نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیئت علمی/دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج

2 استاد فیزیولوزی گیاهی دانشگاه تهران

چکیده

اثرات درمانی سردة بنگ (Hyoscyamus) به خاطر وجود تروپان آلکالوئیدهای مختلف همواره مورد توجه بوده است. کاربرد روشهای مهندسی ژنتیک برای تولید گیاهانی از این سرده با خواص دارویی ارزشمندتر و  ازدیاد آنها در زمان کوتاه تر و با صرف هزینه کمتر یکی از جنبه های مورد توجه می باشد. رویانزایی بدنی و شناخت آن ممکن است کمک شایانی در دستیابی به اهداف فوق بنماید. در این پژوهش تلاش شده است سازوکار رویانزایی از طریق بررسی آنزیمها در مراحل مختلف تشکیل رویان تا حدی روشن شود. کشت قطعات جداکشت برگی بنگ سیاه ( H.niger) در محیط کشت MS واجد BAP (1-mgL 5/1) و IAA (1-mgL 2/0) منجر به رویانزایی موفقیت آمیزی شد. بررسی تغییرات فعالیت آنزیمها نشان داد سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز بیشترین فعالیت را در کالوس واجد رویان اولیه، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز بیشترین فعالیت را درکالوس رویانزا، و پلی فنل اکسیداز بیشترین فعالیت را در کالوس داشتند. همچنین الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز، اکسین اکسیداز و استراز در مراحل مختلف تشکیل رویان بررسی شد و وجود ایزوفرمهای مختلف (به ترتیب 7، 6، 1، 5، 6، 7 و 2 ایزوفرم) در این مراحل  مشخص گردید. جرم مولکولی ایزوفرمها تعیین شد و پس از بررسی فراتنظیمی، فروتنظیمی و یا تعدیل نوارهای ایزوفرمی، ایزوفرمهای اصلی و نهادی دخیل در رویانزایی نیز معرفی گردید. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Somatic embryogenesis and antioxidant enzymes in Hyoscyamus niger

نویسندگان [English]

  • Mahdis Ebrahimzadeh 1
  • Hasan Ebrahimzadeh maboud 2

1 Karaj Islamic Azad University

2 professor of plant physiology in Tehran University

چکیده [English]

The Hyoscyamus genus has always been regarded as an important medical plant and its therapeutic effects are attributed to its contained different tropan alkaloids.  Utilizing genetic engineering for production of plants belonging to this genus with more valuable pharmaceutical properties without consuming much time and cost is one of the most regarded points in this issue.  Somatic embryogenesis and gathering knowledge about it is a great help.  For this perpose we attempted to perform successful somatic embryogenesis, and to get more knowledge about its mechanism via assessing enzymes in different stages of embryo formation.  In this study, leaves were cultured on MS medium containing BAP (1.5 mgL-1) and IAA (0.2mgL-1) lead to a successful embryogenesis. The results show that highest activity of superoxide dismutase and  peroxidase had the highest activity in primary embryo-holding callus, catalase and ascorbate peroxidase had the highest activity in embryogenic callus but polyphenol oxidase had the highest activity in callus. In different stages of embryo formation from leaf explants of H. niger showed that changes of activities of these enzymes in various stages of embryo formation.  The electrophoresis patterns of iso-enzymes of superoxide dismutase, peroxidase, catalase, ascorbate peroxidase, polyphenol oxidase and auxin oxidase showed the presence of 7, 6, 1, 5, 6, 7, and 2 isosymes in these enzymes respectively.  The molecular mass of the isozymes were determined and up-regulation, down-regulation, and modulation of the isosymal bands were assessed.  The main as well as concervative isozymes involved in embryogenesis were also identified. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Hyoscyamus niger
  • Antioxidant enzymes
  • Somatic embryogenesis

رویانزایی بدنی وآنزیمهای پاداکساینده در بنگ سیاه (H. niger  L.) 

مهدیس ابراهیم زاده1،* و حسن ابراهیم زاده2

1 کرج، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، گروه میکروبیولوژی

2 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی

تاریخ دریافت: 24/11/89             تاریخ پذیرش: 8/5/90

چکیده

اثرات درمانی سردة بنگ (Hyoscyamus) به خاطر وجود تروپان آلکالوئیدهای مختلف همواره مورد توجه بوده است. کاربرد روشهای مهندسی ژنتیک برای تولید گیاهانی از این سرده با خواص دارویی ارزشمندتر و  ازدیاد آنها در زمان کوتاه تر و با صرف هزینه کمتر یکی از جنبه های مورد توجه می باشد. رویانزایی بدنی و شناخت آن ممکن است کمک شایانی در دستیابی به اهداف فوق بنماید. در این پژوهش تلاش شده است سازوکار رویانزایی از طریق بررسی آنزیمها در مراحل مختلف تشکیل رویان تا حدی روشن شود. کشت قطعات جداکشت برگی بنگ سیاه ( H.niger) در محیط کشت MS واجد BAP (1-mgL 5/1) و IAA (1-mgL 2/0) منجر به رویانزایی موفقیت آمیزی شد. بررسی تغییرات فعالیت آنزیمها نشان داد سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز بیشترین فعالیت را در کالوس واجد رویان اولیه، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز بیشترین فعالیت را درکالوس رویانزا، و پلی فنل اکسیداز بیشترین فعالیت را در کالوس داشتند. همچنین الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز، اکسین اکسیداز و استراز در مراحل مختلف تشکیل رویان بررسی شد و وجود ایزوفرمهای مختلف (به ترتیب 7، 6، 1، 5، 6، 7 و 2 ایزوفرم) در این مراحل  مشخص گردید. جرم مولکولی ایزوفرمها تعیین شد و پس از بررسی فراتنظیمی، فروتنظیمی و یا تعدیل نوارهای ایزوفرمی، ایزوفرمهای اصلی و نهادی دخیل در رویانزایی نیز معرفی گردید.

واژه های کلیدی:   Hyoscyamus niger، آنزیمهای پاداکساینده، رویانزایی بدنی

* نویسنده مسئول، تلفن: 61113637 ، پست الکترونیکی: m_ebr1974@yahoo.com

مقدمه


بررسی فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در مراحل مختلف رویانزایی بدنی نشان داده است. که تمایز ونمو یاخته های رویانزا به وسیلة آنزیمهای مختلفی تنظیم می شود (24).

ایزوفرمهای سوپراکسید دیسموتاز(SOD ) نقش کلیدی را در جارو کردن سیستمهای اکسیژن فعال (AOS) به وسیلة تنظیم ترازهای O2·- تولید شده در کلروپلاستها، میتوکندریها و سیتوسل دارا می باشند (10). کنترل حالت پایدار ترازهای O2·- به وسیلة SOD یک سازوکار محافظتی مهم بر علیه آسیب اکسایشی یاخته ای می باشد، زیرا O2·- به عنوان یک پیش ساز با خاصیت یاخته کشی بیشتر یا یکی ازمشتقات اکسیژن با واکنشگری شدیدتر نظیر پراکسی نیتریت یا HO· عمل می کند (17). بنابراین SOD اغلب به عنوان خط اول دفاع علیه تنش اکسایشی مورد توجه است (8). یافته های عملکردی با استفاده از گیاهان تراژن نشان داده است که گیاهان بیش بیان کننده SOD مقاومت بیشتری به شرایط تنشی مختلف دارند (36).

SOD امکان تشکیل HO· (یک اکسایندة بسیار قوی با میل ترکیبی بسیار بالا برای مولکولهای حیاتی) را  از طریق واکنش هابر - ویس (Haber-Weiss) و یا واکنش فنتون (Fenton) کاتالیز شده با فلز ، کاهش می دهد (34). سوپراکسید دیسموتاز می تواند به عنوان یکی از متالوپروتئینهای کاتالیزکننده واکنش2O2·-®O2·2-+O2 به کار رود (24)، یعنی SOD یک آنزیم تولید کنندة H2O2 است (14).

به علاوه می توان حدس زد که ترازهای بالاتر H2O2 برون یاخته ای عامل تشکیل یاخته های رویانی است. H2O2 ممکن است به عنوان پیک یاخته ای جدید در رویانزایی بدنی موجب بیان ژن مؤثر و تحریک تشکیل یاخته های رویانزا شود (24).

فعالیت SOD به طور تدریجی در روزهای ابتدایی تمایز بافت کشت شده افزایش و سپس در طول تقسیمات بعدی و تشکیل رویان چند یاخته ای کاهش می یابد. اوج فعالیت SOD همزمان با تشکیل رویانهای چند یاخته ای در اثر تقسیم یاخته های رویانزا می باشد (24). دی اتیل دی تیو کربنات (DDC) به عنوان بازدارندة SOD بسامد رویانزایی بدنی را کاهش می دهد (24). اختلاف در فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز به مقدار پروتئین ارتباط دارد(32).

کاتالاز (CAT) یکی از آنزیمهای جاروکنندة H2O2 می باشد که می تواند به عنوان یکی از متالوپروتئینهای کاتالیز کنندة واکنش 2H2O2®2 H2O+O2 به کار رود (14، 17 و 24). کاتالازها در طی بیماریزایی فروتنظیمی شده و تراز اشکال مختلف اکسیژن فعال را در حدی نگه می دارند که باعث محدودیت رشد عوامل بیماریزا شود(25). فعالیت CAT ، پس از یک افزایش ملایم و متناسب با کمبود آب در برگها و ریشه ها در برگها تقریباً پایدار باقی مانده و در طی کمبود شدید آب در ریشه ها تنزل می یابد که این شاید به علت غیر فعال شدن و تنزل فعالیت کاتالاز باشد (15). بقای فعالیت کاتالاز در برگهای گیاهان تحت تنش به خوبی امکان حذف H2O2 تولید شده در طی تنش خشکی را از طریق تنفس نوری فراهم می نماید (33). در واقع تحت چنین شرایطی تنفس نوری به عنوان یک مخزن انرژی مانع احیای بیش از حد زنجیرة انتقال الکترون نور آمایشی و بازدارندگی نوری می شود (37). بنابراین غلظتهای بالای CO2مشاهده شده در اتاق زیر روزنه  در گیاهان تحت تنش خشکی می تواند نتیجه افزایش فرآیندهای تنفس نوری همراه با کند شدن فعالیت آنزیمهای چرخه کالوین باشد (7).

بررسی فعالیت کاتالاز در طی رویانزایی نشان داده است که فعالیت این آنزیم در کالوس بالا بوده، در اولین روزهای تمایز کاهش می یابد (24) و کاربرد آمینو تریازول (AT) به عنوان بازدارندة کاتالاز بسامد رویانزایی بدنی را افزایش می دهد (24).

پراکسیدازها (POD) واجد گروهی از ایزوفرمها هستند که هم در فرآیندهای درون یاخته ای و هم بین یاخته ای شرکت می کنند و فعالیت آنها اغلب تحت تنش تغییر می یابد و محرومیت از غذا یک علامت برای راه اندازی بسیاری از آلکالین ایزوپراکسیدازها می‏باشد. همچنین رویانزایی گرده را القاء می نمایند که این اشاره به ارتباط بین محرومیت از غذا، و تغییر فعالیت پراکسیداز ها طی رویانزایی دارد (29). فعالیت این آنزیم دفاعی در گیاهان در مقابله با عوامل بیماریزا افزایش می یابد (11 و 13).

مشخص شده است که فعالیت پراکسیدازهای محلول در یاخته های غیر رویانزا سه بار بیشتر از یاخته های رویانزا است. بررسی این فعالیت در طی رویانزایی نشان داده که در کالوس فعالیت آن بالا و در اولین روزهای تمایز کاهش می یابد (24). فعالیت پراکسیداز در دیواره یاخته ای نیز دیده شده است (29).دیواره یاخته ای یک مکان زیر یاخته ای ممکن برای این پراکسیداز ها می باشد. بنابراین، فعالیت سه برابر در یاخته های غیر رویانزا ممکن است منعکس کنندة فعالیتهایی باشد که برای تثبیت شکل یاخته طویل شده مورد نیاز است (29).

PODs می توانند اکسید کننده باشند و به این ترتیب H2O2 را ترجیحاً با استفاده از برخی ترکیبات فنلی نظیر گایاکول به عنوان عناصر احیایی اولیه، جارو نمایند (31). پراکسیداز می تواند به عنوان یکی از متالوپروتئینهای کاتالیز کننده واکنش 2H+® H2O2+ O22-به کار رود (24).

آسکوربات پراکسیداز (APX) یکی از توسعه یافته ترین آنزیمهای پاداکساینده در یاخته گیاهی است و H2O2 را که یک بازدارنده قوی نورآمایشی است، با استفاده از آسکوربات به عنوان دهنده الکترون به آب احیاء می نماید (31). سپس آسکوربات می تواند به وسیله چرخه آسکوربات – گلوتاتیون دوباره تولید شود (16 و 35). APX در کلروپلاستها و سیتوسل قرار دارد، و به عنوان یک آنزیم کلیدی مسیر گلوتاتیون – آسکوربات، پراکسیدها را به وسیله تبدیل آسکوربات به دهیدروآسکوربات حذف می نماید (22).

پلی فنل اکسیداز(PPO)، مونواکسیژناز حاوی مس کاتالیز کننده هیدروکسیلاسیون وابسته به اکسیژن مونوفنلها به دی فنلهای مربوطه و اکسایش دی فنلها به دی کوئینونهای می باشد، بنابراین در جاروکردن H2O2 به وسیله پراکسیدازها همکاری می نمایند (19، 26، 28، 29 و 30). pH بهینه آن 6 بوده، و به وسیله تروپولون که یک بازدارنده شناخته شده آنزیمهای حاوی فلز است بازداشته می شود (12). مطالعات تاگ سازی(cloning) اخیر نشان داده است که PPO اغلب به وسیلةک خانواده ژنی چندگانه که اعضای آن به طور متفاوتی در بخشهای مختلف گیاه بیان می شوند، رمز سازی می گردد (20).

هدف از مطالعه حاضر بررسی تغییرات فعالیت آنزیمهای پاداکساینده و شناسایی ایزوفرمهای آنها در طی مراحل مختلف رویانزایی می باشد.

مواد و روشها 

بذرهای بنگ سیاه (H. niger) از جاده چالوس بالای  تونل

کندوان جمع آوری شدند. پس ازبرطرف کردن خفتگی با خیساندن آنها به مدت 12 ساعت در ژیبرلیک اسید
(1-mgL 35) (2) و سترون نمودن آنها، بذرها در محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده رشد کشت داده شدند. دانه رستهای سترون 12-10 روزه حاصل جهت کشت بافت مورد استفاده قرار گرفتند. قطعات برگی به دست آمده از دانه رستهای سترون در محیط کشت MS (1) واجد 1-mgL 5/1 بنزیل آمینو پورین (BAP) و 1-mgL 2/0 اندول استیک اسید (IAA) کشت شدند.

نمونه برداری در طی رویانزایی انجام گردید. به این صورت که در مورد قطعات جداکشت برگی، برگ (زمان صفر)، برگ حامل کالوس، کالوس، کالوس رویانزا و بالاخره کالوس واجد رویان جمع آوری شدند. بافر فسفات 2/0 مولار با 8/6 = pH برای استخراج پروتئین و آنزیم مورد استفاده قرار گرفت. برای جلوگیری از اکسیداسیون ترکیبات فنلی و اثر سوء آنها در سنجش پروتئین از 1 درصد PVPP استفاده شد.

نسبت استخراج w/v 5/1:1 مناسب تشخیص داده شد. کلیه مراحل استخراج در دمای 4-0 درجه سانتی گراد انجام شد. نمونه ها با کمک بافر استخراج در داخل هاون کاملاً ساییده شدند. سپس همگنای حاصل ابتدا به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با قدرت 13000 دور در دقیقه (با دستگاه HERAEUS 400R) سانتریفیوژ شد. رو شناور بار دیگر به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و با همان دور سانتریفیوژ شدند و جهت مطالعه فعالیت آنزیمها و انجام الکتروفورز مورد استفاده قرار گرفت. به خاطر نقش بازدارنده پلی فنلها روی اکسیداسیون آنزیمی اکسین(27) هنگام استخراج آنزیم اکسین اکسیداز از بافر فاقد PVPP استفاده شد. سنجش فعالیت آنزیمها برای هر نمونه حداقل سه بار تکرار شد. آزمون آماری Kruskal-Wallis جهت بررسی نتایج انجام گرفت. روشهای به کار رفته برای سنجش  فعالیت  آنزیمها

به صورت زیر است:

فعالیت SOD (23) با قابلیت هر عصاره در بازدارندگی واکنش احیایی فوتوشیمیایی نیتروبلو تترازولیوم (NBT) تعیین شد. کار با دستگاه طیف سنج در مد نور سنجی (Photometric) و طول موج nm560 انجام گرفت. از آنجا که یک واحد آنزیم مذکور عبارت است از میزانی از آنزیم که 50 درصد بازدارندگی ایجاد کند فعالیت آنزیم بر اساس واحد آنزیمی در میلی گرم پروتئین محاسبه شد.

سنجش فعالیتCAT (23) در مد Kinetic و در طول موج nm240 انجام گرفت و تغییرات جذب در طول موج nm240 خوانده شد. فعالیت بر حسب واحد آنزیمی در میلی گرم پروتئین (U.mg-1 protein) محاسبه شد.

سنجش فعالیت APX (9)در مد Kinetic در طول موج 265 نانومتر انجام گرفت و منحنی تغییرات جذب در طول موج 265 نانومتر خوانده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلی گرم پروتئین (U.mg-1 protein) محاسبه شد.

فعالیت POD (21) با دستگاه طیف سنج در مدKinetic در طول موج 530 نانومتر، انجام گردید.

سنجش فعالیت PPO (4) در مد Kinetic و در طول موج 430 نانومتر انجام شد. فعالیت آنزیم بر حسب میزان جذب در دقیقه به ازای یک میلی گرم پروتئین (U.mg-1 protein) محاسبه شد.

الکتروفورز پروتئینها در سیستم ناپیوستهبر روی ژل پلی آکریل آمیدغیراحیاء کننده (PAGE) به طور وسیعی برای مطالعه چند شکلی (polymorphism) آنزیمها و ارزیابی فعالیت آنزیمی در دوره های مختلف رشد و نمو مورد استفاده قرار گرفت(3، 19). پس از آماده سازی عصاره پروتئینی که با افزودن 10 میکرولیتر محلول بوموفنل بلو(W/V ، 25/0درصد)  به هر نمونه انجام می گیرد، و پس از تزریق نمونه ها به داخل چاهکها، ژلها  بر روی تانک الکتروفورز با سیستم عمودی سوار گردید. برای تأمین جریان الکتریسیته از یک منبع تغذیه Electrophoresis power supply consort EV 243 که انجام الکتروفورز را در ولتاژ ، شدت جریان و یا توان ثابت امکان پذیر می‏سازد، استفاده شد. رسیدن رنگ بروموفنل بلو به فاصله یک سانتیمتری انتهای ژل زیرین به عنوان زمان ختم عمل الکتروفورز در نظر گرفته شده است.

در مورد آنزیمهای APX و CAT در طی انجام الکتروفورز ولتاژ روی 180 ولت به طور ثابت تنظیم گردید. برای بقیه آنزیمها ولتاژ برای ژل رویی روی 130 ولت و برای ژل زیرین 140 ولت تنظیم شد.

آشکارسازی فعالیتهای آنزیمها روی ژلهای پلی آکریل آمید با روشهای متفاوتی انجام گرفت.

برای ظهور نوارهای مربوط به SOD (5) ژل را داخل محلول حاوی100 میلی لیتر بافر تریس – کلرید (05/0 مولار با 8 = pH )، 4 میلی گرم ریبوفلاوین، 2 میلی گرم(Triplex III) EDTA و2  میلی گرم NBT قرار داده بر روی جعبه نورانی در مجاورت نور فلوئورسان در حالی که ظرف حاوی ژل و محلول ظهور، تکان داده شد مناطق فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز به صورت نوارهای بیرنگ در یک زمینه بنفش ظاهر گردید. پس از ظهور نوارها ژل با آب مقطر شسته شد و در آب مقطر نگهداری گردید.

ظهور نوارهای مربوط به CAT (12) با قرار دادن ژلها به مدت 15-10 دقیقه در H2O2 01/0 درصد، شستشو با آب مقطر، قرار دادن ژلها به مدت 20-15 دقیقه در محلول FeCl3 1 درصد و K3(Fe(CN6)) 1 درصد و در نهایت شستشو با آب مقطر صورت پذیرفت.

روش ظهور نوارهای APX (12) نیز طی چند مرحله انجام شد: 1. ژلها با بافر سدیم فسفات (mM 50 با 7 = pH ) حاوی آسکوربات (mM 2) به مدت 30 دقیقه به تعادل رسیدند. 2. سپس در محلولی شامل بافر سدیم فسفات (mM 50 با 7 = pH ) حاوی آسکوربات (mM 4) و H2O2 (mM 2) به مدت 20 دقیقه قرار داده شدند. 3. ژل در بافر به مدت 1 دقیقه شسته شد. 4. غوطه ور شدن ژل همراه با تکانهای ملایم در محلول حاوی بافر سدیم فسفات (mM 50 با 8/7 = pH )، TEMED(mM 28) و NBT (mM 45/2) به مدت 20-10 دقیقه انجام شد. 5. ژلها پس از ظهور نوارهای بیرنگ در زمینه بنفش رنگ با آب مقطر شستشو داده شدند.

برای ظهور نوارهای آنزیمی با فعالیت POD (4) بر روی ژل پلی آکریل آمید، محلولهای بافر استات 2/0 مولار با 5 = pH (80 میلی لیتر)، آب اکسیژنه 3 درصد (8 میلی لیتر) و بنزیدین 04/0 مولار در متانل 50 درصد (4 میلی لیتر) با یکدیگر مخلوط شدند. ژلها حداقل به مدت 2 تا 3 ساعت و در صورت لزوم بیشتر تا زمان ظهور نوارهای آنزیمی در دمای 4 درجه سانتی گراد در محلول فوق نگهداری شدند و پس از این مرحله شسته شده و در آب مقطر ذخیره شدند.

مخلوط بافر فسفات 2/0 مولار با 8/6 = pH (50 میلی لیتر)، 3-4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) (20 میلی لیتر) وکلسیم کلرید (H2O2 و CaCl2 ) 5/73 درصد (7/0 میلی لیتر) برای آشکارسازی نوارهای آنزیمی مربوط به PPO (4) بر روی ژل مورد استفاده قرار گرفت. ژل تا زمان آشکار شدن نوارهای آنزیمی در مخلوط فوق و در دمای اتاق و تاریکی قرار گرفت. پس از آن در صورت تیره شدن زمینه، ژل به مدت یک شب در محلول آسکوربیک اسید 104 میلی مولار قرار گرفت تا رنگ زمینه زائل شود و در نهایت پس از شستشو با بافر فسفات در آب مقطر نگهداری شد.

برای رنگ آمیزی نوارهای پروتئین دارای فعالیت اکسین اکسیدازی(OOX) (6) ابتدا نمک فست بلو (BBsalt) mgml-1 2، H2O2 005/0 درصد ، اندول-3 - استیک اسید (IAA) mM 5/1 و 2-4-6- تری کلروفنل (TCP) mM 5/0 در 100 میلی لیتر بافر استات 2/0 مولار با 5 = pH حل شدند. ژل تا زمان ظهور نوارهای زرد - قهوه ای در محلول فوق نگهداری و شستشو شد و سپس در آب مقطر نگهداری گردید.

 

نمودار 1 -  مقایسه فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . (009/0)634/15 : Chi-square    1:برگ؛ 2:برگ کالوس زا؛ 3:کالوس؛ 4:کالوس رویانزا؛ 5:کالوس واجد رویان اولیه؛ 6: کالوس واجد رویان پیشرفته.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2 - مقایسه فعالیت کاتالاز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . (054/0)882/10 : Chi-square  1:برگ؛ 2:برگ کالوس زا؛ 3:کالوس؛ 4:کالوس رویانزا؛ 5:کالوس واجد رویان اولیه؛ 6: کالوس واجد رویان پیشرفته.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3 - مقایسه فعالیت آسکوربات پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . (009/0)327/15 : Chi-square 1:برگ؛ 2:برگ کالوس زا؛ 3:کالوس؛ 4:کالوس رویانزا؛ 5:کالوس واجد رویان اولیه؛ 6: کالوس واجد رویان پیشرفته.

 

جدول 1   مقایسه فعالیت  سوپر اکسید دیسموتاز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger .

U : ­μmol/ min

Activity

(U/mg protein)

tissue

8.5 ± 0.29

leaf

11.55 ± 0.27

callogenic leaf

15.23 ± 0.09

callus

15.95 ± 0.19

embryogenic callus

16.83 ± 0.16

early embryo holding callus

12.75 ± 0.68

late embryo holding callus 

جدول 2 -  مقایسه فعالیت  کاتالاز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . U : ­μmol/ min

Activity

(U/mg protein)

tissue

2.27 ± 0.35

leaf

4.41 ± 0.59

callogenic leaf

5.52 ± 0.22

callus

10.65 ± 0.98

embryogenic callus

6.8 ± 2.05

early embryo holding callus

7.11 ± 1.32

late embryo holding callus 

جدول 3 - مقایسه فعالیت  آسکوربات پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . U : ­μmol min

Activity

(U/mg protein)

tissue

0.634 ± 0.08

leaf

1.72 ± 0.11

callogenic leaf

1.126 ± 0.05

callus

7.82 ± 0.72

embryogenic callus

2.258 ± 0.13

early embryo holding callus

1.568 ± 0.13

late embryo holding callus 

نتیجه گیری و بحث

رویانزایی بدنی عبارت است از فرآیندی که طی آن یک ساختار دو قطبی مشابه رویان تخمی از یک یاخته غیر تخمی بدون اتصال آوندی با بافت اصلی تشکیل می شود. رویانهای بدنی به منظور مطالعه سازوکار تنظیم نمو رویان مورد استفاده قرار می گیرند، اما در عین حال ابزاری را در جهت ازدیاد غیر جنسی در مقیاس بزرگ  نیز هستند. تکثیر گیاه با رویانزایی بدنی منتهی به ایجاد گیاهانی با ویژگیهای ریختی  مشابه با یکدیگر و مشابه مادر و از نظر ژنتیکی تقریباً تغییر ناپذیر می گردد‍‍)18).

در بررسی حاضر نیز کشت برگ در محیط کشت MS واجد BAP (1-mgL 5/1) و IAA (1-mgL 2/0) منجر به رویانزایی موفقیت آمیزی شد و شرایط لازم برای بررسی نقش آنزیمهای پاداکسایشی در تمایز رویان فراهم گردید.

بررسی تغییرات فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز در مراحل مختلف تشکیل رویان ( جدول 1 ونمودار 1 ) نشان داد که در برگ فعالیتاین آنزیمکمترین مقدار را دارا می باشد. فعالیت آنزیم در طی تشکیل رویان به تدریج افزایش یافته تا مرحله کالوس واجد رویان اولیه به تدریج افزایش می یابد (8/1 برابر برگ ) و دوباره کاهش حاصل می کند. بررسی آماری نشان داد که فعالیت این آنزیم در مراحل مختلف رویانزایی اختلاف معنی دار دارد( جدول6). این نتایج با بررسی Kakkar و Sawhney  (2002) که ابتدا  افزایش و سپس کاهش فعالیت این آنزیم را در طی نمو رویان گزارش کرده بودند(24) همخوانی دارد.

بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای سوپراکسید دیسموتازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل 1) وجود  7 ایزوفرم را نشان داد . در برگ 4 ، برگ کالوس زا 7  ،کالوس 7 و کالوس واجد رویان 5 ایزوفرم قابل شناسایی می باشد. Rm  و جرم مولکولی ایزوفرمهای فوق در جدول 7 بیان شده است . بررسی مقایسه ای ایزوفرمها در مراحل مختلف تشکیل رویان نشان داد که ایزوفرمهای 1 (KD 1/45) ، 5 (KD 1/22) و 7 (KD 4/13) که تنها در برخی از مراحل رویانزایی مشاهده شده اند   جزء ایزوفرمهای اصلی دخیل در تمایز رویان محسوب می شوند و ایزوفرمهای 2 (KD 33) ، 3 (KD 5/26) ، 4 (KD 2/24) و 6 (KD 9/18) که در تمام مراحل تشکیل رویان قابل مشاهده بودند جزء ایزوفرمهای نهادی دخیل در فرآیندهای عمومی تمایز محسوب می شوند. از سوی دیگر ایزوفرمهای 1 (KD 1/45) ، 3 (KD 5/26) ، 4 (KD 2/24) ، 5 (KD 1/22) و 7  (KD 4/13) در طی تشکیل رویان دچار بیش بیانی یا فراتنظیمی گشته اند و ایزوفرمهای 2 (KD 33) و 6 (KD 9/18) در طی تشکیل رویان تقریباً به طور یکسان بیان شده اند. 

بررسی تغییرات فعالیت پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان ( جدول 4 و نمودار 4 ) نشان داد که در برگ این آنزیم کمترین فعالیت را دارا می باشد. فعالیت این آنزیم در طی تشکیل رویان تا  کالوس واجد رویان اولیه که به حداکثر خود می رسد ( 3 برابر برگ )، افزایش و دوباره کاهش می یابد. بررسی آماری نشان داد که فعالیت این آنزیم در مراحل مختلف رویانزایی اختلاف معنی دار دارد ( جدول 6). این بررسی با نظر Martensson  و همکاران (1998) که به نقش این آنزیم در به راه انداختن رویانزایی اشاره دارند مطابقت داشته، ولی با بررسی دیگر همین گروه مبنی بر کاهش فعالیت این آنزیم در کالوس رویانزا نسبت به کالوس غیر رویانزا، همخوانی ندارد(29).

 

 

 

 

نمودار 4 - مقایسه فعالیت پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . (011/0)848/14 : Chi-square . 1:برگ؛ 2:برگ کالوس زا؛ 3:کالوس؛ 4:کالوس رویانزا؛ 5:کالوس واجد رویان اولیه؛ 6: کالوس واجد رویان پیشرفته.

جدول 4 -  مقایسه فعالیت پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . U : ­μmol/ min

Activity

(U/mg protein)

tissue

6.88 ± 0.79

leaf

7.36 ± 0.6

callogenic leaf

16.78 ± 0.63

callus

9.86 ± 1.32

embryogenic callus

21.3 ± 1.68

early embryo holding callus

8.04 ± 0.35

late embryo holding callus

 

 
   

 

 

 

 

 


نمودار 5 - مقایسه فعالیت پلی فنل اکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . (035/0)971/11 : Chi-square . 1:برگ؛ 2:برگ کالوس زا؛ 3:کالوس؛ 4:کالوس رویانزا؛ 5:کالوس واجد رویان اولیه؛ 6: کالوس واجد رویان پیشرفته.

جدول 5  - مقایسه فعالیت پلی فنل اکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی درH.niger . U : ­μmol/ min

Activity

(U/mg protein)

tissue

6.88 ± 0.79

leaf

7.36 ± 0.6

callogenic leaf

16.78 ± 0.63

callus

9.86 ± 1.32

embryogenic callus

21.3 ± 1.68

early embryo holding callus

8.04 ± 0.35

late embryo holding callus 

جدول 6 - بررسی آماری با آزمون .Kruskal-wallis  مقایسه میانگینهای فعالیتهای  آنزیمها در مراحل مختلف رشد رویان و معنی دار بودن اختلاف بین این مراحل.

Chi-square(p)

Enzyme

15.436 (0.009 )

Superoxid dismutase

10.882 (0.054 )

Catalase

15.327 (0.009 )

Ascorbate pepoxidase

14.848 (0.011 )

Peroxidase

11.971 (0.035 )

Polyphenol oxidase

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1 - الکتروفورز سوپر اکسید دیسموتاز در مراحل مختلف

 تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. A : برگ ، B: برگ کالوس زا ، C : کالوس و D : کالوس واجد رویان. 7 → 1 : شماره های نوارهای ایزوفرمها. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح واره ای نوارها.

بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای پراکسیدازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل4) 6 ایزوفرم را نشان داد که در برگ 5 ، برگ کالوس زا 5  ،کالوس 6 ، کالوس رویانزا 5  و کالوس واجد رویان 6 ایزوفرم قابل شناسایی می باشد. Rm  و جرم مولکولی ایزوفرمهای فوق در (جدول 10) بیان شده است . بررسی مقایسه ای ایزوفرمها در مراحل مختلف تشکیل رویان و نشان داد که ایزوفرم 6 (KD 4/30) که تنها در برخی از مراحل رویانزایی مشاهده شده بود، جزء ایزوفرمهای اصلی دخیل در تمایز رویان بوده و ایزوفرمهای 1 (KD 7/76) ، 2(KD60) ، 3 (KD 6/53) ،4(KD 37)  و 5 (KD 1/34) که در تمام مراحل تشکیل رویان قابل مشاهده بودند جزء ایزوفرمهای نهادی دخیل در فرآیندهای عمومی تمایز محسوب می شوند. از طرف دیگر ایزوفرمهای 7/76 ،60 ، 6/53 ، 37  و 1/34 در طی تشکیل رویان دچار بیش بیانی یا فراتنظیمی گشته اند و ایزوفرم 4/30  تنها در کالوس و کالوس واجد رویان بیان شده است.  

 

 

 
   

 

 

 


شکل 2 - الکتروفورز  کاتالاز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. A : برگ ، B : برگ حامل کالوس ، C : کالوس ، D : کالوس رویانزا و E : کالوس واجد رویان. 1 : شماره نوار ایزوفرم. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح واره ای نوارها.

 

جدول 7 -  الکتروفورز آنزیم SOD در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.        7 → 1  : شماره های نوارهای ایزوفرمها. + ← +++++ مقادیر نسبی نوارهای ایزوفرمی.

number

Rm

molecular weight

Leaf

callogenic leaf

callus

embryo holding callus

1

0.368

45.1

 

++

+++

++++

2

0..473

33

++++

++++

++++

++++

3

0.541

26.5

+++

+++++

+++++

+++

4

0.578

24.2

++

++++

++++

++

5

0.61

22.1

 

++++

++++

 

6

0.663

18.9

++++

++++

++++

++++

7

0.778

13.4

 

++++

++++

 

 

 

جدول 8   الکتروفورز آنزیم CAT در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. 1 : شماره نوار ایزوفرم. +++ ← +++++ مقادیر نسبی نوار ایزوفرمی.

number

Rm

molecular weight

Leaf

callogenic leaf

callus

embryogenic callus

embryo holding callus

1

0.294

106.7

 

 

 

+++

+++++

 

جدول 9 -  الکتروفورز آنزیم APX در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. . 5 → 1: شماره های نوارهای ایزوفرمها. + ← ++++++ مقادیر نسبی نوارهای ایزوفرمی.

number

Rm

molecular weight

leaf

callogenic leaf

embryogenic callus

embryo holding callus

1

0.533

45.1

 

+

+++

+++

2

0.728

28.2

 

 

++

++

3

0.796

23.8

++++

++++

++++++

++++++

4

0.844

21.1

 

++

+++++

+++++

5

0.893

18.7

 

 

+++

+++

 

جدول 10 -  الکتروفورز آنزیم POD در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. . 6 → 1  : شماره های نوارهای ایزوفرمها. + ← ++++++ مقادیر نسبی نوارهای ایزوفرمی.

number

Rm

molecular weight

Leaf

callogenic leaf

callus

embryogenic callus

embryo holding callus

1

0178

76.8

++

++

++++

++++

++++

2

0.264

60

++

++++

++++++

+++++

++++

3

0.303

53.6

++

+++

++++

+++

++

4

0.431

37

++

+++

++++

+++

+++

5

0.46

34.1

+

++

+++

++

+++

6

0.5

30.4

 

 

++

 

++

 

جدول 11 -  الکتروفورز آنزیم PPO در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. . 6 → 1: شماره های نوارهای ایزوفرمها. + ← ++++++ مقادیر نسبی نوارهای ایزوفرمی. 

number

Rm

molecular weight

leaf

callogenic leaf

embryogenic callus

embryo holding callus

1

0.215

141.6

+

 

 

+++

2

0.421

67.79

++++

+++++

++++++

+++

3

0.568

40.1

 

+++

++++

+

4

0.637

31.6

++++

++++++

++++++

+++++

5

0.686

26.3

+++

++++

++++

+++

6

0.735

22

 

+++

+++

 

 

 

جدول 12 -  الکتروفورز آنزیم  OOX در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger. 7 → 1  : شماره های نوارهای ایزوفرمها. + ← ++++++ مقادیر نسبی نوارهای ایزوفرمی.

number

Rm

molecular weight

leaf

callogenic leaf

 

callus

 

embryogenic callus

embryo holding callus

1

0.161

79.1

 

+

+++

++++

+++

2

0.252

62.1

 

 

 

++++

++++

3

0.273

58.3

++

+++++

+++++

+++++

+++++

4

0.315

51.7

+

++++

+++++

++++

++++

5

0.421

38.1

++++

+++++

++++++

++++

++++

6

0.442

35.9

 

+++++

++++++

++++

++++

7

0.484

31.8

 

 

++

++

+++

 

بررسی تغییرات فعالیت کاتالاز در مراحل مختلف تشکیل رویان ( جدول 2 و نمودار 2 ) نشان داد که در برگ این آنزیم کمترین فعالیت را دارا می باشد. فعالیت این آنزیم در طی تشکیل رویان تا  مرحله کالوس رویانزا که به حداکثر خود می رسد ( 69/4 برابر برگ ) به تدریج افزایش یافته و دوباره کاهش می یابد. بررسی آماری نشان داد که بین فعالیتهای این آنزیم در مراحل مختلف رویانزایی اختلاف معنی دار نمی باشد (جدول 6). این نتایج با بررسی Kakkar و Sawhney  (2002) که بالا بودن فعالیت CAT در کالوس و کاهش آن را در اولین روزهای تمایز رویان گزارش کرده اند تطابق کاملی ندارد (24).

بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای کاتالازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل 2) وجود تنها یک نوار ایزوفرمی با جرم مولکولی 7/106 کیلودالتون را نشان داد (جدول 8) . با بررسی مقایسه ای این ایزوفرم در مراحل مختلف تشکیل رویان می توان گفت این ایزوفرم که تنها در برخی از مراحل رویانزایی قابل مشاهده است یک ایزوفرم اصلی دخیل در تمایز رویان محسوب می شود. همچنین بیش بیانی یا فراتنظیمی این ایزوفرم در طی تشکیل رویان قابل توجه می باشد.

بررسی تغییرات فعالیت آسکوربات پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان ( جدول 3 و نمودار 3) نشان داد که در برگ این آنزیم کمترین فعالیت را دارا می باشد. فعالیت این آنزیم در طی تشکیل رویان به تدریج افزایش یافته تا  کالوس رویانزا که به حداکثر خود می رسد ( 3/12 برابر برگ ) و دوباره کاهش می یابد. بررسی آماری نشان داد که بین فعالیتهای این آنزیم در مراحل مختلف رویانزایی اختلاف معنی دار می باشد( جدول6).

بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای آسکوربات پراکسیدازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل 3) 5 ایزوفرم را نشان داد و در برگ 1 ، برگ کالوس زا 3  ،کالوس رویانزا 5 و کالوس واجد رویان 5 ایزوفرم قابل شناسایی می باشد. Rm  و جرم مولکولی ایزوفرمهای فوق در (جدول 9) بیان شده است. با بررسی مقایسه ای ایزوفرمها در مراحل مختلف تشکیل رویان و با توجه به توضیحات داده شده می توان گفت ایزوفرمهای 1 (KD 1/45) ، 2 (KD 2/28) ، 4 (KD 1/21)  و 5 (KD 7/18) که تنها در برخی از مراحل رویانزایی مشاهده شده اند جزء ایزوفرمهای اصلی دخیل در تمایز رویان محسوب می شوند و ایزوفرم 2 (KD 2/28) که در تمام مراحل تشکیل رویان قابل مشاهده بود جزء ایزوفرمهای نهادی دخیل در فرآیندهای عمومی تمایز محسوب می شود. کلیه ایزوفرمها در طی تشکیل رویان دچار بیش بیانی یا فراتنظیمی شده بودند.

بررسی تغییرات فعالیت پلی فنل اکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان ( جدول 5 و نمودار 5 ) نشان داد که در برگ این آنزیم کمترین فعالیت را دارا می باشد. فعالیت این آنزیم در طی تشکیل رویان تا  مرحله کالوس واجد رویان اولیه که به حداکثر خود می رسد (3/3 برابر برگ )، به تدریج افزایش یافته و دوباره کاهش می یابد. بررسی آماری نشان داد که بین فعالیتهای این آنزیم در مراحل مختلف رویانزایی اختلاف معنی دار می باشد (جدول6).

با بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای پلی فنل اکسیدازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل 5 ) وجود 6 ایزوفرم نشان داده شد. همچنین معلوم شد که در برگ 4 ، برگ کالوس زا 5  ،کالوس رویانزا 5 و کالوس واجد رویان 5 ایزوفرم قابل شناسایی می باشد. Rm  و جرم مولکولی ایزوفرمهای فوق در (جدول 11) بیان شده است . با بررسی مقایسه ای ایزوفرمها در مراحل مختلف تشکیل رویان می توان گفت ایزوفرمهای 1 (KD 6/141) ، 3 (KD 1/40) و 6 (KD 22) که تنها در برخی از مراحل رویانزایی مشاهده شده اند جزء ایزوفرمهای اصلی دخیل در تمایز رویان محسوب می شوند و ایزوفرمهای 2 (KD 79/67) ، 4 (KD 6/31) ،  و 5 (KD 3/26) که در تمام مراحل تشکیل رویان قابل مشاهده بودند جزء ایزوفرمهای نهادی دخیل در فرایندهای عمومی تمایز محسوب می شوند. به علاوه ایزوفرمهای 1 (KD 6/141) ،  2 (KD 79/67)   ، 3 (KD 1/40) و 6 (KD 22) در طی تشکیل رویان دچار بیش بیانی یا فراتنظیمی گشته اند و ایزوفرم 5 (KD 3/26) در طی تشکیل رویان تقریباً به طور یکسان بیان شده است.  

در پژوهش حاضر OOXs که جزء PODs می باشند با روش الکتروفورز بررسی گردیدند. مقایسه الگوهای الکتروفورزی شباهت فراوانی را بین نوارهای ایزوفرمی این دو گروه از آنزیمها نشان می دهد.

 

 

 

 

 

 


شکل 3 - الکتروفورز آسکوربات پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. A : برگ ، B : برگ حامل کالوس ، C : کالوس رویانزا و D : کالوس واجد رویان. . 5 → 1: شماره های نوارهای ایزوفرمها. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح واره ای نوارها.

 
   

 

 

 

 

 

 


شکل 4 - الکتروفورز پراکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.     A: برگ ، B : برگ حامل کالوس ، C : کالوس و D : کالوس رویانزا و E : کالوس واجد رویان. 1→ 6 : شماره های نوارهای ایزوفرمها. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح

واره ای نوارها.

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 5 - الکتروفورز پلی فنل اکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. A : برگ ، B : برگ حامل کالوس ، C : کالوس رویانزا و D : کالوس واجد رویان. . 6 → 1  : شماره های نوارهای ایزوفرمها. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح واره ای نوارها.

 

 

 

 


شکل 6 - الکتروفورز اکسین اکسیداز در مراحل مختلف تشکیل رویان از جداکشت برگی در H.niger.. A : برگ ، B : برگ حامل کالوس ، C : کالوس ، D : کالوس رویانزا و E : کالوس واجد رویان. . 7 → 1  : شماره های نوارهای ایزوفرمها. الف) شکل اصلی ژل. ب) نمایش طرح واره ای نوارها.

بررسی الگوی الکتروفورزی ایزوفرمهای اکسین اکسیدازی درمراحل مختلف تشکیل رویان (شکل 6) وجود 7  ایزوفرم را نشان می دهد. با توجه به شکل  در برگ 3 ، برگ کالوس زا 4  ،کالوس 6 ، کالوسرویانزا 7 و کالوس واجد رویان 7  ایزوفرم قابل شناسایی می باشد. Rm  و جرم مولکولی ایزوفرمهای فوق در (جدول 12) بیان شده است . با بررسی مقایسه ای ایزوفرمها در مراحل مختلف تشکیل رویان و با توجه به توضیحات داده شده می توان گفت ایزوفرمهای 1 (KD 1/79) ، 2 (KD 9/65) ،  6(KD 9/35)  و 7 (KD 8/31) که تنها در برخی از مراحل رویانزایی مشاهده شده اند   جزء ایزوفرمهای اصلی دخیل در تمایز رویان محسوب می شوند و ایزوفرمهای 3 (KD 3/58) ، 4 (KD 7/51)  و 5 (KD 1/38) که در تمام مراحل تشکیل رویان قابل مشاهده بودند جزء ایزوفرمهای نهادی دخیل در فرآیندهای عمومی تمایز محسوب می شوند. کلیه ایزوفرمها در طی تشکیل رویان دچار بیش بیانی یا فراتنظیمی شده اند.  

 ما حصل اینکه، مرحله تشکیل کالوس رویانزا از شاخص ترین مراحل رویانزایی است. این مرحله با شدید بودن فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز و با ضعیف بودن فعالیت پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز همراه بوده، تغییر تعداد نوارهای آنزیمی این ویژگی را همراهی نمی نماید.

1-     ابراهیم زاده – مهدیس و ابراهیم زاده – حسن (1387): بررسی تغییرات پروتئینها در مراحل مختلف رویانزایی بدنی از قطعات برگ  H. arachnoideus Pojark و H.niger L. . مجله زیست شناسی ایران – جلد 21،‌ شماره 3 ، صفحات 381-369.

2-     ابراهیم زاده – مهدیس، مجد – احمد و ابراهیم زاده – حسن (1381): رویانزایی بدنی در قطعات جداکشت چند گونه بنگدانه (Hyoscyamus) : H. pusilus L. ، H. arachnoideus Pojark و H.niger L. . مجله زیست شناسی ایران – جلد 13،‌ شماره 3 و 4، صفحات 48-39.

3-     ابریشم چی – پروانه (1379): بررسی متابولیسم گل در گیاه زعفران مزروعی. رساله برای دریافت درجه دکترای تخصصی فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه تهران، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی.

4-     رهنما – حسن (1382): استفاده از روشهای مختلف فیزیولوژیکی و بیوتکنولوژیکی جهت بررسی و ایجاد ارقام مقاوم به شوری در سیب زمینی. رساله دکتری – دانشگاه تهران، دانشکده علوم، گروه زیست‏شناسی.

5-     شریفی – گل اندام (1380): مطالعه تبار زایشی برخی از گونه های بنگ دانه (Hyoscyamus L.) در ایران. پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد علوم گیاهی، گرایش فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه تهران ، دانشکده علوم، دانشکده زیست شناسی.

6-     ندیم – هایده (1356): تغییرات کمی و کیفی پروتئینهای محلول و سه گروه آنزیمی و رابطه با افزایش سن و پیری. پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد. دانشگاه تهران، دانشکده علوم، گروه زیست‏شناسی.

 

7-     Angelopoulos K., Dichio B. and Xiloyannis C. (1996). Inhibition of photosynthesis in olive trees (Olea europaea L.) during water stress and rewatering Journal of Experimental Botany. 47: 1093-1100.

8-     Arnold S., Sabala I., Bozhkov P., Dyachok J. and Filonova L. (2002) Developmental  pathways of somatic embryogenesis, Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 69: 233-249.

9-     Arrigoni O., Gara L., Tommasi F., and Liso R. (1992). Change in ascorbate system during seed development of Vicia faba. Plant Physiol. 99: 235-238.

10-  Bowler C., van Montagu M., Inzé D. (1992). Superoxide dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43: 83-116.

11-  Chen C., Belanger R. R., Benhamou N. and Paulitz T.C. (2000). Defense enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) and Pythium aphanidermatum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 56: 13-23.

12-  Dewir Y. H., Chakrabarty D., Al, M. B., Hahn E. J. and Paek K. Y. (2005). Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities of Eupia millii hyperhydric shoots. Environmental and Expermental Botany. 58 (1-3): 93-99.

13-  Diamantidis G., Effose A., Potier P. and Bally R. (2000). Purification and characterization of the first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum. Soil Biology and Biochemistry. 32: 919-927.

14-  Elkahoui S., Hernandez J. A., Abdelly C., Ghrir R. and Limam F. (2005). Effects of salt on lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities of Catharanthus roseus suspension cells. Plant Science. 168: 607-613.

15-  Feierabend J., Schaan C., Hertwig B. (1992). Photoinactivation of catalase occurs under both high and low temperature stress conditions and accompanies photoinhibition of photosystem II. Plant Physiology. 100: 1554-1561.

16-  Foyer C.H., Mullineaux P.M. (1998). The presence of dehydroascorbate and dehydroascorbate reductase in plant tissues. FEBS Letters. 425: 528-529.

17-  Garnczarska M. (2005). Response of the ascorbate-glutathione cycle to reaeration following hypoxia in lupine roots. Plant Physiology and Biochemistry. 43(6): 583-590.

18-  Halliwell B. and Gutteridge J. M. C. (1999). Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed. Oxford university press, New York.

19-  Hames B.D. and Richwood D. (1999) Gel Electrophoresis of Proteins: A practical Approach, second edition, Oxford University. Press, New York.

20-  Ho K.K. (1999). Characterization of polyphenol oxidase from aerial roots of an orchid, Aranda ‘Christine 130’ . Plant Physiol. Biochem. 37(11): 841-848.

21-  Hoyle M. C. (1992). Indole acetic acid oxidase: a dual catalytic enzyme. Plant Physiol. 50: 15-18.

22-  Izzo F., Meneguzzo S., Loggini B., Vazzana C. and Sgherri C. L. M. (1997). The role of the glutathione system during dehydration of Boea hygroscopica. Physiol. Plant.(99): 23-30.

23-  Jebara S., Jebara M., Limam F. and Aouani M.E. (2005). Changes in ascorbate peroxidase, catalase, guaiacol peroxidase and superoxide dismutase activities in common bean (Phaseolus vulgaris) nodules under salt stress. Journal of Plant Physiology. 162: 929-936.

24-  Kakkar R. K. and Sawhney V. K. (2002). Polyamine research in plants-a changing perspective. Physio. Planta. 116: 281-292.

25-  Keissar H.T., Bashan B., Levy Y. and Kenigsbuch D. (2002). Stage specificity of catalase isoform activity in Exserohilum turcicum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 60: 163-168.

26-  Kuwabara T., Katoh Y. (1999). Involvement of the binuclear copper site in the proteolytic activity of polyphenol oxidase. Plant and Cell Physiology. 40: 1029-1035.

27-  Li S.H., Kuoh C.S., Chen Y.H., Chen H.H. and Chen W.H. (2005) Osmotic sucrose enhancement of single-cell embryogenesis and transformation efficiency in  Oncidium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81: 183-192.

28-  Marri C., Frazzoli A., Hochkoeppler A. and Poggi V. (2003). Purification of a polyphenol oxidase isoform from potato (Solanum tuberosum) tubers. Phytochemistry. 63: 745-752.

29-  Martensson B., Sommarin M. and Widell S. (1998). Peroxidase activity and ATP-dependent Ca2+ transport in subcellular fraction of embryogenic and non–embryogenic Daucus carota cell suspensiens. Plant Physiol. Biochem. 7: 515-524.

30-  Mazzafera P. and Robinson S.P. (2000). Characterization of polyphenol oxidase in coffee. Phytochemistry. 55: 258-296.

31-  Mehlhorn H., Lelandais M., Korth H.G., Foyer C.H. (1996). Ascorbate is the natural substrate for plant peroxidases. FEBS Letters. 425: 528-529.

32-  Miszalski Z., Libik M., Surowka E. and Niewiadomska Ewa. (2005). Cu/Zn superoxide dismutase and catalase activities in Pinus mugo needles growing at elevated stands in the mountains, and their photochemical efficiency of PS II. Jurnal of plant Physiology, 162 (8): 895-902.

33-  Noctor N., Veljovic-Jovanovic S., Foyer C.H. (2000). Peroxide processing in photosynthesis: antioxidant coupling and redox signaling. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 355: 1465-1475.

34-  Smirnoff N. (1993). The role of active oxygen in the response to water deficit and desiccation. New Phytologist. 125: 27-58.

35-  Smirnoff N. (2000). Ascorbic acid: metabolism and functions of a multi-facetted molecule. Current Opinion in Plant Biology. 3:229-235.

36-  Van Breusegem F., Slooten L., Stassart J. M., Moens T., Botherman J., Van Montagu M. and Inze O. (1999). Overproduction of Arabidopsis thaliana Fe SOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize. Plant Cell Physiol 40: 515-523.

37-  Wingler A., Lea P.J., Quick W.P. and Leegood R.C. (2000). Photorespiration: metabolic pathways and their role in stress protection. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences . 355: 1517-1529.