نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 زیست شناسی, دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران-شمال
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران- شمال ، تهران، ایران
3 هیئت علمی دانشکده علوم پایه ، واحد علوم و تحقیقات ، دانشگاه آزاد اسلامی
4 گروه زیست شناسی ,دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی , واحد تهران شمال، تهران ، ایران
چکیده
گیاه شمعدانی عطری (Pelargonium graveolens) گیاهی دارویی و معطر است که در صنعت داروسازی، عطر سازی و صنایع غذایی کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه اثر تابش پرتو فرابنفش با شدتهای متفاوت (وات بر متر مربع 38 /0و 26/0، 12/0، 0) بر روی این گیاه در محیط کشت بافت بررسی شد. میزان فنل کل، فلاونوئید, آنتوسیانین، رنگیزههای فتوسنتزی، کربوهیدرات-ها، پروتئین و فعالیت آنزیمهای فنیل آلانین آمونیا لیاز، کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز سنجش شدند. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره متانولی با استفاده از 2و2- دیفنیل 1- پیکریل هیدرازیل (DPPH) اندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که با افزایش شدت تابش پرتو UV-B ، میانگین پروتئین کل و کلروفیلهای a و b در شدتهای بالای پرتو فرابنفش کاهش یافته و مقدار کاروتنوئید افزایش معنیداری (05/0 (P≤داشته است. میانگین فنل کل، فلاونوئیدها و آنتوسیانینهای برگ گیاهان تحت تیمار افزایش معنی داری در سطح(05/0 (P≤ نشان دادند. همچنین با افزایش شدت تابش، میانگین IC50 عصاره متانولی کاهش یافت. الگوی کاهش IC50 با روند افزایش میانگین فنلها همخوانی داشت. نتایج حاضر نشان میدهد گیاه شمعدانی در پاسخ به تنش UV-B توان آنتی اکسیدانی خود را با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان وافزایش انواع فنلها بالا برده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Biochemical responses of Plargonium graveolens L′HER under UV-B radiation in In Vitro condition
نویسندگان [English]
1 Department of Biology, Faculty of Biological Science, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
2 Department of Biology< Faculty of Biological Sciences, Islamic Azad University, North Tehran Branch
3 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
4 Department of Biology, Faculty of Biological Science, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
چکیده [English]
Pelargonium graveolens L ′Her is an aromatic and medicinal plant which is widely used in pharmaceutical, perfumery and food industry. In this study, the effect of ultraviolet radiation with different intensities (0, 0.12, 0.26 and 0.38 W/m2) was investigated on P. graveolens in InVitro condition. The amount of total phenol, flavonoid and anthocyanin, activity of phenylalanine ammonia lyase (PAL), photosynthetic pigments, carbohydrates, proteins and activity of some anti-oxidant enzymes (Catalase, peroxidase and superoxide dismutase) were evaluated. The antioxidant activity of methanolic extract was measured by using 2-2-di-phenyl-1-picaril hydrazil (DPPH) method. Total protein content and chlorophylls a, b showed a significant decrease (P≤ 0.05), while the amount of carotenoid increased significantly (P≤ 0.05), when ultraviolet radiation increased. With increasing UV-B radiation, the activity of studied enzymes, total phenols, flavonoids and anthocyanins content increased significantly (P≤ 0.05). Also, with increasing radiation intensity, the mean IC50 of methanolic extract decreased. The decreasing pattern of IC50 was consistent with the trend of increasing the mean of phenols. The present results show that P.graveolens in response to UVB stress has increased its antioxidant capacity by increasing the activity of antioxidant enzymes and increasing the phenols.
کلیدواژهها [English]
پاسخهای بیوشیمیایی گیاه شمعدانی عطری Pelargonium graveolens L′Her تحت تنش پرتو فرابنفش درشرایط درشیشه
مرجان آذرافشان1، مریم پیوندی1*، حسین عباسپور1، زهرا نورمحمدی2 و احمد مجد1
1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی
2 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات، دانشکده علوم، گروه ژنتیک
تاریخ دریافت: 02/08/1399 تاریخ پذیرش: 10/09/1399
چکیده
گیاه شمعدانی عطری (Pelargonium graveolens) گیاهی دارویی و معطر است که در صنعت داروسازی، عطر سازی و صنایع غذایی کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه اثر تابش پرتو فرابنفش با شدتهای متفاوت (وات بر مترمربع 38/0و 26/0، 12/0، 0) بر روی این گیاه در محیط کشت بافت بررسی شد. میزان فنل کل، فلاونوئید, آنتوسیانین، رنگیزههای فتوسنتزی، کربوهیدراتها، پروتئین و فعالیت آنزیمهای فنیل آلانین آمونیا لیاز، کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز سنجش شدند. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره متانولی با استفاده از 2و2- دیفنیل 1- پیکریل هیدرازیل (DPPH) اندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که با افزایش شدت تابش پرتو UV-B، میانگین پروتئین کل و کلروفیلهای a و b در شدتهای بالای پرتو فرابنفش کاهش یافته و مقدار کاروتنوئید افزایش معنیداری (05/0 (P≤داشته است. میانگین فنل کل، فلاونوئیدها و آنتوسیانینهای برگ گیاهان تحت تیمار افزایش معنیداری در سطح(05/0 (P≤نشان دادند. همچنین با افزایش شدت تابش، میانگین IC50 عصاره متانولی کاهش یافت. الگوی کاهش IC50 با روند افزایش میانگین فنلها همخوانی داشت. نتایج حاضر نشان میدهد گیاه شمعدانی در پاسخ به تنش UV-Bتوان آنتی اکسیدانی خود را با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان وافزایش انواع فنلها بالا برده است.
واژه های کلیدی: شمعدانی عطری، اشعه فرابنفش، متابولیتهای ثانویه، کشت بافت
* نویسنده مسئول، تلفن: 02122454688 ، پست الکترونیکی: m_peyvandi@iau-tnb.ac.ir
مقدمه
P.graveolens گیاهی متعلق به خانواده شمعدانی است (4). این گیاه اسانسدار و با ارزش، بومی آفریقای جنوبی است و توسط دریانوردان اروپایی قرن 17 همراه با گیاهان طبی و ادویهای به اروپا راه یافت (14و 45). این گیاه دارای خاصیت بسیار بالایی از فعالیت آنتی اکسیدانی است که بر ضد بیماریهایی مانند سرطان، بیماریهای قلبی و دیابت تأثیرگذار است و ریسک ابتلا به این بیماریها را کاهش میدهد و از گسترش آنها جلوگیری میکند. عصارة آبی ساقه و برگ P.graveolens دو برابر تیمول خاصیت آنتیاکسیدانی دارد. همینطور این گیاه دارای خواص ضد کرم پارازیت Meloidogyne incognita میباشد (46). در طب سنتی بسیاری از کشورها مانند یونان از برگ این گیاه به عنوان نوعی دمنوش برای رفع مشکلات روحی مانند استرس و اضطراب و همچنین در بهبود جریان خون و درمان ورم لوزه استفاده میشود (20). اشعه UV-B با طول موج 315-290 نانومتر پرانرژیترین ترکیب نور خورشید است و در نتیجه کاهش لایه ازن میزان رسیدن این نوع اشعه به زمین بیشتر شده است. این اشعه دارای تأثیرات منفی بر روی گیاهان میباشد و در نتیجه رشد و تکامل آنها به طور منفی تحت تأثیر قرار میگیرد (25). هنگامیکه گیاهان در برابر تشعشع UV-B قرار میگیرند، تولید متابولیتهای ثانویه آنها افزایش مییابد و اینگونه است که میتوانند به وسیله دفاع فیتوشیمیایی، خود را از تأثیرات مخرب تشعشع دور نگه دارند (43). امروزه استفاده از عصاره های گیاهی یا متابولیت های ثانویه استخراج شده از گیاهان در صنایع پزشکی، دارویی و غذایی کاربرد گسترده ای یافته است. تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) در گیاهانی که تحت تأثیر عوامل تنشزای زیستی و غیرزیستی مانند پرتو فرابنفش قرار دارند بیشتر از گیاهان در شرایط کنترل شده است. از این رو تولید ترکیبات دفاعی همانند آنتی اکسیدانها در این گیاهان بالاتر است (6). افزایش به کارگیری روشهای کشت سلول و اندامهای گیاهی منجر به تولید متابولیتهای گیاه در مقیاس وسیع شده است. پیشرفت در این تحقیقات، جنبه جدیدی را در کشت درون شیشه ای ایجاد کرده است که افزایش عملکرد و همچنین تولید محصولات متعدد از آن جمله میباشد (5). یکی از این روشها که جهت افزایش تولید متابولیتهای ثانویه به کارمیرود، استفاده از الیسیتورها در کشت درون شیشه(in vitro) میباشد (1). نتایج حاصل ازمطالعات قبلی ما بر روی گیاه شمعدانی عطری (گیاه کامل) در شرایط گلخانه نشان داد که با افزایش شدت پرتو، میزان پروتئین، قند و رنگیزه های فتوسنتزی کاهش و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی (9) و میزان فنلها از جمله فلاوانولهائی نظیر کوئرستین، روتین،کامفرول و میریستین افزایش مییابد (10).
هدف از پژوهش حاضر ارزیابی تأثیرات تابش پرتو فرابنفش بر روی پاسخهای بیوشیمیایی گیاه شمعدانی عطری درشرایط کشت در شیشه میباشد تا از این طریق امکان استفاده از UV-B به عنوان یک الیسیتور جهت افزایش متابولیتهای ثانویه در این گیاه به دست آید.
مواد و روشها
ماده گیاهی و روش سترون سازی: گیاه شمعدانی عطری
از گلخانه وابسته به باغ گیاهشناسی ایران واقع در بلوار باغ گیاهشناسی تهیه شد. رشد گیاه مادر در گلخانه ای با دمای بیشینه 22 درجه سانتی گراد ودمای کمینه 17 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت طول روز (روشنایی) و 8 ساعت طول شب (تاریکی) انجام گرفت. جداکشت های تک گره از شاخههای همسن که از نقاط یکسان تهیه شده بودند، به مدت 5 دقیقه در محلول ضدعفونی کننده و گندزدای دتول(Dettol) (که به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق شده بود) و 10 دقیقه در محلول 15 درصد از هیپوکلریت سدیم 05/0 (وایتکس تجاری) قرارگرفتند. سپس شستشو با آب مقطر سترون (پنج بار) انجام گرفت.
محیط کشت و تیمار با اشعه UV-B : از محیط کشت MS2/1 (2/1 غلظت عناصر ماکرو و میکرو و سایر مواد کامل)استفاده شد. pH مناسب برای محیط کشت بین 7/5 تا 8/5 تنظیم گشت. دراین آزمایش از هورمون 2ip با غلظت 5/0 میلیگرم برلیتر استفاده شد. آزمایش به صورت کاملاً تصادفی و 3 تکرار برای هر تیمار طراحی شد. نمونه های جدا کشت های تک گره با شدتهائی از پرتوی UV-B (وات بر متر مربع 38/0 T3:و 26/0 T2:، 12/0 T1:، شاهد:0) به مدت 10 دقیقه در روز و برای یک هفته تیمار شدند. منبع تابش UV-B به صورت مصنوعی به وسیله لامپهای Sankio Denki (ژاپن / E 8T 15 G) که در فاصله 70 سانتیمتری از گیاهان قرارگرفته بودند تأمین شد. دمای اتاق رشد 3±25 درجه سانتی گراد، طول دوره روشنایی 16 ساعت و طول دوره تاریکی 8 ساعت ولوکس نوری 4500 لوکس بود. برگ گیاهان بعد از گذشت 21 روز (سه هفته بعد از تیمار) برداشت شدند.
سنجش رنگیزه های فتوسنتزی: جهت اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل aوb و همینطور کاروتنوئید از روش WellburntوLichtenthaler (1983) استفاده شد (31). 1/0گرم از وزن تر برگ همراه 5 میلی لیتر استون 80 درصد در هاون چینی ساییده شد. پس از سانتریفوژ جذب فاز بالایی به دست آمده توسط طیفسنج نوری در طول موج های 663 نانومتر (کلروفیلa) 646 نانومتر(کلروفیلb) و 470 نانومتر (کاروتنوئید) خوانده شد.
aکلروفیل: 21/12A663 – 81/2A646
bکلروفیل: 13/20A 646 – 03/5 A 663
کارتنوئید: 1000 A 470 - (27/3 aکلروفیل) - (104 bکلروفیل) /227
کلروفیل کل: aکلروفیل + bکلروفیل
سنجش کربوهیدراتها: جهت بررسی میزان کربوهیدراتهای برگ از روشKochert (1978) استفاده شد (28). استخراج به وسیله اتانول 70 درصد انجام شد و جذب نمونهها در طول موج 485 نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظتهای مشخص گلوکز استفاده گردید.
سنجش پروتئین: 5/0 گرم ماده تر برگ در 5 میلی لیتر بافر تریس– گلایسین در هاون چینی سائیده شد و از 100 میکرولیتر از عصاره پروتئینی حاصله جهت سنجش میزان پروتئین به روش Bradford (1976) استفاده گردید (13). جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت های مشخص آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز: فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از روش Pereira و همکاران (2002) در طول موج 240 نانومتر(42)، فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از روش Koroi (1989) در طول موج 530 نانومتر(29) و فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به وسیله روش (1977) Ries وGiannopolitie در طول موج560 نانومتر(21) در برگ به وسیله دستگاه طیف سنج نوری سنجیده شد. سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز با استفاده از غلظت اسید سینامیک تولید شده به روشWang و همکاران (2006) انجام شد (52). جذب نمونهها در طول موج 290 نانومتر خوانده شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت
های مشخص اسید سینامیک استفاده شد.
سنجش میزان فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و IC50: 1/0 گرم از وزن تر برگ در 10 میلی لیتر متانول 80% برای مدت 24 ساعت خیسانده شد. از این عصاره برای اندازهگیری میزان فلاونوئید کل با استفاده از روشChang و همکاران (2002) و اندازهگیری میزان فنل کل به روش Marrinova و همکاران (2005) استفاده شد (16و 35). جهت رسم منحنی استاندارد برای محاسبه میزان فنل کل ازغلظتهای مشخص اسید گالیک و جهت محاسبه میزان فلاونوئیدها از غلظت های مشخص کوئرستین استفاده شد. همچنین از عصاره بالا جهت سنجش میزان IC50 با استفاده از روش Akowuah و همکاران (2005) استفاده گردید (7). میزانIC50 نمونه ها به وسیله رسم منحنی غلظت در برابر درصد ممانعت کنندگی محاسبه شد. جهت اندازه گیری آنتوسیانین از روش (2000) Baker وNouges استفاده شد (40). 1/0 گرم از وزن تر برگ همراه 10 میلی لیتر متانول اسیدی (99 حجم متانول و 1 حجم اسید کلریدریک) در هاون سائیده شد. سپس جذب محلول در طول موج 530 نانومتر توسط دستگاه طیف سنج نوری خوانده شد و با استفاده از ضریب خاموشی 1-cm 1- mm 33000= ε میزان آنتوسیانین محاسبه گردید.
آنالیز آماری: آنالیز آماری دادهها با استفاده از نرم افزار آماری (16 Version) SPSS انجام شد. اختلاف بین میانگینها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه (one-way ANOVA) محاسبه شد. بررسی نتایج آزمایشها ورسم منحنیها برمبنای مقایسه میانگینها وانحراف از میانگین (Mean±SE)صورت گرفت و گروه بندی تیمارها درسطح احتمال)05/0 (P≤ با آزمون دانکن (Dunkan) در سه تکرار انجام شد.
نتایج
فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و IC50 : بررسی آنالیز
واریانس دادهها نشان داد که میانگین فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین و IC50 در بین تیمارها تفاوت معنیداری )05/0 (P≤ را نشان میدهد (شکل1). گروه بندی میانگین فنل، با آزمون دانکن نشان داد که با افزایش شدت پرتو در تیمارها، میزان فنل به طرز معنی داری )05/0 (P≤ افزایش یافت. بیشترین میزان فنل (18/90 میلی گرم بر گرم وزن تر) در تیمار38/0 وات بر متر مربع و کمترین (01/73 میلی گرم بر گرم وزن تر) در گیاه شاهد به دست آمد. گروه بندی میانگین فلاونوئید با آزمون دانکن نشان داد، با افزایش شدت پرتو در تیمارها، مقدار فلاونوئید افزایش معنی داری )05/0 (P≤ یافته است. بیشترین میزان فلاونوئید ) 58/2 میلی گرم بر گرم وزن تر) در تیمار 38/0 وات بر مترمربع و کمترین میزان در گیاه شاهد مشاهده شد (شکل1). اثر افزایشی به علت تابش پرتو فرابنفش بر روی میزان آنتوسیانین نیز دیده شد. نتایج نشان داد که با افزایش شدت پرتو میزان آنتوسیانین به طور معنی داری )05/0 (P≤ افزایش یافته است. بالاترین میزان آنتوسیانین (38/1 میکرومول بر گرم وزن تر) در تیمار 38/0 وات بر مترمربع و کمترین مقدار(91/0 میکرومول بر گرم وزن تر) در تیمار شاهد به دست آمد (شکل1). همینطور نتایج نشان داد که افزایش شدت تابش پرتو باعث کاهش معنی دار )05/0 (P≤ IC50 شده است. تیمار 38/0 وات بر مترمربع کمترینIC50 و گیاه شاهد بیشترین IC50 را دارا بود (شکل1).IC50 به دست آمده در تیمارهای 26/0 وات بر مترمربع و 38/0 وات بر مترمربع نزدیکتر به IC50 اسید اسکوربیک بودند (شکل1).
شکل1- میانگین فنل کل(A)، فلاونوئید(B)، آنتوسیانین (C)و IC50 (D)عصاره متانولی در شدتهای متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و 38/0 T3:وات بر مترمربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان میدهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوت ها در سطح )05/0 (P≤ براساس آزمون دانکن میباشند.
رنگیزههای فتوسنتزی، پروتئین و کربوهیدراتها: کلروفیل a با افزایش شدت تابش کاهش یافت، که این کاهش در تمام تیمارها نسبت به گیاه شاهد معنیدار )05/0 (P≤ بود (شکل2). کلروفیل b نیز در شدتهای 38/0 و 26/0 وات بر مترمربع کاهش یافت. میانگین کلروفیل کل نیز کاهش معنی داری را )05/0 (P≤ در تمام تیمارها در مقایسه با گیاه شاهد نشان داد. میزان کاروتنوئیدها تنها در تیمار 38/0 وات بر مترمربع افزایش معنی داری )05/0 (P≤ را نشان داد (شکل2). تحلیل نتایج نشان داد که افزایش معنی داری )05/0 (P≤ در میزان کربوهیدراتها در گیاهان مورد مطالعه وجود دارد (شکل2). این افزایش در تیمارهای 26/0 و 38/0 وات بر مترمربع در مقایسه با گیاه شاهد معنی دار است (شکل2). همچنین میانگین پروتئین تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ را در بین گروههای مورد مطالعه نشان داد (شکل2). بررسی آنالیز دادهها نشان داد که تابش پرتو فرابنفش باعث کاهش میزان پروتئین در گیاهان رشد یافته در محیط کشت بافت شده است (شکل2).
شکل 2- میانگین کلروفیل (A)، کاروتنوئید(B)، قند (C) و پروتئین (D)در شدتهای متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و 38/0 T3: وات بر متر مربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان میدهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت ها درسطح
)05/0 (P≤ براساس آزمون دانکن میباشند.
آنزیمهای آنتیاکسیدانی و آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز: نتایج نشان داد، فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) ، پراکسیداز(POD) و سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) در بین گروههای مورد مطالعه تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ دارد. با افزایش شدت تابش پرتو، فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت به طوریکه در تیمار 38/0 وات بر مترمربع ناگهان افزایش چشمگیری در میانگین فعالیت این آنزیم نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد اما بین گیاه شاهد و تیمار 12/0 وات بر مترمربع تفاوت معنی داری )05/0 (P≤ مشاهده نشد (شکل3). با افزایش تابش، میانگین فعالیت آنزیم پراکسیداز نسبت به گیاه شاهد افزایش معنی داری )05/0 (P≤ یافت اما تفاوت معنی داری بین تیمار 26/0 و 38/0 وات بر مترمربع مشاهده نشد (شکل3). نتایج نشان داد که با افزایش شدت تابش فرابنفش میزان آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافته و تفاوت بین تمام تیمارها معنی دار است (شکل3). بررسی داده ها نشان داد که با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش میانگین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز افزایش داشت و تفاوت در بین تمامی تیمارها معنی دار )05/0 (P≤ بود (شکل3).
شکل 3- فعالیت آنزیمهای کاتالاز (A)، پراکسیداز(B)، سوپراکسید دیسموتاز (C) و فنیل آلانین آمونیا لیاز (D)در شدتهای متفاوت تابش فرابنفش. (0:شاهد، 12/0T1:، 26/0 T2:و 38/0 T3:وات بر مترمربع). نتایج میانگین سه تکرار (Maen±SE) را نشان میدهد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت ها در سطح )05/0(P≤ براساس آزمون دانکن میباشند.
بحث
استفاده از تکنیک کشت بافت برای کوتاه کردن زمان تولید گیاهان زینتی و داروئی در سالهای اخیر افزایش یافته است. گیاه شمعدانی عطری نیز یک گیاه دارویی و معطر بسیار مهم است و به طور معمول از طریق قلمه و بذر تکثیر می شود. روند قلمه زدن احتیاج به نگه داری زیادی از قلمهها دارد و این قلمهها ممکن است دچار بیماریهای قارچی و باکتریایی شوند. ازدیاد از طریق بذر نیز به علت گران بودن بذرهای این گیاه چندان مورد استقبال قرار نگرفته است .بنابراین به نظر میرسد تکنیک کشت بافت میتواند راهکار مناسبی برای افزایش تکثیر این گیاه باشد که مزایایی از جمله تکثیر انبوه و سریع,راحتی در ذخیره سازی و حمل و نقل را دارا میباشد (37و 15). نتایج مطالعات ما بر گیاهان گلخانه ای نشان داد با افزایش شدت تابش پرتو، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان، قدرت آنتیاکسیدانی و انواع فلاونولهای برگهای تحت تیمار افزایش مییابد (9 و 10). نتایج حاضر نیز نشان داد با افزایش شدت تابش پرتو UV-B، الگوی کاهش IC50با روند افزایش محتوای فلاونونیدها و آنتوسیانینهای برگ همخوانی دارد. مکانیسم عمل فنل به عنوان یک متابولیت ثانویه به دو روش میباشد: 1- جذب مستقیم پرتو UV و جلوگیری از نفوذ آن به بافتهای حساس و 2- جاروب کردن گونههای فعال اکسیژن و ایفای نقش آنتیاکسیدانی (38و 39). این آنتی اکسیدان های غیرآنزیمی، حفاظت از گیاهان در حین تنش را برعهده دارند و ثابت شده است که غلظت بالای فنلها توانایی مقاومت بالاتری را در برابر اشعه UV به گیاه میدهد (26) .پژوهش حاضر نشان می دهد گیاه تحت تأثیر پرتو فرابنفش برای مقابله با تأثیرات مخرب این پرتو شروع به تولید متابولیتهای ثانویه جهت دفاع از خود کرده است. بررسی تأثیر پرتو UV-B برگیاه شمعدانی در شرایط گلخانه نشان داد میزان انواع فلاونولهائی نظیر روتین، کوئرستین، کامفرول و میریستین وابسته به شدت تابش تغییر میکند. به طوریکه با افزایش شدت تابش اشعه، نسبت کوئرستین/کامفرول افزایش مییابد (10). در مطالعه تأثیر پرتوی فرابنفش بر روی گیاه Artemisia annua L. در محیط کشت بافت مشاهده شد که میزان ترکیبات فنلی در گیاهان تیمار یافته نسبت به گیاه کنترل افزایش یافته است (41). همچنین مطالعه تغییرات فنل در گیاهان Echium orientale L.رشد یافته در محیط کشت نشان داد که میزان فنل در گیاهانی که دو هفته بعد از تیمار برداشت شدند نسبت به گیاهانی که بلافاصله بعد از تیمار برداشت شدهاند افزایش داشته است (54). در بررسی تاثیر پرتوی UV-B بر روی کالوسهای گیاه Echinacea Purpurea و کشت سوسپانسیونی آن Manaf و همکاران (2016) گزارش دادند که میزان فنل، در گیاه تحت تأثیر اشعه UV-B افزایش یافته است (34). همچنین در بررسی تأثیر میزان متفاوت تابش اشعه UV-B بر روی کالوسهای گیاه چای Zagoskina و همکاران (2003) عنوان کردند که میزان فنل در این گیاه افزایش یافته است (55). فلاوونوئیدها ترکیبات عمده در بافتهای گیاهی هستند که عمل حفاظتی آنها دفاع در برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از UV-B است (8). فلاونوئید از طریق جلوگیری از سنتز و شکل گیری مالون دی آلدئید باعث پایداری غشاء و نفوذ پذیری غشاء در نمونه های تحت تابش میشود. در واقع افزایش بیوسنتز فلاونوئیدها تحت فاکتورهای محیطی مختلف و شرایط تنشزا نوعی سازش با شرایط نامساعد محیطی می باشد (2). به طور مثال قرارگرفتن کالوس Passiflora Quadrangularis درمعرض دوز مطلوب UV-B باعث افزایش میزان فلاوونوئیدها شده است (26). همچنین تابش UV-B باعث القاء افزایش سطح فلاوونوئید در کالوس Ginko biloba میشود (22). افزایش میزان فلاونوئیدها در بررسی تأثیر پرتو UV-B بر روی گیاهان Artemisia annua L. و Echium orientale L. در محیط کشت بافت نیز مشاهده شده است (41و 54). اولین مکانیسم دفاعی برای گیاهان در برابر اشعه UV احتمالاً دفاع غیرنفوذی است و تابش UV-B باعث تجمع ترکیبات جذبکننده UV مانند آنتوسیانینها میشود که از دستگاه فتوسنتزی در برابر آسیبهای اکسیداتیو محافظت میکند (36و 48). مطالعه بر روی گیاه Artemisia annua L. در محیط کشت بافت تحت تأثیر پرتو UV-B افزایش میزان آنتوسیانین را نشان داد (41). گزارش Basahiو همکاران (2013)، در بررسی تأثیر پرتو فرابنفش بر روی گیاه Lactuca Sativa نشان داد که تمام ترکیبات جاذب UV مانند کاروتنوئیدها، فنلها و آنتوسیانینها افزایش یافتهاند (12). همچنین در بررسی دانه رستهای Vigna Mungo تحت تیمار UV-B عنوان شد که میزان آنتوسیانینها افزایش یافته است (47). افزایش میزان آنتوسیانین در گیاه کاهو نیز پس از تیمار توسط پرتو UV-B مشاهده شد (3). در مطالعه حاضر تحت تأثیر پرتو فرابنفش میزان IC50 عصاره متانولی شمعدانی عطری کاهش یافت. دلیل به وجود آمدن این حالت را به بیشتر بودن میزان فنلهای کل محلول در گیاه مرتبط میدانند که رابطه همبستگی مستقیمی بین فعالیت آنتیاکسیدانی و میزان فنل کل را نشان میدهد. بیشتر ترکیبات آنتیاکسیدانی طبیعی معمولاً برای ایجاد یک طیف وسیع از خواص آنتیاکسیدانی تا یک سیستم دفاعی قوی در برابر رادیکالهای آزاد با هم همکاری میکنند. توانایی آنتیاکسیدانی ترکیبات فنلی بیشتر به دلیل خاصیت اکسید و احیاء آنها وهمینطور ساختار شیمیایی آنها است، که به توانایی آنها در کلات کردن فلزات انتقالی، ممانعت کردن از لیپوکسی ژناز و جاروبکردن رادیکالهای آزاد منجر میشود (34). نتایج پژوهش حاضر نشان میدهد گیاه شمعدانی عطری در پاسخ به تنش UV-B مقدار فنلهای برگ را افزایش داده است. از اینرو گیاهان تحت تنش، قدرت آنتی اکسیدانی بیشتری (IC50 کمتر) را از خود نشان دادهاند. در بررسی کالوسهایEchinacea Purpurea تحت پرتو UV-B، Manaf و همکاران (2016)، افزایش میزان خاصیت آنتیاکسیدانی (IC50 کمتر) را در کالوسهای تحت پرتو UV-B در مقایسه با کنترل، گزارش دادند (34). در مطالعه ای Li و همکاران (2017)، دریافتند که تحت تنش UV-C میزان ترکیبات فنلی و فعالیت آنتیاکسیدانی چند نوع میوه نیمه گرمسیری در فرمهای متفاوت میوه بالا میرود (32). در بررسی خاصیت آنتیاکسیدانی کالوسهای Pelargonium Sidoides, Kumar و همکاران (2015)، عنوان کردند که خاصیت آنتیاکسیدانی گیاهان دارویی رابطه ای نزدیک با میزان ترکیبات فنلی دارد و بیشتر بودن خاصیت آنتیاکسیدانی نیز باعث بالا رفتن ارزش دارویی یک گیاه میشود (30). همچنین افزایش میزان خاصیت آنتیاکسیدانی (IC50 کمتر) در گیاهان Artemisia annua L. و Echium orientale L. در محیط کشت بافت تحت تأثیر پرتو UV-B مشاهده شد (41و 54). نتایج پژوهش حاضر نشان داد با افزایش شدت تابش میانگین محتوای کلروفیلهای a, b و کلروفیل کل کاهش نشان داده و میزان کاروتنوئید افزایش یافته است. کاهش میزان کلروفیل ممکن است به ممانعت از بیوسنتز کلروفیل و یا تخریب رنگیزهها و یا پارامترهای آنها مانند پروتوکلروفیل و یا پروتوکلروفیلید وابسته باشد (23و 44) و یا کاهش میزان کلروفیل ممکن است با تأثیرات فتومورفولوژی مشاهده شده در گیاه مانند کاهش طول، تغییر شکل و سطح برگ نیز در ارتباط باشد (17). کاروتنوئیدها جاروب کنندههای مؤثری برای ROS هستند و کلروفیلها را در برابر آسیبهای اکسیداتیو نوری ایجاد شده به وسیله اشعه UV-B از طریق از بین بردن انرژی بیش از حد رسیده به گیاه محافظت میکنند (40). به نظر میرسد که گیاه شمعدانی نیز تحت تأثیر پرتو فرابنفش میزان کاروتنوئید را افزایش داده است تا با آسیب ناشی از تخریب کروفیل مقابله کند. در بررسی تشعشعات UV-B و UV-C بر روی گیاه Artemisia Annua L عنوان شد که میزان کلروفیل تحت تأثیر اشعه UV به طرز معنیداری کاهش یافته است و افزایش میزان کاروتنوئید ممکن است به علت نقش جاروب کنندگی آن برای اکسیژن تکی باشد (44). Azarafshan و همکاران (2019) نشان دادند که در گیاه شمعدانی تحت تیمار UV-B میزان کلروفیلها کاهش و مقدار کاروتنوئیدها افزایش مییابد (9). همچنین در بررسی تأثیر اشعه UV-B بر روی میزان کلروفیل خزه Bryum argenteum توسط Hui و همکاران (2015)، عنوان شد که کلروفیل a و b و کلروفیل کل کاهش داشته است (23). مطابق با یافته های ما در شرایط کشت بافت (شیشه) میزان قند با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش افزایش نشان میدهد، که میتواند به دلیل تنش اضافی ناشی از کشت بافت علاوه بر تنش UV باشد. علاوه بر این محیط کشت میتواند تنش اسمزی را نیز ایجاد کند که تحت این تنش میزان کربوهیدرات ها به عنوان اسمولیتهای سازگار بالا می رود. Tegelberg و همکاران (2002)، در بررسی تأثیر پرتو UV-B بر روی فاکتورهای بیوشیمیایی گیاه Betula Pendula گزارش کردند که میزان کربوهیدراتهای کل و محلول افزایش یافته است که ممکن است نتیجه تغییر تقسیمبندی کربن یا شکستن کربوهیدراتهای ذخیره به حالت کربوهیدراتهای محلول باشد و یا اینکه تعمیر و پروسه ممانعت از آسیبهای UV بیشتر از این که احتیاج به کربوهیدراتها ذخیره داشته باشد محتاج کربوهیدراتهای محلول باشد (50). همینطور Huima و همکاران (2016)، در بررسی تأثیر UV-B بر گیاه داروئی Chrysanthemum عنوان کردند که تحت تأثیر UV میزان کربوهیدراتها افزایش یافته است (24). دراین مطالعه میزان پروتئین با تابش اشعه فرابنفش کاهش معنی داری یافت. تخریب پروتئین تحت تیمار UV-B ممکن است مستقیم (از طریق تخریب یا تغییر شکل باقی ماندههای آمینواسیدی) یا غیرمستقیم (از طریق آسیب اکسیداتیو مربوط به افزایش تولید ROS یا مربوط به تغییر ساختار DNA و RNA که در نتیجه تغییر در نسخهبرداری، ترجمه و در نهایت کاهش سنتز پروتئین را همراه دارد) باشد (48). در بررسی تأثیر اشعه UV-B در گیاه Solanum lycopersicum L مشاهده شد که میزان پروتئین با افزایش شدت تابش پرتو فرابنفش کاهش مییابد (11). کاهش در میزان پروتئین در نخود فرنگی و لوبیای مانگ نیز گزارش شده است (18). دراین مطالعه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز تحت تأثیر پرتو فرابنفش افزایش داشته است. اشعه UV به عنوان محرک آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز و آنزیمهای دیگر مسیر ساخت فنیل پروپانوئیدها مطرح شده است. PAL فنیل آلانین را به تراس اسید سینامیک تبدیل میکند و این ترکیب با واکنشهای متوالی تبدیل به ترکیباتی نظیر فلاوونوئیدها و فنلها میشود. در بررسی سازش دفاعی در گیاه دارویی Coleus Forskohii در مقابل پرتو تابی UV-B, Takshak و Agrawal (2015) عنوان کردند که میزان آنزیم PAL تحت تنش UV-B افزایش یافته است (49). در بررسی سطوح مقاومت در برابر اشعه UV-B در گیاه Vaccinium Corymbosum, Ecsobarو همکاران (2017)، عنوان کردند که میزان PAL و بیان ژنهای مربوط به آن در ارقام مقاوم نسبت به ارقام حساس بیشتر بوده است (19). دراین مطالعه مشخص شد که میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در گیاهان تحت تیمار افزایش یافته است. تحت افزایش میزان UV-B سلولهای گیاهی تولید ROS میکنند که به گیاه آسیب میرساند. گیاهان راهکارهای متفاوتی برای جاروبکردن ROS ها دارند. یکی از آنها سیستم آنزیمی و آنزیمهایی مانند CAT، SOD و POD است (56). به نظر میرسد که گیاه مورد مطالعه در این پژوهش نیز دفاع آنزیمی را برای مقاومت در برابر تاثیرات مخرب پرتو فرابنفش که توسط ROSها ایجاد میشود فعال میکند. افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه سویا توسط Xu و همکاران(2008) گزارش شده است (53). در بررسی گیاه Pelargonium Zonal تحت تنش
UV-B,Vidovic و همکاران (2015) مطرح کردند که میزان فعالیت کاتالاز در پاسخ به شدت تابش افزایش یافته است (51). Rai و همکاران (2011)، در بررسی تأثیر UV-B و UV-C بر گیاه Artemisia Annua L., گزارش دادند که فعالیت پراکسیداز با افزایش شدت پرتو UV-B افزایش یافته است (44). افزایش در میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز تحت تأثیر اشعه UV در دانه رستهای بادام زمینی نیز گزارش شده است (27). همچنین در مطالعه پاسخهای مسیر فلاوونوئید به تیمار پرتو UV-B و همبستگی آن با پراکسیداسیون لیپیدها و سیستم آنتیاکسیدانی در Caryopteris Mongolica گزارش شد که فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش یافته است (33).
نتایج این پژوهش نشان داد گیاه شمعدانی معطر در پاسخ به تابش شدتهای مختلف پرتو UV-B، توان آنتی اکسیدانی خود را, هم از طریق افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و هم بالابردن مقدار فلاونوئیدها و آنتوسیانینها افزایش داده است.
تشکر و قدردانی
از شهرداری منطقه 3 تهران و مرکز تحقیقات و مشاوره گل
و گیاه پارک ملت به علت در اختیار قرار دادن امکانات کشت بافت و گلخانه این مجموعه تقدیر و تشکر میگردد.