نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران.
2 دانشگاه بوعلی سینا
3 موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال
4 پردیس کشاورزی و منابع طبیعی ، دانشگاه تهران، کرج،ایران.
چکیده
گیاه پروانش یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی است. افزایش مقدار ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها (TIA) در
اندامهای این گیاه از طریق اعمال تیمارهای زیستی و غیر زیستی یکی از اهداف فعالیتهای اصلاحی میباشد. در این بررسی تاثیر دو گونه از باکتریهای تقویتگر رشد Pseudomonas fluorescens و Azospirillum brasilense به صورت جداگانه و ترکیبی همراه با دو سطح تیمار رطوبتی به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوک-های کامل تصادفی در سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفتند. اثر تیمارها 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی بر برخی صفات ریختشناسی و نیز بیان دو ژن Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش با استفاده از تکنیک qRT-PCR بررسی گردید. تنش کمبود آب، رشد طولی ریشه را به طور معنیداری افزایش داد ولی تاثیر معنیداری بر بیان ژنها نداشت. باکتری A. brasilense در شرایط عدم تنش، با افزایش طول، حجم و سطح ریشه، افزایش معنیدار بیان ژن کلیدی Str را در پی داشت. باکتری P. fluorescens نیز با وجود کاهش مقادیر صفات رویشی، تاثیر مثبت و معنیداری بر بیان ژن-های مورد بررسی در شرایط عدم تنش و تنش نسبت به گیاهان شاهد داشت. از نظر تاثیر بر بیان ژنهای مورد بررسی، دو گونه باکتریایی بهطور جداگانه، نسبت به تلقیح ترکیبی، بهتر عمل نموده و بیان ژنها را در هر دو شرایط رطوبتی نسبت به گیاهان شاهد بدون تنش و تحت تنش افزایش دادند. انتظار میرود با افزایش بیان دو ژن Tdc و Str محصول این ژنها و محصولات نهایی مسیر بیوسنتزی انواع TIA از جمله مقدار آجمالیسین در ریشه گیاه پروانش افزایش یابد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Evaluation of water deficite stress and plant growth-promoting rhizobacteria effect on some of morphological traits and expression level of TDC and STR at the root of Catharanthus roseus
نویسندگان [English]
1 Agronomy & Plant Breeding Department, , Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan- Iran.
2 Bu-Ali Sina University
3 Seed and Plant Certification and Registration Institute, Karaj, Iranmo
4 College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran,, Karaj, Iran.
چکیده [English]
Catharanthus roseus is one of the most extensively investigated medicinal plants. Increase the concentrations of TIAs in plant organs, by biotic and abiotic treatments, is an important breeding objective on C. roseus. The effect of plant growth promoting rhizobacteria, Pseudomonas fluorescens and Azospirillum brasilense separately and in combination along with moisture treatment at two levels were tested in Catharanthus roseus as a factorial experiment based on randomized complete block design in three replications. Effect of treatments was evaluated 30 days after applying moisture treatments on some of morphological traits and Tdc and Str genes expression at the root of plant using qRT-PCR reaction. Water deficit significantly increased root length but it had no significant effect on the expression of these genes. Treatment with A. brasilense in normal condition enhanced length, volume and surface of roots, also significantly increased Str key gene expression. P. fluorescens had a positive and significant effect on the expression of the studied genes under normal and stress conditions compared to the control plants, despite the decrease in the amount of morphological traits. P. fluorescens and A. brasilense, separately, performed better in terms of their effects on the expression of the studied genes and increased the gene expression in normal and stress conditions compared to control plants. It is expected that by increasing the expression of Tdc and Str genes, the product of these genes as well as the final products of TIAs biosynthetic pathway, including ajmalicin content enhance at the root of periwinkle plant.
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر تنش کمبود آب و باکتریهای تقویت کننده رشد گیاه بر برخی از صفات ریختشناسی و بیان ژنهای Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش (Catharanthus roseus)
مریم احمدزاده1، امیرحسین کشتکار1*، کبری مسلمخانی2 و مسعود احمدزاده3
1 ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی
2 ایران، تهران، موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال
3 ایران، کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی
تاریخ دریافت:14/04/1399 تاریخ پذیرش: 12/05/1399
چکیده
گیاه پروانش یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی است. افزایش مقدار ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها (TIA) در اندامهای این گیاه از طریق اعمال تیمارهای زیستی و غیر زیستی یکی از اهداف فعالیتهای اصلاحی میباشد. در این بررسی تاثیر دو گونه از باکتریهای تقویتگر رشد Pseudomonas fluorescens و Azospirillum brasilense به صورت جداگانه و ترکیبی همراه با دو سطح تیمار رطوبتی به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوکهای کامل تصادفی در سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفتند. اثر تیمارها بر برخی صفات ریختشناسی در مرخله گلدهی و نیز بیان دو ژن Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش با استفاده از تکنیک qRT-PCR بررسی گردید. تنش کمبود آب، رشد طولی ریشه را به طور معنیداری افزایش داد ولی تاثیر معنیداری بر بیان ژنها نداشت. باکتری A. brasilense در شرایط عدم تنش، با افزایش طول، حجم و سطح ریشه، افزایش معنیدار بیان ژن کلیدی Str را در پی داشت. باکتری P. fluorescens نیز با وجود کاهش مقادیر صفات رویشی، تاثیر مثبت و معنیداری بر بیان ژنهای مورد بررسی در شرایط عدم تنش و تنش نسبت به گیاهان شاهد داشت. از نظر تاثیر بر بیان ژنهای مورد بررسی، دو گونه باکتریایی بهطور جداگانه بهتر عمل نموده و بیان ژنها را در هر دو شرایط رطوبتی نسبت به گیاهان شاهد بدون تنش و تحت تنش افزایش دادند. انتظار میرود با افزایش بیان دو ژن Tdc و Str محصول این ژنها و محصولات نهایی مسیر بیوسنتزی انواع TIA از جمله مقدار آجمالیسین در ریشه گیاه پروانش افزایش یابد.
واژه های کلیدی: پروانش، ریزوباکتریهای تقویت کننده رشد گیاه، واکنش qRT-PCR، ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها، تنش کمبود آب
* نویسنده مسئول، تلفن: 09188109096 ، پست الکترونیکی: akesht@googlemail.com
مقدمه
گیاه پروانش با نام علمی Catharanthus roseus (L.) G. Don متعلق به تیره خرزهره (Apocynaceae)، به عنوان یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی به شمار میرود (28، 45 و 54). ارزش بسیار بالای پروانش بر اساس منفعت دارویی هنگفت آن که تولید کننده بیش از 130 نوع ترپنوئید ایندول آلکالوئید Terpenoid indole alkaloid (TIA) میباشد، قرار دارد (13). گروه TIA، یکی از بزرگترین و متنوعترین گروه آلکالوئیدی در گیاه پروانش است. این گیاه منبع انحصاری دو آلکالوئید وینبلاستین و وینکریستین میباشد که به دلیل داشتن فعالیت ضد سرطانی، از جمله مهمترین آلکالوئیدها محسوب میشوند (54). علاوه براین ریشه این گیاه محل تجمع دو آلکالوئید آجمالسین و سرپنتین است (7، 28، 29، 33 و 45). آجمالیسین اولین بار در سال 1957 به عنوان داروی ضد فشار خون برای درمان اختلالات گردش خون و بیماران دارای فشار خون بالا، شناخته شد (51). امروزه با وجود پیشرفتهای زیاد در زمینه ساخت ترکیبات دارویی، این آلکالوییدها هنوز از طریق استخراج از گیاه پروانش به دست میآیند (7، 9 و 35). هزینه بالای تولید آلکالوئیدهای مهم دارویی به مقدار کم تجمع این مواد در اندامهای گیاه پروانش مربوط میشود. بنابراین افزایش مقدار TIA در اندامهای این گیاه یکی از اهداف فعالیتهای ژنتیکی و اصلاحی در گیاه پروانش محسوب میشود (28).
تحقیقات نشان داده است که بین میزان بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی TIA و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط با این ژنها در گیاه پروانش ارتباط وجود دارد (18، 25 و 52). Dutta et al در سال 2005 بمنظور درک این ارتباط، شش منبع ژنتیکی مختلف از C. roseus را مورد مطالعه قرار دادند. در این بررسی، نیمرخ بیان یک ژن ابتدای مسیر بیوسنتزی (str) و دو ژن انتهای این مسیر (d4h و dat) مورد مطالعه قرار گرفت و همبستگی مثبتی بین فراوانی رونویسی و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط در منابع ژنتیکی مختلف یافت شد (18).
طبق مطالعات صورت گرفته، تولید متابولیتهای ثانویه اغلب در واکنش به هر دو شرایط تنش زیستی و غیر زیستی افزایش مییابد (38 و 39). در گیاه پروانش نیز بمنظور افزایش مقدار آلکالوئیدهای گیاه، از عوامل زیستی و غیر زیستی در مطالعات مختلف بهره گرفته شده است (19؛ 30، 32 و 40). به عنوان نمونه، Jaleel et al در سال 2008 با مطالعه اثرات تنش کمبود آب بر متابولیسم اکسیژن فعال و نیز تجمع آلکالوئید آجمالیسین، نشان دادند که میزان آلکالوئید آجمالیسین در گیاهان پروانش تحت تنش به طور معنیداری نسبت به گیاهان شاهد بیشتر است. آنها بر اساس نتایج به دست آمده چنین بیان نمودند که مناطق جغرافیایی دچار کمبود آب میتوانند به خوبی برای کشت گیاهان دارویی نظیر پروانش مورد استفاده قرار گیرند و بدین ترتیب میزان آلکالوئید مهم اقتصادی گیاه افزایش پیدا میکند (31).
همچنین بر اساس گزارش برخی از محققین، میکروارگانیسمهای ریزوسفری، به عنوان الیسیتور زیستی عمل نموده و میتوانند سنتز تولیدات ثانویه را در گیاه القا نمایند (23 و 46). الیسیتورهای زیستی به عنوان فرآوردههای بدون خطر می توانند برای پایداری تولیدات کشاورزی مناسب باشند (6). در میان میکروارگانیسمهای موجود در ریزوسفر، ریزوباکتریهای تقویتگر رشد گیاهی Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) از اهمیت زراعی بالایی برخوردار هستند (15). امروزه انواع PGPR و اثر متقابلشان با گیاه، مورد بهرهبرداری تجاری قرار گرفته و کاربردهای عملی برای کشاورزی پایدار دارند (16و 26). نقش برخی از این میکروارگانیسمها در افزایش تعدادی از آلکالوئیدهای گیاهان دارویی از جمله پروانش به اثبات رسیده است (30 و 32). در سال 2007، Jaleel et al اثر باکتری تقویتگر P. fluorescens را روی پارامترهای رویشی و میزان تولید آلکالوئید آجمالیسین در C. roseus تحت تنش کمبود آب مورد مطالعه قرار دادند. در این مطالعه، تیمار با گونه فلورسنت باکتری Pseudomonas ، پارامترهای رشدی را تحت تنش کمبود آب افزایش داد و ممانعت رشدی ناشی از تنش را از طریق افزایش معنیدار وزن تر و خشک گیاه بهبود بخشید. مقدار آجمالیسین نیز در تیمار گیاهان تحت تنش با این باکتری افزایش یافت. نتیجه این بررسی نشان داد که تیمار گیاهچه با انواع بومی PGPR میتواند روش مناسبی برای افزایش عملکرد بیوماس و محتوای آلکالوئید در گیاهان دارویی باشد (30). همچنین استفاده تلفیقی از PGPR و تنش کمبود آب به عنوان یک تدبیر مفید برای حفظ محیط زیست معرفی شده که میتواند همزمان با بهبود شرایط تنش، مقدار و عملکرد آلکالوئید را در اندام گیاهان دارویی افزایش دهد (23 و 30).
همانطور که از مرور منابع مختلف پیداست با وجود انجام برخی مطالعات در زمینه تاثیر تنش کمبود آب و نیز باکتریهای تقویتگر رشد گیاه بر صفات ریختشناسی و محتوای آلکالوئیدهای گیاه پروانش، اثر این تیمارها بر بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی TIA به ویژه در ریشه گیاه، مورد بررسی واقع نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، از تیمارهای تنش کمبود آب و دو گونه از باکتریهای تقویت کننده رشد گیاه برای بررسی برخی از صفات رویشی و نیز ارزیابی نیمرخ بیان دو ژن Tdc و Str در ریشه گیاه پروانش استفاده گردید. همانطور که بیان شد، این دو ژن، جزء ژنهای ابتدای مسیر بیوسنتزی بوده و برای بسیاری از انواع TIA از جمله آجمالیسین در گیاه پروانش مشترک میباشند (شکل 1).
شکل 1- بخشی از مسیر بیوسنتزی ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها در گیاه پروانش
(نشاندهنده ژنهای مورد بررسی در پژوهش حاضر، برگرفته از منبع شماره 38)
مواد و روشها
کاشت و تیمار گیاه پروانش با PGPR: بذر F1 گیاه پروانش (Catharanthus roseus L.) از شرکتPanAmerican Seed تهیه گردید. بذرها با آب جاری شسته شده و برای ضدعفونی آنها از محلول هیپوکلریت سدیم (NaClO) 1/0 درصد به مدت 15 دقیقه استفاده شد. سپس بذرها توسط آب مقطر استریل طی چهار مرحله شسته شدند (5).
بر اساس مرور منابع مختلف، دو گونه از باکتریهای تقویت کننده رشد گیاه، به نامهای Pseudomonas fluorescens (سویه 169) و Azospirillum brasilense که توانایی کلونیزه کردن ریزوسفر گیاه پروانش را نیز دارند (32)، به صورت سوسپانسیون 108 واحد تشکیل کلونی Collony Forming Unit (cfu) بر میلیلیتر (10 و 20)، از مؤسسه تحقیقات خاک و آب کشور (بخش تحقیقات بیولوژی خاک)- کرج، تهیه شد و طبق دستورالعمل موسسه، در سه نوبت مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا بذرها با مایه تلقیح باکتریایی به مدت 30 دقیقه آغشته و در سینیهای کشت دارای ترکیب پرلیت و کوکوپیت به صورت سطحی کاشته شدند. سینیهای کشت، پس از آبدهی بمنظور جذب کامل رطوبت، زیر پوشش پلاستیکی، در دمای 20 تا 25 درجه سانتیگراد و نور طبیعی نگهداری شدند (4). آبیاری سینیهای کشت به صورت روزانه و در شرایط یکسان انجام گرفت. گیاهچهها پس از ظهور و در مرحله شش برگی، از سینیهای کشت خارج و در گلدانهای پلاستیکی جداگانه با قطر دهانه 15 سانتیمتر و ارتفاع 15 سانتی متر، کاشته شدند. تلقیح خاک گلدان و نیز تلقیح ریشه گیاهچهها قبل از انتقال از سینی کشت به گلدان صورت گرفت. به این ترتیب که ریشه گیاهچهها به مدت 20 دقیقه در بشرهای دارای هریک از مایههای تلقیح غوطهور شد. از آب مقطر نیز به میزان مساوی و هم حجم با تیمار باکتریایی به عنوان شاهد (عدم تلقیح باکتری) استفاده شد.
تنش رطوبتی: گیاهان پس از انتقال نشا به گلدان، برای اطمینان از استقرار، به مدت یک ماه تا حد ظرفیت زراعی آبیاری شدند. بافت خاک از نوع شنی لومی بود و ظرفیت زراعی خاک گلدان با استفاده از دستگاه صفحه فشاری Pressure plate تعیین گردید. پس از طی این مدت، گیاهان تحت تیمار رطوبتی قرار گرفتند. تیمار تنش رطوبتی در دو سطح شاهد (95 درصد ظرفیت زراعی) و تنش (55 درصد ظرفیت زراعی) اعمال گردید. به این ترتیب که گیاهان مربوط به هر یک از چهار سطح تیمار باکتریایی به دو قسمت تقسیم شده و بخشی به عنوان شاهد و بخش دیگر برای اعمال تنش در نظر گرفته شد. آبیاری گلدانها و اعمال تنش به روش وزنی انجام گرفت. به این ترتیب که از هر تیمار تعداد 4 گلدان اضافه برای تعیین وزن گیاهچه در طی دوره رشد و بمنظور تعیین وزن خاک گلدان بدون وزن گیاهچه استفاده شد. در مجموع، تیمارها شامل تیمار رطوبتی در دو سطح شاهد (95 درصد ظرفیت زراعی) و تنش (55 درصد ظرفیت زراعی) و تیمار باکتریایی در چهار سطح شاهد، P. fluorescens ،
A. brasilense و تلقیح ترکیبی بودند که به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوک کاملا تصافی در سه تکرار بر گیاهان پروانش اعمال شدند.
اندازهگیری صفات ریختشناسی و نمونهبرداری از ریشه گیاهان برای بررسی بیان ژن، 30 روز پس از شروع اعمال تیمار رطوبتی و در مرحله گلدهی انجام شد. شکل 2 تصویر گیاهان شاهد را تحت شرایط آبیاری نرمال (الف) و تنش رطوبتی (ب) در زمان نمونهبرداری نشان میدهد. ارتفاع و طول ریشه با خطکش اندازهگیری شد. بمنظور محاسبه حجم ریشه از استوانه مدرج cc 10 استفاده و تفاوت حجم آب استوانه مدرج قبل و پس از غوطهور کردن ریشه به عنوان حجم ریشه در نظر گرفته شد. سطح ریشه نیز با استفاده از فرمول زیر تعیین گردید:
(8) ) RA= 2(MRL × MRV × π
که در آن RA= سطح ریشه، MRL= طول ریشه، MRV= حجم ریشه و 14/3 = π میباشد.
الف ب
شکل 2- گیاهان شاهد پروانش، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی.
الف) در شرایط آبیاری نرمال ب) در شرایط تنش رطوبتی
تجزیههای آماری: پس از بررسی نرمال بودن باقیماندهها، از دادههای اصلی برای انجام تجزیههای آماری استفاده گردید. تجزیه واریانس و مقایسه میانگینها به وسیله نرمافزار SAS Ver. 9.2 (SAS Institute Inc., 2008) و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنیدار (LSD) در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.
آنالیزهای مولکولی بیان ژنها: استخراج RNA و qRT –PCR: نمونههای ریشه جمعآوری شده برای بررسی بیان ژن، در فریزر c°80- نگهداری شدند. آنالیزهای مولکولی بیان ژن Str در چند مرحله صورت گرفت. ابتدا استخراج RNA از 100 میلیگرم ریشه پودر شده و با استفاده از کیت استخراج RibospinTM Seed/ Fruit ساخت شرکت GeneAll کرهی جنوبی طبق پروتکل شرکت سازنده انجام و کمیت و کیفیت RNA استخراج شده به ترتیب با استفاده از دستگاه نانودراپ مدل (Thermo Scientific, Nanodrop, 2000C) و ژل الکتروفورز 5/1 درصد تعیین شد. واکنش ساخت cDNA با استفاده از یک میکروگرم RNA و آغازگر الیگو dT، توسط کیت Hyperscript RT-PCR master mix® بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (GeneAll، کره جنوبی) صورت گرفت. با استفاده از برنامه Primer Quest موجود در سایت IDT (Integrated DNA Technologies) آغازگر ژن Str طراحی شد. در انتخاب توالی آغازگر، طول آغازگر، درصد GC (40 تا 60 درصد)، مکمل بودن آغازگرها با هم و احتمال تشکیل حلقه مورد توجه قرار گرفت. همچنین اندازه محصول Product size آغازگر مورد نظر، با استفاده از توالی آغازگر رفت و آغازگر برگشت در سایت NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) محاسبه و در انتخاب توالی آغازگر، لحاظ گردید. اندازه محصول آغازگر، با استفاده از واکنش PCR و الکتروفورز ژل آگارز مورد تایید قرار گرفت. آغازگر Ribosomal protein synthesis (RPS9) (ژن خانهدار) نیز به عنوان ژن کنترل داخلی تعیین شد (جدول 1). برای اطمینان از توالی صحیح و عملکرد اختصاصی آغازگر و همچنین پیدا کردن دمای بهینه اتصال به cDNA سنتز شده، واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلرBio-Rad و به صورت شیب دمایی Gradiant انجام گرفت.
جدول 1- توالی آغازگرهای رفت و برگشت استفاده شده در واکنش qRT-PCR
ردیف |
نام ژن |
آغازگر |
توالی آغازگر 5´- 3´ |
طول قطعه (bp) |
شماره دسترسی |
منبع |
1 |
Tdc |
F |
ACCTACGACCGTCGAAACGGATTT |
232 |
MG748691.1 |
Goklany et al, 2009 (25) |
R |
AAACTCGGGACATATACAGGCGCT |
|||||
2 |
Str1 |
F |
CGCCTACGCATCTCCCTTCT |
82 |
X53602.1 |
- |
R |
TGTCCTCCCACACAATGGTCT |
|||||
3 |
RPS92 |
F |
TCCACCATGCCAGAGTGCTCATTA |
203 |
A749993.1 |
Goklany et al, 2009 (25) |
R |
TCCATCACCACCAGATGCCTTCTT |
|||||
1. آغازگر Str طراحی شد. 2. ژن RPS9 به عنوان ژن کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. |
در نهایت، بر اساس الکتروفورز ژل آگارز محصول PCR، دمای بهینه اتصال مختص هر آغازگر تعیین گردید. واکنش qRT-PCR در 40 چرخه، در دستگاه StepOnePlus Real-Time PCR System شرکت Applied Biosystem Incorporation (ABI)، با استفاده از کیت Real Q Plus 2x Master Mix Green, High ROXTM انجام گرفت. برای هر سه ژن، سه تکرار بیولوژیکی (از سه گیاه متفاوت) و دو تکرار تکنیکی (دو تکرار برای هر cDNA) در نظر گرفته شد. برای انجام واکنش qRT-PCR تمام cDNAهای سنتز شده به غلظت ng/µl 100 رسانده شدند. مواد لازم برای انجام واکنش qRT-PCR شامل cDNA رقیق شده، آغازگر رفت، آغازگر برگشت و Master Mix Green بودند. پروتوکل دمایی مربوطه در جدول 2 نشان داده شده است.
جدول 2- پروتوکل دمایی برای انجام واکنش qRT-PCR
تعداد چرخه |
نام مرحله |
زمان اجرا |
درجه حرارت (C˚) |
1 |
واسرشت سازی اولیه |
10 دقیقه |
95 |
40 |
واسرشت سازی ثانویه |
10 ثانیه |
95 |
اتصال |
10 ثانیه |
دمای مختص به هر پرایمر |
|
گسترش |
15 ثانیه |
72 |
|
1 |
واسرشت سازی |
15 ثانیه |
95 |
اتصال و گسترش |
60 دقیقه |
65 |
تجزیه دادههای مولکولی: برای تجزیه دادههای بهدست آمده، از روش اختلاف در تغییرات چرخه آستانه (∆∆Ct) استفاده شد. بدین صورت که ابتدا چرخه آستانه برای نمونههای مختلف با استفاده از ژن مرجع (خانهدار)، نرمالسازی شد و سپس تفاوت نسبی در میزان بیان ژنهای هدف با استفاده از نرم افزار REST® (42) محاسبه گردید. اختلاف معنیداری بین تیمارها نیز در سطح یک و پنج درصد مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج
ارزیابی صفات ریختشناسی: تجزیه واریانس دادهها ابتدا به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح بلوکهای کامل تصادفی انجام شد اما با توجه به عدم معنیداری اثر بلوک برای تمام صفات مورد ارزیابی اثر بلوک حذف و آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جدول 4 نتیجه تجزیه واریانس صفات مورد اندازهگیری را 30 روز پس از اعمال تنش خشکی نشان میدهد. نتیجه مقایسات میانگین اثرات متقابل نوع باکتری در شرایط رطوبتی و نیز اثرات اصلی تیمار تنش رطوبتی بر صفات مورد نظر بترتیب در جداول 5 و 6 آورده شده است.
جدول 4- تجزیه واریانس دادههای اثر دو شرایط مختلف رطوبتی و چهار سطح عامل باکتریایی بر صفات ریختشناسی گیاه پروانش 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی
منبع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات (MS) |
||||
ارتفاع گیاه |
طول ریشه |
حجم ریشه |
سطح ریشه |
نسبت طول ریشه به ارتفاع |
||
نوع باکتری |
3 |
*81/4 |
**70/17 |
*39 /0 |
** 26/22 |
ns 08/0 |
شرایط رطوبتی |
1 |
**38/108 |
ns 76/3 |
**08/4 |
**26/195 |
** 38/2 |
شرایط رطوبتی× باکتری |
3 |
ns 403/0 |
**43/20 |
**75/0 |
**83/61 |
ns 044/0 |
خطای آزمایشی |
16 |
125/1 |
656/2 |
121 /0 |
598/1 |
044/0 |
ضریب تغییرات (درصد) |
- |
72/7 |
33/8 |
52/9 |
70/7 |
78/14 |
ns ، * و **: بترتیب غیرمعنیدار، معنیدار در سطح احتمال پنج و یک درصد |
ارتفاع گیاه: نتیجه تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثرات اصلی نوع باکتری و تنش رطوبتی بر ارتفاع گیاه بترتیب در سطح پنج و یک درصد معنیدار شده ولی اثرات متقابل این دو عامل معنیدار نبود.
مقایسه میانگین اثر تیمارهای باکتریایی (شکل 3) نشان داد که تیمار با هر دو باکتری باعث کاهش ارتفاع گیاه شده و در این میان باکتری A. brasilense بیشترین اثر را داشته و موجب کاهش معنیدار این صفت در سطح پنج درصد شده است. تنش رطوبتی نیز همانطور که انتظار میرفت، باعث کاهش معنیدار ارتفاع گیاه در سطح یک درصد گردید. بیشترین مقدار میانگین ارتفاع در تیمار شاهد (875/15 سانتیمتر) و کمترین آن در تیمار تنش (167/10 سانتیمتر) دیده شد (جدول 6).
شکل 3- مقایسه میانگین اثرات ساده سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی بر صفت ارتفاع در گیاه پروانش
جدول 5- مقایسه میانگینهای اثرات متقابل سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی و شرایط رطوبتی بر صفات ریشهای در گیاه پروانش
ردیف |
شرایط رطوبتی |
نوع باکتری |
میانگین صفات مورد ارزیابی |
||
طول ریشه |
حجم ریشه |
سطح ریشه |
|||
1 |
شاهد |
شاهد |
b 667/18 |
c133/1 |
c298/16 |
2 |
تلقیح ترکیبی |
b 000/18 |
b 767/1 |
b 983/19 |
|
3 |
باکتری P.f |
b 667/16 |
c033/1 |
cd696/14 |
|
4 |
باکتری A.b |
a 333/23 |
a333/2 |
a 150/26 |
|
5 |
تنش |
شاهد |
a 000/23 |
d800/0 |
cd195/15 |
6 |
تلقیح ترکیبی |
b 333/18 |
d800/0 |
de 539/13 |
|
7 |
باکتری P.f |
b 333/19 |
d800/0 |
d933/13 |
|
8 |
باکتری A.b |
b 167/19 |
e567/0 |
e641/11 |
|
میانگینها با حروف مشابه، اختلاف معنیداری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند. P.f و A.b بترتیب نشان دهنده P. fluorescens و A. brasilense هستند. |
طول، حجم و سطح ریشه: اثر متقابل سطوح مختلف تیمارهای باکتریایی در شرایط رطوبتی مختلف برای هر سه صفت مربوط به ریشه یعنی طول، حجم و سطح ریشه معنیدار بود (جدول 4). مقایسه میانگین اثرات متقابل تیمارها برای این صفات نشان داد که هر سه صفت بیشترین مقدار را در تیمار با باکتری A. brasilence در شرایط عدم تنش داشتهاند. این تیمار رشد طولی ریشه گیاه را تا میزان 33/23 سانتیمتر افزایش داد که با طول ریشه گیاهان شاهد در تنش کمبود آب برابری میکرد. سایر تیمارها از لحاظ طول ریشه در یک گروه قرار گرفتند. از نظر حجم و سطح ریشه نیز باکتری A. brasilence در شرایط تنش کمترین مقدار را دارا بود و پس از آن سایر تیمارهای باکتریایی در تنش کمبود آب در یک گروه قرار گرفتند و اختلاف معنیداری با یکدیگر نداشتند.
جدول 6- مقایسه میانگین اثرات ساده سطوح مختلف تیمار رطوبتی بر صفات اندازهگیری شده در گیاه پروانش
ردیف |
تیمار |
میانگین صفات |
|
ارتفاع |
نسبت طول ریشه به ارتفاع |
||
1 |
شاهد |
a 875/15 |
b106/1 |
2 |
تنش رطوبتی |
b625/11 |
a 737/1 |
میانگینها با حروف مشابه، اختلاف معنیداری در سطح احتمال 5 درصد با یکدیگر ندارند. |
نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه: این صفت نیز تنها تحت تاثیر تیمار تنش خشکی قرار گرفت. مطابق با نتایج جدول تجزیه واریانس و مقایسه میانگین، تیمار تنش خشکی، نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه را در سطح احتمال یک درصد افزایش داد.
ارزیابیهای مولکولی بیان ژن: در این تحقیق برای نرمالسازی دادهها، از ژن RPS9 به عنوان ژن خانهداراستفاده شد. کارایی این آغازگر به عنوان یک ژن خانهدار مناسب در گیاه پروانش تایید شده است. چرا که مقادیر Ct آن تحت تاثیر تیمارهای مختلف قرار نگرفته و در تحقیقات مختلف انجام شده بر روی این گیاه، برای تمام نمونهها، تقریبا ثابت بوده است (24 و 25). در تحقیق حاضر نیز مقادیر Ct مربوط به این آغازگر برای تمام نمونهها، نزدیک به هم بود. ولی مقادیر Ct آغازگرهای Tdc و Str، در بین تیمارهای مختلف با هم تفاوت داشت. این موضوع بر تاثیر تیمارهای مختلف اعمال شده بر میزان بیان ژنهای مورد بررسی، دلالت دارد. منحنی ذوب حاصل از همه نمونهها، تکثیر مطلوب توالی هدف را در تیمارهای مختلف نشان داد (شکل 4).
شکل 4- نمونهای از منحنی ذوب حاصل از تکثیر توالی هدف
اثر تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Tdc، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی: اثرات تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Tdc نسبت به گیاه شاهد، در شکل 5 نشان داده شده است. نتایج نشان میدهد که 30 روز پس از اعمال تنش کمبود آب، بیان ژن Tdc در شرایط تنش رطوبتی نسبت به گیاه شاهد کاهش غیرمعنیداری داشته است. در رابطه با تیمارهای باکتریایی در شرایط عدم تنش نیز، همانطور که در شکل مشاهده میشود تمام تیمارها افزایش بیان ژن را به دنبال داشتهاند اما در مورد باکتری
P. fluorescens این افزایش قابل توجه و در سطح احتمال یک درصد معنیدار بوده است. همچنین تلفیق باکتریها با تیمار تنش کمبود آب، موجب شد تا تیمارهای باکتریایی اثر کمتری بر روی بیان این ژن داشته باشند. در این میان، باز هم باکتری P. fluorescens کمتر از سایرین تحت تاثیر تنش قرار گرفته و افزایش معنیدار بیان ژن را در پی داشته است.
بیان ژن Tdc در ریشه گیاهان برای تمام تیمارهای باکتریایی در شرایط تنش کمبود آب نسبت به شاهد تحت تنش، افزایش داشت (شکل 6) که باز هم بیشترین میزان افزایش به باکتری P. fluorescens (64/16) و سپس باکتری A. brasilence (98/6) تعلق داشت. همانطور که نتایج نشان میدهد، هنگامیکه دو باکتری به طور جداگانه اعمال شدند، اثر بیشتری بر بیان ژن Tdc در هر دو شرایط رطوبتی داشتند.
شکل 5- بیان نسبی ژن Tdc تحت تیمار با تنش کمبود آب و باکتریهای تقویت کننده رشد در شرایط نرمال و تنش نسبت به شاهد در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی
حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.
* و **: بترتیب معنیدار در سطح احتمال پنج و یک درصد
شکل 6- بیان نسبی ژن Tdc تحت تیمار با باکتریهای تقویت کننده رشد در شرایط تنش رطوبتی نسبت به شاهد تحت تنش در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی
حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
اثر تیمارهای مختلف بر بیان نسبی ژن Str، 30 روز پس از اعمال تنش رطوبتی: مطابق با شکل 7، بهکارگیری تیمارهای باکتریایی میزان بیان ژن Str را نسبت به گیاه شاهد افزایش داد. تیمار با باکتری P. fluorescens و سپس A. brasilence بیشترین افزایش بیان ژن را بترتیب به میزان 34/10 و 23/6 برابر موجب شد که درسطح پنج درصد معنیدار بود. هنگامیکه این دو باکتری در تیمار ترکیبی کنار یکدیگر قرار گرفتند میزان بیان ژن کمتر از زمانی که هریک به تنهایی اعمال شدند، افزایش یافت. یعنی در شرایط عدم تنش هر یک از دو باکتری مورد استفاده به تنهایی بهتر از حالت ترکیبی عمل نمودند. همین تیمارها وقتی به مدت 30 روز در شرایط تنش رطوبتی قرار گرفتند، کارایی تیمار باکتری A. brasilense نسبت به حالت ترکیبی کاهش پیدا کرد. اما باز همP. fluorescens بیشترین افزایش بیان ژن (12/5) را در پی داشت. همچنین بیان ژن Str در شرایط تنش خشکی نسبت به گیاه شاهد کاهش غیرمعنیداری (36/1-) نشان داد.
شکل 8 نیز افزایش بیان ژن Str را در تمام تیمارهای باکتریایی در شرایط تنش کمبود آب نسبت به شاهد تحت تنش نشان میدهد.
شکل 7- بیان نسبی ژن Str تحت تیمار با تنش کمبود آب و باکتریهای تقویت کننده رشد در شرایط نرمال و تنش نسبت به شاهد در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی
حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.
*: معنیدار در سطح احتمال پنج درصد
شکل 8- بیان نسبی ژن Str تحت تیمار با باکتریهای تقویت کننده رشد در شرایط تنش رطوبتی نسبت به شاهد تحت تنش در ریشه گیاه پروانش، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی
حروف P.f، A.b و S بترتیب نشان دهنده P. fluorescens ،
A. brasilense و شرایط تنش هستند.
بحث و نتیجه گیری
در این پژوهش تاثیر هشت تیمار شامل تلفیق فاکتوریل دو گونه از باکتریهای PGPR به صورت جداگانه و توأم با تنش رطوبتی، بر برخی صفات ریختشناسی و نیز میزان بیان دو ژن کلیدی در دو شاخه مختلف مسیر بیوسنتزی انواع TIA، یعنی مسیر ایندولی (Tdc) و مسیر میانی (Str) در ریشه گیاه، 30 روز پس از اعمال تیمار رطوبتی مورد بررسی قرار گرفت.
کمبود آب در جریان تولید گیاهان می تواند صدمات سنگینی به رشد و نمو و همچنین بر کمیت و کیفیت مواد مؤثرة گیاهان دارویی وارد نماید (3). در مطالعه حاضر، تنش کمبود آب ارتفاع گیاه و حجم ریشه را نسبت به گیاه شاهد به طور معنیداری کاهش داد ولی افزایش رشد طولی ریشه را بهمراه داشت. افزایش رشد ریشه در اثر تنش کمبود آب، در گیاهانی مانند آفتابگردان (36 و 49) و پروانش (30) گزارش گردیده است. یک سیستم ریشهای قوی به ویژه در مراحل اولیه رشد، میتواند مزیت رشد سریع را برای گیاه فراهم آورد. چرا که آب موجود در لایههای سطحی خاک را که به راحتی از طریق تبخیر از دست میرود، جذب مینماید (29). همچنین در مطالعه حاضر، با کاهش ارتفاع و افزایش رشد طولی ریشه، نسبت طول ریشه به ارتفاع گیاه افزایش یافت. در برخی مطالعات، تنش کمبود آب موجب کاهش مقادیر برخی از صفات رویشی گیاه پروانش از جمله ارتفاع گیاه شده است (14 و 37). هاشمآبادی در سال 1396 با مطالعه بر تاثیر نوع آب (آب شهر و آب چاه به صورت ساده و مغناطیس شده) و دور آبیاری بر گیاه پروانش، نشان داد که دورهای آبیاری تأثیر بهسزایی در بهبود صفات رویشی و زایشی دارند، به طوری که با فزایش فاصلة دور آبیاری، این صفات کاهش مییابند (11). به طور کلی تنش کمبود آب، کارایی انتقال و تجمع مواد فتوسنتزی را کاهش داده و میتواند موجب کاهش رشد گیاه شود (14). کاهش رشد در شرایط تنش ناشی از جلوگیری از تقسیم سلول، رشد سلول و یا هر دوی آنهاست. این اثرات ممکن است به دلیل تغییر در تعادل هورمونهای گیاهی در اثر تنش باشد. چرا که مشخص شده تحت شرایط نا مساعد محیطی، مقدار درونزای هورمونهای گیاهی دچار تغییرات اساسی میشود (12). به گونهای که افزایش در نسبت ریشه به ارتفاع، تحت شرایط تنش کمبود آب، به مقدار اسید آبسیزیک ریشهها و شاخهها نسبت داده شده است (26). پیشنهاد شده است که ABA میتواند به عنوان یک واسطه در پاسخ گیاهان به طیف وسیعی از تنشها از جمله تنش کمبود آب عمل کند و همچنین گیاه را قادر می سازد تا در شرایط نامساعد محیطی زنده بماند (22).
بررسیهای گذشته نشان داده است که ریزوباکتریهای تقویت کننده رشد گیاه اثرات سودمندی را بر رشد و نمو گیاه اعمال میکنند. مکانیسمهای عمومی تقویت رشد گیاه توسط انواع PGPR عبارت از تثبیت نیتروژن، کاهش سطوح اتیلن، تولید فیتوهورمونها، القای مقاومت به پاتوژن، انحلال مواد غذایی، کاهش سمیت آلایندهها میباشد (17 و 46). نژادهای فلورسنت باکتری Pseudomonas و نیز A. brasilense که در تحقیق حاضر مورد استفاده قرار گرفتهاند، هر دو در شمار باکتریهای PGPR بوده و در منابع مختلف از آنها به عنوان مهمترین و بزرگترین ریزوباکتریهای تقویت کننده رشد یاد شده است (1، 30 و 32). همانطور که از نتایج این پژوهش پیداست در میان تیمارهای باکتریایی، باکتری
A. brasilense در مورد صفات ریشهای، در شرایط عدم تنش کمبود آب، به خوبی عمل کرده و افزایش طول، حجم و سطح ریشه را در پی داشته است. این گونه باکتریایی در بهبود سیستم ریشهای گیاه نیشکر از طریق افزایش ریشههای مویین، جانبی و نابجا موثر بوده است (27). تیمار ارقام گندم نیز با دو سویه از باکتری A. brasilense در غلظت cfu/ml 108 و شرایط بدون تنش، وزن خشک ریشه را به طور معنیداری افزایش داد (10). همچنین افزایش طول ریشه در لوبیای تلقیح شده با A. brasilense گزارش شده است (21). همانطور که بیان شد، باکتریهای PGPR در تنظیم تولید اتیلن و کاهش آن درگیاه نقش دارند و تنظیم تولید اتیلن در افزایش رشد طولی ریشه و تاثیر غیرمستقیم بر افزایش ریشهزایی موثر است (1). طبق گزارش برخی از محققین استفاده از تنظیم کنندههای رشد نقش قابل توجهی در افزایش رشد ریشه گیاهان دارد (6). این باکتریها نیز قادر به تولید تنظیم کنندههای رشد گیاهی از قبیل اکسین، سیتوکنین و جیبرلین هستند (17 و 30) و میتوانند با تولید این فیتوهورمونهای مختلف، آرایش و ساختار ریشه را تغییر داده و بر رشد و نمو گیاه اثر گذارند (34). لازم به ذکر است که در پژوهش حاضر، در شرایط تنش، از کارایی تیمارهای باکتریایی در رابطه با صفات ریشهای کاسته شد. از آنجا که نقش این باکتریهای مفید، به عنوان باکتریهای بیوکنترل موجود در منطقه ریشه، در ایجاد مقاومت سیستمیک به پاتوژنها در گیاهان مختلف به اثبات رسیده است (43، 44 و 47)، شاید بتوان گفت که ایفای این نقش و همچنین تاثیر بر بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی متابولیتهای ثانویه، میتواند منجر به کاهش اثرشان بر صفات رویشی گیاه از جمله ارتفاع در پروانش به ویژه در شرایط بروز تنش گردد.
از نظر تاثیر تیمارهای مختلف بر بیان ژنهای مورد بررسی، باکتری P. fluorescens بهتر از سایر تیمارها عمل نمود و در هر دو شرایط تنش و عدم تنش موجب افزایش معنیدار بیان هر دو ژن مورد بررسی نسبت به گیاه شاهد شد. دو ژن Str و Tdc در مطالعات گذشته نیز سابقه تنظیم بیان مشترک را داشتهاند. به عنوان نمونه، در مطالعه Pauw et al. در سال 2004 این دو ژن در پاسخ به الیسیتورهای قارچی مانند عصاره مخمر، به صورت هماهنگ با هم تنظیم و بیان شدند (41). P. fluorescens در مقایسه با شاهد تحت تنش نیز افزایش معنیدار بیان ژن Str را موجب گردید. به طور کلی، در مطالعه حاضر، تیمارهای باکتریایی P. fluorescens و A. brasilense، به طور جداگانه در مقایسه با تلقیح ترکیبی، بیان ژنها را در شرایط بدون تنش و تحت تنش نسبت به گیاهان شاهد بدون تنش و تحت تنش افزایش دادند.
همانطور که بیان شد، نقش ریزوباکتریهای غیر بیماریزا یا PGPR در ایجاد نوعی مقاومت به نام "مقاومت سیستمیک القایی" Induced systemic resistance (ISR) در گیاهان اثبات شده است (16). ویژگی قابلیت دفاعی ISR به این صورت است که گیاهان سطوح جاسمونیک اسید را به عنوان علامتی از دفاع فعال افزایش میدهند. همچنین حساسیت گیاه را نسبت به مقادیر اتیلن بالا میبرند. این مولکولهای علامت رسان به نوبه خود فعالیت مجموعه وسیعی از پاسخهای دفاعی را هماهنگ میکنند (2، 16 و 44). یک پاسخ دفاعی مهم که به جاسموناتها به عنوان مولکولهای علامت رسان بستگی دارد، القای تجمع متابولیتهای ثانویه میباشد (53). نشان داده شده که کاربرد خارجی متیل جاسمونات (MeJA)، القای تولید متابولیتهای ثانویه را در 36 گونه گیاهی مختلف به دنبال داشته است (46). جاسموناتها تولید متابولیتهای ثانویه را در سطح رونویسی و از طریق راهاندازی هماهنگ یک مجموعه از ژنهای بیوسنتزی القا میکنند. در مطالعه Van der Fits and Memelink در سال 2000 تیمار متیل جاسمونات، متابولیسم TIA را در سوسپانسیون سلولی
C. roseus تحریک نموده و افزایش بیان تمام ژنهای مورد آزمون مسیر بیوسنتزی TIA را در پی داشت (50). در مطالعه مذکور عامل رونویسی Octadecanoid-derivative responsive Catharanthus AP2-domain protein 3 (ORCA3) در پاسخ به متیل جاسمونات فعال شده و بیان تعدادی از ژنهای مسیر بیوسنتزی از جمله ژن Str (استریکتوسیدین سنتتاز) را کنترل نمود. ORCA3 و فاکتور رونویسی مرتبط با آن به نام ORCA2 یک ناحیه متصل شونده به DNA DNA-binding domain از نوع عامل رونویسی اتیلن ethylene response factor/APETALA2 (AP2/ERF) دارند. این دو عامل رونویسی در تعامل با یکدیگر پروموتور Str را از طریق اتصال اختصاصی توالی به "عامل پاسخ دهنده به الیسیتور و جاسمونات" Jasmonate- and elicitor-responsive element (JERE) که حاوی جعبه GCC میباشد، فعال میکنند. بیان ژنهای ORCA به سرعت توسط متیل جاسمونات القا میشود که خود دال بر این است که عوامل ORCA سطح بیان خود را یا بهطور خودکار و یا توسط یک یا چند عامل رونویسی در بالا دست ژن تنظیم میکنند. گزینه دوم، یعنی یک جریان رونویسی Transcriptional cascade که بیان ژن پاسخ دهنده به تنش را در گیاه تنظیم میکند، برای مسیر علامتدهی اتیلن و علامتدهی سرما نیز پیشنهاد شده است. در تحقیقی، عامل رونویسی WRKY در گیاه پروانش که به طور ویژه در ریشهها و در پاسخ به فیتوهورمونهایی نظیر جاسمونات، جیبرلین و اتیلن بیان میشود، مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق نشان داده شد که افزایش بیان عامل رونویسی CrWRKY2 در پاسخ به متیل جاسمونات، در کشت ریشههای مویین پروانش، باعث افزایش بیان چندین ژن مسیر بیوسنتزی TIA به ویژه Tdc شد. به علاوه سطح بیان عامل رونویسی فعال کننده ORCA3 و عامل مهار کننده ZCT را نیز افزایش داد (48). القای همزمان عوامل رونویسی فعال کننده و مهار کننده ممکن است برای تغییر خاموش و روشن شدن ژنها در پاسخ به محرکها ضروری باشد (7). در گزارشی نیز نشان داده شد که کاربرد متیل جاسمونات موجب افزایش بیان ژنهای Tdc، G10h و Str در مسیر بیوسنتزی TIA در گیاه پروانش میشود (53). در مطالعهای دیگر، کاربرد تیمار اتیلن تاثیر مثبتی را بر TIA گیاه پروانش در سطح رونویسی و متابولیتی داشت (52).
با توجه به مطالب فوق، شاید بتوان استنباط نمود که با اعمال تیمار PGPR در گیاه پروانش، پاسخ جاسمونیک اسید فعال شده است. این پاسخ نیز به نوبه خود موجب افزایش بیان عامل رونویسی CrWRKT2 و متعاقبا عامل فعال کننده ORCA3 و عامل مهار کننده ZCT گردیده و به این ترتیب بر بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی TIA تاثیر گذاشته است. از این منظر، میتوان بیان نمود که نتایج این تحقیق با نتایج Suttipanta (48) و Zhang et al (53) همخوانی دارد. به گونهای که در تیمار جداگانه
P. fluorescens و A. brasilense عامل فعال کننده ORCA3 تاثیرگذارتر بوده و در تیمار ترکیبی این دو باکتری طی مکانیسمی که مشخص نیست هر دو عامل فعال کننده و مهار کننده موثر بودهاند.
با توجه به اثبات وجود رابطه مثبت بین میزان بیان ژنهای مسیر بیوسنتزی TIA و تجمع آلکالوئیدهای مرتبط با این ژنها در گیاه پروانش (18، 25 و 52) انتظار میرود با افزایش بیان دو ژن Tdc و Str، محصول این ژنها و نیز محصولات نهایی مسیر بیوسنتزی TIA از جمله مقدار آجمالیسین در ریشه گیاه پروانش افزایش یابد. همانطور که در مطالعه Jaleel et al در سال 2007 نیز مقدار آجمالیسین ریشه، به موجب تیمار گیاهان تحت تنش کمبود آب با باکتری P. fluorescens افزایش یافت.
همچنین، این احتمال وجود دارد که شدت تنش بهکار رفته و نیز طولانی بودن مدت زمان اعمال تنش کمبود آب، موجب کاهش اثر برخی از تیمارها از جمله تنش بر بیان ژنهای مورد بررسی شده باشد. بنابراین پیشنهاد میشود که آزمایش مشابهی با شدت تنش ملایمتر و طول زمان کمتر اعمال تنش، در گیاه پروانش انجام شود.
سپاسگزاری
با تشکر ازکادر با محبت آزمایشگاه مرکزی دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی کرج و آقایان مهندس پورصفر، مهندس سلیمانی و کلیه کسانی که در این کار ما را یاری نمودند.