نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

سرما یکی از مهمترین تنش­های غیر زنده می­باشد که بر رشد و نمو گیاهان تأثیر می­گذارد. در این تحقیق تأثیر اسید سالیسیلیک بر برخی خصوصیات بیوشیمیایی در دو رقم کلزا با مقاومت متفاوت به سرما مورد بررسی قرار گرفت. اسید سالیسیلیک در 4 سطح 0، 100، 200 و 400 میکرو­ مولار در مرحله طوقه­ای دو رقم کلزا که شامل رقم RGS (بهاره و حساس به سرما) و رقم LICORD (پاییزه و مقاوم به سرما) محلول‌پاشی گردید. نمونه‌گیری از گیاهان 24 ساعت بعد از محلول­پاشی انجام شد. تأثیر اسید سالیسیلیک و دمای پایین بر پراکسیداسیون لیپید­های غشاء، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان شامل سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز و کاتالاز، آنزیم پلی فنل اکسیداز، مقدار پروتئین محلول برگ و پرولین در برگ­های کلزا مورد بررسی قرار گرفت. اسید سالیسیلیک به طور معنی­داری باعث افزایش فعالیت آنزیم­های سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز (در رقم مقاوم)، مقدار پروتئین محلول و پرولین شد اما فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداسیون لیپید­های غشاء در هر دو رقم به طور چشمگیری کاهش یافت. محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک موجب افزایش عملکرد بذر شد. بیشترین وزن خشک اندام هوایی نیز در رقم مقاوم بدست آمد. البته در مواردی غلظت­های بالاتر اسید سالیسیلیک منجر به کاهش مقدار صفات فوق در هر دو رقم شد. نتایج نشان داد فعالیت آنزیم­ها در دو رقم متفاوت بوده و بجز کاتالاز و پلی فنل اکسیداز در سایر موارد اسید سالیسیلیک سبب افزایش فعالیت این آنزیم­ها گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Differences in antioxidant responses of autumn and spring rapeseed (Brassica napus L.) cultivars affected by salicylic acid under the field condition

نویسندگان [English]

  • Hamed Keshavarz
  • Ali Mohammad Modaress
  • fatemeh zarinkamar

چکیده [English]

Low temperature is one of the most important stress factors limiting the growth and productivity of canola. To alleviate or prevent low temperature-induced oxidative injury, plants have evolved mechanisms to scavenge these toxic reactive species. Recently, many different compounds are applied to minimize the harmful effects of low temperature. In this study effect of foliar application of salicylic acid has been studied on some biochemical properties of two canola cultivars with different cold resistant [RGS (Spring canola and sensitive to cold) and LICORD (Winter canola and resistant to cold)]. Salicylic acid was sprayed at four levels, including 0, 100, 200 and 400 µM. Leaf samples were collected 24 h after spraying. The effects of salicylic acid and cold stress on the lipid peroxidation, activities of antioxidants enzymes including superoxide dismutase, peroxidase, catalase, polyphenol oxidase, protein content and proline in leaves of canola plants were investigated. The results showed that salicylic acid increased significantly activity of antioxidant enzymes  including superoxide dismutase and peroxidase, content of protein and proline but decreased significantly lipid peroxidation and catalase activity in both cultivars. Sprayed with salicylic acid increased the seed yield. Maximum shoot dry weight was in resistance cultivar, as well. However, in some cases, higher concentrations led to a decrease in the measured traits of both cultivars. The results show that enzyme activity in both cultivars were different. Except CAT and PPO, in other cases, salicylic acid enhanced the activity of these enzymes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidant enzymes
  • Canola
  • lipid peroxidation
  • oxidative Stress

تفاوت در پاسخ آنتی­اکسیدانی دو رقم کلزا بهاره و پاییزه (Brassica napus L.) در شرایط مزرعه­ای تحت تأثیر اسید سالیسیلیک 

حامد کشاورز1، سید علی محمد مدرس ثانوی1* و فاطمه زرین کمر2 

1 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت 

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 19/1/90           تاریخ پذیرش: 1/8/91

چکیده

سرما یکی از مهمترین تنش­های غیر زنده می­باشد که بر رشد و نمو گیاهان تأثیر می­گذارد. در این تحقیق تأثیر اسید سالیسیلیک بر برخی خصوصیات بیوشیمیایی در دو رقم کلزا با مقاومت متفاوت به سرما مورد بررسی قرار گرفت. اسید سالیسیلیک در 4 سطح 0، 100، 200 و 400 میکرو­ مولار در مرحله طوقه­ای دو رقم کلزا که شامل رقم RGS (بهاره و حساس به سرما) و رقم LICORD (پاییزه و مقاوم به سرما) محلول‌پاشی گردید. نمونه‌گیری از گیاهان 24 ساعت بعد از محلول­پاشی انجام شد. تأثیر اسید سالیسیلیک و دمای پایین بر پراکسیداسیون لیپید­های غشاء، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان شامل سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز و کاتالاز، آنزیم پلی فنل اکسیداز، مقدار پروتئین محلول برگ و پرولین در برگ­های کلزا مورد بررسی قرار گرفت. اسید سالیسیلیک به طور معنی­داری باعث افزایش فعالیت آنزیم­های سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز (در رقم مقاوم)، مقدار پروتئین محلول و پرولین شد اما فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداسیون لیپید­های غشاء در هر دو رقم به طور چشمگیری کاهش یافت. محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک موجب افزایش عملکرد بذر شد. بیشترین وزن خشک اندام هوایی نیز در رقم مقاوم بدست آمد. البته در مواردی غلظت­های بالاتر اسید سالیسیلیک منجر به کاهش مقدار صفات فوق در هر دو رقم شد. نتایج نشان داد فعالیت آنزیم­ها در دو رقم متفاوت بوده و بجز کاتالاز و پلی فنل اکسیداز در سایر موارد اسید سالیسیلیک سبب افزایش فعالیت این آنزیم­ها گردید.

واژه‌های کلیدی: آنزیم­های آنتی­اکسیدان، پراکسیداسیون لیپید­های غشاء، تنش اکسیداتیو، کلزا

* نویسنده مسئول،  تلفن: 09121481637، پست الکترونیکی:   Modaresa@modares.ac.ir

مقدمه

 

رشد و نمو و عملکرد گیاهان بشدت تحت تأثیر عوامل محیطی است. دما ازجمله عوامل محیطی مهمی است که در پراکنش گیاهان نقش دارد و دمای پایین از تنش­های مهم محدود کننده­ی رشد، تولید و پراکنش گیاهان است. دمای پایین فعالیت بیوسنتزی گیاهان را کاهش داده و از کارکرد طبیعی فرایند­های فیزیولوژیک جلوگیری می­نماید و ممکن است سبب آسیب­های دائمی شود که در نهایت به مرگ می­انجامد (3).

تنش­های محیطی باعث تغییرات شیمیایی و بیوشیمیایی و به هم خوردن تعادل در فعالیت آنزیم­های سلول­های گیاهی می­شود. اولین اتفاقی که در شرایط تنش می­افتد تولید گونه­های فعال اکسیژن  Reactive Oxygen Species) ((ROS)  O2-.)و(OH است (1). این مولکول­ها باعث تخریب غشاء سلولی، ماکرومولکول­ها، آنزیم­ها، اسید­های نوکلئیک، پروتئین­های سلول و DNA می‌شوند (1). در عین حال نقش مهمی در انتقال پیام در مراحل اولیه پاسخ به تنش ایفا می­کنند که موجب فعال شدن مکانیسم دفاعی سلول­ها می­شود. نقش آنتی­اکسیدان­های آنزیمی و غیر آنزیمی در تنش­ها اکسایشی بوده و مانع از صدمات اکسیداتیو و یا کاهش این صدمات می­شوند. از مهمترین آنزیم­های آنتی‌اکسیدان می­توان به سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، پراکسیداز (POX) و کاتالاز (CAT) اشاره کرد. تعادل بین فعالیت­های این آنزیم­ها و سرعت تولید این رادیکال­ها موجب بقای ثبات در غلظت این رادیکال­ها شده و برای سازگاری گیاهان با تنش­ها ضروریست.

ترکیبات غشاء نقش مهمی در حساسیت به سرما دارند. سرما موجب تغییر ترکیبات چربی­های غشایی و کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء سلولی است (8). سوپر اکسید اولین آنزیمی است که در کاهش O2-.نقش دارد و باعث تبدیل O2-. به پراکسید هیدروژن (H2O2) می­شود. سمیت H2O2 به اندازه­ی رادیکال­های سوپر اکسید نیست اما دارای اثرات اکسید کنندگی است. مقدار H2O2 درون سلولی به وسیله فعالیت تعداد زیادی آنزیم کنترل می­شود که CAT و POX ازجمله مهمترین آنها هستند. دمای پایین باعث القاء تغییراتی در مقدار پروتئین­ها و آمینو اسید­هایی همانند پرولین می‌شود. پرولین در تنظیم فشار اسمزی، حفظ یکپارچگی غشاء، برقراری نسبت مناسب NADP /NADPH و پاکسازی رادیکال­های آزاد نقش دارد. انباشتگی پرولین در شرایط تنش به میزان مقاومت گیاه بستگی دارد (1).

مواد فنولیکی، اسید سالیسیلیک (SA) و دیگر مشتقات آن (اسید بنزوئیک، اسید جنریک و اسید استیل اسید سالیسیلیک) ازجمله موادی هستند که باعث ایجاد مقاومت در گیاهان می­شود. مدت زمان زیادی است اسید سالیسیلیک (SA) به ‌عنوان یک مولکول پیغام­ بر در ایجاد مکانیسم­های دفاعی گیاهان عمل می­کند (2). بر طبق نظر راسکین (29) SA باید به‌عنوان یک هورمون طبقه­بندی شود. شواهد زیادی نشان داده که SA در پاسخ به تنش‌هایی مانند دمای بالا و پایین (32)، شوری (10) و عناصر سنگین (27) نقش دارد. کاربرد SA موجب بهبود فعالیت آنتی‌اکسیدان­ها در گیاه شده و به تولید مواد حفاظتی مانند پلی‌آمین­ها کمک می­کند (2). میزان تأثیر SA در ایجاد مقاومت نسبت به تنش وابسته به غلظت، به روش استفاده، وضعیت گیاه، مرحله نموی و مقدار رادیکال­های آزاد سلول بستگی دارد (2). غلظت بالاتر SA باعث تنش اکسیداتیو می­شود که گیاه توانایی مقابله با آن را ندارد و ممکن است منجر به مرگ گیاه شود (20). این ترکیب علاوه بر موارد ذکر شده در فرایندهایی ازجمله تعرق (23)، بسته شدن روزنه­ها (28)، تراوایی غشاء (7)، رشد و فتوسنتز (22) نیز می­تواند تأثیرگذار باشد. این شبه هورمون با ایجاد تأثیرات معنی‌دار بر فتوسنتز، تعرق، جذب و انتقال عناصر و افزایش غلظت کلروفیل منجر به افزایش کارآیی فتوسنتز، تولید بیشتر فرآورده­های فتوسنتزی و در نتیجه افزایش عملکرد و اجزاء عملکرد در گیاهان زراعی می­شود (26). افزایش در تعداد غلاف در ماش سیاه و لوبیا و افزایش عملکرد در گندم ازجمله این نتایج است (33، 30 و 24). در این تحقیق تأثیر محلول­پاشی SA بر شدت اکسیداسیون لیپید­های­ غشائی، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، مقدار پروتئین­های محلول و پرولین در گیاه کلزا در شرایط دمای پایین در شرایط مزرعه­ای بررسی شده و رابطه بین تنش اکسیداتیو و واکنش سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی، مورد مطالعه قرار گرفته است.

مواد و روشها

آزمایش در سال زراعی 89-1388 در مزرعه­ی تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس به اجرا درآمد. ارتفاع محل آزمایش از سطح دریا 1352 متر و مختصات جغرافیایی آن به‌ترتیب`10/510 طول شرقی و `44/350 عرض شمالی بود. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. پس از اجرای عملیات شخم به‌منظور کنترل علف­های هرز، مزرعه با علفکش ترفلان (تری فلورالین به میزان 5/3 کیلوگرم در هکتار) تیمار شد و بعد تیمار­ها به طور تصادفی به واحد­های آزمایشی منتسب گردیدند. مساحت هر کرت در تمامی آزمایش­ها 10 متر شامل 6 خط کاشت با فواصل 35 سانتی­متر و طول 5 متر بود. فاصله­ای به اندازه­ی 5/1 متر بین بلوک­ها و 75/0 متر بین کرت­ها لحاظ گردید. اسید سالیسیلیک در 4 سطح (آب مقطر) 0، 100، 200 و 400 میکرو­ مولار در مرحله طوقه­ای بر روی دو رقم کلزا شامل RGS (بهاره و حساس به سرما) و رقم LICORD (پاییزه و مقاوم به سرما) محلول‌پاشی گردید. زمان محلول‌پاشی با توجه به آمار 30 ساله منطقه با نزدیک شدن دما به محدوده دمایی 7 - 10 درجه سانتی­گراد و داده­های ایستگاه هواشناسی واقع در دانشکده کشاورزی تعیین گردید (30 آبان). نمونه­گیری از برگ کلزا 24 ساعت بعد از محلول­پاشی (اول آبان) انجام شد (جدول 1). به‌منظور سنجش فعالیت آنزیم­ها و تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدها، نمونه­ها در نیتروژن مایع فریز و تا زمان انجام آنالیز­های بیوشیمیایی در فریزر 80- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء: براساس روش هلت و پیکر (18) و با استفاده از اندازه­گیری مالون­دی­آلدئید (MDA) به‌عنوان فرآورده­ی نهایی پراکسیداسیون لیپیدی غشاء انجام شد. بدین منظور 3/0 گرم از بافت تازه گیاهی در 3 میلی­لیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد (وزن به حجم) عصاره گیری شد. سپس به 1 میلی­لیتر از سوسپانسیون صاف شده 1 میلی­لیتر تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد (وزن به حجم) اضافه شد و در حمام آب گرم (100 درجه سانتی­گراد) به مدت 30 دقیقه قرار گرفت. سپس لوله­ها از حمام خارج و پس از سرد شدن، میزان مالون دی آلدئید با اندازه­گیری جذب در طول موج­های 532 و 600 نانو­متر و با استفاده از ضریب خاموشی (ε=155 μM -1cm) محاسبه شد.

عصاره­گیری برای سنجش فعالیت آنزیمی و پروتئین: برای سنجش فعالیت آنزیمی و پروتئین 2/0 گرم از بافت گیاهی تازه منجمد شده در نیتروژن مایع در بافر پتاسیم فسفات 05/0 مولار، 7 =pH در دمای 4-0 درجه سانتی­گراد سائیده و عصاره­گیری شد، سپس همگن حاصل در 12000 دور در دقیقه در دمای 4-2 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول روشناور برای سنجش فعالیت آنزیم­ها و مقدار پروتئین محلول مورد استفاده قرار گرفت.

پروتئین: مقدار پروتئین نمونه­ها بر طبق روش برادفورد (11) تعیین شد. بدین منظور 1 میلی­لیتر از محلول برادفورد به همراه 100 میکرولیتر عصاره­ی آنزیمی پس از مخلوط شدن کامل، در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار گرفت و جذب محلول در طول موج 595 نانومتر ثبت شد. غلظت پروتئین بر حسب میلی­گرم بر گرم بافت تازه با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد.

فعالیت آنزیم SOD: بر طبق روش گیانوپولیتیز و ریز (16) انجام شد. مخلوط واکنش، شامل بافر پتاسیم فسفات 50 میلی ­مولار حاوی EDTA 1/0 میلی ­مولار، کربنات سدیم 50 میلی­ مولار با 2/10=pH، L-methionine 12 میلی­ مولار، نیتروبلوتترازولیوم 75 میلی ­مولار، ریبوفلاوین 1 میکرو ­مولار و 200 میکرولیتر عصاره­ی آنزیمی بود. نمونه­ها به مدت 15 دقیقه در معرض نور قرار گرفت و پس از این مدت جذب آنها در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. همچنین از یک لوله­ی آزمایش حاوی مخلوط واکنش بجز عصاره­ی آنزیمی به‌عنوان شاهد استفاده شد. یک واحد فعالیت SOD به‌عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 50 درصد احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم می­گردد و فعالیت آن به میلی­گرم بر گرم پروتئین وزن تر بر حسب تغییرات جذب در دقیقه بیان شد.

سنجش فعالیت آنزیم POX: سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز بر طبق روش قناتی و همکاران (15) انجام شد. فعالیت آنزیمی با افزودن مقادیر مناسب از عصاره­ی آنزیمی، بافر، گایاکول با غلظت نهایی 28 میلی ­مولار و پراکسید هیدروژن با غلظت نهایی 5 میلی ­مولار در طول موج 470 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین و فعالیت آنزیمی به میلی­گرم بر گرم پروتئین وزن تر بر حسب تغییرات جذب در دقیقه بیان شد.

فعالیت آنزیم CAT: سنجش فعالیت آنزیم CAT به روش ککمک و هورست (12) انجام شد. بر این اساس از عصاره آماده شده در مرحله قبل استفاده شد. مخلوط واکنش شامل عصاره­ی آنزیمی، بافر پتاسیم فسفات و پراکسید هیدروژن با غلظت نهایی 10 میلی ­مولار بود. تجزیه آب اکسیژنه با کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر پیگیری و به میلی­گرم بر گرم پروتئین وزن تر بر حسب تغییرات جذب در دقیقه بیان شد.

فعالیت PPO: سنجش فعالیت PPO بر طبق روش قناتی و همکاران (15) تعیین گردید. مخلوط واکنش، شامل 100 میکرو­لیتر از عصار­ه­ی آنزیمی، 500 میکرولیتر آب اکسیژنه 5 میلی ­مولار و 500 میکرو­لیتر متیل­کاتکول 02/0 مولار در 1900 میکرو­لیتر بافر پتاسیم فسفات است. افزایش در جذب در طول موج 410 نانومتر محاسبه و فعالیت آنزیمی به میلی­گرم بر گرم پروتئین وزن تر بر حسب تغییرات جذب در دقیقه بیان شد.

پرولین: پرولین برگ بر طبق روش بیتس (9) مشخص شد. بدین منظور 2/0 گرم بافت برگ توزین و در هاون چینی در 3 میلی‌لیتر اسید سولفوسالیسیلیک 3 درصد به خوبی سائیده شد. همگن حاصل با دور 18000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس 2 میلی‌لیتر معرف ناین هیدرین و 2 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال اضافه شد. پس از بستن در لوله­ها، به مدت 1 ساعت در حمام آب داغ (°C 100) قرار داده ­شد. پس از سرد شدن به هر کدام از لوله­ها 4 میلی‌لیتر تولوئن اضافه گردید و با استفاده از دستگاه ورتکس به مدت 15 ثانیه تکان داده شدند. روشناور را که به رنگ قرمز و حاوی پرولین محلول در تولوئن بود، برداشته و همزمان با نمونه­های استاندارد در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار گرفت و جذب نمونه­ها در طول موج 520 نانومتر قرائت گردید. غلظت پرولین بر حسب میلی­گرم بر گرم بافت تازه برگ با استفاده از منحنی استاندارد تعیین شد.

به‌منظور بررسی عملکرد، برداشت (4 تیر ماه 1389) به صورت دستی و با داس از فاصله­ی 4 تا 5 سانتی­متری سطح زمین، هنگامی که 30 تا40 درصد بذرها از حالت سبز به قهوه­ای تا سیاه تغییر رنگ داده بودند انجام شد. مساحت برداشت شده­ی هر کرت از 4 ردیف میانی با لحاظ کردن اثر حاشیه، بالغ بر 1 مترمربع بود. بوته­های برداشت شده به دانه و کاه تقسیم گردید و در آون 60 درجه سانتی­گراد برای مدت 72 ساعت قرار داده شدند. عملکرد دانه براساس رطوبت 10 درصدی دانه محاسبه گردید. تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار SAS انجام شد. برای مقایسه میانگین­ها از آزمون چند دامنه­ای دانکن )05/0>P ) استفاده گردید.

نتایج

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 1) نشان داد که بین دو رقم بهاره و پاییزه در شرایط کشت مزرعه­ای اختلاف معنی­داری از نظر صفات اندازه­گیری شده وجود دارد )05/0>P ) و تیمار غلظت­های مختلف SA نیز سبب ایجاد تفاوت معنی­داری در صفات اندازه­گیری شد )01/0>P ).

محلول‌پاشی با SA به طور معنی­داری باعث کاهش MDA در برگ گیاه کلزا (بجز غلظت 400 میکرو مولار در رقم حساس) شد (جدول 2)، به‌طوری‌که با افزایش غلظت از میزان MDA کاسته شد (جدول 2). تیمار 400 میکرو مولار دارای کمترین میزان MDA در برگ رقم مقاوم بود اما در رقم حساس تیمار 400 میکرو مولار از اثر بخشی SA کاست، به‌طوری‌که باعث افزایش MDA در برگ رقم حساس گردید (جدول 2).

 

جدول 1- تجزیه واریانس میانگین مربعات صفات مورد بررسی در دو رقم کلزا تحت تأثیر غلظت­های مختلف اسید سالیسیلیک

منابع تغییر

درجه آزادی

MDA

SOD 

POX 

CAT

PPO 

پروتئین

پرولین 

عملکرد بذر در هکتار

وزن خشک اندام هوایی

تکرار

2

0014/0

0021/0

00003877/0

0012/0

00000008/0

3423/1

036/0

17/0

32/0

رقم

1

**528/0

**1546/4

**0125/0

**0061/0

**0003/0

**9860/13

**2986/2

041/0

**24/27

غلظت SA

3

**171/0

**3316/0

**0035/0

**0039/0

**00002/0

**3926/37

**3184/1

*32/0

16/4

اثر متقابل

3

**172/0

**0714/0

**0030/0

**0042/0

**00008/0

**5504/31

**2099/1

01/0

41/3

خطای آزمایشی

14

00086/0

0049/0

000059/0

000048/0

0000004/0

4954/0

027/0

089/0

97/1

% ضریب تغییرات

 

85/2

23/6

26/7

48/6

03/6

75/3

74/8

30/18

74/16

بدون علامت و **  به‌ترتیب بدون معنی و معنی‌داری در سطح احتمال 1 درصد

جدول 2- تأثیر محلول­پاشی با اسید سالیسیلیک (میکرو مولار) بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان و متابولیت­های غیر آنزیمی در دو رقم کلزا با تحمل متفاوت به سرما

رقم

غلظت

MDA

SOD 

POX 

CAT

PPO 

پروتئین

پرولین

عملکرد بذر در هکتار

وزن خشک اندام هوایی

RGS (حساس)

0

b20667/1

b3902/1

e0499/0

a1453/0

c0081/0

e6985/14

e4397/1

ab4933/1

c 443/6

100

c14667/1

b4534/1

cd1141/0

c0690/0

d0070/0

b4396/19

de4811/1

a 0133/2

c 333/7

200

d07667/1

a6473/1

bc1258/0

d0520/0

de0061/0

ab1807/20

cde6699/1

ab6067/1

c 443/7

400

a29333/1

a6839/1

e0435/0

b0980/0

e0058/0

d6288/17

bc8104/1

ab5900/1

bc 110/8

 Licord(مقاوم)

0

a33667/1

e4280/0

d1027/0

a1413/0

b0113/0

ab8369/19

cbd7663/1

ab5167/1

bc 190/8

100

e90000/0

e5045/0

ab1376/0

a1430/0

b0112/0

a0990/21

b9948/1

 a9467/1

a943/10

200

f69333/0

d7363/0

bc1267/0

a1330/0

a0176/0

bc1415/19

a5457/3

 b3967/1

ab443/10

400

g60667/0

c1775/1

a1489/0

c0750/0

a0166/0

9773/17 cd

ced5665/1

ab5100/1

bc277/8

در هر ستون میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی‌دار در سطح 5 درصد می­باشند.

واحد فعالیت آنزیمی: میلی­گرم بر گرم پروتئین وزن تر بر حسب تغییرات جذب در دقیقه. واحد پروتئین و پرولین: میلی­گرم بر گرم وزن تر. واحد مالون­دی­آلدهید: میکرو­ مولار بر سانتی­متر

 

 

فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان بشدت تحت تأثیر رقم و غلظت­های مختلف SA قرار گرفت. بیشترین فعالیت آنزیم SOD در رقم حساس و با بالاترین غلظت SA (400 میکرو مولار) بدست آمد (جدول 2). میزان فعالیت آنزیم SOD در رقم مقاوم با افزایش غلظت سیر صعودی داشت اما در رقم حساس بین غلظت 200 و 400 میکرو مولار اختلافی وجود نداشت (جدول 2). نتایج نشان می­دهد که در رقم مقاوم با افزایش غلظت بر میزان فعالیت آنزیم POX افزوده ­شد، به‌طوری‌که بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در رقم مقاوم و با غلظت 400 میکرو مولار بدست آمد. در رقم حساس بیشترین میزان فعالیت آنزیم POX در غلظت 200 میکرو مولار بدست آمد و با افزایش غلظت به 400 میکرو مولار از میزان فعالیت POX کاسته شد (جدول 2).

فعالیت آنزیم CAT به طور معنی­داری تحت تیمار SA کاهش یافت. بیشترین مقدار حساسیت آنزیم CAT در رقم حساس و بدون تیمار SA مشاهده شد. در رقم مقاوم بین شاهد و غلظت 100 و 200  تفاوت معنی­داری مشاهده نشد اما غلظت 400 میکرو مولار باعث کاهش مقدار فعالیت آنزیم CAT گردید. افزایش غلظت از 200 به 400 باعث افزایش فعالیت این آنزیم در رقم حساس شد (جدول 2). فعالیت آنزیم PPO نیز تحت تأثیر غلظت SA قرار گرفت و بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در رقم مقاوم و با غلظت 200 میکرو مولار SA مشاهده شد اما افزایش غلظت SA به 400 میکرو مولار تأثیری در فعالیت این آنزیم نداشت. در رقم حساس افزایش غلظت منجر به کاهش فعالیت این آنزیم شد (جدول 2).

 

 

شکل 1- تأثیر محلول­پاشی با اسید سالیسیلیک بر عملکرد بذر در دو رقم کلزا با تحمل متفاوت به سرما

در هر ستون میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک در هر ستون، فاقد اختلاف آماری معنی‌دار در سطح 5 درصد می­باشند.

شکل 2- تأثیر رقم بر وزن خشک اندام هوایی کلزا

در هر ستون میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک در هر ستون، فاقد اختلاف آماری معنی‌دار در سطح 5 درصد می­باشند.

 

بیشترین غلظت پروتئین محلول در رقم مقاوم با غلظت 100 میکرو مولار مشاهده شد اما افزایش غلظت SA باعث کاهش مقدار پروتئین محلول شد، به طوری ­که مقدار پروتئین محلول در تیمار 400 میکرو مولار نسبت به شاهد مربوطه کمتر بود. پروتئین محلول در رقم حساس با غلظت 200 میکرو مولار بیشترین غلظت را داشت اما با افزایش غلظتSA  از مقدار پروتئین محلول کاسته شد (جدول 1). بطور کلی محلول­پاشی گیاهان با SA باعث افزایش غلظت پرولین در هر دو رقم شد (بجز رقم مقاوم در غلظت 400 میکرو مولار SA) و بیشترین غلظت پرولین در رقم مقاوم با غلظت 200 میکرو مولار SA بدست آمد و در رقم حساس افزایش غلظت SA باعث افزایش غلظت پرولین شد (جدول 2).

عملکرد بذر در هکتار تنها تحت تأثیر غلظت SA قرار گرفت، به‌طوری‌که بیشترین میزان بذر در هکتار در غلظت Mµ 100 بدست آمد و با افزایش غلظت از میزان عملکرد بذر کاسته شد (شکل 1). عملکرد ماده خشک در هکتار نیز تنها تحت تأثیر تیمار رقم قرار گرفت، به گونه­ای که رقم مقاوم دارای بیشترین میزان ماده خشک در هکتار بود (شکل 2).

بحث

شرایط نامناسب محیطی منجر به افزایش ROS می­شود که خود عاملی برای پراکسیده شدن لیپید­های غشاء و تولید MDA است (1). در این تحقیق SA باعث کاهش MDA شد که احتمالاً به علت کاهش اثرات مخرب رادیکال­های آزاد و حفاظت از غشاء توسط SA باشد که بدین وسیله از صدمه به اسید­های چرب غیر اشباع و کاهش نفوذپذیری غشاء جلوگیری می­شود. نتایج این تحقیق با نتایج ونگ و همکاران (34) مطابقت دارد. نتایج حکایت از آن داشت که محلول­پاشی با SA باعث کاهش و یا به تعویق انداختن خسارت اکسیداتیو ناشی از دمای پایین می­شود. علاوه بر این گزارش شده که SA موجب کاهش MDA تولید شده در تنش شوری در برگ­ها و ریشه­های گیاهان جو می­باشد (14).

آنیون­های سوپراکسید تولید شده در شرایط تنش موجب افزایش تنفس سلولی و تولید یون­های مخرب در میتوکندری می­شود. در چنین شرایطی فعالیت آنزیم SOD به­عنوان یک آنزیم از بین برنده­ی یون سوپراکسید، مشابه نتایج بدست آمده افزایش می­یابد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که محلول­پاشی گیاهان با 200 میکرو مولار SA باعث افزایش فعالیت SOD گردید. افزایش فعالیت این آنزیم منجر به سمیت‌زدایی بیشتر سوپر اکسید و کاهش آسیب­های حاصل در گیاه می­شود. احتمالاً SA عاملی برای کاهش اثرات مخرب دمای پایین می­باشد و از طریق افزایش فعالیت آنزیم­ها باعث افزایش مقاومت به سرما می شود.

طبق نتایج بدست آمده فعالیت آنزیم­های POX و PPO در رقم مقاوم بیش از رقم حساس بود (بدون محلول‌پاشی) و محلول‌پاشی برگ­ها با SA سبب افزایش فعالیت این آنزیم­ها (بجز  PPOدر رقم حساس) گردید (جدول 2). پلی فنل اکسیداز یک اکسید کننده فنل می­باشد و شرایط تنش، فعالیت PPO به‌عنوان شاخصی برای سنجش مقاومت گیاهان نسبت به تنش­های محیطی است. ارقام مقاوم دارای فعالیت بیشتری از PPO می­باشند (34) و دلیل آن هم افزایش تولید فنل­های دیواره و لیگنین است که اندام­های گیاهی را سخت و مقاوم به یخ‌زدگی می­کند. همچنین گزارش شده در گیاهانی مانند کلزا فعالیت PPO توسط جاسمونات­ها افزایش می­یابد (34). پراکسیداز مسئول حذف مقادیر اضافی H2O2 می­باشد. SA به‌عنوان دهنده­ی الکترون برای POX عمل می‌کند که باعث افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان می­شود. نتایج پژوهشی که بر روی ذرت انجام شد نشان داد که غلظت 5/0 میلی­مولار SA و دیگر ترکیبات فنولیک باعث افزایش مقاومت به سرما در گیاهچه­های ذرت می­شود. این افزایش مقاومت به دلیل افزایش فعالیت POX و کاهش در فعالیت CAT بود (19 و 23). در این آزمایش SA سبب کاهش فعالیت آنزیم CAT شد. به طور معمول در شرایط تنش از میزان فعالیت CAT کاسته شده، در حالی که میزان فعالیت سایر آنزیم­ها دفاعی افزایش می­یابد (20). از آنجایی که SA بازدارند­ه­ی فعالیت آنزیم CAT در نتیجه افزایش H2O2 را به همراه خواهد داشت (19). اگرچه H2O2 در غلظت­های بالا سمی است و به وسیله آنزیم CAT و آسکوربات پراکسیداز تجزیه می شود اما در غلظت­های پایین می­تواند نقش پیام را در فرایند­های انتقال پیام بازی کند و ژن­های وابسته به مقاومت در گیاه را فعال کند (17). بنابراین تعادل بین فعالیت دو آنزیم POX و CAT نقش مهمی در کارکرد سیستم دفاعی دارد. نتایج نشان داده که SA با باند شدن به آنزیم CAT سبب کاهش فعالیت آن در توتون (13) و چند گونه گیاهی می­شود (32). به نظر می­رسد افزایش SOD و POX توسط SA با پاکسازی گونه­های فعال اکسیژن از تنش­های اکسیداتیو جلوگیری کرده و باعث افزایش مقاومت در گیاه می­شود. اسید سالیسیلیک با فراهم کردن انرژی از طریق تولید NADPH موجب فعالیت سیستم دفاعی گیاه می­شود. از آنجا که NADPH خود یک احیا کننده ضعیف می­باشد، استعمال بیش از اندازه SA موجب تولید بیش از اندازه این ماده می­شود و از آنجا که گیاه به علت شرایط تنش (بسته شدن روزنه­ها و توقف ورود CO2 به درون مرکز فتوسنتز) توانایی استفاده از تمام NADPH را ندارد، ازاین‌رو موجب خسارت دیدن اندام­های سلولی می­شود. بنابر­این استفاده از غلظت­های بالای SA نه تنها برای گیاه مفید نمی­باشد، بلکه توانایی وارد کردن خسارت به گیاه را نیز دارد (20). رادیکال­های آزاد می­توانند به ساختار پروتئین آسیب زده و کاهش مقدار پروتئین را در پی داشته باشند (26). رادیکالهای آزاد اکسیژن میل ترکیبی بالایی با پروتئین­ها داشته و سبب اکسید شدن آنها می شوند. ازاین‌رو مقدار پروتئین به نسبت بین سنتز و تجزیه رادیکال­های آزاد بستگی دارد. کاهش مقدار پروتئین و افزایش نیترات، آمونیوم و اسید­های آمینه آزاد در شرایط شوری و کم آبی در گیاهان لوبیا و ذرت را گزارش کرده اند (31 و 1).

تجمع ترکیباتی با وزن مولکولی پایین، pH خنثی و بسیار محلول ازجمله مکانیسم­های عمومی گیاهان برای کاهش خسارت می­باشد. این ترکیبات باعث حفظ فشار اسمزی، تثبیت ساختار پروتئین و حفظ غشاء در شرایط تنش می‌شوند. ازاین‌رو نقش مهمی در سازگاری سلول به استرس­های مختلف دارند. تجمع پرولین به علت تخریب پروتئین سینتتاز و کاهش تبدیل پرولین به پروتئین بوده که در نتیجه باعث کاهش رشد می­گردد (26 و 35). در شرایط تنش پروتئین گیاه صرف تولید پرولین می­شود. بنابراین تولید اندام گیاهی در چنین شرایطی متوقف شده و کاهش رشد اندام گیاهی را شاهد خواهیم بود. در این تحقیق نیز SA باعث افزایش میزان پرولین گیاه شد که می­تواند منجر به افزایش مقاومت گیاه در برابر تنش شود. آپوستولووا و همکاران (6) مشاهده کردند که سرما باعث افزایش پرولین در گندم بهاره شد. تجمع پرولین در مواجه با تنش شوری (31) و H2O2 نیز گزارش شده است (8). کاربرد 5/0 میلی ­مولار SA باعث افزایش پرولین و کاهش اثرات مخرب شوری بر رشد عدس شد (31).

فتوسنتز فرایند­ی فیزیولوژیک است که تأثیر بسزایی در رشد و عملکرد گیاهان زراعی دارد. همچنین اثبات شده که تنظیم کننده­های رشد می­توانند نخست باعث بهبود کارایی فرایندهای فیزیولوژیک مرتبط با فتوسنتز ­شوند؛ درثانی با افزایش انتقال آسیمیلات­ها از منبع به مخزن موجب افزایش توده­ی خشک گیاهی و افزایش عملکرد دانه گردند (36). نقش SA در بهبود فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز به اثبات رسیده است. غلظت Mµ 10 SA باعث افزیش فعالیت نیترات ردوکتاز نسبت به عدم مصرف شد (4) که نشان‌دهنده­ی تأثیر SA در فرایند جذب نیتروژن در گیاه نخود و کلزا می­باشد (4 و 5).

تأثیر SA در تعدیل پاسخ گیاه و افزایش فعالیت آنزیم­ها در محدوده­ی وسیعی از تنش­های اکسیداتیو گزارش شده است. افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان ممکن است راهی برای تحمل گیاه به تنش­های محیطی باشد و از آنجایی­که مصرف 200 و 400 میکرو مولار SA باعث کاهش فعالیت سوپراکسید نسبت به شاهد شد، می­توان نتیجه گرفت که ممکن است این ماده به طور غیرمستقیم در از بین بردن رادیکال­های آزاد نقش داشته باشد.

1-  دولت آبادیان. آ، مدرس ثانوی. ع، شرفی.م. (1388). اثر تنش کم آبی و محلولپاشی اسید آسکوربیک بر میزان فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان و برخی تغییرات بیوشیمیایی در برگ ذرت دانه ای (Zea maize L.). مجله زیست شناسی ایران. 422-407 : (3) 22

2-  شبانی. ل، احسان پور. ع.الف. (1388). القاء آنزیمهای آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولیک و فلاونوئید در کشت در شیشه شیرین بیان (L. Glycyrrhiza glabra) با استفاده از متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید. مجله زیست شناسی ایران. 703-691 : (4) 22

3-  مهدوی. ب، مدرس ثانوی. ع، آقا علیخانی. م. (1388). بررسی اثر سویه و دماهای مختلف منطقه ریشه بر صفات مورفولوژیکی و تثبیت نیتروژن سه رقم خلر (Lathyrus sativus L.). مجله زیست شناسی ایران. 681-671 : (4) 22   

 

4-   Ahmad, A. )1988(. Nitrate accumulation and nitrate reductase activity during rooting of pea cuttings treated with auxins. Indian J. exp. Biol. 26: 470-472.

5-   Ahmad, A., Hayat, S., Fariduddin, Q. and Ahmad, I. )2001(. Photosynthetic efficiency of plants of Brassica juncea treated with chlorosubstituted auxins. Photosynthetica. 39: 565-568.

6-   Apostolova, P., Yordanova, R. and Popova, L. (2008). Response of antioixidative defence system to lowtemperature stress in two wheat ultivar. Gen. Appl. Plant Physiology, Special Issue. 34(3-4):281-294.

7-   Barkosky, R.R. and Einhellig, F.A. )1993(. Effects of salicylic acid on plant water relationship. J. Chem. Ecol. 19:237-47.

8-   Basaga, H.S. (1989). Biochemical aspects of free radicals. Biochemistry of Cell Biology. 68:989-998.

9-   Bates, L. S., Waldern R. P and Teave I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and soil. 39:205-207.

10-Borsanio O., Valpuesta V. and Botella M. A. (2001). Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stess in Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 126: 1024-1030.

11-Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annual Review Biochemistry.72:248-254.

12-Cakmak, I. and Horst, W. (1991). Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities in root tip of soybean (Glysin max). Plant Phisiology.83:463-468.

13-Chen, Z, Ricigliano JR, Klessig DF. (1993a). Purification and characterization of a soluble salicylic acid binding protein from tobacco. Proc Natl. Acad. Science. USA. 90: 9533-9537.

14-El-Tayeb M. A. (2005). Response of barley Gains to the interactive effect of salinity and salicylic acid. Plant Growth Regulation. 45: 215-225.

15-Ghanati, F. Morita, A and Yokota, H. (2002). Induction of suberin and increase of liginin content by exess Boron in Tabacco cell. Soil Science. Plant Nutrition. 48:3:357-364.

16-Giannopolitis, C and Ries, S. (1977). Superoxid desmutase. I.Occurence in higher plant. Plant Physiology. 59:309-314.

17-Hausladen, A. And alscher, R. G. (1993). Glutathione-active oxygen. In: Alscher, R. G. And Hess, J. L. (eds) Antioxidants in Higher Plants. CRC Press, Boca Raton. Pp: 12-15.

18-Heath, R. L. and Packer, L. (1969). Photoperoxidation in isolated choloroplast. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of biochemistry and biophysics. 125: 189-198.

19-Horváth, E., Janda, T., Szalai, G. and  Páldi, E. (2002). In vitro salicylic acid inhibition of catalase activity in maize: differences between the isoenzymes and a possible role in the induction of chilling tolerance. Plant Science. 163:1129-1135.

20-Horváth, E., Szalai, G. and Janda T. (2007). Induction of Abiotic Stress Tolerance by Salicylic Acid Signaling: Review. Plant Growth Regulation. 26:290–300.

21-Janda, T., Szalai, G. Tari, I and Paldi, E. (1999). Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta. 208:175-180.

22-Khan, W., Prithiviraj, B. and Smith, D. 2003. Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. Plant Physiol. 160: 485-92.

23-Larque Saavedra, A. )1979(. Stomatal closour in response to acetylsalicylic acid treatment. Z Pflannzen physiol. 93:371-5.

24-Lopez, T.R. )1989(. Evaluacidn de acido salicflico para incrementar ndmero de granos por espiga y rendimiento en trigo Triticum durum var. Altar C-84, Valle de1 Yaqui, Son, tesis de licenciatura, Instituto Tecnologico de Sonora.

25-Mehler, A.H. (1951). Studies on reactivities of illuminated chloroplasts. I. mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Architect of  Biochemistry Biophysics. 33:65-77.

26-Mittler, R. (2006). Abiotic stress, the field environment and stress combination. Trends Plant Science. 11: 15–19

27-Patrick, Mc C., Zuoxing, Z., Jennifer, L. P. and Kalidas, S. (2000). A model for enhanced pea seedling vigour following low pH and salicylic acid treatments. Process Biochemistry 35: 603–613.

28-Rai, V.K., Sharma, S.S. and Sharma, S. )1986(. Reversal of ABA induced stomatal closure by phenolic compounds. J. Exp. Bot. 37:129–34.

29-Raskin, I, (1992). Role of salicylic acid in plants. Annual. Review. Plant Physiology Plant Mol. Biol. 43: 439–463.

30-Rendon, S.L.A. )1983(. Control hormonal de la abscisidn de organos reproductivos en Phaseolus vulgaris L. cv. Cacahuate-72, tesis de Maestrfa en ciencias, C.P., Chapingo, Mexico.

31-Reza, S., Heidari, R., Zare, S. and Norastehnia, A. (2006). Antioxidant response of two salt-stressed barley varieties in the presence or absence of exogenous proline. Gen. Appl. Plant Physiol. 32(3-4): 233-251.

32-Senaratna, T., Touchell, D., Bunn E., Dixon K. (2000). Acetyl salicylic acid (Aspirin) and salicylic acid induce multiple stress tolerance in bean and tomato plant. Plant Growth Regul. 30, 157–161.

33-Singh, G. and Kaur, M. )1980(. Effect of growth regulators on podding and yield of mung bean (Vigna radiata L. cv Wilczek), Indian J. Plant Physiol. 23: 366-370.

34-Wang, Y., Yang, Z.M., Zhang, Q. F. and Li, J. L. (2009). Enhanced chilling tolerance in Zoysia matrella by pre-treatment with salicylic acid, calcium chloride, hydrogen peroxide or 6-benzylaminopurine. Biologia Plantarum.. 53 (1): 179-182.

35-Yoshiba, Y., Kiyosue, T., Nakashima, K., Kamayushi-shino zaki, K. and Shinozaki, K. (1997). Regulation of levels of proline as an osmolyte in plants under water stress. Plant and Cell Physiology. 38,1095-1102.

36-Zhao, H.J., Lin, X.W., Shi, H.Z. and Chang, S.M. )1995(. The regulating effect of phenolic compounds on the physiological characteristics and yield of soybeans. Acta Agro. Sci. 21:351-5.