نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

گردو از درختان بسیار با ارزشی است که در ایران به طور وسیعی کشت می­گردد و میکروارگانیسم­های متنوع و زیادی شامل عوامل مفید و مضر با آن در ارتباط هستند. تحقیقات صورت گرفته در ارتباط با شناسایی میکروارگانسیم­های مرتبط با درختان گردو در ایران بیشتر به عوامل بیماری­زای گیاهی معطوف شده است. بنابراین، در این بررسی با هدف شناسایی گونه­های تریکودرمای مرتبط با ریشه و فراریشه درختان گردو، طی نمونه­برداری از 68 منطقه گردوکاری استان همدان، 235 جدایه قارچ تریکودرما جداسازی شد و با استفاده از مشخصات ریخت­شناسی مورد شناسایی قرار گرفتند. در این بررسی میزان رشد، مشخصات ماکروسکوپی و میکروسکوپی آنها مانند شکل، اندازه و سایر ویژگیهای کنیدیوم، کنیدیوفور، فیالید، کلامیدسپور، ریسه­های هوایی و ریسه­های رشد کرده در داخل محیط کشت به همراه آزمون دمایی، جهت شناسایی جدایه­ها در سطح گونه مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت شش گونه­ی تریکودرما شامل Trichoderma atroviride، T. brevicompactum، T. citrinoviride، T. ghanense،  T. harzianum و T. longibrachiatum تشخیص داده شد. با توجه به نتایج به دست آمده و نقش مثبت گونه­های تریکودرما در ارتقاء سلامتی محصولات زراعی و باغی، لزوم توجه بیشتر در زمینه حفظ، حمایت و استفاده از این میکروارگانیسم­ها در مدیریت باغبانی درختان گردو پیشنهاد می­شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Identification of Trichoderma spp. Related to Root and Rhizosphere of Walnut in Hamedan Province

چکیده [English]

Walnut is one of the most important trees that are cultivated in the large area in Iran. Various microorganisms comprising useful and harmful agents are associated with walnut root and rhizosphere. Almost all of the studies carried out for identification of microorganisms related to walnut until now, have been achieved on plant pathogen agents. Therefore in this research isolation and identification of Trichoderma spp. associated to walnut root and rhizosphere was studied. Sampling has performed of 68 places from Hamedan province and 235 isolates of Trichoderma were obtained. Macroscopic and microscopic features such as shape and size of conidium, conidiophore, phialide, chlamydospore, presence of aerial and submerged mycelia on culture media and growth rate as well as temperature examination data were used for identification of Trichoderma species. Consequently six species comprising T. atroviride, T. brevicompactum, T. citrinoviride, T. harzianum, T. ghanense and T. longibrachiatum were identified. Regarding to positive role of Trichoderma related to root and rhizosphere that cause increasing health and improving growth of plants, this study recommend a kind of horticultural management that could be able to protect and  support these fungi in walnut root and rhizosphere. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Trichoderma
  • Walnut
  • rhizosphere
  • Fungus
  • Hamedan

شناسایی گونه­های تریکودرمای مرتبط با ریشه و فراریشه گردو در استان همدان

دوستمراد ظفری*،1، صدیقه کریمی1 و روشن محمدی2

1 - همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی

2- زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 5/4/89                 تاریخ پذیرش: 22/1/91 

چکیده

گردو از درختان بسیار با ارزشی است که در ایران به طور وسیعی کشت می­گردد و میکروارگانیسم­های متنوع و زیادی شامل عوامل مفید و مضر با آن در ارتباط هستند. تحقیقات صورت گرفته در ارتباط با شناسایی میکروارگانسیم­های مرتبط با درختان گردو در ایران بیشتر به عوامل بیماری­زای گیاهی معطوف شده است. بنابراین، در این بررسی با هدف شناسایی گونه­های تریکودرمای مرتبط با ریشه و فراریشه درختان گردو، طی نمونه­برداری از 68 منطقه گردوکاری استان همدان، 235 جدایه قارچ تریکودرما جداسازی شد و با استفاده از مشخصات ریخت­شناسی مورد شناسایی قرار گرفتند. در این بررسی میزان رشد، مشخصات ماکروسکوپی و میکروسکوپی آنها مانند شکل، اندازه و سایر ویژگیهای کنیدیوم، کنیدیوفور، فیالید، کلامیدسپور، ریسه­های هوایی و ریسه­های رشد کرده در داخل محیط کشت به همراه آزمون دمایی، جهت شناسایی جدایه­ها در سطح گونه مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت شش گونه­ی تریکودرما شامل Trichoderma atroviride، T. brevicompactum، T. citrinoviride، T. ghanense،  T. harzianum و T. longibrachiatum تشخیص داده شد. با توجه به نتایج به دست آمده و نقش مثبت گونه­های تریکودرما در ارتقاء سلامتی محصولات زراعی و باغی، لزوم توجه بیشتر در زمینه حفظ، حمایت و استفاده از این میکروارگانیسم­ها در مدیریت باغبانی درختان گردو پیشنهاد می­شود.

واژه­های کلیدی: Trichoderma، گردو، فراریشه، قارچ، همدان

* نویسنده مسئول،  تلفن: 4424190-0811، پست الکترونیکی: zafari_d@yahoo.com

مقدمه

 

گردو (Juglans) از خانواده Juglandaceae و دارای سه گونه J. regia L.، J. cinerea L و J. nigra L. است که در ایران تنها گونه J. regia می­روید که بیشتر در نواحی غربی، شمالی و جنوبی کشور گسترش دارد. گردو از درختان چند منظوره و مورد علاقه کشاورزان و جنگل­بانان است که از زمانهای قدیم به واسطه استفاده از میوه و چوب آن همواره مورد توجه قرار گرفته است. بیشتر محققان گردو را بومی ایران و قسمتهایی از شرق آسیا تا آسیای میانه و کوههای تبت، نپال، شمال هند، پاکستان و افغانستان می­دانند. به همین جهت نام گردوی ایرانی (Persian Walnut) مورد استفاده محققان باغبانی در سطح جهان قرار گرفته است، هر چند که تنی چند از محققین به درستی یا نادرستی آن را گردوی انگلیسی (English Walnut) می­نامند (8). بر اساس آمار سازمان خواروبار جهانی (FAO)، ایران در سال 2007 میلادی با 170 هزار تن تولید گردو، مقام چهارم را در جهان پس از کشورهای چین، آمریکا و ترکیه به خود اختصاص داده است. این در حالی است که در فواصل سالهای 2006-1997 میلادی، ایران همواره حائز مقام سوم و ترکیه در رتبه چهارم جهانی قرار داشته است (15).

هر  چند  که  افزایش  سطح  زیر  کشت ،  شناسایی  ارقام

پرمحصول و با کیفیت مطلوب از جمله راهکارهای پیشنهاد شده برای بازیابی و ارتقای موقعیت این محصول استراتژیک در سطح جهانی عنوان شده است اما شناسایی میکروارگانیسم­های مفید فراریشه این درخت جهت کنترل تلفیقی آفات و بیماریهای گیاهی، تقویت رشد و طول عمر آن و در نهایت افزایش عملکرد نیز از اهمیت ویژه­ای برخوردار است.

در تحقیقات صورت گرفته در ارتباط با میکروارگانیسم­های ریشه و فراریشه درختان گردو در ایران، به جز تحقیق مختصری روی میکوریزهای همزیست با ریشه این درختان (1)، غالب بررسیها به مطالعه عوامل بیمارگر خاک­زاد ریشه و طوقه این درختان محدود شده است. در همین راستا، قارچهای Phytophthora cactorum (Lebert & Cohn) J. Schröt ، P. citricola Sawada و P. citrophthora (R.E. Sm. & E.H. Sm.) Leonian به عنوان مهم­ترین عامل پوسیدگی ریشه و طوقه درختان گردو در استانهای فارس، کرمان و کهگیلویه و بویر احمد گزارش شده است (6). همچنین جدایه­هایی از Fusarium spp.، Verticillium dahliae Kleb.، Rhizoctonia solani J. G. Kühn، Phytophthora spp.، Armillaria spp.، Phymatotrichum spp. (3) و گونه­های متعدد نماتد­های بیمارگر موجود در فراریشه درختان گردو (7) جدا گردیده است.

گونه­های قارچی جنس تریکودرما در عملکرد زیستگاههای خاکی نقش کلیدی ایفاء می­کنند (20). گونه­های مختلف متعلق به جنس تریکودرما را می­توان از تمام خاکها، چوبهای در حال فساد، کمپوست و یا سایر مواد آلی جداسازی نمود. بسیاری از گونه­های تریکودرما به دلیل توانایی در سرکوب عوامل بیمارگر گیاهی از قبیل Botrytis cinerea (De Bary) Whetzel، Fusarium spp.، Phytophthora cactorum (Lebert & Cohn) J. Schröt، Verticillium dahliae، Rhizoctonia solani، Pythium spp. و همچنین تحریک رشد گیاه، از اهمیت خاصی برخوردار هستند (20 و 21). به طور سنتی، تأثیرات مفید گونه­های تریکودرما روی گیاهان به توانایی آنتاگونیستی آنها روی بیمارگرهای خاک­زاد از طریق ترکیبی از مکانیسمهای مایکوپارازیتیسم، ترشح آنتی­بیوتیک و رقابت برای غذا و مکان نسبت داده شده است (18). هر چند که بررسیهای اخیر نشان می­دهد که این عوامل بیوکنترل همچنین قادر به برقراری ارتباط تنگاتنگی با ریشه گیاهان هستند و حتی لایه­های خارجی اپیدرم را پوشانده و به عنوان همزیستهای فرصت­طلب و غیر بیماری­زا در گیاهان عمل می­نمایند. همچنین گونه­های تریکودرما باعث تغییر متابولیسم گیاه می شوند به طوری که منجر به افزایش توسعه ریشه، باروری محصول و مقاومت به تنشهای زنده و غیرزنده می گردند (22).

بتا گلوکان یکی ازاجزای اصلی ساختار دیواره سلولی قارچهای حقیقی از جمله قارچهای بیماری­زای گیاهی می باشد. برخی از گونه­های تریکودرما از جمله T. virens با تولید آنزیم بتا گلوکاناز منجر به شکسته شدن پیوندهای گلوکوزیدی بتا 1 و 3 پلیمر گلوکان می­شود و آن را به اجزای سازنده تقسیم می­کنند که در نهایت منجر به کنترل بیولوژیک عوامل بیماریزای گیاهی می­شود (9).

علاوه بر این، اهمیت گونه­های تریکودرما شامل T. virens و T. atroviride، در فعال­سازی هورمون اکسین در گیاه Arabidopsis، که منجر به افزایش بیوماس و تحریک رشد ریشه­های جانبی می­شود، به اثبات رسیده است (12). همچنین پتانسیل تعدادی از ریزوبیوم­ها در کاهش تولید اتیلن در شرایط تنش، که منجر به پیری زودرس گیاهان می شود، به اثبات رسیده است (4). به طور کلی ریشه نقش مهمی در گیاهان و درختان ایفاء می­کند، زیرا علاوه بر اینکه به عنوان لنگرگاه گیاه عمل می­نماید، در تأمین نیاز آبی و جذب مواد غذایی از خاک نیز دخالت دارد. بنابراین مطالعه محیط فراریشه­ در گیاهان و درختان، به منظور شناسایی میکروارگانیسم­های مفید، از اهمیت زیادی برخوردار می­باشد.

با توجه به اینکه استان همدان با وجود 8،777 هکتار باغ گردو به لحاظ عملکرد و سطح زیر کشت، به ترتیب رتبه های اول و دوم کشوری را به خود اختصاص داده است (3)، این تحقیق با هدف شناسایی گونه­های تریکودرمای مفید مرتبط با ریشه و فرارریشه درختان گردوی این استان به منظور به کارگیری آنها در ارتقاء سلامت محصول گردو و افزایش عملکرد آن برای اولین بار  در ایران صورت گرفته است.

 

جدول 1- محل جمع­آوری نمونه­های ریشه و خاک فراریشه درختان گردو

شماره نمونه

محل نمونه­برداری

شماره نمونه

محل نمونه­برداری

شماره نمونه

محل نمونه­برداری

1

تویسرکان، روستای قره گوره

24

سامن

47

همدان، روستای ارزانفورد

2

تویسرکان، روستای سلطان چشمه

25

اسدآباد

48

همدان، روستای شمس­آباد

3

تویسرکان، روستای باغان

26

اسدآباد، روستای ملهم­دره

49

همدان، روستای ورکانه

4

تویسرکان، روستای خرم رود

27

اسدآباد، ترخین­آباد

50

نهاوند، روستای تکه

5

تویسرکان، روستای وردآورد علیا

28

اسدآباد، روستای ملهم­دره

51

نهاوند، فارسبان

6

تویسرکان، روستای وردآورد وسطی

29

اسدآباد

52

نهاوند، روستای قلعه قباد

7

تویسرکان، روستای کندر

30

نهاوند

53

نهاوند، روستای نسار

8

تویسرکان، روستای کهنوش

31

نهاوند، گیان

54

نهاوند، روستای گل­زرد

9

تویسرکان، روستای کندر

32

نهاوند

55

نهاوند، روستای میلاب

10

تویسرکان، روستای اشتران

33

نهاوند

56

تویسرکان، سرکان

11

ملایر

34

تویسرکان، روستای فریازان

57

تویسرکان، مبارک­آباد

12

ملایر

35

تویسرکان، روستای کورزان

58

تویسرکان، روستای خرم رود

13

ملایر، روستای کساوند

36

تویسرکان، مبارک­آباد

59

تویسرکان، شهرستانک

14

ملایر، کیان کردسا

37

تویسرکان، روستای ولاشجرد

60

تویسرکان، روستای کرزان

15

ملایر، روستای زنگنه علیا

38

تویسرکان

61

تویسرکان، سرابی

16

تویسرکان، سرکان

39

تویسرکان

62

تویسرکان، روستای مبارک­آباد

17

تویسرکان، سرکان

40

تویسرکان

63

قزوین، ضیاء­آباد

18

تویسرکان

41

تویسرکان، روستای بادامک

64

زنجان، خرم­دره

19

سامن، روستای نازول

42

تویسرکان

65

قزوین، ابهر

20

سامن

43

تویسرکان

66

زنجان، حصار

21

سامن

44

تویسرکان

67

جاده کرمانشاه، وهنان

22

سامن

45

ملایر، ازندریان

68

تویسرکان، سرابی

23

سامن

46

همدان، روستای سنگستان

 

 

 

جدول 2- گونه­های شناسایی شده Trichoderma بر اساس مشخصات ریخت­شناسی.

ردیف

گونه

تعداد جدایه

ردیف

گونه

تعداد جدایه

1

T. harzianum

189

4

T. longibrachiatum

4

2

T. brevicompactum

35

5

T. citrinoviride

1

3

T. atroviride

5

6

T. ghanense

1


مواد و روشها

جمع­آوری نمونه­ها: در سال 1383 به منظور شناسایی گونه­های تریکوردمای مرتبط با درختان گردو، از باغات گردوی مناطق مختلف استان همدان و همچنین چندین محل از استانهای قزوین و زنجان نمونه­برداری به عمل آمد (جدول 1). نمونه­برداری از عمق 50-10 سانتیمتری خاک سایه­انداز درختان گردو انجام گرفت و در کیسه­های پلاستیکی مجزا به آزمایشگاه منتقل شدند. 

جداسازی و خالص­سازی جدایه­های تریکوردما: جداسازی جدایه­های تریکودرما با استفاده از محیط کشتهای عمومی و انتخابی شامل مالت-آگار (Malt Agar =MA)، آرد ذرت-آگار (Corn Meal Agar=CMA)، آرد یولاف-آگار (Oat Meal Agar=OA)، SNA (Synthetic Nutrient Poor Agar)، داوه (Davet) و الاد و خت (Elad and Chet) انجام پذیرفت (13 و 14).

برای جداسازی جدایه­های تریکودرما روی این محیطها، از نمونه­های خاک، سوسپانسیون در رقتهای مختلف (10/1، 100/1، 1000/1، 10000/1) تهیه شد و دو قطره از سوسپانسیون هر نمونه به هر تشتک حاوی محیط کشت منتقل گردید. همچنین در برخی موارد توده­های کوچک و متراکم خاک نیز به طور مستقیم روی محیط کشت قرار داده شد. تشتکها بعد از 4-3 روز نگهداری در دمای 25 درجه سانتی­گراد با استریومیکروسکوپ (Stereomicroscope) مورد بررسی قرار گرفتند. خالص سازی با استفاده از روش کشت نوک ریسه پرگنه­های مشکوک به تریکودرما روی محیط سیب­زمینی-دکستروز آگار (Potato Dextrose Agar=PDA)انجام شد. هر پرگنه به عنوان یک جدایه قارچی در نظر گرفته شد.

بررسیهای ریخت­شناسی: به منظور شناسایی جدایه­ها در سطح گونه با استفاده از کلید شناسایی گمس و بیست (16) میزان رشد، مشخصات ماکروسکوپی و ریزساختاری پرگنه­ها شامل شکل، اندازه و سایر ویژگیهای کنیدیوفورها، فیالیدها، کنیدیوم­ها، کلامیدوسپورها، ریسه­های هوایی و ریسه­های فرورفته در محیط کشت مورد مطالعه قرار گرفت. برای دست­یابی به حداقل، حداکثر و میانگین اندازه­ها، از هر یک از اندامهای ذکر شده 30 تکرار اندازه گیری شد. برای مطالعه میزان رشد جدایه­ها، حلقه هایی به قطر پنج میلی­متر از حاشیه فعال پرگنه سه روزه هر جدایه، درون تشتکهای حاوی محیط کشتهای مالت آگار و سیب زمینی-دکستروز آگار قرار داده شد و در دمای 20 درجه سانتی­گراد، تحت شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند و میزان رشد آنها در روزهای سوم و چهارم اندازه­گیری شد.

مشخصات پرگنه­ها شامل رنگ آنها، خوابیده یا کرکی بودن، نحوه کنیدیوم­زایی و رنگ سطح زیرین پرگنه، با کشت جدایه­ها روی محیطهای مالت آگار، سیب­زمینی-دکستروز آگار و آرد ذرت-دکستروز-آگار (Corn Meal Dextrose Agar=CMD)، مطالعه گردید. بررسی­ و اندازه گیری مشخصات ریزساختاری با استفاده از میکروسکوپ­ Olympus مدل BH2 مجهز به سیستم نومارسکی و میکروسکوپ Leica مجهز به سیستم فاز صورت گرفت.

نتایج و بحث

از میان 68 نمونه خاک مخلوط با ریشه که از محیط فراریشه درختان گردوی استان همدان و نقاطی از استانهای قزوین و زنجان جمع­آوری شده بود، جمعاً 235 جدایه در قالب شش گونه به شرح زیر جداسازی، خالص سازی و شناسایی شد.

ویژگیهای گونه­های تریکودرمای جداشده T. atroviride: پرگنه­های این گونه دارای رشد نسبتاً سریع بودند و در ابتدا به رنگ زرد مایل به سبز و در نهایت سبز تیره شدند. بوی خاصی از پرگنه این گونه متصاعد می­شد که شبیه بوی نارگیل بود. کنیدیوفورها دارای انشعابات کم و قابل انعطاف و ظریف بودند. انشعابات غالباً به صورت 3-2 شاخه­ای و فراهم و به ندرت بیش از سه شاخه داشتند. فیالیدها تکی یا 4-2 عدد به صورت فراهم و کم و بیش تنگی­شکل و اغلب خمیده و کشیده بودند. اندازه فیالیدها 3-4/2×12-6 میکرومتر بود. کنیدیوم­ها کروی تا تخم­مرغی شکل، سبز تیره، دارای سطح صاف با اندازه 4/3-2/2×2/4-6/2 میکرومتر بودند. کنیدیوم­زایی معمولاً به صورت یکنواخت و پراکنده صورت می­گرفت. بعضی جدایه­ها جوشهایی به صورت شعاعی تولید کردند. ریسه­ها بی­رنگ و دارای دیواره صاف بودند. کنیدیوم­ها نیم­کروی تا تخم­مرغی، دارای دیواره صاف و فاقد اثر محل افتادن بودند. این گونه به وسیله شکل و اندازه فیالیدها و کنیدیوفورها و نیز میزان شعاع رشد پرگنه از سایر گونه های شبیه قابل تفکیک است. با توجه به مشخصات ذکر شده و توصیف نامه مرتبط با گونه­های جنس تریکودرما، جدایه­های واجد این مشخصات متعلق به گونه T. atroviride ­می­باشند (16). این گونه توسط ظفری و همکاران (5) از ایران گزارش شده است و یکی از عوامل بیوکنترلی مهم می­باشد (شکل 1، الف و ب).

T. brevicompactum : رشد پرگنه در این گونه سریع بود، کنیدیوم­زایی به فراوانی و به صورت نواحی فشرده صورت گرفت. بهترین حرارت برای رشد دمای 32-30 درجه سانتی­گراد بود و در دمای بیش از 36 درجه، رشد متوقف شد. اجتماع کنیدیوفورهای متراکم باعث رنگ سبز زیتونی تا سبز مایل به آبی یا خاکستری مایل به زیتونی در پرگنه شد. کنیدیوفورها هرمی شکل، بی­رنگ با دیواره صاف و انشعابات پیرامونی بودند و زواید نازا در اطراف جوشهای کنیدیومی جوان وجود داشت که با بالا رفتن سن قارچ از بین رفتند. محور اصلی کنیدیوفور و انشعابات اولیه کوتاه و معمولاً 5/5-4 میکرومتر قطر داشتند. فیالیدها اغلب آمپولی شکل با گردن کوتاه و باریک و به اندازه 4-3×5/6-5 میکرومتر بودند ولی فیالیدهای انتهایی کنیدیوفور بلندتر بوده و به بیش از 5×12-8 میکرومتر نیز می­رسیدند. فیالیدهای کوتاه به هم فشرده شده و ظاهر فشرده­ای به ساختارهای کنیدیوم­زایی می­دادند. کنیدیوم­ها نیم­کروی یا بیضوی کوتاه، اغلب به قطر 3-2 میکرومتر با دیواره صاف و از نظر میکروسکوپی به رنگ سبز خاکستری بودند (19). در این بررسی جدایه­های مربوط به این گروه پس از T. harzianum بیشترین فراوانی را داشته است (شکل 2، الف و ب).

T. citrinoviride : پرگنه در  این  گونه  دارای  رشد

سریع، بدون بو و کنیدیوم­زایی کم و بیش متراکم و رنگ آن سبز تیره بود. کنیدیوفورها دارای محور اصلی بلند و انشعابات کم و نامنظم (به صورت غیرمتقارن) و انشعابات اولیه اکثراً کوتاه و به ندرت انشعاب ثانویه در آنها دیده می­شد. فیالیدها به صورت انفرادی و نامنظم در روی کنیدیوفور قرار می­گرفتند و به ندرت تشکیل خوشه و دسته را می­دادند. کنیدیو­زایی در محیط کشت CMD به صورت نوارهای عریض و حاشیه­ای بر روی دوایر متحدالمرکز صورت گرفت. فیالیدها در انشعابات اولیه به صورت منفرد و نامنظم تشکیل ­شدند و استوانه­ای شکل، تنگی یا آمپولی شکل بودند که در قسمت میانی بزرگ شده و مستقیم و غیرخمیده بودند. اندازه فیالیدها 1/3-2×5/6-5/3 میکرومتر بود که طول فیالیدهای انتهایی تا 12 میکرومتر هم می­رسید. فیالیدها به صورت سه شاخه­ای و فراهم و یا جفتی و گاهی تکی و به صورت یک در میان و حتی نامنظم هم دیده می­شدند. کنیدیوم­ها بیضی شکل با دیواره صاف، به رنگ سبز روشن یا سبز تیره به اندزه­ی 4/2-5/1-7/3-2/2 میکرومتر بودند (16) (شکل 3، الف و ب).

T. ghanense : در محیط کشت PDA کنیدیوم­زایی به صورت یکنواخت و پراکنده بود و تولید رنگ سبز تیره نمود. در 35 درجه سانتیگراد کنیدیوم­زایی زیاد و با کاهش دما به 30 و 25 درجه سانتی­گراد میسیلیوم­های هوایی پنبه ای شکل به وجود آمد. سطح زیرین پرگنه در تمام دماهای اشاره شده بی­رنگ بود. در محیط کشت CMD ایجاد میسیلیوم هوایی نموده و کنیدیوم­زایی به صورت نوارهای پهن در حاشیه پرگنه و به رنگ سبز تیره بود. فیالیدها در انشعابات اولیه به صورت منفرد و شکل آنها  استوانه­­ای و به صورت خمیده و قلاب مانند بوده و در قسمت میانی اندکی تورم داشتند. فیالیدها به صورت مرتب آرایش یافته و اندازه آنها 1/4-1/2×13-5 میکرومتر بود. کنیدیوم­ها بیضوی شکل، سبزرنگ و با دیواره صاف و اندازه آنها 5-3×5/7-5/4 میکرومتر بودند (16) (شکل 4، الف و ب).

 

 

 

شکل 1- الف) پرگنه T. atroviride روی محیط PDA، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. atroviride.

 

شکل2. الف) پرگنه T. brevicompactum روی محیط MA، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. brevicompactum.

 

شکل 3. الف) پرگنه T. citrinoviride روی محیط CMD، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. citrinoviride.

 

شکل 4. الف) پرگنه T. ghanense روی محیط PDA، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. ghanense.

 

شکل 5. الف) پرگنه T. harzianum روی محیط MA، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. harzianum.

 

شکل 6. الف) پرگنه T. longibrachiatum روی محیط CMD، ب) تصویر میکروسکوپی کنیدیوفور و کنیدیوم­های T. longibrachiatum.

 

T. harzianum  : رشد پرگنه سریع و کنیدیوم­زایی غالباً به صورت پراکنده و تمام سطح پرگنه را پوشاند یا تولید جوشهای فشرده­ای به قطر حدود هشت میلی­متر نمود که حاشیه آنها اغلب توسط ریسه­های عقیم احاطه شده بود. رنگ جوشها در ابتدا سبز مایل به زرد بود ولی به سرعت به سبز تیره متمایل شد. گاهی کنیدیوم­زایی به صورت دوایر متحدالمرکز یا متراکم نزدیک حاشیه پرگنه به صورت توده­های بزرگ نامنظم به هم پیوسته صورت می­گرفت. پرگنه بدون بو و دارای ریسه­های هوایی کرکی بی­رنگ با دیواره صاف بود. سطح زیرین پرگنه (پشت تشتک پتری) از بدون رنگ تا زرد تیره متغییر بود. کنیدیوفورها هرمی شکل، بی­رنگ، دارای انشعابات کم و انشعابات غالباً به صورت 3-2 شاخه­ای و فراهم (verticillate) و به ندرت بیش از سه شاخه داشتند. تولید فیالیدها از قسمت پایه کنیدیوفورها شروع می­شد به همین دلیل در مراحل اولیه رشد، نوک کنیدیوفورها نازا به نظر می­رسید ولی در مرحله بلوغ کنیدیوفورها به صورت منظم منشعب شده و تا نوک زایا بودند. فیالیدها آمپولی (ampuliform) یا تنگی شکل با گردن باریک و اکثراً 4-3 شاخه­ای به صورت فراهم و گاهی به صورت دوتایی و به اندازه 8/3-5/2×5/7-5/3 میکرومتر بودند. کنیدیوم­ها نیم­کروی (subglobus) تا تخم­مرغی واژگون (Obvoid) و اندازه آنها 5/2-3/1×2/3-7/1 میکرمتر بود و دیواره­های صاف و نیمه­شفاف تا سبز روشن داشتند (16). از آنجا که بیش از 80 درصد جدایه­های جمع آوری شده به T. harzianum تعلق داشتند، این گونه فروان­ترین گونه­ی تریکودرما در منطقه فراریشه گردو می باشد. (شکل 5، الف و ب).

T. longibrachiatum : کنیدیوم­زایی در این گونه سریع و روی محیط PDA بعد از 24 ساعت در دمای 40-30 درجه سانتی­گراد شروع شد ولی با کاهش دما کنیدیوم­زایی مدت زمان بیشتری طول کشید. بیشترین مقدار کنیدیوم­زایی در دمای 35-30 درجه سانتی­گراد صورت گرفت و در دمای 20 درجه سانتی­گراد و کمتر با تأخیر شروع شد. رنگ کنیدیوم­ها به صورت یکنواخت سبز یشمی و گاهی در میان توده آنها لکه­های سفید نیز دیده می­شد. این گونه در دمای 30 درجه سانتی گراد در داخل محیط کشت تولید رنگ دانه زرد روشن یا زرد مایل به سبز می­نمود ولی در دمای 40 درجه سانتی­گراد هیچ رنگی در محیط کشت تولید نمی­شد. ریسه­ها بی­رنگ و دارای دیواره صاف بودند. کنیدیوفورها نسبتاً بلند و ایستاده با انشعابات کم­تراکم و نامنظم که با محور اصلی تشکیل زاویه قائمه می­دادند و یا نوک آنها به طرف محور اصلی کنیدیوفور خم می­شد. ترشحات قطره­ای روی ریسه تشکیل نشد و بوی مشخصی از پرگنه­ها متصاعد نگردید.

در محیط کشت CMD تولید کنیدیوفورها به صورت غیرپیوسته و نامنظم بودند و در انشعابات اولیه و نیز در قسمت انتهایی کنیدیوفور، فیالیدها به صورت منفرد دیده می­شدند. فیالیدها غالباً به صورت منفرد و یا دسته­های 3-2 تایی و به صورت پیرامونی روی کنیدیوفور تشکیل شدند. نوک شاخه­های فرعی به یک فیالید استوانه­ای ختم می­شد. فیالیدها استوانه­ای و در قسمت میانی اندکی بزرگ شده و اکثراً مستقیم و بدون خمیدگی بودند. اندازه فیالید 3/3-3/2×5/11-5 میکرومتر بود ولی فیالیدهای انتهایی طویل­تر و گاهی طول آنها به 15 میکرومتر می­رسید. کنیدیوم­ها بیضی گرد تا کشیده، با دیواره صاف، به رنگ سبز روشن بودند و محل اتصال آنها به فیالید تا حدودی مشخص بود. اندازه آنها 5/3-2/2×5/6-2/3 میکرومتر بود (شکل 6، الف و ب). این گونه با اندازه­گیری میزان رشد روی محیط کشت PDA در دمای 30 و 40 درجه سانتی­گراد، اندازه کنیدیوم­ها و بی­رنگ ماندن سطح زیرین پرگنه­ها در دمای 40 درجه سانتی­گراد از سایر گونه­های بخش خود متمایز می­شد (16).

فراوانی گونه­های شناسایی شده: فراوانی گونه­های شناسایی شده در جدول دو نشان داده شده است. بیش از 80 درصد جدایه­های جمع آوری شده متعلق به گونه T. harzianum بودند. با توجه به بررسیهای صورت گرفته در ارتباط با گونه­های تریکودرما، گونه T. harzianum بیشترین فراوانی را در خاکهای ایران و جهان دارا می­باشد. نعیمی و همکاران (10) نیز در بررسی گونه­های تریکودرما در شالیزارهای برنج استان مازندران نشان دادند که از 202 جدایه جمع آوری شده، 116 جدایه به گونه T. harzianum تعلق داشتند.

در سالهای اخیر آلودگیهای زیست محیطی ناشی از کاربرد گسترده سموم شیمیایی، تمایل به استفاده از آفت­ کشهای زیستی را افزایش داده است و در این میان، عوامل بیوکنترلی مبتنی بر تریکودرما، در تحریک رشد گیاه و بهبود فعالیتهای خاک، نسبت به موجودات دیگر (ویروسها، باکتریها، نماتدها و پروتوزواها) تواناتر هستند (11).

گونه­های تریکودرما باعث افزایش جذب و غلظت ترکیبات غذایی شامل مس، فسفر، آهن، منگنز و سدیم در ریشه گیاهان در کشت هیدروپونیک می­شوند که منجر به پیشرفت فعالیت ساز و کارهای جذب فعال گیاه می­شود. گونه های تریکودرما به صورت همزیست با گیاه زندگی می­کنند و قادر به رشد، رقابت و بقا در خاک و سایر بوم نظامها بوده و توانایی تشکیل کلنی روی ریشه­های گیاهان را دارند و هنگامی که در معرض ریشه­های سالم قرار می گیرند، تعداد آنها افزایش می­یابد. تشکیل کلنی بر روی ریشه­ها موجب رشد فزاینده ریشه و در نتیجه رشد کل گیاه و به موزات آن افزایش تولیدات گیاهی و افزایش باردهی اندامهای تولید مثلی گیاه می­شود. آنها همچنین با غلبه بر تنشهای غیرزنده و بالا بردن میزان جذب عناصر غذایی و استفاده از نیتروژون قابل جذب توسط ریشه گیاه کمک می کنند و این از طریق حل کردن عناصر غذایی در خاک انجام می شود. اگر چه ساز و کار ژنتیکی و مولکولی این فرآیندها شناخته نشده است (2)

تحقیقات صورت گرفته توسط جیگاتامبیگا و همکاران (17) در زمینه تأثیر گونه­های تریکودرما روی نماتدهای عامل ریشه گرهی نخل زینتی در مقایسه با آفت­کش کاربوفوران (Carbofuran) نشان داد که ترکیب گونه­های T. harzianum و T. viride می­تواند نسبت به آفت­کش مذکور جمعیت نماتدهای عامل ریشه گرهی و همچنین تعداد گالهای ایجاد شده در اثر آنها را روی ریشه درختان نخل زینتی به طور معنی­داری کاهش دهند.

در استراتژی بیوکنترل عوامل بیماری­زای گیاهی و مدیریت تلفیقی آفات و بیماریهای گیاهی لزوم توجه به عوامل بیوکنترل و آنتاگونیست بومی از اهمیت زیادی برخوردار است زیرا در صورت استفاده از یک عامل بیوکنترلی غیربومی ممکن است آن عامل با شرایط جدید سازگار نشود و قادر به ایفای نقش اصلی خود در مدیریت آفات و بیماریهای گیاهی نگردد. بنابراین شناسایی گونه­های تریکودرمای ذکر شده از محیط ریشه و فراریشه درختان گردو در استان همدان می­تواند نویدی برای مطالعات بعدی در زمینه استفاده از آنها در مدیریت تلفیقی بیماریهای درختان گردوی این منطقه باشد.

1- انصاری، خلیل.، فهیمی، ح.، خلیقی، ا. و لطیفیان، ح. 1379. بررسی و شناسایی قارچ­های همزیست ریشه­ای (میکوریز) در گردوی ایرانی در برخی از مناطق. پژوهش و سازندگی، 13: 79-81.

2- ایران نژاد، آ.، وطن پور ازغندی، ع.، رهنما، ح.، جلیانی، ن. و بزرگی پور، ر. 1389. بهبود ریشه زایی و سازگاری گیاهچه­های کشت بافتی زیتون زرد با استفاده از باکتری Agrobacterium rhizogenes و قارچ Trichoderma harzianum. مجله به زراعی نهال و بذر، 2-26 (1): 85-93

3- بختیاری، م. ح. 1382. بررسی و شناسایی مقدماتی عوامل قارچی خاکزاد مولد زوال درختان گردو در استان همدان. خلاصه مقالات اولین همایش تخصصی گردوی کشور، همدان. صفحه 81.

4- خسروی، ه.، یخچالی، ب. و علیخانی، ح. 1388. تعیین پتانسیل تعدادی از ریزوبیومهای بومی به عنوان باکتریهای محرک رشد گیاه و نقش آنها در کاهش اتیلن تنشی. مجله زیست شناسی ایران، 22 (4): 661-670

5- ظفری، د.، ارشاد، ج.، زارع، ر. و علیزاده، ع. 1382. تحقیقی در زمینه­ی شناسایی گونه­های Trichoderma در ایران. فصلنامه بیماری­های گیاهی ایران، 38: 12-22.

6- قادری، ف. و بنی­هاشمی، ض. 1386. پراکنش و اهمیت نسبی گونه­های Phytophthora جدا شده از درختان گردو در حال زوال در استانهای فارس، کرمان و کهگیلویه و بویراحمد و واکنش برخی ژنوتیپ­های گردو به آنها. بیماریهای گیاهی، 43: 163-183.

 7- کاشی، ل. 1383. مطالعه فون نماتدهای ریشه گردو در استان همدان. پایان­نامه کارشناسی ارشد بیماری­شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی­سینا همدان، 179 صفحه.

8- مردانی، ف.، سردابی، ح.، یوسفی، ب. و معروفی ح. 1388. استفاده از مالچ در موفقیت جنگل­کاری با ژنوتیپ­های برتر گردو (Juglans regia L.) در اراضی جنگلی استان کردستان. فصلنامه تحقیقات جنگل و صنوبر ایران، 17: 25-32

9- محمد زاده، ر.، مطلبی، م.، زمانی، م.ر. و بیدمشکی پور، ع. 1387. شناسایی، کلون کردن و مطالعه ساختار ژن 1 و 3 گلوکاناز (bgnI) جدایه قارچ (Trichoderma virens 10). مجله زیست شناسی ایران، 21 (3): 483-492

10- نعیمی، ش.، اخوت، س.م.، جوان نیکخواه، م.، کردریچ، ل. و خسروی و. 1388. مطالعه فراوانی و پراکنش شبه گونه­های Trichoderma در مزارع برنج استان مازندران. مجله دانش گیاهپزشکی ایران، 40 (2): 79-91

 

11- Al-Taweil, H. I., Osman, M. B., Aidil, A. H. and Yussof, W. M. W. 2009. Optimizing of Trichoderma viride cultivation in submerged state fermentation. American Journal of Applied Science, 6(7): 1277-1281.

12- Contreras-Cornejo, H, A., Macías-Rodríguez, L., Cortés-Penagos, C. and López-Bucio, J. 2009. Trichoderma virens, a plant beneficial fungus, enhances biomass production and promotes lateral root growth through an Auxin-dependent mechanism in Arabidopsis. Plant Physiology, 149: 1579–1592.

13- Davet, P. 1979. A technique for analyzing soil populations of Trichoderma spp. And Gliocladium virens. Annual Review of Phytopathology, 11: 529-534.

14- Elad, Y. and Chet, I. 1983. Improved selective medium for isolation of Trichoderma spp. from soil. Phytoparasitica, 11: 55-558.

15- FAO: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx

16- Games, W. and Bissett, J. 1998. Morphology and identification of Trichoderma In: Kubicek, C. P. and Harman, G. E. (eds) Trichoderma and Glicladium. Vol. 1. pp. 3-34. Taylor & Francis, London, UK.

17- Jegathambigai, V., Karunaratne, M. D., Svinningen, A. and  Mikunthan, G. 2008. Biocontrol of root-knot nematode, Meloidogyne incognita damaging queen palm, Livistona rotundifolia using Trichoderma species. Commun Agriculture Applied Biology Science, 73(4): 681-687.

18- Howell, C. R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Disease, 87: 4-10.

19- Kraus, G., Druzhinina, I., Gams, W., Bissett, J., Zafari, D., Szakacs, G., Kopchinski, A., Prillinger, H.J., Zare, R. and Kubicek, C.P. 2004. Trichoderma brevicompactum sp. nov. Mycologia, 96(5): 1059 - 1073.

20- Meincke, R., Weinert, N., Radi, V., Schloter, M., Smallas, K. and Berg, G. 2010. Development of a molecular approach to describe the composition of Trichoderma communities. Journal of Microbiological Methods, 80: 63–69

21- Samolski, I., Luis, A. D., Vizcaino, J. A., Monte, E., and Suarez, M. B. 2009. Gene expression analysis of the biocontrol fungus Trichoderma harzianum in the presence of tomato plants, chitin, or glucose using a high-density oligonucleotide microarray. BMC Microbiology, 9: 217.

22- Vinale, F., Sivasithamparam, K., Ghisalberti, E. L., Marra, R., Woo, S. L., and Lorito, M. 2008. Trichoderma-plant pathogen interactions. Soil Biology & Biochemistry, 40: 1-10.