اینکه تنها راه تهیه این دارو استخراج از گیاه پروانش بوده، هر گونه افزایشی در مقدار درصد این آلکالویید در گیاه می تواند از جنبه اقتصادی ارزش زیادی داشته باشد (2) به طوری که ارزش هر گرم آلکالویید وینکریستین و وینبلاستین در سال 2009، توسط هیجدن و همکاران به ترتیب در حدود 5/135 و 9/28 یورو گزارش شده است (14).

تاکنون علاقه اصلی در پرورش گیاهان دارویی همانند گیاهان دیگر به کارگیری اعمال زراعی مانند تغذیه و آبیاری جهت افزایش محصول بوده است و اطلاعات کمی در مورد تأثیر تغذیه گیاهی بر متابولیت­های ثانویه وجود دارد (17). بنابراین هدف از تحقیق حاضر بررسی تأثیر سطوح مختلف نیتروژن بر میزان عملکرد اندام هوایی و غلظت و عملکرد آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین در گیاه پروانش در منطقه کرج می­باشد.

مواد و روشها

 این تحقیق در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در چهار تکرار در مزرعه پژوهشی مؤسسه تحقیقاتی تماد در کیلومتر 5 جاده مخصوص کرج انجام شد. بذور با کولتیوار (G. Don) در 2 فروردین ماه به صورت نشایی و با استفاده از کیسه­های پلاستیکی نشاء کشت شد. پس از آماده سازی اولیه مزرعه و تصادفی نمودن تیمارها، کود محاسبه شده برای هر کرت به دقت توزین و به هر کرت اضافه گردید و به خوبی با خاک مخلوط شد. در این آزمایش 40 کیلوگرم در هکتار کود سوپر فسفات تریپل و 30 کیلوگرم در هکتار کود سولفات پتاسیم قبل از انتقال نشاها به زمین داده شد. کود نیتروژن در چهار سطح 0، 100، 150 و 200 کیلوگرم نیتروژن خالص در هکتار از منبع اوره در چهار مرحله، مرحلۀ اول قبل از انتقال نشاها و 3 مرحلۀ بعدی، به صورت سرک بعد از انتقال نشاها به زمین داده شد. نشاها در زمان 6- 4 برگی در فواصل 30×50 سانتیمتر در کرتها کشت شدند. در هر کرت 4 ردیف و در هر ردیف 6 بوته قرار داشت. پس از انتقال نشاها، آبیاری در حد نیاز انجام شد. قبل از انتقال نشاها، خاک محل آزمایش تجزیه و خصیوصیات شیمیایی و فیزیکی مورد نیاز آن مورد بررسی قرار گرفت. بافت خاک از نوع لومی رسی و 2/8pH=، نیتروژن کل 05/0 % و فسفر قابل جذب ppm 4/7 و پتاسیم قابل جذب ppm 480 بود. در اواخر شهریور در زمان (Full bloom) نمونه­برداری به منظور اندازه گیری عملکرد آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین از بوته های ردیفهای وسط هر کرت انجام گردید و وزن نمونه­های برداشت شده با ترازوی دیجیتالی اندازگیری و سپس به مدت یک هفته در دمای 45 درجه سانتی گراد خشک گردید و جهت آزمایشهای بعدی آماده شدند.

جهت استخراج آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین، دو گرم پودر خشک گیاه پروانش با متانول خالص به مدت 6 ساعت رفلاکس گردید و عصاره به دست آمده تبخیر و سپس در آب و اسیدکلریدریک و کلروفرم حل شد و سپس با استفاده از دکانتور، فاز کلروفرمی که حاوی چربیها، ترپنوئیدها و رنگیزها بود حذف گردید. پس از این مرحله با استفاده از هیدروکسیدآمونیوم، pH فاز اسیدی به 11 رسید و در نهایت با حلال کلروفرم آلکالوییدهای مورد نظر جدا گردیدند. عصاره به دست آمده تبخیر شد و ته مانده این مرحله در متانول مخصوص HPLC حل شد و درنهایت نمونه آماده تزریق به دستگاه ­شد.

برای اندازگیری غلظت آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC)و براساس روش توصیه شده از فارماکوپۀ بریتیش انجام گردید (12). در این تحقیق دستگاه (HPLC) از نوع واریان، مدل پرو استار مجهز به ستون 18C با قطر 46/0 ´ 25 سانتیمتر بود. فاز متحرک در این آزمایش تشکیل شده از cc 5/4 دی اتیل آمین که توسط آب به حجم cc300 رسانده شد و با فسفریک اسید غلیظ، pH آن را به 5/7 رسانده و سپس  cc700 متانول به آن اضافه شد و خوب مخلوط گردیده و  فاز متحرک برای  سیستم HPLC آماده شد. نمونه‌ها در طول موج 297 نانومتر قرائت شدند و نرم افزار تراسر اکسل 120 برای مدیریت داده‌ها استفاده شد.

جهت تهیه نمونه استاندارد، 1 گرم از سولفات وینبلاستین و 10گرم از سولفات وینکریستین در 10 میلی لیتر آب حل کرده و در این مرحله نمونه استاندارد آماده تزریق به دستگاه HPLC می­گردد. طبق نمونه­های استاندارد، پیک وینکریستین و وینبلاستین به ترتیب در دقیقۀ 781/10 و 796/14 در طول موج 297 مشاهده گردید.

عملکرد آلکلوییدها از حاصل ضرب بین غلظت آلکالوییدها (درصد) در وزن خشک سرشاخه ها (گرم در مترمربع) به دست آمده. 

 نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار SAS و آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و نمودارها با نرم افزار Excel ترسیم گردید.

نتایج

الف- عملکرد اندام هوایی: نتایج آزمایش نشان داد که اثر سطوح مختلف نیتروژن بر عملکرد محصول پروانش در سطح 5 درصد معنی دار است و کاربرد نیتروژن تأثیر مثبت بر عملکرد اندام هوایی دارد. به طوری که بیشترین و کمترین عملکرد وزن خشک اندام هوایی به ترتیب در 100 کیلوگرم در هکتار (111 گرم در متر مربع) و شاهد (76/58 گرم در متر مربع) مشاهده شد، اما بین شاهد و دو سطح دیگر اختلاف معنی­داری مشاهده نشد (جدول 1).

ب-عملکرد سرشاخه­ها: اندازگیری عملکرد سرشاخه­ها نشان داد که اثر تیمار نیتروژن بر صفت یاد شده در سطح 5 درصد معنی دار نبود (جدول 1).

پ- غلظت آلکالویید وینبلاستین: آنالیز نتایج به دست آمده نشان داد که سطوح مختلف کودی بر درصد وینبلاستین نمونه­ها تأثیر معنی­داری داشته (جدول 1)، به طوری که بیشترین غلظت آلکالویید وینبلاستین در سطوح 150 و 200 کیلوگرم در هکتار (0.018 درصد)  و  کمترین

غلظت آلکالویید در شاهد (0.0024 درصد) مشاهده شد.  

 

 

جدول 1- تأثیر مقادیر مختلف تیمار نیتروژن بر عملکرد اندام هوایی و سرشاخه، درصد و عملکرد آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین

عملکرد آلکالویید

وین­کریستین

عملکرد آلکالویید

وین­بلاستین

درصد آلکالویید

وین­کریستین

درصد آلکالویید وین­بلاستین

وزن­خشک سرشاخه

وزن­خشک پیکر

رویشی

تیمار کودی N

Mg/ m2         

Mg/ m2         

%

%

g/m2

g/m2                  

Kg/h     

1. 11A

0.02B

0. 098A

0. 0024B

11. 37A

58.76B

0 

0. 78B

0. 04B

0. 05B

0. 0028B

15. 6A

111A

100 

0. 54B

0. 22A

0. 043B

0. 018A

12. 59A

43. 70B

150 

0C

0. 23A

0C

0. 018A

13. 2A

70B

200

    گروه بندی میانگینها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد.

 


ت- غلظت آلکالویید وینکریستین: نتایج آزمایش نشان داد که اثر سطوح مختلف نیتروژن بر غلظت آلکالویید وین­کریستین در سطح 5 درصد معنی دار است (جدول 1). بیشترین و کمترین غلظت آلکالویید وینکریستین به ترتیب در شاهد برابر 0.098 درصد و تیمار 200 کیلوگرم در هکتار برابر صفر است.

ج- عملکرد آلکالویید وینبلاستین: بررسی عملکرد آلکالویید وینبلاستین در سرشاخه­های محصول برداشت شده در تیمارهای مختلف کودی نشان داد که سطوح مختلف نیتروژن بر عملکرد وینبلاستین گیاه پروانش تأثیر معنی­داری داشت (جدول 1). کمترین عملکرد وینبلاستین در سرشاخه­های نمونه­های شاهد وجود داشت (0.02 میلی گرم در مترمربع) و بیشترین عملکرد وینبلاستین برابر 0.23 میلی گرم در مترمربع و مربوط به تیمار 200 کیلوگرم در هکتار بود. نتایج همچنین نشان می­دهد که تمام تیمارهای کودی باعث افزایش غلظت وینبلاستین شده­اند.

 د- عملکرد آلکالویید وینکریستین: آنالیز نتایج به دست آمده نشان داد که سطوح مختلف کودی بر عملکرد وینکریستین نمونه­ها تأثیر معنی­داری داشته به صورتی که کمترین عملکرد وینکریستین مربوط به تیمار 200 کیلوگرم در هکتار و برابر 0 و بیشترین غلظت آن برابر 1.11 میلی گرم در مترمربع مربوط به تیمار شاهد است.

نتایج همچنین نشان می­دهد که تمام تیمارهای کودی باعث کاهش غلظت وینکریستین شده­اند.

بحث

اگرچه تولید متابولیت­های ثانویه تحت کنترل ژنها هستند، ولی غلظت آنها در گیاه به طور قابل توجهی تحت تأثیر شرایط محیطی قرار می­گیرد، که از جمله مهم ترین این عوامل خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک و عناصر غذایی کم مصرف و پرمصرف هستند (24). تحقیقات قبلی نشان داده است که عملیات زراعی مانند تغذیه غالباً به طور غیرمستقیم بر متابولیت­های ثانویه مؤثر هستند (مانند تأثیر تغذیه بر اسانسها و گلیکوزیدها) و به ندرت این عوامل به طور مستقیم عمل می­نمایند (مانند تأثیر تغذیه نیتروژن بر آلکالوییدها)(17). نتایج به دست آمده در این آزمایش، مشخص گردید که افزودن کود نیتروژن دار سبب افزایش عملکرد اندام هوایی می­شود که این نتایج با گزارشات سریوالی و همکاران (27) و حسینیان (5) و لاتا و همکاران (22) همخوانی دارد و با توجه به ساختار مولکولی آلکالوییدها که حاوی نیتروژن است، طبق تحقیقات انجام شده به این نتیجه رسیدند نیتروژن باعث افزایش در غلظت آلکالوییدهای تولید شده در گیاه پروانش می گردد (6). نتایج این آزمایش نشان داد که با افزایش کودهای نیتروژنه عملکرد سرشاخه ها نسبت به شاهد افزایش ولی تأثیر معنی داری نداشته­اند. حسینیان (5) نیز در بررسی اثر سطوح مختلف نیتروژن در خاکهای شنی بر گیاه پروانش اختلاف معنی­داری را در عملکرد وزن خشک برگ مشاهده نکردند.

با توجه به اینکه در گیاه پروانش، سرشاخه‌ها از مهم ترین اندامهای حاوی وینبلاستین و وینکریستین هستند، عملکرد آلکالوییدها در این بخش از گیاه معیار بهتری نسبت به عملکرد کل گیاه می باشد (1). به همین منظور در این تحقیق میزان آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین سرشاخه‎‌های گیاه پروانش اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که، با افزایش سطوح نیتروژن، درصد آلکالویید وینبلاستین در سرشاخه‌ها افزایش می‌یابد، در حالی که درصد آلکالویید وینکریستین در سرشاخه‌ها کاهش می‌یابد.

نتایج حاصل بر عملکرد آلکالوییدهای در واحد سطح نشان داد که با مصرف کودهای نیتروژنه، عملکرد آلکالویید وینبلاستین افزایش و آلکالویید وینکریستین کاهش پیدا کرد، با توجه به اینکه وینکریستین در گیاه از وینبلاستین ساخته می­شود افزایش آن همراه با کاهش وینبلاستین خواهد بود (16 و 23). طبق نتایج به دست آماده می­توان بیان کرد که تیمار 150 کیلوگرم در هکتار از نظر اینکه به نسبت مناسب سبب افزایش هر دو آلکالویید وینبلاستین و وینکریستین می شود، بهترین تیمار برای عملکرد این دو آلکالویید است. بیشتر تحقیقات انجام شده براساس آلکالویید کل پروانش است و گزارش در مورد تأثیر عناصر ماکرو بر آلکالوییدهای وینبلاستین و وینکریستین بسیار کم است در نتیجه نیاز به تحقیقات جامع­تری است. لاتا و همکاران (21) و واسکی و همکاران (28) گزارش کردند ترکیبات نیتروژن دار بیشترین اثر را در افزایش مادۀ خشک در برگها و ریشه­ها داشته، که این روند رابطۀ مستقیم با فتوسنتز و غلظت جذب نیتروژن دارد که با افزایش آنها نیتروژن کل در گیاه افزایش می­یابد و در نتیجه سنتز آلکالوییدها بیشتر شده و در نهایت وینبلاستین و وینکریستین افزایش می­یابد و همچنین تحقیقات انجام شده در گیاهان آلکالویید داری چون تاتوره، بلادون و تاجریزی نیز نشان داد که مصرف کود نیتروژنه بر مقدار آلکالویید آنها تأثیر می­گذارد (8، 10، 13 و 15).

  1. امیدبیگی، ر. 1384. تولیدوفرآوری گیاهان دارویی. انتشارات آستان قدس رضوی، جلد دوم، ص 149.
  2. سجادی، ا. 1379. مقایسه چهل و سه کولتیوار گیاه پروانش از نظر مقدار آلکالویید ضد سرطان وینبلاستین. پژوهش در علوم پزشکی. سال پنجم. پیوست دوم.
  3. حسن زاده قورت تپه، ع. ، قلاوند، م. ، احمدی و میرنیا. خ. ، 1380. بررسی تأثیر کودهای شیمیایی، آلی و تلفیقی به خصوصیات کمی و کیفی ارقام آفتابگردان در استان آذربایجان غربی. مجله علوم کشاورزی دانشگاه گرگان، 104-85.
  4. رضائی نژاد، ی. ، افیونی، م. ، 1379. اثر مواد آلی بر خواص شیمیایی خاک، جذب عناصر به وسیله ذرت وعملکرد آن. مجله علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی، جلد چهارم شماره چهارم، 27-19.
  5. حسینیان، ف. ، 1381. بررسی تاثیر تغذیه نیتروژن بر آلکالوییدهای گیاه پروانش. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه گرگان.
    1. Abdolzadeh, A., F. Hosseinian, M. Aghdasi and H. Sadgipoor, 2006. Effect of nitrogen sources and levels on growth and alkaloid content of periwinkle. Asian J. Plant Sci., 5(2): 271-276.
    2. Afridi, M. M. R. K. , Afaq Wasiuddiun, S. H. , Khalique, A. , 1977. Effect of different levels of nitrogen on growth and alkaloid content of Datura innoxia L. Ind. J. Pharm. 6, 165-166.
    3. American Society of Health-System Pharmacists. , 2004a. Hyaluronidase injection. Retrieved March 3, 2004. http://www.ashp.org/shortage/
    4. Balkcom, K. S. and Monks, C. D. , 2007. Nitrogen plant growth regulator rates on Cotton yield and fiber quality. Cotton Research and Extension Report, 32: 21-22.
    5. Bernath, J. , 1986. Production ecology of secondary plant products, Recent advances in botang, Horticulture and Pharmacology, 1: 435-443.
    6. Bowman, W. D. , Bahn, L. and Damm, M. , 2003. Alpine landscape variation in foliar nitrogen and phosphorus concentrations and the relation to soil nitrogen and phosphorus availability. Arctic, Antarctic and Alpine Research, 35(2): 144-149.
    7. British pharmacopoeia 2008. 
    8. Brussaard, L. , Ferrera – Cerrato, R. , 1997. soil ecology in sustainable agricultural systems. New York : Lewis Publishers, U. S. A. , 168.
    9. Company sigma. , 2009. http://www.sigmaaldrich.com.
    10. D emeryer, K. , Dejaegere, R. , 1989. Influence of the ion-balance in the growth medium on the yield and alkaloid content of Datura strramonium L. Plant Soil 114, 289-294.
    11. De Luca, V. Laflamme, P. 2001. Cun Opin Plant Biol. 4, 225.
    12. Farnaz, Ch. , 1983. Nutrient and water management for medicinal and aromatic plants. Acta Horticulturae. no. 132: 203-215.
    13. Gupta. R. , 1977. Periwinkle-produces anticancer drug. Indian farming. 7: 11-13
    14. Hegde. DM. ,1986. Effect of level and time of nitrogen application on growth and productivity of periwinkle, Catharanthus roseus. Herba Hung 25: 107-114.
    15. Lata. B. , 2007. Cultivation, mineral nutrition and seed production of Catharanthus roseus (L.) G. Don in the temperate climate zone. Phytochem Rev. 6: 403 – 41
    16. Lata. B. , Sadowska. A. , 1996a. Effect of nitrogen level in the substrate on yield and alkaloid concentration in Catharanthus roseus L. (G. ) Don. Folia Hort 8(2): 59-69.
    17. Lata. B. , Sadowska. A. , 1996b. Effect of N,P,K and Zn foliar fertilization on the yield of Catharanthus roseus L. (G. ) Don. Folia Hort 8(2): 51-58.
    18. Morgan, J.A. Shanks, J.V. , 1999. Phytochemistry. 51-61.
    19. Palevitch, D. 1987. Nutrient and water managmenent for medicinal and aromatic plants. Acta Horticulturae. No. 132: 203-215.
    20. Salisbury. F. B. , and Ross. C. W. , 1991. Plant physiology. Fourth edition,Wadsworth Publishing Company, Belmant, California, USA, 682.
    21. Shylaja. MR. , Sankar. MA. , Nair. GS. , Mercy. KA. , 1996. Response of Catharanthus roseus L. (G. Don) to nitrogen phosphorus and potassium fertilization Indian Cocoa Arecanut Spices J 20(3): 83-88.
    22. Sreevalli. Y. , Kulkarni. R. N. , Baskaran. K. , and Chandrashekara. R. S. , 2003. Increasing the content of leaf and root alkaloids of high alkaloids content mutants of periwinkle through nitrogen fertilization. Industrial Cpops and products. 19: 191-195.
    23. Vasuki. KPS. , Rao. KVN. , 1980. Effect of micronutrients and their interactions on growth and alkaloid production in Catharanthus roseus L. (G. ) Don,( proo Indian Aead. Acad. Aci.). Plant Sci 89: 197-201.